CN113234697A

CN113234697A - 一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113234697A
Application number: CN202110464798.5A
Authority: CN
Inventors: 杨愈丰; 郭坚; 刘迪嘉; 许佳伟
Original assignee: Zhuhai Campus Of Zunyi Medical University
Current assignee: Zhuhai Campus Of Zunyi Medical University
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113234697B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用。所述葡萄糖脱氢酶变体，如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖脱氢酶中第336位氨基酸置换成其他氨基酸，所述其他氨基酸选自除赖氨酸以外的任意一种天然氨基酸。所述葡萄糖脱氢酶变体对木糖和甘露糖基本没有活性，对麦芽糖的活性低于野生型的葡萄糖脱氢酶，可用于制备葡萄糖传感器或血糖试纸。

Description

一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用。

背景技术

葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，GDH)是可从多种微生物和组织中获得的一种氧化还原酶，可特意性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸(D-葡萄糖-δ-内酯)，并以NAD⁺(NADP⁺)作为辅基，测定其产物葡萄糖酸的生成量或NADH(NADPH)在340nm处增高的吸光度可以对该酶或其底物进行量化分析。因此该酶在血糖检验试纸、生物燃料电池和电化学生物传感器等方面都有广泛的应用。GDH作为以上设备的一个重要的生物元件，在很大程度上决定了设备的性能。因此，酶学性质优良的GDH的获得对相关生物医学工程设备的研发来说至关重要。

对于糖尿病患者来说，日常的血糖检测工作非常重要。伴随着血糖监测技术的快速发展，监测手段也越来越方便、快速和准确，便携式血糖监测系统已经广泛应用于病人自我监测和医院内即时检验(point-of-care testing，POCT)的血糖监测中。其中血糖检测用酶作为便携式血糖监测系统的核心部分，其性能对检测结果的准确性起到至关重要的作用。目前血糖检测用酶有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)、己糖激酶(Hexokinase，HK)和GDH等多种。

最早采用的是GOD，其血糖检测原理是利用消耗氧气催化葡萄糖氧化，反应依赖氧气的特点使该检测方法受空气中氧分压的影响较大，往往会产生较大的测量误差。

另一种检测方法是HK法，但该法需要与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶联用，需要消耗NADP，当样品中存在能消耗NADP的成分时，会对检测结果造成干扰。另外，由于试剂稳定性较差、价格昂贵，因而限制了HK法在临床上的普及。

而将GDH作为血糖检测用酶时，在该酶的催化下，葡萄糖发生脱氢氧化反应，生成葡萄糖酸内酯。在该反应过程中，生成的还原型辅基或辅酶的含量与葡萄糖的浓度成正相关，且一般浓度的抗凝剂、防腐剂、尿酸、胆红素等对血糖测定不产生干扰。相对于传统的GOD法和HK法而言，GDH法操作更简便，只需一种酶参与反应即可实现，并且既可以进行连续监测(λ＝340nm)又可以进行终点分析，因此有利于构建起方便快捷且自动化分析模式。

GDH根据所结合辅基或辅酶的不同，可以分为PQQ依赖的GDH(PQQ-GDH)、NAD依赖的GDH(NAD-GDH)、和FAD依赖的GDH(FAD-GDH)三种。可溶表达的sPQQ-GDH底物专一性很差，底物谱太宽；膜结合型的mPQQ-GDH系膜蛋白，表达和分离纯化都很困难，这些都严重限制了其在血糖测定方面的应用。NAD-GDH由于辅基结合不牢固，需要不断添加辅基来维持其活性，也不利于血糖检测。而FAD-GDH辅基结合紧密不易脱落，其次反应过程中不需要氧气的参与，因此不管是检测的准确性还是保存的长久性都优于葡萄糖氧化酶和其他辅基依赖性GDH，并且市面主流的血糖仪的使用的核心酶也是FAD-依赖的葡萄糖脱氢酶，一般自开封起可使用到有效期结束。

但野生型FAD-GDH对木糖、麦芽糖和甘露糖均会有一定的脱氢氧化活性，产生轻微反应，使得在检测血糖时会出现假性血糖。因此，希望提出一种对血糖检测效果更好的葡萄糖脱氢酶。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用，所述葡萄糖脱氢酶变体对木糖和甘露糖基本没有活性，对麦芽糖的活性低于野生型的葡萄糖脱氢酶，可用于制备葡萄糖传感器或血糖试纸。

本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶变体，如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖脱氢酶中第336位氨基酸置换成其他氨基酸，所述其他氨基酸选自除赖氨酸以外的任意一种天然氨基酸。如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖脱氢酶为来源于土曲霉的野生型FAD-GDH。

优选的，所述第336位氨基酸置换成丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或酪氨酸。

更优选的，所述第336位氨基酸置换成甲硫氨酸或谷氨酰胺。

最优选的，所述第336位氨基酸置换成甲硫氨酸。

本发明还提供了一种用于葡萄糖测定的组合物，所述组合物包括上述葡萄糖脱氢酶变体。

本发明还提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码上述的葡萄糖脱氢酶变体。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包括上述核苷酸序列。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体由上述核苷酸序列或重组载体转化得到。

本发明还提供了上述葡萄糖脱氢酶变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过如SEQ ID NO:2-3所示的引物对野生型FAD-GDH基因进行扩增，并与载体pPICK9连接，得到重组质粒pPICK9-fad-gdh；

(2)以所述重组质粒pPICK9-fad-gdh为模板，采用如SEQ ID NO:4-5所示的引物进行饱和突变，得到突变质粒；

(3)将所述突变质粒进行线性化处理，并转化至宿主细胞中；

(4)将养步骤(3)经转化后的宿主细胞，分离纯化，得到所述葡萄糖脱氢酶变体。

优选的，步骤(3)中所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

优选的，步骤(3)中还包括将转化后的宿主细胞进行筛选的步骤。

更优选的，所述筛选的步骤为：采用含有遗传霉素的YPD培养基对所述转化后的宿主细胞进行筛选。

优选的，步骤(4)中采用异丙醇进行纯化。

本发明还提供了上述葡萄糖脱氢酶变体在制备血糖试纸或葡萄糖传感器中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明对来源于土曲霉的FAD-GDH基因进行了相关的融合表达并对氨基酸残基进行分析和突变等工作，明确了K336位点的改变对整个酶的酶活有较大的影响。采用PCR定点饱和突变技术对K336位点进行改造，突变后的葡萄糖脱氢酶变体与野生型FAD-GDH相比，活性和底物专一性都得到了较大程度的提高，具备优良的性能。

附图说明

图1表示葡萄糖脱氢酶变体的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中序号1-6分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336M、K336Q、K336S、K336T、K336N、K336C；

图2表示葡萄糖脱氢酶变体的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中序号1-4分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336A、K336G、K336H、K336L；

图3表示葡萄糖脱氢酶变体的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中序号1-7分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336D、K336I、K336P、K336R、K336V、K336W、K336Y；

图4表示葡萄糖脱氢酶变体K336M和野生型葡萄糖脱氢酶FAD-GDH的酶活-pH值关系图；

图5表示葡萄糖脱氢酶变体K336M和野生型葡萄糖脱氢酶FAD-GDH的酶活-温度关系图；

图6表示葡萄糖脱氢酶变体K336M和野生型葡萄糖脱氢酶FAD-GDH的pH值稳定性图；

图7表示葡萄糖脱氢酶变体K336M和野生型葡萄糖脱氢酶FAD-GDH的热稳定性图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：重组质粒pPIC9K-fad-gdh的构建

利用无限制(restriction-free，RF)克隆法，以SEQ ID NO:2-3所示的序列作为上、下游引物，以野生型FAD-GDH基因为模板(该基因可编码如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖脱氢酶)，进行PCR扩增；再使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)有限公司)，将PCR扩增产物进行纯化，将纯化后的产物连接pPIC9K质粒，使用TakaraPrimeSTAR GXL DNA聚合酶进行第二次PCR，得到重组质粒pPIC9K-fad-gdh。

其中引物序列为：

上游引物：5’-CTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCACACAGGAAACAGACCATG-3’(SEQ IDNO:2)；

下游引物：5’-GGAACAGTCATGTCTAAGGCGAATTACATCCGCCAAAACAGCCAAGC-3’(SEQ IDNO:3)。

实施例2：葡萄糖脱氢酶变体的构建

以SEQ ID NO:4-5所示的序列作为随机突变引物，并以实施例1制备得到的重组质粒pPIC9K-fad-gdh作为模板进行定点饱和突变，将饱和突变PCR产物转化到XL10-GOLD感受态细胞中进行克隆。使用提取试剂盒(购自生工生物工程(上海)有限公司)提取质粒，并对质粒进行测序。从中筛选得到19种在FAD-GDH的K336位点突变的质粒pPIC9K-fad-gdh。

其中随机突变引物的序列为：

上游引物：5’-TACTTCAATTTCAGGAACCNNNGCAGTGTCCTACCC-3’(SEQ ID NO:4)；

下游引物：5’-GGGTAGGACACTGCNNNGGTTCCTGAAATTGAAGTA-3’(SEQ ID NO:5)。

实施例3：葡萄糖脱氢酶变体在重组毕赤酵母菌株中的表达

将实施例2制备得到突变质粒进行线性化处理，后使用基因导入仪突变质粒转入毕赤酵母细胞中，得到重组毕赤酵母。

将重组毕赤酵母涂于MD平板，30℃恒温培养2-3天至白色菌落长出。用牙签挑取MD平板上的白色单菌落，接种于含0.5mg/mL遗传霉素的YPD平板中，30℃培养2-3天至白色菌落长出。再次用牙签挑取0.5mg/mL遗传霉素的YPD平板上生长的白色单菌落，接种至含1.0mg/mL遗传霉素的YPD平板中，30℃培养2-3天至白色菌落。

挑取含1.0mg/mL遗传霉素的YPD平板上生长的圆润白色单菌落于50mL的BMGY培养基中，30℃、250rpm培养至A600为6.0。

取600μL上述菌液进行保菌处理，剩余菌液用50mL离心管5000rpm、4℃离心5min收集菌体，用新鲜的BMMY培养基重悬菌体，30℃、250rpm培养。

每隔24h取样测定菌液浓度和样品上清的酶活力，同时加入甲醇至终浓度为1.5％，至酶活不再升高时停止诱导。

实施例4：葡萄糖脱氢酶变体的纯化

将实施例3制备得到的菌株菌液以8000g、4℃的条件离心10min，取上清，再加入预冷的异丙醇至终浓度为40％，以4℃、12000g的条件离心15min，弃上清，所得沉淀用pH 7.4的MOPS进行溶解，得到纯化的蛋白。获得的蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳进行检测，SDS-PAGE蛋白电泳结果如图1-3所示，图中M均表示Marker。

图1中序号1-6分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336M、K336Q、K336S、K336T、K336N、K336C。

图2中序号1-4分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336A、K336G、K336H、K336L。

图3中序号1-7分别表示的葡萄糖脱氢酶变体为：K336D、K336I、K336P、K336R、K336V、K336W、K336Y。

从图1-3中可以看出，蛋白条带呈现拖尾状在60KDa和72KDa之间，与目的蛋白分子量大小一致，纯化效果良好。

实施例5：葡萄糖脱氢酶变体的酶活力测定

以实施例4纯化得到的葡萄糖脱氢酶变体为原料，检测其酶活力，酶活力检测原理如下：

D-Glucose+ox-PMS→D-glucono-δ-lactone+re-PMS

re-PMS+ox-DCIP→ox-PMS+re-DCP

DCIP(2,6-Dichlorophenolindophenol sodium salt，2,6-二氯靛酚钠)为氧化态的时候溶液为蓝色，600nm波长下具有吸收波长，还原态的DCIP溶液接近无色。若发生上述反应，蓝色溶液会逐渐褪色且吸光值也会相应地减少，因此通过A600值的变化我们可以对酶活力进行测定和计算。反应体系及其浓度如表1。

表1.葡萄糖脱氢酶的酶活力测定体系

表1中的MOPS(3-morpholinopropane sulfonic acid，3-吗啉基丙磺酸)的pH值为7.4，反应温度为25℃，测定其吸光值的变化(ΔABs/min)，DCIP的摩尔吸光系数为16.3×10³cm^-1·M^-1，一分钟内还原1μmol DCIP的酶活实质上等价于1单位该酶的酶活力。单位体积酶溶液中酶活按照以下公式计算：

酶活性(U/mL)＝-ΔABs/16.3×2.0/0.01×N(酶的稀释倍数)

葡萄糖脱氢酶变体K336M表达量达到9.1×10⁴U/L，野生型FAD-GDH表达量为8.5×10⁴U/L。

实施例6：葡萄糖脱氢酶变体的酶学性能测试

1.底物专一性

按照实施例5中的酶活力测定方法，将反应体系的底物分别换成1mol/L的D-麦芽糖，D-木糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-乳糖，海藻糖，D-果糖，D-山梨醇和蔗糖，测定其酶活力，并与以D-葡萄糖为底物的时测定的酶活力进行比较。每个样品做三个平行样。结果如表2所示。

表2.野生型FAD-GDH和葡萄糖脱氢酶变体底物专一性比较

ND表示未检出

从表2所示的结果可以看出，相比于FAD-GDH(野生型)，K336A、K336H、K336L、K336M、K336Q和K336V六种葡萄糖脱氢酶变体的底物专一性明显提高，具有实际应用价值。其中通过对底物专一性最好的葡萄糖脱氢酶变体K336M进行分析可知，相较于对木糖、麦芽糖和甘露糖均会有一定的脱氢氧化活性的野生型FAD-GDH，K336M对木糖和甘露糖基本没有活性，对麦芽糖的活性也低于野生型的葡萄糖脱氢酶FAD-GDH。

2.最适反应pH值测定

将酶放入不同pH值的缓冲液中，测定K336M和FAD-GDH酶活与pH关系并进行比较，结果如图4所示，毕赤酵母表达的K336M在pH值为7-8时酶活较好，最适pH值为8.0，野生型FAD-GDH在pH值为6-8时酶活力较好，最适pH值为6.0。

3.最适反应温度测定

在不同温度条件下测定酶活并比较，比较K336M和FAD-GDH的酶活与温度的关系，结果如图5所示。在反应温度较低时，FAD-GDH和K336M的酶活随着反应温度的升高而提高，前者最适反应温度为55℃，后者最适反应温度为45℃，两者随温度继续升高酶活降低。但K366M降低幅度更大，说明突变后K336M对温度的耐受减弱。

4.pH值稳定性

将K336M与FAD-GDH分别置于不同pH值的缓冲液中，在室温下放置1h，然后测定其残余的酶活，以此考察不同pH值对酶活的影响。结果如图6所示，毕赤酵母表达的FAD-GDH和K336M具有相似的稳定pH值范围，说明突变对K336M的pH稳定性影响较小。

5.热稳定性

将K336M与FAD-GDH置于62℃条件下，检测不同时间下残余的酶活。结果如图7所示，可以看出毕赤酵母表达的K336M和FAD-GDH均具有较好的热稳定性，K336M酶活的半衰期大约为30min，FAD-GDH的热稳定性半衰期大约为50min。

6.酶促反应动力学性质

对K336M和FAD-GDH野生型用不同浓度的底物进行酶活测定，用Graph-Pad Prism7软件计算，可以得到相应的Km和Vmax值。对于毕赤酵母表达的K336M，其Km值为94.65±4.47mM，低于FAD-GDH的Km值97.53±3.28mM；其最大反应速率Vmax为1403±29U/mg，高于FAD-GDH的最大反应速率Vmax值1522±31U/mg。

实施例7：用于葡萄糖测定的组合物

本实施例提供一种用于葡萄糖测定的组合物，含有实施例4中纯化得到的葡萄糖脱氢酶变体K336M，该组合物可用于制备血糖试纸或葡萄糖传感器。

SEQUENCE LISTING

<110> 遵义医科大学珠海校区

<120> 一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asn Ser Thr Ser Ala Lys Tyr Asp Tyr Ile Val Ile Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gly Leu Ala Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Asp Pro Ser

20 25 30

Val Asn Val Leu Ile Leu Glu Ala Gly Gly Ser Val Trp Asn Asn Pro

35 40 45

Asn Val Thr Asn Val Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Ser Asp Ile

50 55 60

Asp Trp Gln Tyr Gln Ser Val Asn Gln Pro Tyr Gly Gly Asn Val Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Asn

85 90 95

Gly Met Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Ala Trp Glu

100 105 110

Thr Ile Gly Asn Thr Gly Trp Thr Trp Lys Asn Leu Phe Pro Tyr Tyr

115 120 125

Arg Lys Ser Glu Asn Phe Thr Val Pro Thr Lys Ser Gln Thr Ser Leu

130 135 140

Gly Ala Ser Tyr Glu Ala Gly Ala His Gly His Glu Gly Pro Leu Asp

145 150 155 160

Val Ala Phe Thr Gln Ile Glu Ser Asn Asn Leu Thr Thr Tyr Leu Asn

165 170 175

Arg Thr Phe Gln Gly Met Gly Leu Pro Trp Thr Glu Asp Val Asn Gly

180 185 190

Gly Lys Met Arg Gly Phe Asn Leu Tyr Pro Ser Thr Val Asn Leu Glu

195 200 205

Glu Tyr Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Trp Pro Tyr Lys

210 215 220

Ser Arg Pro Asn Leu His Val Leu Leu Asn Thr Phe Ala Asn Arg Ile

225 230 235 240

Val Trp Asp Gly Glu Ala Arg Asp Gly Asp Ile Thr Ala Ser Gly Val

245 250 255

Glu Ile Thr Ser Arg Asn Gly Thr Val Arg Val Ile Asn Ala Glu Lys

260 265 270

Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Lys Ser Pro Ala Ile Leu Glu

275 280 285

Leu Ser Gly Ile Gly Asn Pro Ser Val Leu Asp Lys Tyr Asn Ile Pro

290 295 300

Val Lys Val Asn Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln Val

305 310 315 320

Asn Ser His Met Asp Ala Ser Gly Asn Thr Ser Ile Ser Gly Thr Lys

325 330 335

Ala Val Ser Tyr Pro Asp Val Tyr Asp Val Phe Gly Asp Glu Ala Glu

340 345 350

Ser Val Ala Lys Gln Ile Arg Ala Asn Leu Lys Gln Tyr Ala Ala Asp

355 360 365

Thr Ala Lys Ala Asn Gly Asn Ile Met Lys Ala Ala Asp Leu Glu Arg

370 375 380

Leu Phe Glu Val Gln Tyr Asp Leu Ile Phe Lys Gly Arg Val Pro Ile

385 390 395 400

Ala Glu Val Leu Asn Tyr Pro Gly Ser Ala Thr Ser Val Phe Ala Glu

405 410 415

Phe Trp Ala Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Ser Val His Ile Gly Ser

420 425 430

Ser Asn Pro Ala Glu Phe Pro Val Ile Asn Pro Asn Tyr Phe Met Leu

435 440 445

Asp Trp Asp Ala Lys Ser Tyr Val Ala Val Ala Lys Tyr Ile Arg Arg

450 455 460

Ser Phe Glu Ser Tyr Pro Leu Ser Ser Ile Val Lys Glu Ser Thr Pro

465 470 475 480

Gly Tyr Asp Val Ile Pro Arg Asn Ala Ser Glu Gln Ser Trp Lys Glu

485 490 495

Trp Val Phe Asp Lys Asn Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val Gly Thr

500 505 510

Ala Ala Met Met Pro Arg Glu Ile Gly Gly Val Val Asp Glu Arg Leu

515 520 525

Asn Val Tyr Gly Thr Thr Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu

530 535 540

Pro Phe Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala Val Ala

545 550 555 560

Glu Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Ala Asp Ala Gly Arg Arg

565 570

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctctcgagaa aagagaggct gaagcttcac acaggaaaca gaccatg 47

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaacagtca tgtctaaggc gaattacatc cgccaaaaca gccaagc 47

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(22)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 4

tacttcaatt tcaggaaccn nngcagtgtc ctaccc 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(17)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 5

gggtaggaca ctgcnnnggt tcctgaaatt gaagta 36

Claims

1.一种葡萄糖脱氢酶变体，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖脱氢酶中第336位氨基酸置换成其他氨基酸，所述其他氨基酸选自除赖氨酸以外的任意一种天然氨基酸。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶变体，其特征在于，所述第336位氨基酸置换成丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或酪氨酸。

3.根据权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶变体，其特征在于，所述第336位氨基酸置换成甲硫氨酸或谷氨酰胺。

4.根据权利要求3所述的葡萄糖脱氢酶变体，其特征在于，所述第336位氨基酸置换成甲硫氨酸。

5.一种用于葡萄糖测定的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4中任一项所述的葡萄糖脱氢酶变体。

6.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶变体。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求6所述的核苷酸序列。

8.一种转化体，其特征在于，所述转化体由权利要求6所述的核苷酸序列或权利要求7所述的重组载体转化得到。

9.权利要求1-4中任一项所述的葡萄糖脱氢酶变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)将所述突变质粒进行线性化处理，并转化至宿主细胞中；

10.权利要求1-4中任一项所述的葡萄糖脱氢酶变体在制备血糖试纸或葡萄糖传感器中的应用。