CN111235122B

CN111235122B - 一种3α羟类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸检测中的应用

Info

Publication number: CN111235122B
Application number: CN201910087703.5A
Authority: CN
Inventors: 华权高; 郑慧铃; 伍卫娇
Original assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Current assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN111235122A

Abstract

一种3α羟基类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸循环酶法检测中的应用,其特征在于将3α羟基类固醇脱氢酶野生型的氨基酸序列的第52位、76位、124位、137位、169位以及228位进行了替换修饰，分别为I52V、T76A、K124E、A137S、R169C、F228L，该突变体具有极高的稳定性，包括pH和温度的稳定性，使用本突变体酶制备的总胆汁酸循环酶法试剂盒具有极高的稳定性。

Description

一种3α羟类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸检测中的应用

技术领域

本发明涉及医疗诊断领域，具体涉及一种活性和稳定性提高的3α羟类固醇脱氢酶突变体和使用这个突变体酶的人血清总胆汁酸检测试剂盒。

背景技术

3α-羟类固醇脱氢酶（3α–Hydroxysteroid dehydrogenase，3α-HSD），可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C_19~27类固醇3 位羟基/酮基的氧化还原。临床上用3α-HSD 作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸（Total bile acids，TBA）浓度。目前，TBA 测定中所用的工具酶3α-HSD 均从睾酮丛毛单胞菌中直接提取，但提取过程复杂、酶蛋白得率低，酶的稳定性低，在一定程度上限制了TBA 测定的临床推广。因此，要使3α-HSD广泛应用于临床医学中，一方面需要寻求更简单高效的提取纯化方法，另一方面必须要提高3α-HSD酶的催化活性、稳定性。

3α羟类固醇脱氢酶是睾酮丛毛单胞菌分泌的一种类固醇脱氢酶，由257个氨基酸残基构成，理论分子量为26.4kDa，可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C_19~27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原。胆汁酸是3α-HSD 的作用底物之一，临床上用3α-HSD作为工具酶来测定人血清中的总胆汁酸浓度。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题而提供。

本发明通过以下技术方案实现：一种高活性和宽pH范围及温度稳定性的3α-羟类固醇脱氢酶变体，由亲本睾酮丛毛单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得3α-羟类固醇脱氢酶突变体，亲本睾酮丛毛单胞菌氨基酸序列SEQ ID NO 2中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示3α-羟类固醇脱氢酶突变体中突变的氨基酸，所述3α-羟类固醇脱氢酶突变体为3α-羟类固醇脱氢酶氨基酸突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，在野生型酶的序列上有6个突变氨基酸，分别为 I52V、T76A、K124E、A137S、R169C、F228L。

本发明提供了一种总胆汁酸测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，其中，试剂1的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液1、表面活性剂和稳定剂1；试剂2的组成成分包括：3α-HSD突变体酶、还原型辅酶Ⅰ、表面活性剂、缓冲液2和稳定剂2；

其中，所述缓冲液1选自由邻苯二甲酸氢盐缓冲液，酒石酸盐缓冲液，草酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、PIPES哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、二甲胂酸钠盐酸缓冲液所组成的组中的一种；

所述缓冲液2选自由硼酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液所组成的组中的一种。

可选的，所述表面活性剂选自由Pluronics、PEG-PCL、PEG-PLA和PEG-PLGA所组成的组中的一种或两种；所述稳定剂1选自由NaCl、CaCl2、MgSO4、EDTA.2Na和EDTA.2K所组成的组中的一种或多种。

可选的，所述稳定剂2选自半胱氨酸、巯基乙醇、腺苷酸、鸟苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸和牛血清白蛋白所组成的组中的一种或多种。

可选的，在所述试剂1中，Thio-NAD的浓度为2-3mmol/L；缓冲液1的终浓度为75mmol/L；表面活性剂的浓度按质量体积百分含量计为3.5％；稳定剂1的浓度为5g/L；去干扰剂的浓度为5mmol/L；在所述试剂2中，3α-HSD的浓度为8-17KU/L；还原型辅酶Ⅰ的浓度为5g/L；缓冲液2的终浓度为25mmol/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为7.0％；稳定剂2的浓度为5g/L。

可选的，所述试剂1和试剂2中还包括去干扰剂、抗氧化剂和防腐剂中的至少一种；

可选的，所述去干扰剂为草氨酸钠；抗氧化剂为β-巯基乙醇；防腐剂为Proclin300。

本发明还提供了所述的试剂盒在总胆汁酸的测定中的应用，包括：将待测样本、试剂1、试剂2按照3μL：210μL：70μL的体积比(可根据试剂中主要成分的浓度和检测仪器的不同，按比例进行用量的调整)混匀后静置60-120秒，在测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm下，使用纯化水和校准品进行线性校准，测量待测样本中总胆汁酸的浓度。

本发明还提供了所述总胆汁酸测定试剂的制备方法：

其中，本发明对于试剂1的制备过程中各成分的混合顺序没有特别要求，可以直接将所述原料混合物中的各组分进行同时、分批或分步混合，只要能得到均匀的稳定相即可，优选通过搅拌使混合更加均匀。

其中，试剂2的配制是按照缓冲液、表面活性剂、稳定剂、还原型辅酶I、3α-HSD突变体酶的顺序，依次混合，得到均匀的稳定相。优选通过搅拌使混合更加均匀。所述制备过程可以在室温的条件下进行。

其中，本发明所提供的总胆汁酸测定试剂在制备后在2-8℃开盖使用状态，稳定时间可以达到30天。

本发明还提供了所述总胆汁酸测定试剂的检测方法，包括，将待测样本、试剂1、试剂2按照3μL：210μL：70μL的体积比(可根据试剂中主要成分的浓度和检测仪器的不同，按比例进行用量的调整)混匀后静置60-120秒，在测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm下，使用纯化水和校准品进行线性校准，测量样本中总胆汁酸的浓度。

其中，所述待测样本为血清、血浆、其他体液或组织液、质控品及其他含有胆汁酸的溶液。优选的，按照待测样本、试剂1、试剂2的用量为3μL、210μL、70μL的方式混合获得混合物。

优选的，将混合物静置60秒，然后置于检测仪器中测量2-3分钟吸光度值(A)；计算每分钟吸光度变化率(△A/min)，在本发明的一种优选的实时方式中，所述检测仪器为具有双试剂功能的生化分析仪，测量所使用的光径优选为1cm。

其中，试剂使用纯化水和校准品（外购商品校准品）进行线性校准。按公式：总胆汁酸的浓度(μmol/L)＝C标准*(△A/min样本-△A/min空白)/(△A/min标准-△A/min空白)计算样本中总胆汁酸的浓度。

附图说明

图1 3α-HSD 原酶与突变修饰酶的pH 稳定性比较。

图2 3α-HSD 原酶与突变修饰酶的热稳定性比较。

图3 3α-HSD 原酶与突变修饰酶的贮藏稳定性比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1、利用易错PCR方法构建表达3α-HSD突变体的毕赤酵母文库

利用易错PCR技术在体外向睾酮丛毛单胞菌3α-HSD基因引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：

其中，上游引物F和下游引物R序列为：

F: 5'-TCAAGATCCCTAGGATGACTGGTCCCCTGATCTAT-3';

R: 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTCAGTTCAGTGGCACGGCTTC-3'。

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。

易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶AvrⅡ和NotI分别对易错PCR扩增产物和质粒pPIC9K进行消化，连接，获得包含突变体基因的表达质粒，转化至E.coli JM109感受态细胞。涂布于LB（含100μg/μL的Amp) 平板。生长12 h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得表达质粒。

将表达质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化液涂布于MD平板上，30℃培养2 d，构成表达3α-HSD突变体的毕赤酵母文库。

实施例2、利用DNA Shuffling方法构建表达3α-HSD突变体的毕赤酵母文库

利用DNA Shuffling的方法将易错 PCR构建的3α-HSD突变体中的突变位点进行随机组合。DNA Shuffling的条件如下：提取易错PCR方法构建的表达睾酮丛毛单胞菌3α-HSD突变体的毕赤酵母文库的基因组，用DNaseⅠ消化30min，将消化产物酚氯仿抽提除去蛋白质后溶解于30μL 无菌水中。以该基因组为模板进行如下操作：

步骤一：PCR反应体系：

Taq (2.5U) 0.5 μL

5×buffer（Mg²⁺ plus） 10μL

基因组 0.5μL

dNTP(25mmol/L) 4 μL

dd H2O 34.5 μL

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，10个循环；72℃10min。

步骤二：在上述体系中加入引物F和R各1μL，PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。

扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后，用实施例1同样的方法，构建表达3α-HSD突变体的毕赤酵母文库。

实施例3、能够稳定表达3α-HSD活性的突变体筛选

将保存于MD平板上的毕赤酵母文库影印复制到MM平板上，30℃培养2天，以表达亲本睾酮丛毛单胞菌3α-HSD的毕赤酵母作为对照菌。

平板初筛：每12 h向MM平皿盖上补加200 μL甲醇诱导重组3α-HSD表达，诱导2-3天后，将平板置于65℃热处理60 min，冷却到室温，向平板上均匀倾倒18mL的混合溶液，其中包括pH8.0的0.2M Tris-Cl；0.25% NTB（硝基四唑兰）;10mmol NAD 2ml;(100μ/ml);diaphorase (黄递酶)；2% Triton X-100；20mmol androsterone 1ml；余量为水，2 min内单克隆所显红色深于对照的菌落为初筛目的菌株。

96孔板筛选方法：向1.8 mL/孔（平底）的96孔板中加入300μL BMGY培养基，121℃灭菌20 min。向其中接入初筛获得的菌株，以表达亲本睾酮丛毛单胞菌3α-HSD的毕赤酵母作为对照菌，30 ℃ 250 r/min振荡培养至OD600为2-6。离心，弃上清，用900 μL BMMY培养基重悬菌体，每24 h加入1 % （V/V）甲醇诱导3α-HSD表达，诱导4 天，离心收集上清，根据实施例4的方法测定3α-HSD突变体在65℃下的半衰期t50。

筛选易错PCR和DNA Shuffling构建的表达3α-HSD突变体的毕赤酵母文库，获得1株热稳定性明显提高的菌株，测定3α-HSD核苷酸序列（由上海生工生物工程技术服务有限公司测序），利用三联体密码子推测3α-HSD的氨基酸序列，3α-HSD突变体的氨基酸取代及半衰期分别为 I52V、T76A、K124E、A137S、R169C、F228L,其半衰期提高倍数为野生型半衰期的3.2倍。

实施例4 3α-HSD突变体的t50测定

为测定3α-HSD的t50值，需要对酶进行分离纯化。摇瓶发酵：接种量10％（V/V），25 mLBMGY培养基中，30℃振荡培养16～20 h 至OD600为2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD600为1，每隔24 h添加0.5 %的甲醇诱导表达，培养3-4 d后，收集发酵上清液。

分离纯化：将突变菌株的发酵上清液经过10 KD超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变3α-HSD活性组分。

t 50的测定方法：

按Boyer 等人的方法测定酶活性。酶活的定义为反应温度为25 ℃, 总反应体积为0.5ml , 反应体系中含有:100 mmol/L焦磷酸钠缓冲液(pH 11.0), 0.5 mmol/L NAD+ ,0.2mmol/L雄酮, 0.5 g/L BSA .加入酶液(1～5 μl)启动反应。3α-HSD在65℃下半衰期的测定方法为：在65℃下处理酶液，在不同处理时间取样，测定3α-HSD残余酶活百分比（％）。以残余酶活百分比的log值对时间T（min）作图，直线的斜率为失活常数kinact。由t50=ln2/kinact得到3α-HSD在该温度下的t50。

检测方法：采用具有双试剂功能的自动生化分析仪(光径1cm、测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm)，按照样本：试剂1：试剂2=3μL：210μL：70μL的方式加样，加入试剂260秒后，读取2-4分钟的吸光度值；使用纯化水和校准品进行线性校准；按公式：总胆汁酸的浓度(μmol/L)＝C标准*(△A/min样本-△A/min空白)/(△A/min标准-△A/min空白)，计算样本中总胆汁酸的浓度。

实验例一

将突变体酶和原酶分别与不同pH范围6.0~11.0 磷酸缓冲液混合，25℃水浴30min。将突变体酶和原酶分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中保温10 min 后测酶活。同时将突变体酶和原酶分别在37℃水浴中放置40 h，每隔一段时间取样，按实施例4方法测酶活，计算相对残余酶活。

原酶与突变体酶的pH 稳定性比较

酶分子经过突变后，其耐酸耐碱能力会发生变化。图1显示化学突变体对3α-HSD 的pH稳定性影响。与原酶相比较，突变体酶对pH 波动表现了更好的抵抗能力。在pH=6和pH=7时，原酶的相对残余酶活低于20%，而在pH 6.0~11.0 的范围内，突变体酶的相对残余酶活都大于60%。

实验例二原酶与突变体酶的热稳定性比较

由图2 可知，在温度超过45 ℃时，突变体酶与原酶的相对残余酶活显著的降低。50 ℃水浴10 min后，原酶的相对残余酶活仅仅20.7%，而突变体酶的相对酶活值高达71.8%。60℃水浴10 min 后，原酶完全失活，突变体酶仍有少量酶活。

实验例三

原酶与突变体酶在37 ℃水浴中放置40h，每隔一定时间取样测酶活。由图3可知，随着时间的延长，酶的活性呈下降趋势，但与原酶相比，突变体酶的酶活降低幅度小。当放置40h 时，突变体酶的酶活约是原酶酶活的7.5 倍。

实验例四

测试例用于说明本发明制备的总胆汁酸测定试剂盒的稳定性。选取实施例1制备获得的试剂1、试剂2和购买的朗道校准品组装成试剂盒。

稳定性评价方法：试剂8℃开盖使用状态下，30天之内，每1-3天测定质控品；计算每次测定结果与第一天测定结果的相对偏差，相对偏差小于±8％判定为稳定。

检测方法：采用具有双试剂功能的自动生化分析仪(光径1cm、测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm)，按照样本：试剂1：试剂2=3μL：210μL：70μL的方式加样，加入试剂260秒后，读取2-4分钟的吸光度值；使用纯化水和校准品进行线性校准；按公式：总胆汁酸的浓度(μmol/L)=C标准*(△A/min样本-△A/min空白)/(△A/min标准-△A/min空白)，计算样本中总胆汁酸的浓度。试剂盒中测定结果列于下表。可见稳定性明显提高。

最后，还需注意到的是，上述列举的仅是本发明的若干个实施例。显然，本发明不限于以上实施例。

序列表

<110> 武汉生之源生物科技股份有限公司

华, 权高

<120> 一种3α羟类固醇脱氢酶突变体及其在总胆汁酸检测中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> Comamonas testosteroni

<400> 1

Met Ser Ile Ile Val Ile Ser Gly Cys Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala

1 5 10 15

Thr Arg Lys Val Leu Glu Ala Ala Gly His Gln Ile Val Gly Ile Asp

20 25 30

Ile Arg Asp Ala Glu Val Ile Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu Gly Arg

35 40 45

Lys Gln Ala Val Ala Asp Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp

50 55 60

Gly Leu Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Ala Lys Val Leu Gly

65 70 75 80

Asn Val Val Ser Val Asn Tyr Phe Gly Ala Thr Glu Leu Met Asp Ala

85 90 95

Phe Leu Pro Ala Leu Lys Lys Gly His Gln Pro Ala Ala Val Val Ile

100 105 110

Ser Ser Val Ala Ser Ala His Leu Ala Phe Asp Glu Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ser Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu

130 135 140

His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn

145 150 155 160

Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Cys Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala

165 170 175

Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu

180 185 190

Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys

195 200 205

Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Arg Ala Glu Pro Ser Glu Met Ala Ser

210 215 220

Val Ile Ala Leu Leu Met Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val His Gly Ala

225 230 235 240

Gln Ile Val Ile Asp Gly Gly Ile Asp Ala Val Met Arg Pro Thr Gln

245 250 255

Phe

<210> 2

<211> 1073

<212> DNA

<213> Comamonas testosteroni

<400> 2

catggctggt ttcctcacac gcaaacgttg cgccagtgta ggaagggcca cggtaaattt 60

tccctagggg aattacatcg tccgtttgca tgtagcctgg ttgttcatga tgggctttga 120

tgtgcgccat caccacccag acaaaaggag acaagacatg tccatcatcg tgataagcgg 180

ctgcgccacc ggcattggtg cggctacgcg caaggtcctg gaggcggccg gtcaccagat 240

cgtaggcatc gatatacgcg atgcggaagt gattgccgat ctctcgacgg ccgaaggtcg 300

aaagcaggcg gttgccgatg tactggcgaa gtgcagcaag ggcatggacg gcctggtgct 360

gtgcgccggc ctgggaccgc aggccaaggt gcttggcaat gtggtttcgg tcaattattt 420

tggcgcgacc gagctgatgg atgccttttt gccagcgctg aaaaaaggcc atcagcccgc 480

agccgtcgtc atctcgtccg tggcttccgc gcatctggct tttgacgaga acccactggc 540

gctggcactg gaagccggcg aggaatccaa ggcccgcgcc attgtcgaac atgcgggaga 600

gcagggcgga aatctggcct atgcgggcag caagaatgct ttgacggtgg ctgtgcgcaa 660

atgcgccgcc gcctggggcg aggctggcgt gcgcctgaac accatcgccc ccggtgcaac 720

cgagactccc ttgctgcagg cgggcctgca ggacccgcgc tatggcgaat ccattgccaa 780

gttcgttcct cccatgggcc gccgtgccga gccgtccgag atggcgtcgg tcatcgccct 840

tttgatgagc ccggccgcaa gctatgtgca tggcgcgcag atcgtcattg atggcggcat 900

tgatgcggtg atgcgcccga cacagttctg acctctcatg tggcgctttg ccagagggcc 960

tgcgccttcc ccccctcgct gtgcgggagg gggaaggcgg cctcgctgca aggctttttt 1020

ttgttcaccg cccccgtttg ggcattgccg gttttcaaac ggcgcctgct aga 1073

Claims

1.一种活性和稳定性提高的3α羟类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，在野生型睾酮丛毛单胞菌3α羟类固醇脱氢酶的氨基酸序列的52位、76位、124位、137位、169位以及228位进行了替换修饰，分别为Ⅰ52V，T76A、K124E、A137S、R169C、F228L，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的表达3α羟类固醇脱氢酶突变体的核酸，其特征在于，序列为SEQ ID NO：2所示，能够编码如权利要求1所述蛋白。

3.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的核酸序列。

4.一种表达细胞，含有如权利要求3所述的表达载体，并能表达如权利要求1所述的氨基酸序列的蛋白。

5.一种使用如权利要求1所述突变体酶的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2，其中试剂1的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液1、表面活性剂、稳定剂1和去干扰剂；试剂2的组成成分包括：如权利要求1所述序列的3α-HSD突变体、还原型辅酶Ⅰ、表面活性剂、缓冲液2和稳定剂2。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂1的组分为：所述缓冲液1为二甲胂酸钠盐酸缓冲液；所述表面活性剂为Pluronics L31；所述稳定剂1为CaC1₂和EDTA.2Na按照质量比1：1混合制成；所述去干扰剂为草氨酸钠；所述缓冲液2为pH7.5的巴比妥钠-盐酸缓冲液：所述稳定剂2为半胱氨酸；在所述试剂1中，Thio-NAD的浓度为2-3mmo1/L；缓冲液1的终浓度为75mmo1/L；表面活性剂的浓度按质量体积百分含量计为3.5％；稳定剂1的浓度为5g/L：去干扰剂的浓度为5mmol/L；在所述试剂2中，3α-HSD的浓度为8-17KU/L；还原型辅酶1的浓度为5g/L；缓冲液2的终浓度为25mmo1/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为7.0％；稳定剂2的浓度为5g/L。