JP2017523792A - 3アルファ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体およびウルソデオキシコール酸調製のためのプロセス - Google Patents
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Abstract
Description
DHCAの3位の立体特異的還元によるUDCAの酵素的もしくは微生物的調製のためになおさらに有利に使用され得、かつ特に、基質および/または補因子について改善された活性を有し、および/または基質阻害が低減され、および/または補因子利用が改変された(特異性が増大、改変されるか、または依存性が拡張された)酵素変異体を提供することを意図したものである。
本発明は特に、以下の具体的な実施形態に関する:
1. 3−ケトステロイドの対応する3−ヒドロキシステロイドへの(例えば、3,12−ジケト−7β−CAまたはDHCAの、12−ケト−UDCAまたは7,12−ジケト−3α−CA(7,12−ジケト−LCA)への、特にNADHおよび/またはNADPH、とりわけNADHの化学量論的消費下での)少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−HSDH)であって、これにおいて該酵素が、配列番号4の位置34および/または68において、あるいは、配列番号4に対し少なくとも80%の配列同一性、例えば少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%などの配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列の対応する配列位置において、変異を含み;および/またはC−末端に25個までの、特に15、14、13、12、11、または10個までの同じか若しくは異なる(タンパク質構成)アミノ酸基による、とりわけ1〜10個、例えば3〜9個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、または特にヒスチジン(例えば3xHis、6xHis、または9xHis)による鎖延長を含み;ヒスチジン残基は、C−末端に直接、または任意の1〜10個、特に1〜3個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である、上記酵素。例として挙げ得るのは:LEHHH、LEHHHHHH、およびLEHHHHHHHHHである。主題はさらに、上記の変異体の1つ以上に加えて、またはそれに代わるものとして、25個までの同じかまたは異なるアミノ酸基によるN−末端鎖伸長を含む3α−HSDHである。これらは、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10個の同じかまたは異なる(タンパク質構成)アミノ酸残基により、特に1〜10個、例えば3〜9個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、または特にヒスチジン(例えば3xHis、6xHis、または9xHis)により延長され;ヒスチジン残基は、N−末端に直接、または任意の1〜10個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である。例として挙げ得るのは:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH−である。
a. R34X1および/若しくは
b. L68X2
[式中、X1は、アルギニン(R)以外のアミノ酸基、特にタンパク質構成アミノ酸基、とりわけ任意の比活性を増大し、および/または基質阻害を低減し、および/または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸を表し;かつ
X2は、ロイシン(L)以外のタンパク質構成アミノ酸基、特に任意の比活性を増大し、および/または基質阻害を低減し、および/または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、とりわけ天然アミノ酸を表す];
c) 1〜10個のヒスチジン(H)残基を含む鎖によりC−末端が延長される付加変異体であり;例えばヒスチジン残基は、C末端に直接、または1〜10個、とりわけ1〜3個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である;
d) 1〜10個のヒスチジン(H)残基によりN−末端が延長される付加変異体であり;例えばヒスチジン残基は、N末端に直接、または1〜10個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である;
を含む単一または多重変異から選択され、
変異した、すなわち改変されたアミノ酸配列が、配列番号4に対し80%〜100%未満の、例えば85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%の配列同一性を有する、上記酵素。
R34X1および
L68X2および
b) 二重変異体
R34X1/L68X2
[式中、X1はN、C、S、またはLを表し;
X2は、A、G、C、K、S、またはVを表し、
これにおいて特に好ましいX1、X2の組合せは;X1=Nおよび/またはX2=Aを含む]
c) 1〜10個のヒスチジン残基を含むペプチド鎖によりC−末端が延長される付加変異体であり;例えばヒスチジン残基は、C−末端に直接、または1〜10個、特に1〜3個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である;
d) 1〜10個のヒスチジン残基を含むペプチド鎖によりN−末端が延長される付加変異体であり;例えばヒスチジン残基は、N−末端に直接、または1〜10個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である;および
e) a)および/またはb)による変異体であって、いずれの場合もc)および/またはd)による、特にc)またはd)による付加変異をさらに含む該変異体、
から選択される、前記3α−HSDH。
以下を含む単一変異体:[R34N]、[R34C]、[R34S]、[R34L]、[L68A]、[I68C]、[L68K]、[L68S]、[L68V]、および[L68G]、
以下を含む二重変異体:[R34N/L68A]
であり、いずれの場合も、Hisタグなしと、C−末端および/またはN−末端Hisタグありとの双方がある。
b. DHCAによる基質阻害の低減、例えば、>10mMからの範囲、例えば11〜200mM、12〜150mM、15〜100mMにKi値をもつこと、
c. これらの特性a)およびb)が、個別に、または任意の組合せ、すなわち、a)のみ、b)のみ、c)のみ、a)とb)、a)とc)、またはb)とc)で存在可能なこと、
a) P185X1および/若しくは
b) T188X3
並びに任意でさらに、
c) L68X2
[式中、X1は、プロリン(P)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表し;
X2は、ロイシン(L)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表し;
X3は、スレオニン(T)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表す];
d) 任意でさらに、1〜10個のヒスチジン(H)残基を含むC−末端伸長をもつこと;および/若しくは任意でさらに、1〜10個のヒスチジン(H)残基を含むN−末端伸長をもつこと、
を含む単一または多重変異から選択され、
これにおいて、変異した、すなわち改変されたアミノ酸配列が、配列番号4に対し80%〜100%未満の、例えば85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%の配列同一性を有する、3α−HSDH。
P185X1
T188X3
b) 二重変異体
P185X1/T188X3;
L68X2/T188X3;
L68X2/T185X1;
[式中、X1はA、T、S、G、またはV,特にAを表し;
X2は、A、G、C、K、S、またはV、特にAを表し;かつ
X3は、A、G、W、S、またはV、特にAまたはSを表す]
c) 任意でさらに、1〜10個のヒスチジン残基を含むC−末端伸長をもつもの、例えばヒスチジン残基が、C末端に直接、または1〜10個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能であるもの;
および;および/または
d) 任意でさらに、1〜10個のヒスチジン残基を含むN−末端伸長をもつもの、例えばヒスチジン残基が、N末端に直接、または1〜10個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能であるもの;
および
e) a)およびb)による変異であって、いずれの場合もc)および/またはd)による、とりわけc)またはd)による付加変異をさらに含むもの、
から選択される、上記実施形態5および6の1つによる3α−HSDH。
以下を含む単一変異体:[T188A]、[T188S]、[T188G]、[T188V]、[T188W]、[P185A]、[P185T]、[P185S]、[P185G]、[P185V]、P185A],
以下を含む二重変異体:[L68A/T188A]および[L68A/T188S]、
であり、
いずれの場合も、Hisタグなしと、C−末端および/またはN−末端Hisタグありとの双方がある。
a. デヒドロコール酸(DHCA)についての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における増大された比活性(Vmax[U/mg])であって;これにおいて、例えば、未変異酵素に比較して、補因子NADHの存在下での比活性(U/mg)が少なくとも1、5、10、50、または100%まで、しかし特に少なくとも1倍、とりわけ2〜100倍、または3〜20倍、または5〜10倍増大されること、
b. DHCAによる基質阻害の低減、例えば、>10mMから、例えば11〜200mM、12〜150mM、15〜100mMの範囲のKi値をもつこと、
c. NADHについての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における増大された比活性(Vmax[U/mg])であって;これにおいて、例えば、未変異酵素に比較して、DHCAの存在下での比活性(U/mg)が少なくとも1、5、10、50、または100%まで、しかし特に少なくとも1倍、とりわけ2〜100倍、または3〜20倍、または5〜10倍増大されること、
を示し、
これらの特性a)〜c)が、個別に、または任意の組合せ、すなわち、a)のみ、b)のみ、c)のみ、a)とb)、a)とc)、またはb)とc)で存在可能である、
実施形態5〜7の1つによる3α−HSDH。
挙げられ得る例は、以下の核酸配列:
a) GDHと、実施形態1〜8の1つによる3α−HSDH変異体と、および任意で7β−HSDHとを同時にコードする核酸配列、
b) GDHと、実施形態1〜8の1つによる3α−HSDH変異体と、および任意で7β−HSDHを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、
から選択される核酸配列であり、
これにおいて、コーディング配列は、互いに独立して、構成物中に単独で、または重複して、例えば2、3、4、5、または6〜10コピーなどで存在し得る。したがって、個々の発現産物の活性に存在するいずれの差異も、適切なコピー数を選択することにより補償され得る。
デヒドロゲナーゼが、NADPH再生酵素、例えばNADPHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、およびNADPH−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、およびまたグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G−6−PDH)、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)か、あるいはNADH再生酵素、例えばNADHデヒドロゲナーゼ、NADH−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、NADH再生グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)、NADH再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)、およびNADH再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)から選択される、実施形態13による組換え微生物。
a) 双方の生体触媒は、互いに別個に、遺伝的に改変されかつ最適化され得る。特に、NADHまたはNADPHの再生のいずれかに対し最適化された、種々の補因子再生酵素の使用が可能である。
b) 生体触媒を、異なる割合で生体触媒反応に用いることが可能である。これにより、たとえ全ての生体触媒が既に調製された後であっても、生体触媒作用中の多酵素プロセスの個々の反応速度を保証できる。
a. ギ酸のCO2への少なくとも酵素的酸化を触媒する、NAD+依存性FDHの変異体を含むFDHであり、これにおいて該変異体が、未変異酵素に比較して、補因子としてさらにNADP+を受容する、該FDH;および
b. GDH
から選択される、実施形態19によるプロセス。
のウルソデオキシコール酸(UDCA)の調製のためのプロセスであって、これにおいて、
a) 任意に、式(2):
b)DHCAは、請求項1〜8の1つにおける定義による少なくとも1つの3α−HSDH変異体(単離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物により発現される)の存在下に、および少なくとも1つの7β−HSDH(単離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物により発現される)の存在下に、対応する式(5):
の12−ケト−ウルソデオキシコール酸(12−ケト−UDCA)へ還元され、その後
c)式(5)の12−ケト−UDCAがUDCAへ化学的に還元され;そして
d)任意で、反応産物がさらに精製される、上記プロセス。
のUDCAの調製のためのプロセスであって、これにおいて、
a)任意に、式(2):
b)DHCAは、少なくとも1つの7β−HSDHの存在下、および少なくとも1つの3α−HSDHの存在下に、式(5):
の対応する12−ケト−UDCAへ還元され、その後
c)式(5)の12−ケト−UDCAがUDCAへ化学的に還元され;そして
d)任意で、反応産物がさらに精製され;
ここで、工程b)の変換が、実施形態12〜15の1つによる組換え微生物の存在下、例えば実施形態12〜15の1つによる1以上の異なる組換え微生物のホールセルの存在下に行われ、これにおいて、微生物が変換および補因子再生に必要な酵素を本明細書に詳述された方法で含む、上記プロセス。
1.一般的な定義および用いた略語
別に指定しない限り、用語「7β−HSDH」は、DHCAまたは7,12−ジケト−3α−CA(7,12−ジケト−LCA)の3,12−ジケト−7β−CAまたは12−ケト−UDCAへの、特にNADPHの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的および/または位置特異的な還元、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。本発明との関連においては、該酵素は、天然かまたは組換えにより産生される酵素であってよい。酵素は原則的に、細胞性不純物、例えばタンパク質不純物との混合物として存在してもよいが、しかし純粋な形態で存在することが好ましい。適切な検出法は、例えば以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である(例えば、Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982)。この活性をもつ酵素は、EC番号1.1.1.201に分類される。適切な酵素は、例えばColinsellea aerofaciensから単離され得る。
本発明は、7β−HSDH、FDH、GDH、または3α−HSDH活性をもつ具体的に開示されたタンパク質または酵素、および/またはそれらの変異体に限定されず、むしろそれらの機能的等価物にも及ぶ。
a)分子量(SDSゲル電気泳動):約28〜32kDa、特に約29〜31kDa、または約30kDa;
b)分子量(未変性条件下、例えば特にSDSなしでのゲル濾過):約53〜60kDa、特に約55〜57kDa、例えば56.1kDa。このことは、Collinsella aerofaciens DSM 3979 7β−HSDHの二量体の性質を立証する;
c)7−ケト−LCAの7−カルボニル基の7β−ヒドロキシ基への立体選択的還元;
d)pH8.5〜10.5、特に9〜10の範囲における、UDCAの酸化のための最適pH;
e)pH3.5〜6.5、特にpH4〜6の範囲における、DHCAおよび7−ケト−LCAの還元のための最適pH;
f)以下の表からの、そこに列記された少なくとも1つの基質/補因子についての、少なくとも1つの動的パラメータ;以下の表において、いずれの場合も具体的に挙げた値から±20%、特に±10%、±5%、±3%、±2%、または±1%の付近の範囲。
a. 7−ケトステロイドを、対応する7β−ヒドロキシステロイドへ立体特異的に還元すること;および/または
b. 7位にケト基を、および少なくとも1つのさらなるケト基をステロイド骨格上に含むケトステロイドを、対応する7β−ヒドロキシステロイドを生じるべく、例えば特に、デヒドロコール酸(DHCA)を、対応する3,12−ジケト−7β−コール酸を生じるべく、7位において、位置特異的にヒドロキシル化すること、触媒作用を及ぼすこと、および、例えばNADPH依存性であること、
によって特徴づけられる。
3.1 核酸
本発明はまた、7β−HSDH、FDH、GDH、および/または3α−HSDH活性をもつ酵素、及びその変異体をコードする、核酸配列も対象とする。
マルチプルアラインメントパラメータ:
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップエクステンションペナルティ 10
ギャップセパレーションペナルティ範囲 8
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アラインメント遅延のための%同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け 0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
k−tupleサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
ベストダイアゴナル数 5
に従い、かつ以下のパラメータを用いて決定し得る:
DNAギャップオープンペナルティ 15.0
DNAギャップエクステンションペナルティ 6.66
DNAマトリック アイデンティティ
タンパク質ギャップオープンペナルティ 10.0
タンパク質ギャップエクステンションペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP −1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
−遺伝子の単一または数個のヌクレオチドが特異的に置換される、部位特異的突然変異誘発(Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
−遺伝子の任意の所望の位置において任意の所望のアミノ酸のためのコドンが置換または付加される、飽和突然変異(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
−不適切に動作するDNAポリメラーゼによりヌクレオチド配列が変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739)、
−例えば、欠陥のあるDNA修復メカニズムのためヌクレオチド配列の変異率の増加が起こる、突然変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、または
−密に関連した遺伝子のプールが形成され消化されて、フラグメントがポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、これにおいて最終的に完全長のモザイク遺伝子が、反復する鎖分離および再アニーリングにより産生される、DNAシャフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
本発明の対象はさらに、調節核酸配列の遺伝子制御下に、本発明の少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、発現構築物;およびこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターである。
状況に応じて、用語「微生物」は、出発(野生型)微生物、もしくは遺伝的に改変された組換え微生物、または双方を意味するものと理解される。
第1工程:CAのDHCAへの化学的変換
CAのヒドロキシル基は、クロム酸または酸性溶液(例えばH2SO4)中のクロム酸塩を用いて、従来の化学的経路により、それ自体が公知の方法でカルボニル基へ酸化される。この結果としてDHCAを生じる。
DHCAは水溶液中で、3α−HSDHおよび7β−HSDHまたはそれらの変異体により、NADPHまたはNADHの存在下に特異的に還元されて、12−ケト−UDCAを生じる。補因子NADPHまたはNADHは、ADHまたはFDHまたはGDHまたはそれらの変異体により、それぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースから再生され得る。反応は穏やかな条件下で進行する。例えば、反応はpH=6〜9、特に約pH=8において、また約10〜30、15〜25、または約23℃において行なわれ得る。
12−ケト−UDCAの12−カルボニル基は、Wolff−Kischner還元により、それ自体公知の方法で除去され、これにより12−ケト−UDCAからUDCAが産生される。この反応において、カルボニルがまずヒドラジンと反応して、ヒドラゾンを生じる。その後ヒドラゾンは、塩基(例えばKOH)の存在下で200℃に加熱され;このプロセスの間に窒素が除去されてUDCAを生じる。
本発明の対象はさらに、本発明のポリペプチド、またはその機能的、生物学的な活性フラグメントの組換え体産生のための方法であり、これにおいて、ポリペプチド産生微生物が培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘導され、そしてポリペプチドが培養物から単離される。所望であれば、ポリペプチドはまたこの方法で、工業規模でも製造され得る。
本明細書に記載の方法において、本発明の酵素は遊離で、または固定された形態で使用されてもよい。固定された酵素とは、不活性な担体上に固定された酵素を意味するものと理解される。適当な担体材料、およびその上に固定された酵素は、EP−A−1149849、EP−A−1 069 183およびDE−OS 100193773から、およびそれらに引用された参考文献から公知である。これに関し、これらの文書の開示は、その記載全体が参照される。適当な担体材料は、例えば粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換物質、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。担体材料は、通常、担持された酵素の調製のために、微粉化された粒子の形態で使用され、多孔性の形態であることが好ましい。担体材料の粒径は、通常、5mm以下、とりわけ2mm以下である(粒度曲線)。同様に、デヒドロゲナーゼをホールセル触媒として使って、遊離または固定された形態を選択してもよい。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウム、およびカラギーナンである。酵素、およびまた細胞も、グルタールアルデヒドを用いて直接架橋され得る(CLEAへの架橋)。対応する、およびさらなる固定化プロセスは、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim に記載されている。
別段の定めがない限り、本発明の範囲内で行なわれるクローニング工程、例えば制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNAフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の移行、DNAフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、及び組換えDNAの配列分析は、Sambrook et al. (1989)に記載されたように行われ得る。
材料:
Collinsella aerofaciens DSM 3979(ATCC 25986、以前の名称Eubacterium aerofaciens)のゲノムDNAは、Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) から入手した。
C.testosteroniのゲノムDNAは、Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) から入手可能であり、あるいはC.testosteroni株からそれ自体公知の方法を用いて単離され得る。
培地1リットル当たりトリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10gを含む、LB培地
培地1リットル当たりトリプトン12g、酵母抽出物24g、グリセロール4ml、10%KPi緩衝液(11.55gKH2PO4、62.7gK2HPO4、全量をH2Oで500mlとする)を含む、TB培地
Wilms et al., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2001 VOL. 73, NO. 2, 95-103に従って改変された、最少培地
図2は、野生型7β−HSDH酵素および変異体のアミノ酸配列を示す;しかしながらいずれの場合もすべてC−末端にヘキサヒスチジンタグが与えられている。この方法で、全ての酵素が単離されかつ特性評価された。
A)プラスミド形質転換:
市販の発現ベクターpET28a(+)は、制限酵素Ncol/Eco311およびXholの切断部位を介してそれぞれの3α−HSDH遺伝子がその中へクローニングされており、これを組換え3α−HSDH酵素(野生型および変異酵素)の発現に使用した。発現ベクターpET28a(+)は、HSDH遺伝子をクローニングする場合、連続した6個のヒスチジン分子をコードする遺伝子配列を、直接HSDHに結合可能である。発現後、この配列(ヘキサヒスチジンタグまたはHis−tagと称される)は、HSDHタンパク質のC−末端に現れる。元の、または野生型のHSDH遺伝子は、細菌Comamonas testosteroniに起源し、それぞれの3α−HSDH遺伝子を含むプラスミドはpET28a(+) 3α−HSDHと称される。pET28a(+) 3α−HSDHプラスミドを形質転換するためには、5μgのライゲーション混合物を100μlのコンピテントBL21(DE3)Δ7α−HSDH大腸菌細胞で処理し、Hanahan(J. Mol. Biol. (1983), vol. 166, pp. 557)により記載されたように形質転換を実施し、同じ工程を野生型遺伝子を含むプラスミドで、および変異したHSDH遺伝子を含むプラスミドで実施した。大腸菌株BL21(DE3)Δ7α−HSDHは、このような状況下では常用されており、この株では7α−HSDHの遺伝子が欠失されていることで識別される。この研究に使用した大腸菌株の正確な特性評価は、表1に準じる。
発現には、発現構築物(pET28a(+) 3α−HSDHプラスミド)を含む大腸菌株を、50μg/mlのカナマイシンを含むLB培地(リットル当たりトリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g)中で、25℃で20時間増殖させた。細胞を遠心分離(5000xg、30分間、4℃)により収穫した。
ペレットを破砕緩衝液(10mM イミダゾール、50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)中に再懸濁し、細胞1g(湿質量)当たり4mlの緩衝液を添加した。細胞を次に、Sonopuls HD2070ソニケータ(Bandelin, Berlin, Germany)を用いて、一定に冷却しながら1分間(出力30W、ワーキングインタバル50%、および1分間ブレイク)の音波処理により破砕した。破砕を3回反復した。細胞懸濁液を遠心分離し(18000xg、30分間、4℃)、上清が無細胞粗抽出物を称された。
Hisタグは、この配列が特定のクロマトグラフ材料(2価のニッケルイオンが担持された、NTA(Ni−ニトリロトリアセテート)修飾担体材料、例えば「His Pur Ni−NTA」(Nimagen B. V., Nijmegen, The Netherlands))により、高い特異性をもって結合されることから、HSDHタンパク質の非常に簡単な精製を可能にする。この目的を達成するため、この材料を含む予め破砕緩衝液(3〜5カラム体積)で平衡化された滴下カラムに、無細胞粗抽出物をアプライした。弱く結合しているタンパク質を、3〜5カラム体積の洗浄緩衝液(20mM イミダゾール、50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)を用いて洗浄することにより除去した。Hisタグ−3α−HSDHタンパク質を、イミダゾールを含有する溶離緩衝液(250mM イミダゾール、50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)で溶出した。このプロセスは室温で行なった。存在していたイミダゾールは、緩衝液交換により除去された。
3α−HSDHおよび変異体の活性は、光度アッセイを用いて測定し、これにおいて340nmにおける吸収の低下を30秒間にわたり測定した。反応溶液は、全体積1ml中に:874μlの50mM リン酸カリウム(KPi)緩衝液、pH8.0;100μlの100mM デヒドロコール酸(DHCA)溶液(50mM KPi、pH8.0中に溶解されたDHCA);10μlの酵素溶液(任意に希釈);16μlの12.5mM NADPH溶液(蒸留水中に溶解)を含んでいた。以下において、活性は単位(U)で特定され、1Uは1μMolのNADH/minの減少に対応する。
A)プライマー:
表2において特定された突然変異誘発プライマーを用いて、3α−HSDHの位置特異的突然変異誘発を実施した。3α−HSDHの遺伝子配列に基づき、プライマーを、それらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
以下のプライマーを変異体の産生に使用した:
標的化されたアミノ酸交換は、「QuikChange(登録商標)PCR」法を用いて達成され得る。この目的を達成するため、以下のPCR反応を実施した(反応混合物は表3参照):まず、95℃で2分間の最初の変性工程を行い、その後20サイクルの、変性(95℃で30秒間)、プライマーハイブリダイゼーション(60〜68℃で1分間)、および伸長(68℃で11分間)を実施した。行なわれた最後の工程は、68℃で10分間の最終伸長であり、その後、4℃に冷却することによりポリメラーゼ連鎖反応を終了した。用いた鋳型は、3α−HSDH(野生型)をもつpET28aベクターであった。
位置34において突然変異誘発された変異体の活性測定(実施例1参照)は、以下の表4に示したデータを示した。
以下のテキストは、位置68のアスパラギン酸がいくつかの別のアミノ酸と交換された3α−HSDH変異体を記載する。有利な変異体は、ミカエリス−メンテン動力学によりパラメータKMおよびVmaxを測定することにより、それらの動力学によって詳細に特徴評価される。変異体と野生型酵素との比較を可能にするため、野生型酵素を前述と同様に精製して、その動力学の面で特性評価した。
変異体の改変を動力学定数について明確に立証するため、野生型酵素を精製して、以下のテキストにおいて特徴評価した。
表6に列記された突然変異誘発プライマーを、3α−HSDHの位置特異的突然変異誘発に使用した。3α−HSDHの遺伝子配列に基づき、プライマーを、それらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
位置68におけるアスパラギン酸の標的化された交換は、QuikChange(登録商標)PCRにより、実施例2Bに記載されたように実施した。
位置68において突然変異誘発された変異体の光度活性測定(実施例1参照)は、以下の表7に列記されたデータを示した。
最良の変異体(3α−HSDH[L68A])を精製し(1D参照)、その動力学パラメータVmaxおよびKMを測定した。図4は、動力学の経過のダイヤグラムを示し、それから導き出された動力学が表8に列記されている。
実施例2および3に記載された個々の変異体の他に、突然変異を有利に組み合わせることも可能である。例として、位置34および68が同時に改変された二重変異体が産生された。ここで、位置34における最良のアミノ酸交換([R34N])が、位置68における最良の交換([L68A])と組合わされた。
二重変異体を得る方法、および活性試験は、実施例2Bおよび2Cに記載されたような方法に従った。表9は、粗抽出物中の二重変異体の活性を野生型酵素の活性と比較してまとめたものである。
異種発現の発現性能を評価できるようにするため、SDS−PAGEを行った。図5は、変異体3α−HSDH[R34N/L68A]および[L68A]のSDSゲルを示す。変異体のサイズは約27.4kDaであった。図は、3α−HSDHが、SDSゲルではそのサイズに応じて移動しないことを示している。それは常に、マーカーの25kDaバンドの幾分下に移動する。
変異体3α−HSDH[R34N/L68A]を精製し、精製された酵素について動力学パラメータVmaxおよびKMを測定した。図6は、ミカエリス−メンテン動力学のダイヤグラムを示す。
表10は、ミカエリス−メンテン動力学に基づき確立された二重変異体について活性値をまとめたものである。
それぞれの変異体の経過のダイヤグラムを、図7に示したように野生型と比較した。ここでは、Hisタグで既に改変された野生型酵素を比較のために使用した。単一変異体(L68A)は、改善された活性(DHCAで)を示す一方で、過剰基質阻害がわずかにより顕著であることが明らかである。2つの位置の組合せは、結果として、低い基質濃度(DHCA)では完全に野生型のような活性があるわけではない変異体を生じたが、二重変異体は、高い基質濃度、すなわち適用するのに重要な範囲では、野生型酵素よりも著しく高い活性をもつ。
野生型酵素の活性をHisタグがあるなしで比較した場合、活性が明らかに互いに異なることが注目された。差異はさらに、ミカエリス−メンテン動力学の比較において明らかとなった(図8)。表11は、KMおよびVmax値の比較概要を示す。Hisタグなしの酵素の精製は非常に困難であることから、比較は、未精製酵素(粗抽出物)について記録した。しかしながら、動力学の相対的な経過、およびそれ故Hisタグの影響についての所見が、精製された酵素を用いる場合に変化することは予想されていない。
Hisタグがあるなしの野生型酵素の活性を比較した場合、活性が明らかに互いに異なることが注目された。6xHisタグの影響をさらに明らかに証明するため、C−末端に3xHisタグをもつ、および9xHisタグをもつ3α−HSDH変異体を、Quick−Change(登録商標)PCRにより産生した。発現(25℃、0.5mM IPTG、20時間)の後、タンパク質を精製し、発現および精製をSDSゲルにより調べた。添付の図9はSDSゲルを示し、以下の表12は種々の変異体の動力学定数を示す。
A)プライマー:
表13において特定された突然変異誘発プライマーを、3α−HSDHの位置特異的突然変異誘発に使用した。3α−HSDHの遺伝子配列に基づき、プライマーをそれらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
標的化されたアミノ酸基交換は、実施例2Bと同様に実施した。この目的を達成するため、N−末端ヘキサヒスチジンダグをもつプラスミドpET28a(+)3α−HSDH(N−His)中の、およびまたC−末端ヘキサヒスチジンタグをもつプラスミドpET28a(+)3α−HSDH(C−His)中の、3α−HSDHの野生型遺伝子を、Quik−Change(登録商標)PCRにより改変して、以下の表14および15に示した変異体が産生されるようにした。
N−末端ヘキサヒスチジンタグをもつT188A、T188S、T188G、P185A、L68A、T188S/L68A、T188A/L68A、P185A/T188A、およびC−末端ヘキサヒスチジンタグをもつT188A、L68Aであった。
0.5mM DHCAにおいて最高の比活性に達した後、活性はなお再び低下し始めることが明らかになる。野生型と同様、酵素は著しい過剰基質阻害を特徴とする。約4.5mMのDHCAにおいて、タンパク質はなお約50%の、また20mMにおいて約20%の残留活性を有する。漸近的経過が成立する。
0.5mMの基質濃度における最大比活性に続き、過剰基質阻害が観察される。20mM DHCAの基質濃度において、酵素は20%を超える残留活性をここで保持する。
ここでは、何ら顕著な過剰基質阻害は観察されない。しかしながら、他の酵素変異体に比較して、活性は相対的に低く(約10%)、最大活性は25U/mgにおいて達成される。高い基質濃度(>5mM)では、活性はこれまでに記載された他の変異体とほぼ等しい。動力学定数は、経過ダイヤグラムを用いて測定した。
再度、0.25mMのDHCA基質濃度において最大比活性が達成された後、著しい過剰基質阻害が観察された。10mMの基質濃度において、残留活性はなお5%である。
[Hwang et al., 2013] により同定された、上記記載の位置T188およびP185に加えて、3α−HSDH L68Aが比較を目的として産生された。他の2つとは対照的に、位置68はタンパク質のN−末端領域にある。3つの位置は全て、これらのアミノ酸が補酵素とリンケージを形成するという事実を共有しており、このことが、何故この変異体もまたN−末端Hisタグを用いて産生されたか、かつ生化学的特徴評価に含まれたのかの理由である。この目的を達成するため、プラスミドpET28a(+)3α−HSDH(N−His)を、Quick−Change(登録商標)PCRにより改変して、所望の変異体が産生されるようにした。培養および発現の後、タンパク質をNi−NTAクロマトグラフィーにより精製し、比活性を測定して動力学定数を決定した。再度、DHCA基質濃度を10μM〜10mMの間で変化させ、その間のNADH濃度は一定して0.2mMであった。
基質濃度0.5mM DHCAにおいて最大比活性に達した後、あまり顕著ではない過剰基質阻害が観察された。基質濃度1mMでは、残留活性はなお約85%であり、10mMではなお20%を超えた。これは、比較すれば2つの単一変異体の場合よりも多い。
0.5mMにおいて最大比活性に達した後、活性の低下が観察された。これは顕著な過剰基質阻害に帰すことができる。曲線の経過は対応する単一変異体のものと同様である。基質濃度10mMでは、約20%の残留活性がなお観察される。
基質濃度0.5mM DHCAにおいて最大比活性に達した後、過剰基質阻害が観察された。基質濃度10mMでは、酵素の残留活性はなお約30%である。全体に、曲線の経過および基質阻害は、対応する単一変異体の場合よりも低くさほど顕著ではないが、活性は著しく低い。
変異体の光度活性測定(実施例1に類似)、およびその動力学定数は、以下の表14および15に編集される。
Claims (24)
- 3−ケトステロイドの対応する3−ヒドロキシステロイドへの、特にNADHの化学量論的消費下での、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−HSDH)であって、これにおいて該酵素が、配列番号4の位置34および/または68において、あるいは配列番号4に対し少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列の対応する配列位置において変異を含み;および/またはC−末端に15個までの同じか若しくは異なるアミノ酸基による鎖延長を有し、および/またはN−末端に25個までの同じか若しくは異なるアミノ酸基による鎖延長を有する、該3α−HSDH。
- 3−ケトステロイドの対応する3−ヒドロキシステロイドへの、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒し、かつ配列番号4におけるアミノ酸変異により改変されるアミノ酸配列を有する3α−HSDHであって、アミノ酸配列変異が:
a) R34X1および/若しくは
b) L68X2
[式中、X1は、アルギニン(R)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表し;かつ
X2は、ロイシン(L)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表す];
c) 1〜10個のヒスチジン(H)基を含むC−末端伸長;
d) 1〜10個のヒスチジン(H)基を含むN−末端伸長、
を含む単一または多重変異から選択される、3α−HSDH。 - a) 単一変異体
R34X1および
L68X2および
b) 二重変異体
R34X1/L68X2
[式中、X1はN、C、S、またはLを表し;
X2は、A、G、C、K、S、またはVを表す]
c) 1〜10個のヒスチジン基を含む基によりC−末端が延長された付加変異体;
d) 1〜10個のヒスチジン基を含む基によりN−末端が延長された付加変異体;および
e) a)および/またはb)による変異体であって、いずれの場合もc)および/またはd)による付加変異体をさらに含む該変異体、
から選択される、請求項1または2に記載の3α−HSDH。 - 配列番号4の配列を有する3α−HSDHに比較して、以下の特性プロフィール:
a) デヒドロコール酸(DHCA)についての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における、増大された比活性(Vmax[U/mg]);
b) DHCAによる基質阻害の低減;
c) NADHについての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における増大された比活性(Vmax[U/mg]);
d) これらの特性a)〜c)が、個別に、または任意の組合せで存在できること、
を示す、請求項1〜3のいずれか1項に記載の3α−HSDH。 - 3−ケトステロイドの対応する3−ヒドロキシステロイドへの、特にNADHの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−HSDH)であって、これにおいて該酵素が、配列番号4の位置188および/または位置185、および任意で位置68において、あるいは、配列番号4に対し少なくとも80%の配列同一性をもつアミノ酸配列の対応する配列位置において変異を含み;および/または、該酵素が、15個までの同じか若しくは異なるアミノ酸基によるC−末端鎖伸長を含み、および/または該酵素が、25個までの同じか若しくは異なるアミノ酸基によるN−末端鎖伸長を含む、3α−HSDH。
- 3−ケトステロイドの対応する3−ヒドロキシステロイドへの少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒し、かつ配列番号4におけるアミノ酸変異により改変されるアミノ酸配列を含んでおり、アミノ酸配列変異が:
a) P185X1および/若しくは
b) T188X3
並びに任意でさらに、
c) L68X2
[式中、X1は、プロリン(P)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表し;
X2は、ロイシン(L)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表し;
X3は、スレオニン(T)以外の(タンパク質構成)アミノ酸基を表す];
d) 任意でさらに、1〜10個のヒスチジン(H)残基を含むC−末端伸長をもつこと;および/若しくは任意でさらに、1〜10個のヒスチジン(H)残基を含むN−末端伸長をもつこと、
を含む単一または多重変異から選択される、3α−HSDH。 - a) 単一変異体
P185X1
T188X3
b) 二重変異体
P185X1/T188X3;
L68X2/T188X3;
L68X2/T185X1;
[式中、X1はA、T、S、G、またはVを表し;
X2は、A、G、C、K、S、またはVを表し;かつ
X3は、A、G、W、S、またはVを表す]
c) 任意でさらに、1〜10個のヒスチジン残基を含むC−末端伸長をもつもの
;および/または任意でさらに、1〜10個のヒスチジン残基を含むN−末端伸長をもつもの、
から選択される、請求項5および6に記載の3α−HSDH。 - 配列番号4の配列を有する3α−HSDHに比較して、以下の特性プロフィール:
a) デヒドロコール酸(DHCA)についての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における増大された比活性(Vmax[U/mg])、
b) DHCAによる基質阻害の低減、
c) NADHについての、NADHを補因子として用いるDHCAの酵素的還元における増大された比活性(Vmax[U/mg])
を示し、
これらの特性a)〜c)が、個別に、または任意の組合せで存在することができる、請求項5〜7のいずれか1項に記載の3α−HSDH。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の3α−HSDHをコードする、ヌクレオチド配列。
- 少なくとも1つの調節配列の制御下にある、請求項9に記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
- 請求項10に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、発現ベクター。
- 請求項9に記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列、または請求項10に記載の少なくとも1つの発現カセット、または請求項11に記載の少なくとも1つの発現ベクターをもつ、組換え微生物。
- 任意でさらに、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSDH)および補因子再生に適するデヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも1つのさらなる酵素のコーディング配列をもつ、請求項12に記載の組換え微生物。
- さらなるHSDHが、7β−HSDH(NADPH−および/またはNADH−依存性)から選択され;かつ
前記デヒドロゲナーゼが、NADPH再生酵素、例えばNADPHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、およびNADPH再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、およびまたグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G−6−PDH)、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)か、あるいはNADH再生酵素、例えばNADHデヒドロゲナーゼ、NADH再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、NADH再生グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)、NADH再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)、およびNADH再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)から選択される、請求項13に記載の組換え微生物。 - 7α−HSDHノックアウト株である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 3α−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成のためのプロセスであって、これにおいて対応する3−ケトステロイドが、請求項1〜8のいずれか1項に記載された3α−HSDHの存在下に、または請求項12〜15のいずれか1項に記載された前記3α−HSDHを発現する組換え微生物の存在下に還元され、かつ任意で、少なくとも1つの生成された還元産物が反応混合物から単離される、プロセス。
- 3−ケトステロイドが、デヒドロコール酸(UDCA)、およびその誘導体、例えば、特に、前記酸の塩、アミド、またはアルキルエステルから選択される、請求項16に記載のプロセス。
- 還元が、NADPHおよび/またはNADHの存在下、および特にNADPHおよび/またはNADHを消費して行なわれる、請求項16または17に記載のプロセス。
- 消費されたNADPHが、NADPH再生酵素との共役により再生され、これにおいて後者が、とりわけNADPHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、およびNADPH再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、およびNADPH再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)から選択され、これにおいてNADPH再生酵素が任意で組換え微生物により発現され;および/または、消費されたNADHが、NADH再生酵素との共役より再生され、これにおいて後者が、とりわけNADHデヒドロゲナーゼ、NADH−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、NADH再生グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)、NADH再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)、およびNADH−再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)から選択され、これにおいてNADH再生酵素が任意で組換え微生物において発現される、請求項18に記載のプロセス。
- NADPH再生酵素が:
a) 少なくともギ酸のCO2への酵素的酸化を触媒する、NAD+依存性FDHの変異体を含むFDHであり、これにおいて前記変異体が、未変異酵素に比較して、補因子としてさらにNADP+を受容する、該FDHs;および
b) GDHs
から選択される、請求項19に記載のプロセス。 - 式(1):
[式中、Rは、アルキル、H、アルキル金属イオン、またはN(R3)4 +を表し、ここで、基R3は、同じかまたは異なり、かつHまたはアルキルを表し、あるいは基−CO2Rは酸アミド基−CONR1R2で置き換えられ、ここで、R1およびR2は、互いに独立してアルキル基を表す]
のウルソデオキシコール酸(UDCA)の調製のためのプロセスであって、これにおいて、
a)任意に、式(2):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたような酸アミド基−CONR1R2で置き換えられる]のコール酸(CA)が、式(3):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたような酸アミド基−CONR1R2で置き換えられる]のデヒドロコール酸(DHCA)へ化学的に酸化され;
b)DHCAは、請求項1〜8のいずれか1項における定義においてクレームされた、少なくとも1つの3α−HSDH変異体の存在下に、および少なくとも1つの7β−HSDHの存在下に、対応する式(5):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたような酸アミド基−CONR1R2で置き換えられる]
の12−ケト−ウルソデオキシコール酸(12−ケト−UDCA)へ、とりわけNADHおよび/またはNADPHの存在下に、かつNADHおよび/またはNADPHを消費して、還元され、その後
c)式(5)の12−ケト−UDCAがUDCAへ化学的に還元され;そして
d)任意で、反応産物がさらに精製される、プロセス。 - 少なくとも工程b)が、請求項12〜15のいずれか1項に記載された組換え微生物の存在下に行われる、請求項21に記載のプロセス。
- 工程b)が、同じかまたは異なる補因子再生系と共役される、請求項21または22に記載のプロセス。
- 式(1):
[式中、Rは、アルキル、H、アルキル金属イオン、またはN(R3)4 +を表し、ここで、基R3は、同じかまたは異なり、かつHまたはアルキルを表し、あるいは基−CO2Rは、酸アミド基−CONR1R2で置き換えられ、ここで、R1およびR2は、互いに独立してアルキル基を表す]
のUDCAの調製のためのプロセスであって、これにおいて、
a)任意に、式(2):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたような酸アミド基−CONR1R2で置き換えられる]のCAが、式(3):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたような酸アミド基−CONR1R2で置き換えられる]のDHCAへ化学的に酸化され;
b)DHCAは、少なくとも1つの7β−HSDHの存在下、および請求項1〜8のいずれか1項に記載された少なくとも1つの3α−HSDHの存在下に、式(5):
[式中、Rは、上記に示した意味を有し、あるいは基−CO2Rは、上記に定義されたようなアミド基−CONR1R2で置き換えられる]
の対応する12−ケト−UDCAへ、とりわけNADHおよび/またはNADPHの存在下に、および、NADHおよび/またはNADPHを消費して、還元され、その後
c)式(5)の12−ケト−UDCAがUDCAへ化学的に還元され;そして
d)任意で、反応産物がさらに精製され;
これにおいて、工程b)の変換が、請求項12〜15のいずれか1項に記載の組換え微生物の存在下に行われる、該プロセス。
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