JP6199742B2 - 新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体及びウルソデオキシコール酸の調製方法 - Google Patents

新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体及びウルソデオキシコール酸の調製方法 Download PDF

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Description

本発明は、新規７β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体群、これらの酵素変異体群をコードする配列群、該酵素変異体群の調製方法及びコール酸化合物の酵素反応、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製におけるこれらの使用に関し；本発明はまた、該酵素変異体を用いるＵＤＣＡの合成のための新規方法；及び組換え、多重改質した（multipy-modified）微生物を用いるＵＤＣＡの調製に関する。
発明の背景
活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及び関連するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、他の中でも、胆石症の薬剤処置のために長年用いられてきた。この二つの化合物は、７位の炭素原子上のヒドロキシ基の立体配置のみにおいて異なる（ＵＤＣＡ：β位、ＣＤＣＡ：α位）。ＵＤＣＡの調製について、種々の方法が先行技術に記載されており、これらは純粋に化学的に行われるか、又は化学的プロセス工程と酵素的プロセス工程との組合せからなる。各々の場合において、出発点は、コール酸（ＣＡ）又はコール酸から調製したＣＤＣＡである。
このように、ＵＤＣＡ調製のための古典的化学的方法は、以下のように概略的に表すことができる：
Figure 0006199742
重大な欠点は、その他の事項の中でも、次の通りである：化学的酸化は選択的ではないため、カルボキシ基と、３αおよび７α-ヒドロキシ基をエステル化によって保護しなければならない。
酵素１２α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α-ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替的化学的／酵素的方法は、次のように表わすことができ、例えば本願出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０号に記載されている。
Figure 0006199742
１２α-ＨＳＤＨは、ＣＡを選択的に１２-ケト-ＣＤＣＡへと酸化する。古典的な化学的方法により必要な二つの保護工程はこれによって不要になる。
なお、Monti, D.ら（One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009）は、代替的酵素−化学的方法を記載し、これは以下のように概略的に表すことができる。
Figure 0006199742
ＣＡは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５由来の７α-ＨＳＤＨ（Zhu, D.ら、Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539）及び１２α-ＨＳＤＨによって、7,12-ジケト-ＬＣＡへ、最初に酸化される。これら二つの酵素は各々、ＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ ＡＴＣＣ ２７５５５（ＤＳＭ５９９）由来の７β-ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）（MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9）による還元後に12-ケト-ＵＤＣＡが形成される。最終生成物はヴォルフ−キシュナー（Wolff-Kishner）還元によって得られる。 この方法は、触媒反応の平衡位置のため、完全変換が不可能であるという欠点、および変換の最初の工程のために二つの異なる酵素を使用しなければならず、これは操作コストを増加させるという欠点がある。補因子再生のため、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋の再生のためのＬＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨの再生のためのＧｌｃＤＨ又はＧＤＨ）が用いられる。ここで使用される補因子再生における欠点は、生成した同時生産物を反応混合物から除去するのが非常に困難で、そのため反応平衡を有利に影響させることができず、原料の不完全変換となる。
コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens） ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９；以前Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株由来の７β−ＨＳＤＨは、HiranoおよびMasudaによって１９８２年に記載された（Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63）。この酵素の配列情報は開示されていない。ゲル濾過によって測定した分子量は、４５，０００Ｄａであった（Hirano，1059頁左欄を見よ）。なお、この酵素では７−オキソ基の７β−ヒドロキシ基への還元は観察されなかった（Hirano、1061頁、Discussion第１パラグラフを見よ）。よって、Hiranoらによって記載された酵素は、７位におけるＤＨＣＡの3,12-ジケト-７β-ＣＡへの還元の触媒には不適当であると当業者は認識する。
本願出願人の先の国際特許出願PCT/EP2010/068576号は、他の事項の中でも、コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６由来の新規７β−ＨＳＤＨについて記載しており、これは特に約２８〜３２ｋＤａの分子量（ＳＤＳ−ゲル電気泳動における）、約５３〜６０ｋＤａの分子量（特に、ＳＤＳを含まないような非変性条件下でのゲル濾過における）、および７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基を立体選択的に７β−水酸基へと還元する能力を有する。
また、PCT/EP2010/068576号において、以下に概略的に示すことができるＵＤＣＡ調製方法が提供される。
Figure 0006199742
この場合、ＣＡの酸化は単純な古典的化学経路によって起こる。ＤＨＣＡは、７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨの酵素の組合せにより、それぞれ連続して、またはワンポットにて１２−ケト−ＵＤＣＡへと還元される。ヴォルフ−キシュナー還元との組合せにより、ＵＤＣＡは、ＣＡから３工程のみで合成できる。７β−ＨＳＤＨが補因子ＮＡＤＰＨに依存する一方、３α−ＨＳＤＨは補因子ＮＡＤＨを必要とする。同じ補因子への依存性または依存性の拡大（例えば補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）を伴う酵素の組合せが利用可能であることは、補因子の再生が簡単になるため好都合である。
本発明により解決しようとする課題は、さらに改良された７β−ＨＳＤＨを提供することにある。特に、７位から３，１２−ジケト−７β−ＣＡにおけるＤＨＣＡの立体選択的な還元を経由した酵素的又は微生物的なＵＤＣＡの調製をさらに好都合にするために用いることができる酵素変異体を提供すべきであり、特に、低減した基質阻害を有するか、及び／又は変化した補因子の使用を有する（特異性の増大、変化、または依存性の拡大）酵素変異体を提供すべきである。
別の課題は、新規な酵素的及び微生物的な合成経路を提供することにあり、特に、ＤＨＣＡを経由したＵＤＣＡの還元的調製における単純化された補因子の再生によっても特徴付けられる合成経路を提供することにある。
驚くべきことに上記の課題は、コリンゼラ属の好気性菌、特にコリンゼラ・アエロファシエンス株に由来する、新規な部位特異的および立体特異的な７β−ＨＳＤＨの変異体の産生および性質決定、およびコール酸化合物の反応、特にＵＤＣＡの調製におけるその使用によって解決された。
さらに上記の課題は、同時またはいずれかの順序で時間的に遅延して起こってもよい、７β−ＨＳＤＨまたは３α−ＨＳＤＨによって触媒される二つの部分的な還元工程を経由するＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換工程、および二つの部分的な還元工程において消費された補因子を再生する、特にギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）またはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）のようなデヒドロゲナーゼを用いる補因子の再生工程を有する、生体触媒的（微生物的または酵素的）方法の提供によって解決された。
図１ａは、コリンゼラ・アエロファシエンス由来の７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｂは、図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す；図１ｃは、コマモナス・テストステローニ（Comanomonas teststeroni）由来の３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｄは、図１ｃのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す；図１ｅは、ドブネズミ（Rattus norvegious）由来の３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｆは、図１ｅのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す；図１ｇは、ＦＤＨ変異体Ｄ２２１Ｇをコードする核酸配列を示し、図１ｈは、図１ｇの核酸配列に対するアミノ酸配列を示す。 図２は、本発明により調製した精製７β−ＨＳＤＨのＳＤＳゲルを示す。レーン１：未精製細胞抽出物；レーン２：精製タンパク質；レーンＭ：Ｐａｇｅ Ｒｏｕｌｅｒ（商標）、分子量マーカー（Fermentas、ドイツ）。 図３は、（Ａ）ｐＥＴ２１ａ（＋）、（Ｂ）ｐＥＴ２２ｂ（＋）、（Ｃ）ｐＣＯＬＡ（Ｍｏｄ）及び（Ｄ）ｐＥＴ２８ａ（＋）の構築スキームを示す。 図４は、ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ（図４ａ）およびｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ（図４ｂ）の構築スキームを示す。 図５は、ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨの構築スキームを示す。 図６は、／β−ＨＳＤＨ野生型と、７β−ＨＳＤＨ変異体Ｇ３９ＡおよびＧ３９Ｓとの活性の比較を示す。すなわちＡ列は、一定の補因子濃度１００μＭにて用いた、異なる基質濃度に対する特異的酵素活性のプロットを示し、Ｂ列は、一定の基質濃度０．３ｍＭにて用いた、異なる補因子濃度に対する酵素活性のプロットを示す。 図７は、全細胞法における、７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨによるＤＨＣＳの生体内変換のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。この図は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋ ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨ株による全細胞変換のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。選択した開始条件は、５０ｍＭ 基質、４００ｍＭ 補助基質、ｐＨ６．０であった。サンプリングは４８時間後に行った。１２−ケト−ＵＤＣＡ（１）、未知の副生成物（２）、３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ（３）、７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ（４）、およびＤＨＣＡ（５）のピークが観察できる。 図８は、ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ、７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ａ、および３α−ＨＳＤＨをコードする配列を有する三重ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ７ベータ（Ｇ３９Ａ）の構築スキームを示す。 図９は、ＤＨＣＡの全細胞生体内変換過程を示す。１２−ケト−ＵＤＣＡ、３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ及びＤＨＣＡの比例したピーク面積（ＨＰＬＣ分析による）を、時間の関数として示す。 図１０は、７β−ＨＳＤＨ野生型と選択した変異体との間の配列比較を示す。「７ベータＨＳＤＨ 野生型」、「７ベータＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ」、「７ベータＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｌ」、「７ベータＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｉ」、および「７ベータＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｖ」と表される配列は、配列番号２、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９に対応する。 図１１は、７β−ＨＳＤＨ及びその変異体の酵素反応速度研究を示す。特異的酵素活性を、一定の補因子濃度：０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨ又は０．５ｍＭ ＮＡＤＨで用いる、異なる基質濃度（ＤＨＣＡ濃度）に対してプロットした。 図１２は、本発明の、デヒドロコール酸から１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への２工程の酵素的還元を示す略図である。ここで、ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨを用い、補因子再生にはギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を用いる。 図１３は、７β−ＨＳＤＨの様々なＮＡＤＨ依存性変異体の発現に用いられたベクターｐＦｒ７（Ｄ）、ｐＦｒ７（ＤＩ）、ｐＦｒ７（ＤＬ）、およびｐＦｒ７（ＤＶ）の構築方式を示す略図である。 図１４は、ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体を用いた生体内変換のバッチにおける、胆汁酸塩の割合を示す。１００ｍＭの基質（ＤＨＣＡ）を用いた処理２４時間後の結果を示す。 図１５は、ベクターｐＦｒ３Ｔ７（Ｄ）を示す略図である。 図１６は、ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ）、ＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨ、およびＮＡＤＨ依存性ＦＤＨを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３Ｔ７（Ｄ）株による全細胞生体内変換の結果を示す。生体内変換は以下の条件で行った：２０ｍＬ 反応量、１７．７ｇ／ｌＢＴＭ細胞、１００ｍＭ ＤＨＣＡ、５００ｍＭ ギ酸アンモニウム、２６％グリセロール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）。最初の５時間、１時間ごとに、ｐＨをギ酸によってマニュアルで最初の値に調節した。 図１７は、使用した様々なベクター：ａ）ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３（これは図８に示したベクターに対応する）およびｂ）ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３を示す概略図である。 図１８は、デヒドロコール酸から１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への２工程の酵素的還元を示す略図である。ここで、ＮＡＤＰＨ−依存性７β−ＨＳＤＨを用い、補因子再生にはＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方を再生するギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）変異体を用いる。 図１９は、リットル規模でのＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３株による生体内変換の時間分解変動を示す。本バッチは、７０ｍＭ ＤＨＣＡ、１７．７ｇ／ｌＢＴＭの保管した生体触媒、５００ｍＭ ギ酸ナトリウム、２６％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）中の５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んだ。ｐＨ調節により、生体内変換の間を通してｐＨを６．５に維持した。 図２０は、ベクターｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧを示す略図である。 図２１は、ベクターｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧを示す略図である。 図２２は、補因子再生のためのＧＤＨを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ株による生体内変換の時間分解変動を示す。本バッチは、１００ｍＭ ＤＨＣＡ、１７．７ｇ／ｌＢＴＭの保管した生体触媒、５００ｍＭグルコース、０．１ｍＭ ＮＡＤを含まない（上図）および含む（下図）、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７）中の１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んだ。ｐＨを水酸化カリウム溶液によってマニュアルで最初の値に調節した。 図２３は、異なるベクター：ａ）ベクターｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）およびｂ）ベクターｐＦｒ３を示す略図である。 図２４は、二つの異なる全細胞生体触媒を用いた、デヒドロコール酸から１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への２工程の酵素的還元を示す略図である。反応ＡおよびＤは、７β−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒によって触媒され、反応ＢおよびＣは、３α−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒によって触媒される。２工程反応の過程において、中間体３，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸は、７β−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒から３α−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒へ通過しなければならず、中間体７，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸は、３α−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒から７β−ＨＳＤＨを含む全細胞生体触媒へ通過しなければならない。 図２５は、７０ｍＭの基質（ＤＨＣＡ）を用いた際の、２４時間後の生体内変換バッチの胆汁酸塩の割合を示した図である。二つの生体触媒であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）株およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３株を異なる割合で用いた際のバッチを示す。 生体触媒である、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３による、リットル規模の生体内変換の時間分解変動を示す。本バッチは、９０ｍＭ ＤＨＣＡ、８．８５ｇ／ｌＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および８．８５ｇ／ｌＢＴＭ Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３、５００ｍＭギ酸アンモニウム、２６％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）中の５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んだ。ギ酸を用いたｐＨ調節により、生体内変換の間を通してｐＨを６．５に維持した。
本発明の特別な態様
本発明は特に、以下の特別な態様に関する。
１． 少なくとも立体特異的な酵素的還元により７−ケトステロイドをそれに対応する７−ヒドロキシステロイドへと触媒する７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）変異体であって、該変異体は、未変異の酵素、例えば特に配列番号２を有するか及び／又はその位置３６〜４２の配列モチーフＶＭＶＧＲＲＥを少なくとも有する酵素と比較して、低減した基質阻害（特に７−ケトステロイド基質に対する）を有するか、及び／又は変化した補因子の使用（例えば、補因子（特にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）に関して、増大又は変化した特異性、もしくは依存性が拡大した、即ち、以前に用いられていない追加の補因子の使用）を有する、上記変異体。
２． いずれの基質阻害も示さないか、又は７−ケトステロイド基質に対する、特にデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）に対するＫｉ値が＞１０ｍＭ、例えば１１〜２００ｍＭ、１２〜１５０ｍＭ、１５〜１００ｍＭの範囲である、態様１記載の変異体。
３． 補因子ＮＡＤＰＨの存在下での特異的活性（Ｕ／ｍｇ）が、未変異酵素と比較して、少なくとも１％、５％もしくは１０％、特に少なくとも１倍、特に２〜１０倍上昇または低下しているか；又は本質的に存在せず、かつＮＡＤＨの使用に置き換えられているか、又はＮＡＤＰＨ及びＨＡＤＨの使用に拡大されている、態様１又は２記載の変異体。
４． 少なくとも立体特異的な酵素的還元により７−ケトステロイドをそれに対応する７−ヒドロキシステロイドへと触媒する、任意に先述の態様の１つに記載の７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）変異体であって、該変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を有するか、又はこれに由来しこの配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記変異体。
５． 少なくとも立体特異的な酵素的還元により７−ケトステロイドをそれに対応する７−ヒドロキシステロイドへと触媒する、任意に先述の態様の１つに記載の７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）変異体であって、該変異体は、配列番号２の位置３６〜４２の配列モチーフＶＭＶＧＲＲＥにおいて少なくとも１つの変異を有するか、又はこれに由来しこの配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも１つの変異を有する、上記変異体。
６． ａ）単一変異体群Ｇ３９Ｘ１およびＲ４０Ｘ２、
ｂ）二重変異体群（Ｇ３９Ｘ１、Ｒ４０Ｘ２）、（Ｒ４０Ｘ２、Ｒ４１Ｘ３）および（Ｇ３９Ｘ１、Ｒ４１Ｘ３）、もしくは
ｃ）三重変異体群（Ｇ３９Ｘ１、Ｒ４０Ｘ２、Ｒ４１Ｘ３）
（それぞれの事例は配列番号２に関する）（式中、各ケースにおいて、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸を表し、特に基質阻害が減少しているか、及び／又は補因子の使用または補因子依存性が改変されている、ＧまたはＲとは異なる、いずれかの天然アミノ酸を表す）；または
ｄ）配列番号２由来のアミノ酸配列であって、この配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の、対応する単一、二重、または三重変異体群；
から選択される、態様４又は５記載の変異体。
適切な単一変異体群の例として：Ｇ３９Ａ、Ｇ３９Ｓ、Ｇ３９Ｄ、Ｇ３９Ｖ、Ｇ３９Ｔ、Ｇ３９Ｐ、Ｇ３９Ｎ、Ｇ３９Ｅ、Ｇ３９Ｑ、Ｇ３９Ｈ、Ｇ３９Ｒ、Ｇ３９ＫおよびＧ３９Ｗ、ならびにＲ４０Ｄ、Ｒ４０Ｅ、Ｒ４０Ｉ、Ｒ４０Ｖ、Ｒ４０Ｌ、Ｒ４０Ｇ、Ｒ４０Ａが挙げられる。
適切な二重変異体群の例として：
上記Ｇ３９Ｘ１とＲ４０Ｘ２変異体との二重の組合せであって、Ｘ１が特にＤもしくはＥであり、かつ／またはＸ２がいずれかのアミノ酸、特に脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えば（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｉ）、（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｌ）、（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｖ）のようなタンパク質を構成するアミノ酸であってよい二重の組合せ；およびＧ３９Ｄの代わりにＧ３９Ｅによる類似の二重変異体；ならびに
上記Ｇ３９Ｘ１変異体またはＲ４０Ｘ２変異体とＲ４１Ｘ３変異体との二重の組合せであって、Ｘ３がいずれかのアミノ酸、特に基質阻害が減少しており、かつ／または補因子の使用または補因子依存性が改変されており、Ｒとは異なる天然アミノ酸、例えば（Ｇ３９Ｘ１，Ｒ４１Ｘ３）もしくは（Ｒ４０Ｘ２，Ｒ４１Ｘ３）の型である、
例えばＸ１＝Ｄ又はＥ；Ｘ２＝Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｘ３＝Ｎ、Ｉ、Ｌ又はＶである）二重の組合せ、
例えば（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｉ）；（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｌ）；（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｖ）；（Ｒ４０Ｉ，Ｒ４１Ｉ）；（Ｒ４０Ｖ，Ｒ４１Ｉ）、（Ｒ４０Ｌ，Ｒ４１Ｉ）
が挙げられる。
適切な三重変異体群の例として、上記単一変異体群Ｇ３９Ｘ１、Ｒ４０Ｘ２およびＲ４１Ｘ３のいずれかの三重の組合せであって；Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は上記で定義されたとおりであるが；特にＸ１はＤもしくはＥを表し、かつ／又はＸ２およびＸ３はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸、特にタンパク質を構成するアミノ酸を表す三重の組合せ、例えば特に（Ｇ３９Ｘ１＝ＤもしくはＥ；Ｒ４０Ｘ２＝Ｉ、ＬもしくはＶ；Ｒ４１Ｘ３＝Ｎ、Ｉ、ＬもしくはＶ）の型である三重変異体群、例えば（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｉ，Ｒ４１Ｎ）が挙げられる。
態様１〜６の変異体は、さらに、または代わりに、特にさらに、Ｋ４４、Ｒ５３、Ｋ６１、およびＲ６４の位置に、少なくとも１個のさらなる置換、例えば１個、２個、３個もしくは４個の置換を任意に有してもよい。この場合、これらの残基はそれぞれ独立して、いずれかのアミノ酸、特にタンパク質を構成するアミノ酸によって、特に、本明細書に定義するように、得られた変異体の基質阻害が減少し（特に７−ケトステロイド基質に対して）；かつ／または補因子の使用もしくは補因子の依存性が変化する（例えば補因子に関する特異性が増大、変化しているか、または依存性が拡大している、すなわち以前に用いていない追加の補因子の使用）ように置換されてもよい。
７． 先述の態様の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体をコードする核酸配列。
８． 少なくとも１つの調節性核酸配列の遺伝的制御下にある態様７記載の核酸配列、ならびに任意に、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、特に３α−ＨＳＤＨ、および補因子再生に適したデヒドロゲナーゼ、例えばＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨ、Ｇ−６−ＰＤＨ、ＰＤＨから選択される少なくとも１つ（例えば１つ、２つまたは３つ）のさらなる酵素をコードする配列を含む発現カセット。特に、発現カセットに含まれる酵素は、異なる、しかし好ましくは同一の補因子の組合せ、例えば補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの組合せを用いることができる。
９． 態様８記載の発現カセットを少なくとも１つ有するベクター。
１０． 態様７記載の核酸配列を少なくとも１つ有するか、または態様８記載の発現カセットを少なくとも１つ有するか、または態様９に記載のベクターを少なくとも１つ有し、さらに、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）をコードする配列を任意に有する、組換え微生物。
１１． ７β−ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に合成する方法であって、対応する７−ケトステロイドを、態様１〜６の１つに定義される７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下で、又はこの変異体を発現する態様１０記載の組換え微生物の存在下で反応させ、かつ得られる還元生成物の少なくとも１つを反応混合物から任意に分離する、上記方法。
１２． 態様１１記載の方法であって、還元されるケトステロイドは
ａ）デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）、
ｂ）７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ）、
ｃ）７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）及び
ｄ）これらの誘導体、例えば特に該酸の塩、該酸のアミド又は該酸のアルキルエステル、から選択される。
１３． 還元を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下（及びこれらの消費により）生じさせる、態様１１及び１２のうちの１つに記載の方法。
１４． ７β−ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に酸化する方法であって、ヒドロキシステロイを、態様１〜６の１つに定義される７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下で、またはこの変異体を発現する態様１０記載の微生物の存在下で反応させ、かつ得られる酸化生成物を反応混合物から任意に分離する、上記方法。
１５． ７β−ヒドロキシステロイドが、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはその誘導体、例えば特に塩、アミドまたはアルキルエステルである、態様１４記載の方法。
１６． 酸化を、ＮＡＤＰ＋及び／又はＮＡＤ＋の存在下（及びこれらの消費により）生じさせる、態様１４及び１５のうちの１つに記載の方法。
１７． 消費されたレドックス均等物を、化学的、電気化学的、または酵素的に、特にその場で（in situで）再生する、態様１３及び１６のうちの１つに記載の方法。
１８． 態様１７記載の方法であって、
消費されたＮＡＤＰＨをＮＡＤＰＨ再生酵素との結合によって再生し、該ＮＡＤＰＨ再生酵素が、特にＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）−、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択され、該ＮＡＤＰＨ再生酵素は任意に組換え微生物により発現されるか；または
消費されたＮＡＤＨをＮＡＤＨ再生酵素との結合によって再生し、ＮＡＤＨ再生酵素が、特にＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択され、該ＮＡＤＨ再生酵素は任意に組換え微生物において発現される、上記方法。
組換え微生物における補因子再生酵素の発現が好ましい。
１９． ＮＡＤＰＨ再生酵素が、天然又は組換えの、分離されたか又は濃縮された、
ａ）アルコール脱水素酵（ＥＣ１．１．１．２）および
ｂ）それに由来する機能的均等物
から選択される、態様１８記載の方法。
２０． 態様１８記載の方法であって、
ＮＡＤＰＨ再生酵素は、少なくとも酵素的酸化によりギ酸をＣＯ２へと特に触媒するＮＡＤ＋依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の変異体から選択され、該変異体は未変異酵素と比較して、単独にまたはさらに、特にさらに、ＮＡＤＰ＋を補因子として受容するか；または
ＮＡＤＨ再生酵素は、ＮＡＤ＋依存性ＦＤＨまたはＮＡＤ＋依存性ＧＤＨ、例えば特に、配列番号３６のマイコバクテリウム−バッカエＮ１０由来のＦＤＨおよび配列番号４８の枯草菌由来のＧＤＨ（これはＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを再生する）またはこれらの修飾型から選択され、これらの修飾型はそれぞれの場合において前述の二つの酵素に対する機能的な均等物（補因子の再生に関して）である、上記方法。
２１． 態様２０記載の方法であって、ＦＤＨ変異体は特異的活性によってＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元し、この特異的活性は、未変異（野生型）酵素によるＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元に特異的な活性の、約０．１〜１０００％、例えば１〜１００％、５〜８０％、または１０〜５０％である、上記方法。
２２． 態様２０及び２１のうちの１つに記載される方法であって、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体は、配列番号３６のマイコバクテリウム−バッカエＮ１０由来のＦＤＨのアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を有するか、又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８％５、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記方法。
２３． 態様２０及び２２のうちの１つに記載される方法であって、ＮＡＤＰ＋受容性変異体は、配列番号３６の位置２２１〜２２６の配列モチーフＴＤＲＨＲＬにおいて少なくとも１つの変異を有するか、又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８％５、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも１つの変異を有する、上記方法。
可能性のある適切なＦＤＨ変異体の限定されない例として、配列番号３６の位置Ｄ２２２および／またはＲ２２３における変異が挙げられる。例として、Ｘ＝Ｇ、Ａ、Ｋ、またはＮであるＤ２２２Ｘ；Ｘ＝ＨまたはＹであるＲ２２３Ｘ、ならびに位置２２２および２２３における変異の組合せを言及することができる。
２４． 態様２０〜２３の１つに記載される方法であって、ＮＡＤＰ＋受容性変異体は、配列番号３６の単一変異体Ｄ２２２Ｇ（本明細書では「Ｄ２２１Ｇ」変異体と表されることが多い（配列番号３６の位置２のＡｌａを最初のアミノ酸として数える））又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する単一変異体群から選択される。具体例として、配列番号１５、１９、および３５のＦＤＨ変異体を言及することができる。
さらに適切なＦＤＨ酵素として、例えばカンジダ・ボイディニー（Candida boidini）またはシュードモナス属（Pseudomonas sp）の一種から分離できる野生型酵素に始まり、補因子の特異性を変化させるための上記変異に対応する少なくとも１つの機能的変異の挿入が利用できる。さらに、先行技術には、化学的もしくは熱安定性または触媒活性のような、様々なＦＤＨの性質を改善するための多くの研究が見出される。これらは例えば、Tishkov et al., Biomolecular Engineering 23 (2006), 89-110に要約されている。従って、該文献に記載される単一または複数の点突然変異は、例えば酵素安定性を増大させるために、本発明によって記載される改変された補因子の使用のための変異と組合せることができる。
２５． ａ）態様２２〜２４の１つに記載されるＦＤＨ変異体および態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードし、任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードするか；又はｂ）態様２２〜２４の１つに記載されるＦＤＨ変異体および未変異７β−ＨＳＤＨを同時にコードし、任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードするか；又はｃ）態様２２〜２４の１つに記載されるＦＤＨ変異体および態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質であって、３α−ＨＳＤＨを任意に有する融合タンパク質をコードするか；又はｄ）態様２２〜２４の１つに記載されるＦＤＨ変異体および未変異７β−ＨＳＤＨを有する融合タンパク質であって、３α−ＨＳＤＨを任意に有する融合タンパク質をコードするか、ｅ）ＦＤＨ野生型および態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードし、任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードするか；またはｆ）ＦＤＨ野生型、態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質であって、３α−ＨＳＤＨを任意に有する融合タンパク質をコードするか；ｇ）ＧＤＨ及び７β−ＨＳＤＨ野生型を同時にコードし、任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードするか；ｈ）ＧＤＨ及び７β−ＨＳＤＨ野生型を有する融合タンパク質であって、３α−ＨＳＤＨを任意に有する融合タンパク質をコードするか；ｉ）ＧＤＨ及び態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードし、任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードするか；ならびにｋ）ＧＤＨ及び態様１〜６の１つに記載される７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質であって、３α−ＨＳＤＨを任意に有する融合タンパク質をコードする、核酸配列群から選択される核酸配列であって；
コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば２、３、４、５、もしくは６〜１０コピーで構築物内に含んでもよい核酸配列。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。
２６． 少なくとも１つの調節性核酸配列の遺伝的制御下にある態様２５記載の核酸配列を有する発現カセットであって、コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば２、３、４、５、もしくは６〜１０コピーで構築物内に含んでもよい発現カセット。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。
２７． 態様２６記載の発現カセットを少なくとも１つ有するベクターであって、コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば２、３、４、５、もしくは６〜１０コピーでベクター構築物内に含んでもよいベクター。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。
２８． 態様２５記載の核酸配列を少なくとも１つ有するか、又は態様２７記載の発現カセットを少なくとも１つ有するか、又は態様２８記載のベクターを少なくとも１つ有する、組換え微生物。
２９． ７β−ＨＳＤＨ（野生型）、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体および／または対応するＦＤＨ野生型、ならびに任意に３α−ＨＳＤＨの同時発現が可能であるか；又は７β−ＨＳＤＨ（野生型）、本明細書に記載されるＧＤＨ、および任意に本明細書に記載される３α−ＨＳＤＨの同時発現が可能である、組換え微生物。
３０． ７β−ＨＳＤＨ変異体、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体および／または対応するＦＤＨ野生型、ならびに任意に３α−ＨＳＤＨの同時発現が可能であるか；又は７β−ＨＳＤＨ変異体、本明細書に記載されるＧＤＨ、および任意に本明細書に記載される３α−ＨＳＤＨの同時発現が可能である、組換え微生物。
３１． ７β−ＨＳＤＨ変異体が態様１〜６の１つに記載される変異体である、態様３０記載の組換え微生物。
３２． 態様２９または３０記載の組換え微生物であって、ＦＤＨ変異体は態様２０〜２４の１つに定義される変異体であり；ＦＤＨ野生型は配列番号３６のマイコバクテリウム−バッカエＮ１０由来のＦＤＨであるか、またはこれに由来するＦＤＨであって少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するＦＤＨである、上記組換え微生物。
３３． 態様２９または３０記載の組換え微生物であって、３α−ＨＳＤＨは、配列番号６又は８又は２２のアミノ酸配列を有するか、又はこれらに由来しこの配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素である、上記組換え微生物。
３４． １以上の（異なる）発現構築物に、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、および３α−ＨＳＤＨをコードする配列を有する、態様２９〜３３の１つに記載される組換え微生物。従って本発明は、７β−ＨＳＤＨまたはその変異体、ＦＤＨまたはその変異体、および３α−ＨＳＤＨまたはその変異体をコードする配列を１コピー以上、例えば２、３、４、５、または６〜１０コピー有する単一プラスミド系によって改変された（例えば形質転換された）組換え微生物に関する。従って本発明はまた、７β−ＨＳＤＨまたはその変異体、ＧＤＨまたはその変異体、および３α−ＨＳＤＨまたはその変異体をコードする配列を１コピー以上、例えば２、３、４、５、または６〜１０コピー有する単一プラスミド系によって改変された（例えば形質転換された）組換え微生物にも関する。しかしながら該酵素（７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、および３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体）はまた、別々の２または３の、互いに適合性のプラスミドに１コピー以上含めることもできる。単一プラスミド系および複数コピーのプラスミドを調製するための適切な基本ベクターは、当業者に公知である。本発明者らが言及し得る例として、単一プラスミド系には例えばｐＥＴ２１ａ、および複数コピーのプラスミドには、例えばＮｏｖａｇｅｎ社により市販されるｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、およびｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１のようなｄｕｅｔベクターが挙げられる。この種のベクターについての、他のベクターおよび微生物宿主株との適合性は、例えばＮｏｖａｇｅｎ社の「Ｕｓｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＴＢ３４０ Ｒｅｖ．Ｅ０３０５」に記載されている。
プラスミド系を産生するための酵素の最適な組合せは、当業者により、本発明の教示を考慮して過度の努力なしに行うことができる。従って当業者は、例えばそれぞれの場合において使用される７β−ＨＳＤＨ酵素の補因子特異性に依存して、前述のデヒドロゲナーゼ、特にＦＤＨ、ＧＤＨ、およびそれらの各変異体から、補因子再生に最も適した酵素を選択できる。
さらに、反応のために選択された酵素を２以上のプラスミドに分配し、かつ、得られたプラスミドによって、本発明の生体触媒的反応に共に用いられる２以上の異なる組換え微生物を産生する可能性がある。プラスミド調製のために用いられる特定の酵素の組合せは、特に、類似した補因子の使用を特定するためにも応用できる。例えば第１の微生物は、本発明のＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体およびこの補因子を再生するＦＤＨ変異体をコードする配列を有するか、またはＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体およびＮＡＤＰＨ再生ＧＤＨをコードする配列、またはＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨおよびＮＡＤＨ再生ＦＤＨおよび／もしくはＧＤＨをコードする配列を有するプラスミドによって改変できる。一方で第２の微生物は、ＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨをコードする配列およびＮＡＤＨ再生ＦＤＨ野生型および／もしくはＮＡＤＨ再生ＧＤＨをコードする配列を有するプラスミドによって改変できる。両微生物は次に、本発明の生体触媒的反応に同時に用いることができる。
別々の二つの生体触媒（組換え微生物）の使用は、全ての合成酵素を発現する一つの生体触媒のみの使用を超えた二つの重要な利点を提供する。
ａ）二つの生体触媒は、互いに別々に、遺伝的に改変され最適化される。特に、ＮＡＤＨ再生またはＮＡＤＰＨ再生のいずれかに対して最適化された、異なる補因子再生酵素の使用が可能である。
ｂ）生体触媒作用のために、生体触媒は異なる割合で使用できる。これにより、複数酵素による方法において、全ての生体触媒が準備された後であっても、生体触媒作用の間に個々の反応速度を調整することが可能となる。
驚くべきことに、本発明との関連において、二つの生体触媒の使用によって必要となる反応物質のさらなる膜輸送工程は、反応速度に対してわずかに影響するかまたは影響を与えず、２細胞系の利点はこれらの仮定的な負の局面に勝ることも示された。
３５． 式（１）（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２、Ｈ、アルカリ金属イオン、又はＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、残基Ｒ３は同一であるか又は異なってもよいＨ又はアルキルを表す）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製方法であって、
ａ）式（２）（式中、Ｒは上記意味を有する）のコール酸（ＣＡ）を、任意に化学的に酸化して、式（３）（式中、Ｒは上記意味を有する）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）とし；
ｂ）ＤＨＣＡを、態様１〜６の１つにおける定義による７β−ＨＳＤＨ変異体（分離された酵素として存在するか、又は対応する組換え微生物によって発現される）の少なくとも１つの存在下、及び少なくとも１つの３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）（分離された酵素として存在するか、又は対応する組換え微生物によって発現される）の存在下で還元し、（特にＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの存在下で、かつそれらの消費により）式（５）（式中、Ｒは上記の意味を有する）の、対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）とし；その後
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的に還元してＵＤＣＡとし；
ｅ）反応生成物を、任意にさらに精製してもよい、上記方法。
Figure 0006199742
方法工程ｂ）は異なる設定が可能である。両酵素（７β−ＨＳＤＨ変異体および３α−ＨＳＤＨ）が同時に存在し得るか（例えば分離された両酵素によるか、または両酵素を発現する、対応する１以上の組換え微生物の存在によるワンポット反応）、または部分的反応がいずれかの順序で起こってもよい（最初に７β−ＨＳＤＨ変異体により触媒される還元、次に３α−ＨＳＤＨにより触媒される還元；または最初に３α−ＨＳＤＨにより触媒される還元、次に７β−ＨＳＤＨ変異体により触媒される還元）。
従って、式（１）のＵＤＣＡの調製方法の変形は、例えば以下の通りであってよい：
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）を、任意に化学的に酸化し；
ｂ）ＤＨＣＡを、少なくとも１つの、態様１〜６の１つに定義される７β−ＨＳＤＨ変異体（分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現される）の存在下で、式（４）の３，１２−ジケト−７β−コラン酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）へと（ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの存在下で、かつそれらの消費により）還元し、
ｃ）３，１２−ジケト−７β−ＣＡを、少なくとも１つの、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）（分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現される）の存在下で、式（５）（式中、Ｒは上記の意味を有する）の、対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）へと（ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下で、かつそれらの消費により、使用する３α−ＨＳＤＨに応じて）還元し、その後、
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的に還元してＵＤＣＡとし；かつ
ｅ）反応生成物を、さらに任意に精製する。
Figure 0006199742
３６． 工程ｂ）およびｃ）を、本明細書に記載される、１以上の組換え微生物、例えば態様１０記載の微生物の少なくとも１つの存在下で行う、態様３５記載の方法。
３７． 態様３５又は３６記載の方法であって、工程ｂ）および／またはｃ）を、同一かまたは異なる補因子再生系（分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現される）と組合せる、上記方法。
３８． 態様３７記載の方法であって、工程ｂ）は、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体により、態様２０〜２４の１つに定義されるように、ギ酸またはその塩を消費して、ＮＡＤＰＨを再生する補因子再生系と組合せるか；またはＡＤＨにより、イソプロパノールを消費して、ＮＡＤＰＨを再生する補因子再生系と組合せるか；またはＧＤＨにより、グルコースを消費して、ＮＡＤＰＨを再生する補因子再生系と組合せるか；または消費されたＮＡＤＨを、ＮＡＤＨ再生ＧＤＨ、ＡＤＨ、もしくはＦＤＨによって再生する補因子再生系と組合せる、上記方法。
３９． 態様３７又は３８記載の方法であって、工程ｃ）は、態様２０〜２４の１つに定義され、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体により、ギ酸またはその塩を消費して、ＮＡＤＰＨを再生する補因子再生工程と組合せるか；または工程ｃ）は、態様２０〜２４の１つに定義されるように、ＮＡＤＨ再生ＦＤＨ変異体によって、または未変異ＦＤＨにより、ギ酸またはその塩を消費して、またはＮＡＤＨ再生ＧＤＨにより、グルコースを消費して、ＮＡＤＨを再生する補因子再生工程と組合せる、上記方法。
４０． 式（１）（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、残基Ｒ３は同一であるかまたは異なってよい、Ｈまたはアルキルを表す）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の微生物的調製方法であって、
ａ）式（２）（式中、Ｒは上記の意味を有する）のコール酸（ＣＡ）を、任意に化学的に酸化し、式（３）（式中、Ｒは上記の意味を有する）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）とし；
ｂ）ＤＨＣＡを、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下、および少なくとも１の３α−ＨＳＤＨの存在下で、（ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下で、かつそれらの消費により）還元して、式（５）の、対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）とし；
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的に還元してＵＤＣＡとし；かつ
ｄ）反応生成物を任意に、さらに精製し；
工程ｂ）の反応を、微生物的に、即ち態様２８または２９〜３４の１つに記載される、１以上の異なる組換え微生物の全細胞の存在下で生じさせ、単数もしくは複数の微生物は、本明細書にさらに詳細に記載される様式かまたはその他の様式により、少なくとも１の態様２５に記載される核酸配列を用いて、反応および補因子再生に必要な酵素を有する、上記方法。
Figure 0006199742
例えばＤＨＣＡを、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨまたはその変異体の存在下で、（ＮＡＤＰＨの存在下で、かつその消費により）還元して、式（４）（式中、Ｒは上記の意味を有する）の３，１２−ジケト−７β−コラン酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）とし、かつ
３，１２−ジケト−７β−ＣＡを、少なくとも１つの、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）またはその変異体の存在下で、（ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下で、かつそれらの消費により）還元して、式（５）（式中、Ｒは上記の意味を有する）の、対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）としてもよい。
Figure 0006199742
しかしながら、反応順序についてはさらに、最初にＤＨＣＡの３α−ＨＳＤＨによる還元、続いて得られた反応生成物の７β−ＨＳＤＨによる還元が考えられ、かつ両ＨＳＤＨが同時に存在することに基づき、両反応の順序が同時であることも考えられる。
４１． 態様４０記載の方法であって、態様２９〜３４の１つに記載される組換え微生物が１つ以上、特に１つ用いられ、これは、例えば、態様１〜６の１つに記載される少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ変異体、態様２０〜２４の１つに記載される少なくとも１つのＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体、および例えば特に配列番号６、８、もしくは２２に記載される少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ、または少なくとも約６０％の配列同一性によるその変異体を同時に発現するか；またはこれは、態様１〜６の１つに記載される少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ変異体、例えば特に配列番号６、８、もしくは２２記載の少なくとも１つのＧＤＨおよび少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ、または少なくとも約６０％の配列同一性によるそれらの変異体を同時に発現する、上記方法。
４２． 態様３５〜４１の１つに記載される方法を行うためのバイオリアクターであって、これは特に少なくとも１つの酵素（７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、および／もしくは３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体；または７β−ＨＳＤＨ、ＧＤＨ、および／もしくは３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体）、または少なくとも１つのこれらの酵素を、特に固定化型で組換え的に発現する組換え微生物を含む、バイオリアクター。
本発明は、本明細書に記載される具体的な態様に限定されるものではない。当業者はむしろ、本発明の教示を通して、過度の努力なしに本発明のさらなる構成を提供できるであろう。当業者は例えば、目的を持ってさらなる酵素変異体を産生し、所望の特性（改良された補因子依存性および／または安定性、基質阻害の減少）のためにこれらを選別し、最適化するか；またはさらに適した野生型酵素（７β−および３α−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨなど）を分離し、これらを本発明に従って使用することもできる。さらに、例えば使用するＨＳＤＨ、特に７β−ＨＳＤＨまたは３α−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体の特性（特に補因子依存性）に依存して、当業者は補因子再生に使用できる適切なデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、ＦＨＤ、ＡＤＨなど）およびそれらの変異体を選択し、かつ選択した酵素を１以上の発現構築物またはベクターへ分配できることから、必要な場合には１以上の組換え微生物を産生することで、最適化された全細胞に基づいた産生方法が可能となる。
本発明のさらなる構成
１．一般的定義および使用した略語
特記しない限り、用語「７β−ＨＳＤＨ」は、少なくとも立体特異的および／または部位特異的な還元により、特にＮＡＤＰＨの化学量論的な消費と共に、ＤＨＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）を３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは１２−ケト−ＵＤＣＡへと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。酵素は天然または組換えによって産生した酵素であってよい。酵素は、基本的には細胞性の、例えばタンパク質不純物と混合していてもよいが、純粋な形態であることが好ましい。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている（例えば、Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982）。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２０１に分類される。
特記しない限り、用語「３α−ＨＳＤＨ」は、少なくとも立体特異的および／または部位特異的な還元により、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的な消費と共に、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはＤＨＣＡを１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）へと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている。適切な酵素は、例えばコマモナス・テストステローニ（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得ることができる。ＮＡＤＰＨ依存性の３α−ＨＳＤＨは、例えばげっ歯類由来のものも知られており、これもまた使用できる。（Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991, The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825）。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．１．１．５０に分類される。
特記しない限り、用語「ＧＤＨ」は、少なくとも酸化により、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的な消費と共に、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。適切な酵素は、例えば枯草菌または巨大菌から得ることができる。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．１．１．４７に分類される。特記しない限り、用語「ＦＤＨ」は、少なくとも酸化により、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的な消費と共に、ギ酸（または対応するギ酸塩）の二酸化炭素へと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている。適切な酵素は、例えばカンジダ・ボイディニー、シュードモナス属の一種、またはマイコバクテリウム−バッカエから得ることができる。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．２．１．２に分類される。
「純粋な形態」もしくは「純粋」又は「実質的に純粋」な酵素は、本発明によれば、タンパク質を検出するための通常の方法、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｙらによるタンパク質検出法（R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)の記載を参照）によって決定した総タンパク質含量に対して８０ｗｔ％超、好ましくは９０ｗｔ％超、特に９５ｗｔ％超、さらに特に９９ｗｔ％超の純度を有する酵素として理解される。
「レドックス均等物」は、電子ドナーまたは電子アクセプターとして使用できる低分子有機化合物、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋、またはそれらのそれぞれの還元型であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのようなニコチンアミド誘導体を意味する。本発明との関連において、「レドックス均等物」および「補因子」は同義語として用いられる。従って、本発明の意味での「補因子」は、「レドックス対応補因子」、すなわち還元型および酸化型で存在できる補因子としても記載できる。
「消費された」補因子は、基質の特定の還元または酸化反応過程において、対応する酸化型または還元型に変換される。補因子の還元型または酸化型として理解される再生によって、反応中に形成された酸化型または還元型の補因子は、基質反応に再度利用可能となるように、出発型である還元型または酸化型へ変換して戻される。
「変化した補因子の使用」は、本発明との関連において、基準と比較した定性的または定量的変化として理解される。特に変化した補因子の使用は、使用するアミノ酸配列の変異により観察される。この変化は次に、未変異の出発酵素との比較により決定できる。さらに特定の補因子に関する活性は、使用する変異によって増大もしくは減少するか、または完全に阻止される。しかしながら、変化した補因子の使用には、個々の補因子に対する特異性に替わり、第１の補因子とは異なる、少なくとも１つのさらなる第２の補因子が使用可能であるような（すなわち補因子使用の拡大）変化もまた含まれる。しかしながら、反対に、元々存在する二つの異なる補因子の使用能は、特異性がこれらの補因子の１つのみにおいて増大するか、またはこれらの補因子の１つのみにおいて減少するか、または完全に除去されるように変化させることができる。例えば補因子ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に依存する酵素は、補因子の使用の変化のために、ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）および補因子ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の両方に依存するか、または元々のＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に対する依存性をＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）に対する依存性へ完全に変換させるか、その逆もまた可能である。
特記しない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ依存性」は、本発明に従って広範に解釈される。これらの用語には、「特異的」な依存性、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する単独の依存性、ならびに本発明に従って使用する酵素の両補因子に対する依存性、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する依存性の両方が含まれる。
このことは、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ受容性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ受容性」にも同様に適用される。
特記しない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ再生」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ再生」は、本発明に従って広範に解釈される。これらの用語には、「特異的」、すなわち消費された補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する単独の能力、ならびに両補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する能力の両方が含まれる。
「タンパク質を構成するアミノ酸」には、特に（一文字コード）：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨが含まれる。
本発明によれば「固定化」は、本発明に従って用いる生体触媒、例えば７β−ＨＳＤＨの、固体、すなわち周囲を取り囲む液体溶媒に実質的に不溶性の担体物質への共有結合性または非共有結合性の結合を意味する。本発明によれば、組換え微生物のような全細胞もまた、このような担体によって同様に固定化できる。
「未変異酵素と比較して低減した基質阻害」は、特定の基質に対して未変異酵素により観察される基質阻害がもはや観察されないこと、すなわち実質的にもはや測定できないこと、または高い基質濃度、すなわち増大したＫｉ値においてのみ起こることを意味する。
「コール酸化合物」は、炭素骨格構造、特にコール酸のステロイド構造を有し、かつ環の位置７、ならびに任意に環の位置３および／または１２に、ケトおよび／もしくはヒドロキシまたはアシルオキシ基が存在する、本発明による化合物を意味する。
特別な型の化合物、例えば「コール酸化合物」または「ウルソデオキシコール酸化合物」は、特に基礎となる出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸）の誘導体も意味する。
前記誘導体には「塩」、例えば化合物のリチウム、ナトリウム、およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩；ならびにアンモニウム塩が含まれ、ここでアンモニウム塩にはＮＨ４ ＋塩または少なくとも１個の水素原子がＣ１−Ｃ６アルキル残基によって置換されていてもよいアンモニウム塩が含まれる。典型的なアルキル残基は特に、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル−、ｎ−、ｓｅｃ−、またはｔｅｒｔ−ブチルのようなＣ１−Ｃ４アルキル残基、およびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、ならびにこれらの一回または複数回の分岐類似体である。
本発明による化合物の「アルキルエステル」は、特に低級アルキルエステル、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルである。限定されない例として、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピル−、ｎ−、ｓｅｃ−、もしくはｔｅｒｔ−ブチルエステル、または長鎖エステル、例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステル、ならびにこれらの一回または複数回の分岐類似体を言及することができる。
「アミド」は特に、本発明による酸と、アンモニアまたは一級もしくは二級モノアミンとの反応生成物である。このようなアミンは例えばモノ−もしくはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルモノアミンであり、ここでアルキル残基は任意に、互いに独立して、例えばカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびスルホン酸基によりさらに置換されてもよい。
本発明による「アシル基」は特に、２〜４の炭素原子を有する非芳香族基、例えばアセチル、プロピオニル及びブチリル、ならびに任意に置換された単環式芳香族環を有する芳香族基であり、適する置換基は、例えばヒドロキシル、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ及びＣ１−Ｃ６アルキル基、例えばベンゾイルまたはトルオイルから選択される。
本発明にしたがって用いられるか又は調製されるヒドロキシステロイド化合物、例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、および７−ケト−リトコール酸は、立体異性的に純粋な形態またはその他の立体異性体と混合した状態で、本発明による方法において用いるか、または該方法により得ることができる。しかしながら、使用または調製される化合物は、好ましくは立体異性的に実質的に純粋な形態で使用されるかまたは分離されるのがよい。
構造式、化学名、および重要な化学化合物に用いた略語を以下の表に示す。
Figure 0006199742
Figure 0006199742
Figure 0006199742
２．タンパク質
本発明は、具体的に開示した、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ又は３α−ＨＳＤＨの活性を有するタンパク質又は酵素、もしくはそれらの変異体に限定されるものではなく、むしろそれらの機能的均等物にも及ぶ。
具体的に開示した酵素の「機能的均等物」または類似体は、本発明との関連において、それらとは異なるが、なお所望の生物活性、例えば７β−ＨＳＤＨ活性を有するポリペプチドである。
例えば「機能的均等物」は、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨの活性について用いられる試験において、本明細書に定義するアミノ酸配列を含む出発酵素の活性の少なくとも１％、例えば少なくとも１０％もしくは２０％、例えば少なくとも５０％もしくは７５％もしくは９０％高いかまたは低い活性を有する酵素として理解される。
また、機能的均等物は、ｐＨ４〜１１の範囲で好ましく安定であり、ｐＨ６〜１０の範囲、例えば特にｐＨ８．５〜９．５のような範囲に最適ｐＨを有し、１５℃〜８０℃、または２０℃〜７０℃、例えば約４５〜６０℃、または約５０〜５５℃の範囲に最適温度を有するのがよい。
７β−ＨＳＤＨの活性は、公知の様々な試験を用いて検出できる。これに限定されるものではないが、本発明者らは、実験についての項で定義するような標準化された条件下で、参照基質、例えばＣＡまたはＤＨＣＡを用いる試験に言及することができる。
ＦＤＨ、ＧＤＨ又は３α−ＨＳＤＨの活性を決定するための試験もまた、それ自体が公知である。
本発明の「機能的均等物」は特に、前述のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置に、具体的に記載したアミノ酸を有する「変異体」であるが前述の生物活性の一つを有する「変異体」もまた意味する。従って「機能的均等物」には、１以上、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得られた変異体が含まれ、記載した変化はいずれの配列位置に起こってもよい。ただし、それらが本発明による性質を有する変異体を導くものに限る。機能的均等物は特に、変異体と未変異のポリペプチドとの間の反応性のパターンが定性的に一致する場合、即ち、例えば同一の基質が異なる速度で変換される場合にも得られる。適切なアミノ酸置換の例を以下の表に示す。
Figure 0006199742
上記の意味での「機能的均等物」はまた、記載するポリペプチドの「前駆体」ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
「前駆体」は、所望の生物活性を有しているか又は有していない、ポリペプチドの天然又は合成の前駆体である。
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子の、カルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知である様式において調製可能であり、これには無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛の塩、ならびに有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン及びピペリジンなどのようなアミンの塩が含まれる。酸付加塩、例えば塩酸または硫酸のような無機酸による塩、ならびに酢酸およびシュウ酸のような有機酸による塩もまた、本発明の対象である。
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」もまた、公知の技術を用いて機能的アミノ酸の側鎖基上もしくはそれらのＮ末端又はＣ末端に調製することができる。このような誘導体には、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応によって調製される遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が含まれる。
もちろん「機能的均等物」には、その他の生物から得られるポリペプチド、および天然の変異体も含まれる。例えば配列比較によって相同配列領域を見出すことができ、本発明の具体的指示によって均等な酵素を決定できる。
「機能的均等物」にはまた、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフであり、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明によるポリペプチドの断片も含まれる。
また、「機能的均等物」は、前述のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的均等物の一つ、および少なくとも一つのさらなる、それとは機能的に異なる、機能的Ｎ−またはＣ−末端結合における非相同性配列（すなわち融合タンパク質部分に、互いに実質的な機能的障害のない）を有する融合タンパク質である。前記非相同性配列の限定されない例として、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカー、または酵素が挙げられる。
本発明による「機能的均等物」には、具体的に開示したタンパク質の相同体も含まれる。これらは、具体的に開示したアミノ酸配列の一つに対し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムに従って算出された、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性（または同一性）を有する。本発明による相同ポリペプチドのパーセント相同性または同一性は、特に、本明細書に具体的に開示したアミノ酸配列の一つの全長に対するアミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。
パーセント同一性の値は、ＢＬＡＳＴアラインメント、ｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムに基づき、または以下に述べるＣｌｕｓｔａｌ設定を用いても決定できる。
タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による「機能的均等物」には、上で指定した型のタンパク質の脱グリコシル化型またはグリコシル化型、およびグリコシル化のパターンを変化させることによって得られる改変型が含まれる。
本発明によるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、例えば点突然変異、タンパク質の延長または短縮により変異を誘発して産生できる。
本発明によるタンパク質の相同体は、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって同定できる。例えばタンパク質変異体の多様なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアルな変異誘発によって、例えば合成オリゴヌクレオチド混合物の酵素的な連結によって産生できる。縮重オリゴヌクレオチド配列に由来する、潜在的な相同体ライブラリーの調製に使用できる非常に多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機を用いて行うことができ、合成遺伝子は次に、適切な発現ベクター内へ連結することができる。遺伝子の縮重セットを用いることによって、所望の潜在的タンパク質配列のセットをコードする全ての配列を、一混合物中に提供することが可能になる。縮合オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である（例えばNarang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477）。
点突然変異または短縮によって産生されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された性質を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための幾つかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアルな変異誘発によって産生された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適用できる。ハイスループット分析に基づく大きな遺伝子バンクのスクリーニングに最もよく用いられる技術は、遺伝子バンクを複製可能な発現ベクター内にクローニングすること、得られたベクターバンクによって適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの分離が容易となる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。相同体を同定するため、バンク内の機能的変異体の頻度を増大させる技術であるＲｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＲＥＭ）が、スクリーニング試験と組み合わせて使用できる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331）。
本発明はさらに、本明細書において明確に参照される、本出願者による以前の国際特許出願であるPCT/EP2010/068576号に記載されるように、コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６に由来する７β−ＨＳＤＨの野生型の使用を含む。
コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９から得られるこの７β−ＨＳＤＨは特に、少なくとももう一つの以下の性質、例えばこのような性質のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つもしくはこのような性質の全てによって特徴付けられる：
ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）：約２８〜３２ｋＤａ、特に約２９〜３１ｋＤａまたは約３０ｋＤａ；
ｂ）分子量（ゲル濾過、特にＳＤＳを含まないような未変性条件）：約５３〜６０ｋＤａ、特に約５５〜５７ｋＤａ、例えば５６．１ｋＤａ。これにより、コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９由来の７β−ＨＳＤＨの二量体の性質が証明される；
ｃ）７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基を７β−水酸基とする立体選択的な還元；
ｄ）ｐＨ８．５〜１０．５、特にｐＨ９〜１０の範囲での、ＵＤＣＡの酸化のための最適ｐＨ；
ｅ）ｐＨ３．５〜６．５、特にｐＨ４〜６の範囲での、ＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元のための最適ｐＨ；
ｆ）以下の表に示す少なくとも１つの基質／補因子に対する、以下の表の少なくとも１つの動的パラメータが；以下の表のそれぞれの場合において具体的に示す値の±２０％の範囲、特に±１０％、±５％、±３％、±２％、または±１％付近にあること。
Figure 0006199742
ｇ）モルモット（Cavia porcellus）、ヒト（Homo sapiens）、およびマウス（Mus musculus）を含む動物１１β−ＨＳＤＨの亜群に関連する、コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９由来の、原核生物の７β−ＨＳＤＨの系統学的な配列類似性。
例えば、この７β−ＨＳＤＨは以下の性質または性質の組合せを示す：ａ）；ｂ）；ａ）及びｂ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）及びｅ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）及びｅ）及びｆ）を示す。
この種類の７β−ＨＳＤＨ又はそれに由来する機能的均等物はさらに、
ａ）７−ケトステロイドを対応する７β−ヒドロキシステロイドへと立体特異的に還元すること、及び／又は
ｂ）ステロイド骨格上の７位のケト基および少なくとも１つのさらなるケト基を含むケトステロイドを対応する７β−ヒドロキシステロイドへと部位特異的にヒドロキシル化すること、例えば特に７位のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）により、対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸へ触媒され、かつ、例えばこれはＮＡＤＰＨ依存性であること
によって特徴付けられる。
前記７β−ＨＳＤＨは特に、配列番号２（寄託番号：ＺＰ＿０１７７３０６１）によるアミノ酸配列を有するか、又はこれに由来し且つこの配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９％９、または９９．５％の同一性の程度を有する配列を有し；任意に以下の性質の１つまたは性質の組合せ：上記の定義に従ったａ）；ｂ）；ａ）及びｂ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）及びｅ）；ａ）及び／又はｂ）及びｃ）及びｄ）及びｅ）及びｆ）によってさらに特徴付けられる。
３．核酸および構築物
３．１ 核酸
本発明はまた、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨおよび／または３α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素およびその変異体をコードする核酸配列にも関する。
本発明はまた、本明細書に具体的に記載する配列に対し、特定の程度の同一性を有する核酸にも関する。
二つの核酸間の「同一性」は、それぞれの場合における核酸の全長に対するヌクレオチドの同一性、特にＣｌｕｓｔａｌ法を用いるＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１ソフトウェア（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2): 151-1）により、以下のパラメータを設定して比較により算出した同一性を意味する。
Figure 0006199742
あるいは、同一性は以下のパラメータにより、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500に従い、インターネットアドレス：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#に従って決定することもできる。
Figure 0006199742
本明細書で言及した全ての核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ヌクレオチド構成要素からの化学合成により、例えば個々の重複である、二重らせんの相補的な核酸構成要素のフラグメント縮合により、それ自体が公知である方法で産生できる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホラミダイト法による公知の方法で実行できる（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの付加、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いたギャップの充填、連結反応、および一般的なクローニング技術については、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
本発明はまた、上記ポリペプチドの一つおよびその機能的均等物をコードする核酸配列 （一本鎖および二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）にも関し、これらは例えば人工のヌクレオチド類似体を用いて入手可能である。
本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性のある部分をコードする単離された核酸分子、および例えば本発明によるコード核酸の同定もしくは増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用できる核酸断片の両方に関する。
本発明による核酸分子は、コード遺伝子領域の３’ 末端及び／又は５’末端の非翻訳配列をさらに含んでもよい。
本発明は、具体的に記載するヌクレオチド配列またはその一部に相補的な核酸分子をさらに含む。
本発明によるヌクレオチド配列は、その他の細胞型および生物における相同配列の同定及び／又はクローニングに使用できるプローブおよびプライマーの産生を可能にする。これらのプローブまたはプライマーはしばしば「ストリンジェント」な条件下で（以下を参照）、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０、または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在するその他の核酸分子から分離されており、さらにそれが組換え技術によって産生される場合には、その他の細胞性物質または培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には、化学物質前駆体またはその他の化学物質を含まない。
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技術および本発明により提供される配列情報を用いて単離できる。例えばｃＤＮＡは、具体的に開示する完全配列またはその部分の一つをハイブリダイゼーションプローブとして用い、標準的なハイブリダイゼーション技術（例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるような）によって適切なｃＤＮＡライブラリーから単離できる。さらに、開示する配列またはその部分の一つを含む核酸分子は、この配列に基づいて準備したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。このように増幅した核酸は、適切なベクター内へクローン化することができ、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いた標準的な合成技術によっても産生できる。
本発明による核酸配列またはその誘導体、相同体またはこれらの配列の一部は、例えば通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術によって、その他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを通して単離できる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で本発明による配列にハイブリダイズする。
「ハイブリダイズ」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、標準的な条件下でほとんど相補的な配列に結合する能力を意味するが、これらの条件下では非相補的な相手との間で非特異的な結合は起こらない。このため、９０〜１００％相補的であってよい。相補的な配列が互いに特異的に結合する性質は、例えばノーザンもしくはサザンブロットにおいて、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用される。
ハイブリダイゼーションには、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に用いられる。しかしながらハイブリダイゼーションには、本発明による核酸の長めの断片または完全配列を用いることもまた可能である。これらの標準的な条件は、使用する核酸（オリゴヌクレオチド、長めの断片または完全配列）に依存して、またはどのような型の核酸、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、がハイブリダイゼーションに用いられるかに依存して異なる。従って例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点は、同一の長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのそれよりもおおよそ１０℃低い。
標準的な条件は、例えば核酸に依存して、０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）濃度の緩衝水溶液中で４２〜５８℃の温度、またはさらに、５０％ホルムアミドの存在下で、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドにおいて４２℃を意味する。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約２０℃〜４５℃の温度、好ましくは約３０℃〜４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して、有利なハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約３０℃〜５５℃の温度、好ましくは約４５℃〜５５℃である。ハイブリダイゼーションに対して記載したこれらの温度は、例えばホルムアミドの非存在下で、おおよそ１００ヌクレオチドの長さの核酸、および５０％のＧ＋Ｃ含量を有する核酸について算出した融点の値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの型、またはＧ＋Ｃ含量に依存して当業者に公知の式から算出できる。当業者は、ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を以下の教科書に見出すことができる：Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
「ハイブリダイゼーション」は特に、ストリンジェントな条件下で起こる。これらのハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件は特に、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌの変性および切断したサケ精子ＤＮＡからなる溶液中での、４２℃における一晩のインキュベーションと、それに続く０．１×ＳＳＣを用いた６５℃における膜洗浄工程として理解される。
本発明はまた、具体的に開示したかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。
よって、本発明のさらなる核酸配列は、例えば配列番号１、５、７、１４、１９、３４、または４７由来であるのがよく、かつ単一もしくは幾つかのヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失によってそれとは異なるが、所望の性質を有するポリペプチドをさらにコードする。
本発明は、いわゆるサイレント変異を含むか、または特別な独自の、もしくは宿主生物のコドン使用に対応し、具体的に開示した配列と比較して変化した核酸配列、および天然の変異体、例えばそれらのスプライス変異体または対立遺伝子変異体もまた網羅する。
本発明はまた、保存されたヌクレオチド置換（すなわち問題のアミノ酸が、同じ電荷、大きさ、極性および／または溶解度のアミノ酸によって置き換えられる）によって得られる配列にも関する。
本発明はまた、具体的に開示する核酸の配列多型に由来する分子にも関する。これらの遺伝的多型性は、自然変動による集団内の個体間に存在し得る。これらの自然変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列内に１〜５％の変動をもたらす。
配列番号１、５、７、１４、１９、３４又は４７を有する、本発明の核酸配列の誘導体は、例えば全配列領域に対し、由来するアミノ酸レベルで少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する対立遺伝子変異体を意味する（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについての上記情報を参照のこと）。相同性は、配列の一部領域において高くなってもよい。
さらに、誘導体は、本発明の核酸配列、特に配列番号１、５、７、１４、１９、３４又は４７の相同体、例えば真菌または細菌相同体、短縮配列、コードおよび非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとしても理解される。例えば配列番号１、５、７、１４、１９、３４又は４７に対する相同体は、配列番号１、５、７、１４、１９、３４又は４７に示される全ＤＮＡ領域に対して、ＤＮＡレベルで少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、さらに特に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
また、誘導体は、例えばプロモーターとの融合物として理解される。記載するヌクレオチド配列の前に存在するプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、逆位および／または欠失により、プロモーターの機能性または有効性を損なうことなく変化してもよい。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を変化させることで増大可能であるか、または例え異なる種の生物のものであっても、さらに有効なプロモーターと完全に交換してもよい。
さらに、機能的変異体の産生方法が当業者に公知である。
使用した技術により、当業者は、完全にランダムであるかまたは標的化された変異を遺伝子内または非コード核酸領域（これらは例えば発現調節に重要である）にも挿入して、遺伝子バンクを準備する。これに必要とされる分子生物学の方法は当業者に公知であり、例えばSambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
遺伝子を改変するため、およびそれ故に、その遺伝子がコードするタンパク質を改変するための方法は当業者に長く親しまれており、例えば、
−遺伝子の単一または幾つかのヌクレオチドに標的化した交換をもたらす部位特異的変異誘発（Trower MK (Publ.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、
−遺伝子のいずれかの部位で、いずれかのアミノ酸のコドンが交換または付加され得る飽和変異誘発（Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22: 541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3: 1）、
−不正確に機能するＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチド配列が変異する、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（エラープローンＰＣＲ）（Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18: 3739）；
−例えばＤＮＡ修復機構の欠陥のため、ヌクレオチド配列の変異率が増大している変異誘発株における、遺伝子の継代（Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Publ.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、または
−密接に関連した遺伝子のプールを形成し、これを消化して断片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用い、鎖の分離と再度の結合を繰り返すことにより、最終的に完全長のモザイク遺伝子を産生するＤＮＡシャッフリング（Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747）
のようなものがある。
いわゆる進化分子工学（とりわけ、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200: 31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Publ.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載される）を用い、当業者は標的化された様式において機能的変異体を大量に産生できる。第１の工程では最初に、例えば上記の方法を用いてそれぞれのタンパク質の遺伝子バンクを産生する。遺伝子バンクは適切な方法で、例えば細菌によって、またはファージディスプレイによって発現される。
所望の性質に大きく一致する性質を有する機能的変異体を発現する宿主生物の関連する遺伝子は、変異の別のラウンドへ供することができる。変異の工程および選択またはスクリーニングは、存在する機能的変異体が所望の性質を十分な程度有するまで反復できる。この反復される手順により、工程において限られた数の変異、例えば１〜５の変異を実施でき、かつ関連する酵素の性質におけるそれらの影響について評価、選択が為される。選択した変異体は次に同様の別の変異工程に供してよい。結果として、検討するべき個々の変異体の数を著しく減少させることができる。
本発明による結果は、問題となる酵素の構造および配列についての重要な情報を提供するが、これは所望の改変された性質を有するさらなる酵素の標的化された生成に必要なものである。特に、いわゆる「ホットスポット」はすなわち標的化された変異の導入によって酵素の性質を改変するために適する可能性のある配列部分として定義できる。
３．２ 構築物
本発明はさらに、調節性核酸配列の遺伝的制御の下に、本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物；および少なくとも１つのこれらの発現構築物を含むベクターに関する。
本発明による「発現ユニット」は、本明細書に定義するように、プロモーターを含む、発現活性を有する核酸を意味し、これは発現される核酸または遺伝子との機能的結合の後、発現、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節する。従ってこれに関連して「調節性核酸配列」との用語も用いられる。プロモーターに加え、その他の調節性エレメント、例えばエンハンサーも存在してよい。
本発明による「発現カセット」または「発現構築物」は、発現される核酸または発現される遺伝子に機能的に結合した発現ユニットを意味する。発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列のみではなく、転写および翻訳の結果、タンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
本発明に関連する用語「発現」または「過剰発現」は、対応するＤＮＡによってコードされる、微生物内での１以上の酵素の細胞内活性の発生または増大を表す。このために、例えば遺伝子を生物に挿入し、存在する遺伝子を別の遺伝子によって置換し、単数または複数の遺伝子のコピー数を増加させ、強力なプロモーターを使用するか、または高い活性をもつ対応する酵素をコードする遺伝子を使用し、かつこれらの方法を任意に組み合わせることができる。
好ましくは、本発明による前記構築物はそれぞれのコード配列の５’上流にプロモーター、および３’下流にターミネーターの配列を含み、任意に通常の調節性エレメントをさらに含み、それぞれの場合にこれらはコード配列に作動的に結合している。
本発明による「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」は、転写される核酸に機能的に結合し、前記核酸の転写を調節する核酸を意味する。
これとの関連において、「機能的」または「作動的」結合は、例えばプロモーター活性を有する一つの核酸及び転写される核酸配列及び任意であるさらなる調節性エレメント、例えば核酸の転写を確実にする核酸配列、並びに例えばターミネーターを、各調節性エレメントが核酸配列の転写においてその機能を果たすことができるような方法で連続的に配置することを意味する。これは、化学的な意味での直接結合は必要とされない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、標的配列におけるそれらの機能を、さらに離れた位置から、またはその他のＤＮＡ分子からであっても発現できる。配置は、二つの配列が共有結合的に連結されるように、転写される核酸配列がプロモーター配列の後に（例えば３’末端に）位置することが好ましい。プロモーター配列と導入遺伝子の発現を起こす核酸配列との間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対未満、または５０塩基対未満であってよい。
プロモーターおよびターミネーターに加え、言及してもよいその他の調節性エレメントの例として、標的指向化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択性マーカー、増幅シグナル、複製開始点などが挙げられる。適切な調節性配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
本発明の核酸構築物は、特に配列番号１、５、７、１４、１９、３４又は４７、もしくはそれらの誘導体および相同体の配列、ならびにそれらに由来し得る核酸配列を含み、これらは、遺伝子発現を制御、例えば増大させるための調節性シグナルの１以上と作動的または機能的に結合してもよい。
これらの調節性配列に加え、これらの配列の天然の調節がなお実際の構造遺伝子の前に存在し、この天然の調節をオフにして遺伝子の発現が増大するように、任意に遺伝的に改変することができる。しかしながら、核酸構築物はさらに単純に構築してもよく、すなわち追加の調節性シグナルをコード配列の前に挿入せず、天然プロモーターとその調節を除去しなくてもよい。代わりに、調節性配列は、調節がもはや起こらず、遺伝子発現が増大するように変異させられる。
好ましい核酸構築物はまた、プロモーターに機能的に連結した、前述の「エンハンサー」配列を１つ以上有するのがよく、これによって核酸配列の発現の増大が可能になる。さらなる調節性エレメントまたはターミネーターのようなさらなる有利な配列もまた、ＤＮＡ配列の３’末端に挿入できる。構築物は、本発明の核酸を１コピー以上含んでもよい。構築物はまた、任意に構築物を選択するための、抗生物質耐性または栄養要求性の補完遺伝子のようなマーカーをさらに含んでもよい。
適切な調節性配列の例は、グラム陰性菌への応用に有利であることが見出された、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ラムダ−ＰＲのようなプロモーター、またはラムダ−ＰＬプロモーター内に含まれる。さらなる有利な調節性配列が、例えばグラム陽性菌プロモーターであるａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母または真菌プロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ内に含まれる。人工プロモーターもまた調節のために用いられてよい。
宿主生物内での発現のため、核酸構築物は、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にするベクター、例えばプラスミドまたはファージ内へ挿入されるのがよい。プラスミドおよびファージとは別に、ベクターは、当業者に公知のその他の全てのベクター、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、およびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および線状または環状ＤＮＡとしても理解される。これらのベクターは、宿主生物内で自律的に複製できるか、または染色体において複製できる。これらのベクターは本発明の別の構成を表す。
適切なプラスミドは、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセスにおけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、もしくはｐＩＪ３６１、バチルスにおけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウムにおけるｐＳＡ７７、もしくはｐＡＪ６６７、真菌におけるｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２、もしくはｐＢＢ１１６、酵母における２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、または植物におけるｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、もしくはｐＤＨ５１である。前述のプラスミドは、可能性のあるプラスミドのうちの少数の選択を示している。さらなるプラスミドは当業者に公知であり、例えば書籍、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）に見出すことができる。
ベクターの別の構成によれば、本発明の核酸構築物又は本発明の核酸を含むベクターもまた、線状ＤＮＡの形態で微生物内へ挿入できるのがよく、非相同性または相同性組換えによって、宿主生物のゲノム内へ組み込むことができる。線状ＤＮＡは、線状にしたプラスミドのようなベクターから、または本発明による核酸構築物もしくは核酸のみからなってよい。
生物における異種性遺伝子の最適な発現のため、該生物で用いられる特定の「コドン使用」に従って核酸配列を改変するのがよい。「コドン使用」は、問題となる生物のその他の既知遺伝子についてのコンピュータ計算に基づいて容易に決定できる。
本発明の発現カセットは、適切なプロモーターと適切なコードヌクレオチド配列を、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルと融合させることで調製できる。このためには、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)及びT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されるような通常の組換えおよびクローニング技術が用いられる。
適切な宿主生物内での発現のため、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的なベクター内へ挿入されるのがよい。ベクターは当業者に公知であり、例えば「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Pouwels P. H. et al., Publ., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）に見出すことができる。
４．微生物
状況に応じ、用語「微生物」は出発（野生型）微生物、遺伝的に改変した組換え微生物、または両方を意味する。
本発明によるベクターを用いて組換え微生物を産生することができ、該微生物は、例えば本発明のベクターの少なくとも１つによって形質転換され、本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる。上記の本発明による組換え構築物は、適切な宿主系に導入されて発現されるのがよい。好ましくは、当業者に公知のクローニング及びトランスフェクションの方法、例えば共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いて、それぞれの発現系において記載される核酸の発現をもたらす。適切な系は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ., Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。タンパク質の異種性発現のための、細菌発現系についての総説もまた、例えばTerpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222に提供される。
原則として、全ての原核生物または真核生物の生物が、本発明の核酸又は核酸構築物のための組換え宿主生物として考慮することができる。細菌、真菌又は酵母などの微生物を宿主生物として用いるのがよい。グラム陽性菌またはグラム陰性菌を用いるのがよく、好ましくは腸内細菌科、シュードモナス（Pseudomonaceae）科、リゾビウム（Rhizobiaceae）科、ストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、又はノカルジア（Nocardiaceae）科の細菌、特に好ましくはエシェリキア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ノカルジア（Nocardia）、バークホルデリア（Burkholderia）、サルモネラ（Salmonella）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、又はロドコッカス（Rhodococcus）属の細菌を用いるのがよい。大腸菌の属および種が非常に好ましい。さらなる有利な細菌は、アルファプロテオバクテリア（alpha-proteobacteria）、ベータプロテオバクテリア（beta-proteobacteria）、又はガンマプロテオバクテリア（gamma-proteobacteria）の群に見出すことができる。
本発明の単数または複数の宿主生物は、上記の定義に従って７β−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする、本発明に記載の核酸配列、核酸構築物、またはベクターの少なくとも一つを好ましく含む。
本発明の方法で用いられる生物は、宿主生物により、当業者に公知の方法で増殖または培養される。微生物は、原則として一般に糖の形態である炭素源、一般に酵母抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形態である窒素源、鉄、マンガン、マグネシウム塩のような微量元素、および任意にビタミンを含む液体培地中で、０℃〜１００℃の温度、好ましくは１０℃〜６０℃にて、酸素通気により増殖する。液体栄養培地のｐＨは固定値に維持してよい。即ち増殖の間に調節してもしなくてもよい。培養はバッチ式、半バッチ式、または連続して行う。栄養素は発酵開始時に供給するか、または半連続的もしくは連続的に補充してよい。
５．ＵＤＣＡの調製
工程１：ＣＡからＤＨＣＡへの化学反応
ＣＡの水酸基を、クロム酸または酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸塩によって、古典的化学経路によりそれ自体が公知の方法でカルボニル基へと酸化させる。ＤＨＣＡを形成する。
工程２：ＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的または微生物的変換
水溶液中で、ＤＨＣＡを、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨまたはその変異体により、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下で特異的に１２−ケト−ＵＤＣＡへと還元する。補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、ＡＤＨまたはＦＤＨまたはＧＤＨまたはそれらの変異体によって、イソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースから再生できる。反応は穏和な条件下で進行する。例えば、反応はｐＨ＝６〜９、特に約ｐＨ＝８、および約１０〜３０℃、１５〜２５℃、または約２３℃にて行ってよい。
微生物的反応工程の場合、必要な一つまたは二つ以上の酵素活性を発現する組換え微生物を、変換される基質（ＤＨＣＡ）の存在下で、嫌気的又は好気的に適切な液体培地中で培養することができる。適切な培養条件は、それ自体が当業者に公知である。これらは例えばｐＨ５〜１０又は６〜９の範囲、１０〜６０℃又は１５〜４５℃又は２５〜４０℃の温度範囲又は３７℃における反応を含む。適切な培地は例えば以下に記載するＬＢおよびＴＢ培地を含む。反応は、例えばバッチ式もしくは連続式またはその他の通常の方法の変異形（上記のような）で生じさせることができる。反応時間は例えば数分〜数時間または数日の範囲で起こってよく、例えば１時間〜４８時間であってよい。酵素活性が連続的に発現しない場合、標的細胞密度が例えば約ＯＤ６００＝０．５〜１．０に達した後、任意に、適切な誘導物質を添加することによってこれを誘導することができる。
発酵方法、培地への添加、酵素の固定化、および有用な物質の分離に関する微生物的産生方法の可能なさらなる適切な改変は、「酵素または変異体の産生」に関する以下の項にも見出すことができる。
工程３：１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基を、それ自体が公知である方法でヴォルフ−キシュナー還元により除去し、１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡを形成する。反応では、最初にカルボニル基とヒドラジンが反応してヒドラゾンとなる。次にヒドラゾンを塩基（例えばＫＯＨ）の存在下で２００℃に熱し、窒素の開裂によりＵＤＣＡを形成する。
６．酵素および変異体の組換え産生
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは機能的で生物学的に活性のあるその断片の組換え産生方法に関し、ポリペプチドを産生する微生物が培養され、任意にポリペプチドの発現が誘導され、培養から後者が分離される。ポリペプチドは所望により、この方法によって工業的規模でも産生できる。
本発明により産生した微生物は、連続的にもしくはバッチ法（バッチ培養）において非連続的に、または流加もしくは反復流加法において培養できる。公知の培養法についての総説は、Chmielの教科書（（Bioprozestechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess engineering] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment]) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994）に見出すことができる。
使用する培地は、各々の株の要求を適切に満たさなければならない。様々な微生物のための培地についての記述は、American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)による冊子「Manual of Methods for General Bacteriology」に見出される。
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常１以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類、または多糖類のような糖類である。非常に良好な炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースである。糖はまた、糖蜜、または製糖過程におけるその他の副生成物のような複合化合物を通して培地に添加してもよい。様々な炭素源の混合物を加えることも有利であり得る。可能なその他の炭素源は、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂ならびに脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸のような脂肪酸、グリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコール、および酢酸または乳酸のような有機酸である。
窒素源は通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例として、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、もしくは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などのような複合窒素源が挙げられる。窒素源は個別に、または混合物として用いてよい。
培地中に含まれてもよい無機塩化合物として、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が挙げられる。
使用される硫黄源は、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物のような無機硫黄化合物であってよいが、メルカプタンおよびチオールのような有機硫黄化合物であってもよい。
使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩であってよい。
金属イオンを溶液中に保持するため、培地にキレート剤を添加してよい。特に適切なキレート剤は、カテコールもしくはプロトカテク酸のようなジヒドロキシフェノール類、またはクエン酸のような有機酸を含む。
本発明に従って用いる発酵培地は通常、ビタミン、または例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンを含む増殖促進物質のようなその他の増殖因子も含む。増殖因子および塩は、しばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどのような培地の複合成分に由来する。さらに、培地には適切な前駆体も添加できる。培地中の化合物の的確な組成物は特定の実験に強く依存し、それぞれの特定の事例に対して個別に決定される。培地の最適化についての情報は、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」（Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）に見出すことができる。増殖培地は、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、ＤＩＦＣＯ）などのように、市販業者からも入手可能である。
培地の全ての成分は、熱（１．５バール、１２１℃にて２０分）によるか、または無菌濾過によって滅菌される。成分は必要に応じて、共に、または別々に滅菌してよい。培地の全ての成分は、培養開始時に含まれていてよいか、または連続式もしくはバッチ式により任意に添加されてもよい。
培養温度は通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、実験の間、一定に保つか、または変化させてもよい。培地のｐＨは５〜８．５の範囲、好ましくは７．０付近でなければならない。培養ｐＨは、培養の間に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水のような塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸のような酸性化合物を添加することによって制御できる。発泡を制御するため、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤の使用が可能である。プラスミドの安定性を維持するため、抗生物質のような適切な選択的作用物質を培地に添加してよい。好気性の状態を維持するため、酸素または外気のような酸素を含むガス混合物が培養中に供給される。培養温度は通常２０℃〜４５℃である。培養は所望の産物が最大に形成されるまで継続される。この目標は通常１０時間〜１６０時間以内に達成される。
発酵ブロスはその後さらに処理される。必要に応じ、バイオマスは遠心分離、濾過、デカント、もしくはそれらの方法の組合せのような分離技術によって発酵ブロスから完全にもしくは部分的に除去されるか、または完全に残してもよい。
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、細胞を破砕し、タンパク質分離の既知の方法によってライセートから産物を得ることもできる。細胞は、高周波数超音波により、高圧により、例えばフレンチプレス内で、オスモリシス（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）によって、界面活性剤、溶菌酵素、もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーを用いて、またはここに挙げた方法の幾つかの併用によって任意に破砕できる。
ポリペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィー法、ならびに限外濾過、結晶化、塩析、透析、および非変性ゲル電気泳動のようなその他の通常の方法によって精製できる。適切な方法は、例えばCooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Methods of Biochemical Processing], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York又はScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載される。
組換えタンパク質を分離するため、規定のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを延長することで、例えばより簡便な精製に役立つ改変したポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いるのがよい。この種の改変は、例えばアンカーとして機能するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカー、または抗体により抗原として認識可能なエピトープとして知られる改変である（例えばHarlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載される）。これらのアンカーは、固体担体、例えばクロマトグラフィーカラムに充填可能であるか、またはマイクロタイタープレート上もしくはその他の担体上で使用できるポリマーマトリックスにタンパク質を付着させるために役立つ。
同時に、これらのアンカーはタンパク質の認識のためにも用いることができる。タンパク質の認識のために、蛍光色素のような通常のマーカーに加え、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが、単独またはタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組合せて使用することができる。
７．酵素の固定化
本明細書に記載する方法において、本発明の酵素は、遊離で、または固定化して用いることができる。固定化酵素は、不活性の支持体に固定された酵素として理解される。適切な支持体材料およびその上への酵素の固定化は、EP-A-1149849号、EP-A-1 069 183号、およびDE-OS 100193773号、ならびにそれらに引用される参考文献から公知である。これに関しては、これらの文献の開示全体が参照される。適切な支持体材料として、例えば粘土、カオリナイトのような粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換材料、ポリスチレンのような合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンのようなポリオレフィンが挙げられる。支持された酵素の調製のため、支持体材料は通常微粉化した粒子状の形態で用いられ、多孔性の形態を有することが好ましい。支持体材料の粒径は通常５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下である（粒径分布曲線）。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを用いる場合にも、遊離型または固定化型を選択できる。支持体材料は、例えばアルギン酸カルシウム、およびカラギーナンである。酵素および細胞は、グルタルアルデヒドにより直接架橋することもできる（ＣＬＥＡへの架橋）。対応するさらなる固定化方法は、例えばJ. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" 及びK. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載される。
実験についての項
特記しない限り、本発明との関連において行われるクローニング工程、例えば制限酵素による切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへの核酸の転写、ＤＮＡ断片の連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、および組換えＤＮＡの配列分析は、Sambrook et al. (1989) op. citに記載されるように行われる。
Ａ．一般情報
材料：
コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９（ＡＴＣＣ ２５９８６、以前の命名はユーバクテリウム−アエロファシエンス）のゲノムＤＮＡは、ドイツ微生物・培養細胞コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＤＳＭＺ）から入手した。ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡはそれ自体が公知の出発化合物であり、文献に記載されている。その他の全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｌｕｋａ（ドイツ）から入手した。全ての制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、およびイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はＦｅｒｍｅｎｔａｓ（ドイツ）から入手した。
培地：
培地１リットルあたりトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを含むＬＢ培地。
培地１リットルあたりトリプトン１２ｇ、酵母抽出物２４ｇ、４ｍＬ グリセロール、１０％ ＴＢ緩衝液（１１．５５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、６２．７ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、Ｈ２Ｏにより全量５００ｍＬへ）を含むＴＢ培地。
Wilms et al., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2001 VOL. 73, No. 2, 95-103に従って改変した最少培地。
発現ベクターおよびベクター構築物
組換えタンパク質の発現のため、公知である以下の発現ベクターを用いた：
ｐＥＴ２１ａ（＋）（図３ａを参照）
ｐＥＴ２２ｂ（＋）（図３ｂを参照）
ｐＥＴ２８ａ（＋）（図３ｄを参照）および
ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１
（それぞれＮｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）。
ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）およびｐＥＴ２２ｂ（＋）はそれぞれマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を有し、各々の場合にＴ７−プロモーターの制御下で、下流にｌａｃ−オペレーターとそれに続くリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を有する。各々の場合に、発現ドメインのＣ−末端領域にＴ７−ターミネーターを有する。両プラスミドは、ＣｏｌＥ１−レプリコン（ｐＢＲ３２２−レプリコン）、アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）、ｆ１−複製開始点、及びｌａｃ−インヒビター（ｌａｃＩ）をコードする遺伝子を有する。
また、ｐＥＴ２１ａ（＋）プラスミドは、ＭＣＳのＮ−末端領域にＴ７タグを有し、ＭＣＳのＣ−末端に任意にＨｉｓタグを有する。ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドは、ＭＣＳのＮ−末端領域にｐｅｌＢシグナル配列を有し、ＭＣＳのＣ−末端にＨｉｓタグを有する。
ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１ベクターは二つのＭＣＳを有し、それぞれがＴ７−プロモーターの制御下で、下流にｌａｃ−オペレーターとそれに続くリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を有する。二つのＭＣＳのＣ−末端にはＴ７−ターミネーターが存在する。さらにこのベクターは、ｌａｃ−インヒビターをコードする遺伝子およびＣＯＬＡ−レプリコン（ＣｏｌＡ−レプリコン）を有する。
本研究では、市販のｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１ベクターを改変した変異体を用いた。この改変プラスミド変異体（ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）と命名；図３ｃを参照））では、元のベクターのカナマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子により置換した。加えて、部位特異的点突然変異誘発によってクロラムフェニコール耐性遺伝子からＮｃｏＩ制限酵素部位を除去した。第１のＭＣＳのＮ末端領域にはＨｉｓタグが存在するが、第２のＭＣＳのＣ−末端にはＳタグが存在する。
ｐＥＴ−プラスミドのＣｏｌＥ１−レプリコンとｐＣＯＬＡ−プラスミドのＣＯＬＡ−レプリコンとは互換性がある。これにより、大腸菌へのｐＥＴ−プラスミドおよびｐＣＯＬＡ−プラスミドの安定的な挿入を同時に行うことができる。この方法により、様々な遺伝子の組み合わせを、それらが同一のオペロンに位置することなく大腸菌内にクローン化できる。ｐＥＴ−ベクター（〜４０）とｐＣＯＬＡ−ベクター（２０〜４０）のコピー数の相違のため、同時形質転換に用いた遺伝子の発現レベルに影響を与える可能性が高い。
以下のベクター構築物を使用した。
ｐＥＴ２２ｂ（＋）７β−ＨＳＤＨ：ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター内に、コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を通して通常の方法によりクローン化した。
ｐＥＴ２２ｂ（＋）３α−ＨＳＤＨ：ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター内に、コマモナス・テストステローニ由来の３α−ＨＳＤＨを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を通して通常の方法によりクローン化した（Oppermann et al., J Biochem, 1996, 241(3): 744-749）。
ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ（図４ａを参照）：ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター内に、マイコバクテリウム−バッカエＮ１０由来のギ酸デヒドロゲナーゼを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を通してクローン化した。部位特異的変異誘発により、ギ酸デヒドロゲナーゼの位置２２１（位置１のメチオニンは考慮しない）、すなわち位置２２２（位置１のメチオニンから数える；配列番号１５、１９、３５）のアスパラギン酸残基（Ｄ）をグリシン残基により置換した（以下の産生実施例４を参照）。ギ酸デヒドロゲナーゼは、ヌクレオチド配列の位置１２０２に、最後のアミノ酸であるバリンとアラニンとの交換を導く、単一塩基の欠失を有する。同時に、この塩基の欠失は停止コドンのスイッチオフを導き、元は読み枠の外側にあったＨｉｓタグを活性化させる（配列番号３４および３５を参照）。
ｐＥＴ２１ａ（＋）７β−ＨＳＤＨ：ｐＥＴ２１ａ（＋）ベクター内に、コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ切断部位を通して通常の方法によりクローン化した。
ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ ７β−ＨＳＤＨ（図４ｂを参照）。
ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ）３α−ＨＳＤＨ（図８を参照）。
ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨ（図５を参照）。
微生物
Figure 0006199742
大腸菌株ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）は、３７℃にて、適切な抗生物質を含むＬＢ培地中で増殖させた。
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）は、３７℃にて、適切な抗生物質を含むＬＢ培地中で増殖させた後、ＯＤ６００＝０．８において、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導を２５℃、１４０ｒｐｍにて行った。
方法
１．７β−ＨＳＤＨ活性を決定するための標準的な条件
反応混合物の全量１ｍｌには以下が含まれる：
８８０μｌの５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０
１０μｌの１０ｍＭ ＵＤＣＡ（水に溶解、ｐＨ８）
１０μｌの酵素溶液（上記の緩衝液中、１〜１０Ｕ／ｍｌの範囲）
１００μｌの１ｍＭ ＮＡＤＰ＋（上記の緩衝液中）
３４０ｎｍでの吸光の増加を測定し、６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて活性を酵素単位（Ｕ、すなわちμｍｏｌ／分）として算出した。
産生実施例７による、７β−ＨＳＤＨ活性を決定するための標準的な条件
反応混合物の全量１ｍｌには以下が含まれる：
８７０μｌの５０ｍＭ リン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液、ｐＨ８．０
１００μｌの１００ｍＭ ＤＨＣＡ（５０ｍＭ ＫＰｉに溶解、ｐＨ８）
１０μｌの酵素溶液（上記の緩衝液中、２〜６Ｕ／ｍｌの範囲）
２０μｌの１２．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ（ｄｄＨ２Ｏに溶解）
３４０ｎｍでの吸光の増加を測定し、６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて活性を酵素単位（Ｕ、すなわちμｍｏｌ／分）として算出した。
２． ＢＣＡアッセイによるタンパク質の定量
サンプルをＢＣＡ試薬（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍより入手）と混合し、３７℃にて４５分間インキュベートした。タンパク質含量は、用いたアッセイの濃度範囲で、５６２ｎｍにて検量線（ＢＳＡ）に対して決定した。
３．薄層クロマトグラフィー
５〜１０μｇのサンプルを、ＴＬＣフィルムシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）にアプライした。参照として標準物質もアプライした。ＴＬＣフィルムの一端を、移動相が上端に達するまで溶媒に浸した。ＴＬＣフィルムを乾燥させ、リンモリブデン酸によって発色させた。
４．分子生物学の手順：
特記しない限り、分子生物学操作は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989；Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載される確立された方法に基づいて行った。
Ｂ．実施例
産生実施例１：７β−ＨＳＤＨ活性の同定
コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６のゲノムＤＮＡ配列は、２００７年に「ワシントン大学ゲノム配列決定センター（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）」により、ＧｅｎＢａｎｋの「ヒト腸管ミクロビオームプロジェクト」において公開された。ＨＳＤＨは「短鎖デヒドロゲナーゼ」に属する。ＧｅｎＢａｎｋではコリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６に由来する「短鎖デヒドロゲナーゼ」の生化学的機能について注釈が付けられていなかったことから、九つの候補をベクターｐＥＴ２２ｂ＋内へクローン化し、次にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）内に発現させた。
このために、７β−ＨＳＤＨのコード配列をＰＣＲによって増幅した。コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６（ＤＳＭ３９７９）のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、かつプライマーとして５’−ｇｇｇａａｔｔｃＣＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡ−３’（配列番号：３）および５’−ｃｃｃＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＣＧＣＧＧＴＡＧＡＡＣＧＡ−３’（配列番号：４）を用いてＰＣＲ産物を得た。プライマー配列中のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に下線を施した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、次に酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断した。対応するベクターもまた、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断した。産物をアガロースゲルにアプライして分離し、切り出して精製した。切断したＰＣＲ産物および切断したベクターをＴ４−リガーゼによって連結させた。連結物によりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られたベクター（７β−ＨＳＤＨ遺伝子を含む）を配列決定して確認し、これによってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した後、ＩＰＴＧで誘導して発現させた。
発現は５０ｍｌのＬＢ培地中で行った。前培養物の調製のため、ＬＢ寒天プレート上のコロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ培地（対応する抗生物質を含む）中で３７℃、１６０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。５０ｍｌのＬＢ培地（対応する抗生物質を含む）に、５００μｌの前培養物を植えた。培養物は３７℃、１６０ｒｐｍにてインキュベートした。ＯＤ６００がおおよそ０．８になるまでに、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって発現を誘導した。６時間または一晩経過後、細胞を遠心沈降した。ペレットを６ｍｌのリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．１ｍＭのＰＭＳＦを含む）に再懸濁し、超音波によって破砕した。細胞片を遠心分離によって除去した。
７β−ＨＳＤＨ活性の同定のため、光度測定によって活性を調べた。１ｍｌキュベット内で、酵素と０．１ｍＭの試験物質（ＵＤＣＡ）をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中に混合した。ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）またはＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ＋）の添加後に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分解または形成を測定した。九つの候補のうち一つの酵素が、ＮＡＤＰ＋の存在下でＵＤＣＡに対する活性（６０Ｕ／ｍｌ）を示したが、ＣＡに対しては活性を示さなかった。ＮＡＤＰＨに依存したこの酵素の７β−ＨＳＤＨ活性が同定された。
光度測定において、７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨの存在下で、ＵＤＣＡに対して６０Ｕ／ｍｌの活性を示し、７−ケト−ＬＣＡに対して３５Ｕ／ｍｌの活性を示し、ＤＨＣＡに対しては１１９Ｕ／ｍｌの活性を示した。ＣＡに対する活性は検出されなかった。
７β−ＨＳＤＨをコードする遺伝子を、迅速な精製を可能にするため、Ｈｉｓ−タグを有するｐＥＴ２８ａ＋内へサブクローン化した。このＨｉｓ−タグを有する７β−ＨＳＤＨを、上記のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）内へ活発に発現させた。Ｔａｌｏｎカラムを用いて精製を行った。カラムを最初にリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む）により平衡化した。細胞ライセートの負荷後、カラムをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む）によって洗浄した。７β−ＨＳＤＨを、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび２００ｍＭイミダゾールを含む）によって溶出した。溶出液中のイミダゾールを透析によって除去した。精製による収率は７６％、純度はおおよそ９０％であった。
産生実施例２：コリンゼラ・アエロファシエンス ＡＴＣＣ ２５９８６に由来する７β−ＨＳＤＨの、調製用規模でのクローニング、発現、および精製、ならびに該酵素のさらなる性質決定
２．１ 発現構築物のクローニングおよび産生
ＰＣＲにより、上記の産生実施例１に記載したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから７β−ＨＳＤＨをコードする遺伝子をもう一度増幅した：
ＰＣＲ産物をもう一度上記のように精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。消化したＰＣＲ産物をもう一度精製し、Ｔ４リガーゼを用いてｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター内にクローン化することで発現ベクターを産生した。得られた発現構築物により、次にＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換した。予想されるタンパク質は、シグナルペプチドおよびＮ−末端の６×Ｈｉｓ−タグおよびトロンビン切断部位を含む２０アミノ酸残基を有するはずである。挿入ＤＮＡの配列は、配列決定によって確認した。
２．２ ７β−ＨＳＤＨの過剰発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現構築物によって形質転換した。このために、発現構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中（２リットル振盪瓶内で２×４００ｍｌ）で増殖させた。細胞を遠心分離（１０．０００×ｇ、１５分、４℃）によって回収した。ペレットを２０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む）に再懸濁した。細胞を冷却しながら、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０超音波機器（Ｂｒａｎｓｏｎ、ドイツ）を用いた１分間の超音波処理によって（４０Ｗ 出力、４０％間隔、１分間 休止）細胞を破砕した。溶解は３回繰り返した。細胞抽出物を遠心分離した（２２．０００×ｇ、２０分、４℃）。上清をＴａｌｏｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）に負荷し、ローディング緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）によって平衡化した。この手順は２４℃にて行った。未結合物質は、カラムをローディング緩衝液（３カラム容積）で洗浄することによって洗い流した。弱く結合したタンパク質を、洗浄緩衝液（ローディング緩衝液中に２０ｍＭ イミダゾールを含む；３カラム容積）で洗浄することにより除去した。Ｈｉｓ−タグ−７β−ＨＳＤＨタンパク質を、溶出緩衝液（ローディング緩衝液中に２００ｍＭ イミダゾールを含む）によって溶出した。溶出液を、５ｋＤａの分子排除限界を有する透析チューブ（Ｓｉｇｍａ、米国）内で、２リットルのリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）に対し、４℃にて一晩透析した。最後にサンプルを新しいチューブに入れ、さらなる分析のために−２０℃で保管した。ＢＣＡ試験キット（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を製造者の指示に従って用いることにより、タンパク質濃度を決定した。加えて、サンプルを１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシーブリリアントブルーによって染色した。タンパク質の純度を、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ、米国）を用いたデンシトメトリーによって決定した。
２．３ ゲル濾過
７β−ＨＳＤＨの分子量を決定するため、Pharmacia AKTAタンパク質精製システムによりゲル濾過を行った。精製した酵素を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）によって予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラムにアプライした。タンパク質を同緩衝液により流速１ｍｌ／分で溶出した。７β−ＨＳＤＨの分子量は、その溶出容量を、タンパク質標準物質（血清アルブミン（６６ｋＤａ）、アスペルギルス・オリザエ由来のα−アミラーゼ（５２ｋＤａ）、ブタ膵臓トリプシン（２４ｋＤａ）、およびニワトリ卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ））の溶出容量と比較することで決定した。
２．４ 酵素アッセイおよび反応速度解析
酵素アッセイのための反応混合物は、全量１ｍｌ中に、５０μｍｏｌリン酸カリウム（ｐＨ８）、０．１μｍｏｌ ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）＋、基質、およびタンパク質を含んだ。該反応混合物を、光路長１ｃｍのキュベット内に入れた。７β−ＨＳＤＨ活性は、分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）を用い、３４０ｎｍの吸光度においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度の変動を記録することにより決定した。酵素活性は、２５℃における６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を用い、酵素単位（Ｕ、すなわちμｍｏｌ／分）として算出した。基質、補酵素、濃度、ｐＨ、緩衝液、およびインキュベーション温度を変化させて、幾つかの異なる測定を行った。反応速度定数は標準的方法を用いて決定した。
２．５ ７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−リトコール酸の生体内変換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を確認するため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を行った。７−ケト−ＬＣＡ０．４ｇをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）１０ｍｌに懸濁させ、２Ｍ水酸化ナトリウムの添加によりｐＨを８に調整した。イソプロパノール０．２ｍｌ、１００Ｕ ７β−ＨＳＤＨ、および８０Ｕの、サーモアナエロバクター・エタノリカス由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−ＴＥ）（Ｋ．Ｍｏｍｏｉ博士（ＩＴＢ大学、シュトゥットガルト）より供与）ならびに１μｍｏｌ ＮＡＤＰ＋を加えた。同緩衝液を加え、全反応量を２０ｍｌとした。反応混合物を、２４℃で攪拌しながら２４時間インキュベートした。この間、ＡＤＨにより、２−プロパノールの酸化を通してＮＡＤＰＨを再生した。生成物を２Ｍ塩酸１ｍｌで酸化し、酢酸エチル５ｍｌにより５×抽出した。次に有機溶液を蒸留した。
２．６ クロマトグラフィー産物の決定
ＨＰＬＣ分析は、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ ＲＰ−１８型（Ｈｉｔｂａｒ（登録商標） ＲＴ１２５−４プレパックカラム、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標） ＳＴＡＲ ＲＰ−１８エンドキャップ型、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）のカラムを、ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ（登録商標） ＳＴＡＲ ＲＰ１８型（エンドキャップ型、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）のプレカラムと共に用い、ＨＰＬＣシステム ＬＣ２０ＡＤ（島津、日本）により、流速１ｍｌ／分にて行った。移動相は二種の溶離液から構成されていた。溶離液Ａはアセトニトリルを含み、溶離液Ｂは蒸留水（オルトリン酸でｐＨ２．６に調整、８５％）を含んだ。以下の勾配を用いた：Ａ ３５％（８ｍｉｎ）-３５％−４３％（１％ ｍｉｎ−１）-４３％−７０％（１％ ｍｉｎ−１）-７０％（５ｍｉｎ）-７０％−３５％（１７．５％ ｍｉｎ−１）-３５％（５ｍｉｎ）；溶離液Ａ ６５％（８ｍｉｎ）-６５％−５７％（１％ ｍｉｎ−１）-５７％−３０％（１％ ｍｉｎ−１）-３０％（５ｍｉｎ）-３０％−６５％（１７．５％ ｍｉｎ−１）-６５％（５ｍｉｎ）。２０μｌのサンプル（１ｍｇ／ｍｌ）を分析した。標準物質として、標準ＵＤＣＡ、７−ケト−ＬＣＡ、およびＣＤＣＡを同濃度で用いた。記録は、２００ｎｍにおけるＵＶ検出によって行った。
２．７ 配列アラインメントおよび系統発生解析
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ−ソフトウェア（Thompson et al., 1997, Nucleic Acid Research 25: 4876-82）を用いて多重配列アラインメントを作成し、Ｊａｌｖｉｅｗ ソフトウェア（Clamp et al., 2004, Bioinformatics 20: 426-7）を用いて改変した。プログラムＴｒｅｅＶｉｅｗ １．６．６（Roderic 2001, http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html）を用いて系統樹を作成した。
２．８ 試験結果：
２．８．１ 調製用の生体内変換における７β−ＨＳＤＨ活性の同定
酵素の機能を確認するため、７−ケト−ＬＣＡの生体内変換を１０ｍｌ規模にて行った。分離した酵素を、既に述べたように２−プロパノールを用いたＮＡＤＰＨ再生のためのＡＤＨと組み合わせて用いた。ＨＰＬＣ分析により、ＵＤＣＡは酵素により産生された唯一の反応生成物であることがわかった（９０％変換）。反応混合物中にＣＤＣＡ（保持時間１９．４分）は検出されなかった。この結果から、酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性の７β−ＨＳＤＨであり、７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基を７β−水酸基へと選択的に還元できることがわかった。
保持時間 ＵＤＣＡ：１５．５分
保持時間 ７−ケト−ＬＣＡ：１８．３分
２．８．２．精製およびゲル濾過
コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９由来の７β−ＨＳＤＨ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）内にクローニングし、続いて過剰発現させた後、Ｎ−末端にＨｉｓ−タグを有する融合タンパク質を、１リットルの培養液あたり７β−ＨＳＤＨの収率３３２．５ｍｇ（５８２８Ｕ）として得た。Ｈｉｓ−タグを有する７β−ＨＳＤＨを、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより一工程で精製した（純度＞９０％、収率７６％、図２を参照）。レーン１および２の主要バンドは、遺伝子のアミノ酸配列に由来する予想分子量に対応する３０ｋＤａに、予想される発現産物を示す。しかしながら、ゲル濾過によって、７β−ＨＳＤＨに対し５６．１ｋＤａの分子量が見出された。これは、コリンゼラ・アエロファシエンス ＤＳＭ ３９７９由来の７β−ＨＳＤＨが二量体の性質を有することを証明するものである。
２．８．３．配列アラインメント
本発明に従って用いた７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を、既知のＨＳＤＨ配列と比較した（アラインメントは示さない）。観察された配列類似性により、本発明の酵素は、短鎖デヒドロゲナーゼ（ＳＤＲ）のファミリーに属することがわかる。ＳＤＲ類は非常に低い相同性および配列同一性を示すことが知られている（Jornvall, H., B. Persson, M. Krook, S. Atrian, R. Gonzalez-Duarte, J. Jeffery, and D. Ghosh. 1995. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR). Biochemistry 34: 6003-13及びPersson, B., M. Krook, and H. Jornvall. 1991. Characteristics of short-chain alcohol dehydrogenases and related enzymes. Eur J Biochem 200: 537-43）。しかしながら、この配列アラインメントは、ＳＤＲの一次構造内の保存されたドメインをはっきりと示している。Ｎ−末端モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−４１、Ｇｌｙ−４５、およびＧｌｙ−４７に対応する、番号はアラインメントに対応する）は、ＳＤＲスーパーファミリーの特徴的なジヌクレオチド結合モチーフに対応する。さらに、ＳＤＲ酵素の触媒三つ組である、三つの強く保存された残基Ｓｅｒ−１７７、Ｔｒｉ−１９０、およびＬｙｓ−１９４が観察された。
２．８．４．系統発生解析
クロストリジウム・ソルデリ（Clostridium sordellii）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、および大腸菌に由来する７α−ＨＳＤＨは同じ亜群に属する。二つの３α−ＨＳＤＨは、その他のＨＳＤＨよりもさらに明らかな類似性を示す。興味深いことに、原核生物の７β−ＨＳＤＨは、モルモット、ヒト、およびマウスを含む動物１１β−ＨＳＤＨの亜群に関連する。
２．８．５．反応速度定数
ＵＤＣＡ、７−ケト−ＬＣＡ、ＤＨＣＡ、ＮＡＤＰ＋、およびＮＡＤＰＨに対して、νｍａｘおよびＫＭの絶対値を決定するため、ラインウィーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロットにより反応速度平衡分析を行った。基質飽和曲線および逆数プロットから得た、試験した基質および補酵素に対する全ての反応速度データを以下の表に示す。全ての基質および補酵素に対するνｍａｘ、ＫＭ、およびｋｃａｔ値は同範囲にあったが、ＤＨＣＡに対するＫＭ値はその他の基質よりも著しく高くかった。これは多分、水中での低溶解度が原因であろう。酵素はＮＡＤＰＨ依存性であり、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨに対する反応速度定数は、非常に低い活性のために決定できなかった。
Figure 0006199742
２．８．６．最適ｐＨ
また、精製した酵素を用い、様々な基質に対する７β−ＨＳＤＨ活性をｐＨの関数として決定した。７β−ＨＳＤＨによるＵＤＣＡの酸化のために最適な活性は、ｐＨ９〜１０の範囲で観察され、これは酸性側で徐々に減少した。対照的に、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元に対する最適な活性は、ｐＨ４〜６の範囲に見られ、酸性側で急激に減少し、アルカリ側で徐々に減少した。異なる緩衝液は、同ｐＨにおいて、７β−ＨＳＤＨの活性にわずかな影響しか与えなかった。
２．８．７．熱安定性
本発明に従って用いたＮＡＤＰ依存性７β−ＨＳＤＨは、以下の安定性を示す：４００分経過後、３０℃における活性は２３℃における活性よりも約３０％低かった。酵素は、３０℃において１５００分経過後完全に不活性化したが、２３℃においては、１５００分経過後２０％の活性が残っていた。凍結融解を繰り返した後で、−２０℃にてリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中で数か月間保管した間に、著しい活性の減少は観察されなかった。
産生実施例３：７β−ＨＳＤＨ変異体の産生およびその性質決定
アミノ酸配列の位置３９（開始メチオニンを含む）（配列番号２を参照）を変異させた。
３．１ プライマー
７β−ＨＳＤＨの部位特異的変異誘発には、以下に示す変異誘発プライマーを用いた。プライマーは、所望のアミノ酸交換がもたらされるように、７β−ＨＳＤＨ遺伝子配列に基づいて選択した。変異される塩基はプライマーの中心に位置し、プライマー対の融点は同じ範囲にあることに留意した。
Ｇ３９Ａ変異体を調製するため、プライマー対、７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｆｗｄおよび７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｒｅｖを用いた。Ｇ３９Ｓ変異体を調製するためには、プライマー対、７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ｓ＿ｆｗｄおよび７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ｓ＿ｒｅｖを用いた。
グリシン→アラニン
順方向：７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｆｗｄ：CGTCGTCATGGTCGCCCGTCGCGAGG. 配列番号９）
逆方向：７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｒｅｖ：CCTCGCGACGGGCGACCATGACGACG. 配列番号１０）
グリシン→セリン
順方向：７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ｓ＿ｆｗｄ：CGTCGTCATGGTCAGCCGTCGCGAGG. 配列番号１１）
逆方向：７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ｓ＿ｒｅｖ：CCTCGCGACGGCTGACCATGACGACG. 配列番号１２）
３．２ ＰＣＲプログラム
反応中、最初に２分間の変性工程を９８℃にて行った。次に、変性（９８℃にて３０秒）、プライマーハイブリダイゼーション（５８℃にて２．５分）、および伸長（７２℃にて６分）を２５サイクル行った。最後の工程で、１５分間の最終伸長を７２℃にて行い、次に４℃に冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。
３．３ ＰＣＲアッセイ
Figure 0006199742
鋳型として７β−ＨＳＤＨを有するｐＥＴ２２ｂベクターを用いた。
３．４ 手順
タンパク質配列中のアミノ酸の標的化した交換を可能にするため、対応する遺伝子のＤＮＡ配列を部位特異的変異に供した。このために、それらの配列中に所望の変異が含まれる、互いに相補的なプライマーを用いた。変異される遺伝子を有する、Ｎ６−アデニン−メチル化、二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用いた。Ｎ６−アデニン−メチル化プラスミドＤＮＡは、ｄａｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５から分離した。
ポリメラーゼ連鎖反応は上記のように行った。所望の変異を有し、鎖を切断したプラスミドが形成されるように、プライマーを鋳型に対して相補的に伸長させた。その他のＰＣＲ反応とは異なり、この場合、新たに形成されたＤＮＡ分子はＰＣＲ反応のための鋳型としては役立たないため、ＤＮＡ収率は直線的にのみ増大する。
ＰＣＲ反応が完了すると、親であるＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩによって消化した。この酵素は、非特異的にＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限切断するが、新たに形成された非メチル化ＤＮＡは制限切断しないという特色を有する。制限切断は、ＰＣＲ反応混合物に１μＬのＤｐｎＩを加え、３７℃にて１時間インキュベートして行った。
この調製物の１０μｌを、２００μｌの化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。プラスミド分離後、配列決定によって変異の成功を確認した。
３．５ 性質決定
各変異体および野生型酵素に対し、マイクロタイタープレート光度計での反応速度測定を行い、一定の基質濃度および変化させた補因子濃度、かつその逆の両方により、酵素の変換速度を記録した。特異的な酵素活性を決定するため、細胞ライセート中の酵素濃度をデンシトメトリーにより決定した。
基質変換速度の基質濃度への依存性を決定するため、反応量に対して１００μＭ ＮＡＤＰＨの補因子濃度を用い、一方で基質濃度は、デヒドロコール酸の７μＭ〜１０ｍＭの範囲で３１通りの異なる濃度に変化させた（各々の場合、反応混合物に対して）。
基質変換速度の補因子濃度への依存性を決定するため、反応量に対して０．３ｍＭデヒドロコール酸の基質濃度を用い、一方で補因子濃度は、野生型タンパク質についてＮＡＤＰＨの２５μＭ〜１００μＭの範囲で８通りの異なる濃度に変化させ、または両変異体について、ＮＡＤＰＨの６μＭ〜１００μＭの範囲で１６通りの異なる濃度に変化させた（各々の場合、反応混合物に対して）。これらの一連の測定において、最初の４測定に対する線形回帰によって反応速度を決定した（０秒〜１８秒）。
得られたデータはＩＧＯＲ Ｐｒｏによって評価した。特異的な酵素活性に対する基質または補因子濃度のプロットから、一定の基質濃度および変化させた補因子濃度における一連の測定について、ミカエリス・メンテンによる反応速度の典型的な曲線が観察される。一方で、一定の補因子濃度および変化させた基質濃度における一連の測定のプロットからは、基質阻害を伴うミカエリス・メンテンによる反応速度の典型的な曲線が観察される（図６を参照）。この理由から、古典的なミカエリス・メンテンモデルを、一定の基質濃度および変化させた補助基質濃度における一連の測定の評価に用い、基質阻害を伴うミカエリス・メンテンモデルを、一定の補助基質濃度および変化させた基質濃度における一連の測定の評価に用いた。
νｍａｘ、Ｋｍ、およびＫｉは非線形回帰によって決定した。
Figure 0006199742
ν 特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
νｍａｘ 最大特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
ｃＳ 基質または補因子濃度、ｍｏｌＬ−１
Ｋｍ 半飽和濃度、ｍｏｌＬ−１
Ｋｉ 阻害定数、ｍｏｌＬ−１
得られたパラメータを表に示す。
Figure 0006199742
測定データの分析により、７β−ＨＳＤＨは、野生型タンパク質に対して最も強く、Ｇ３９Ｓ変異体に対して最も弱いデヒドロコール酸に対して基質阻害を示すことが明らかとなった。特に、先に言及したタンパク質の場合には、高いＫｉと大きな誤差により、とにかく基質阻害が起こったか否かが問われ得る。デヒドロコール酸の半飽和濃度は２桁のマイクロモル濃度範囲にある。これについては、野生型タンパク質とＧ３９Ａ変異体はそれぞれ、３１±５μＭおよび３３±６μＭであったことから両者に著しい相違は見られなかったが、Ｇ３９Ｓ変異体のこの値は７５±９μＭであり、他の二つの酵素の値のほぼ２倍である。ＮＡＤＰＨの半飽和濃度の場合には、野生型酵素よりも変異体酵素に低い値が観察された（野生型の４６±７μＭに対し、Ｇ３９Ａ変異体は１６．４±１．９μＭ、およびＧ３９Ｓ変異体は１３．１±２．９μＭ）。
両変異体についてのνｍａｘ値は、野生型タンパク質の値のほぼ１．５倍である（野生型タンパク質の１４．６±１．０Ｕ／ｍｇに対し、Ｇ３９Ａ変異体は２１．０±１．１Ｕ／ｍｇ、およびＧ３８Ｓ変異体は２０．１±１．０Ｕ／ｍｇ）。古典的なミカエリス・メンテンモデルに対し、基質阻害を伴うミカエリス・メンテンモデルでは、基質濃度の増大に伴って特異的な酵素活性は漸近的にνｍａｘに接近せず、再び減少することから、νｍａｘ値は到達可能な最大の特異的酵素活性であるとはみなされない。到達可能な最大の酵素活性、すなわち反応速度曲線の最大での酵素活性は、野生型タンパク質では〜１３Ｕ／ｍｇ、ならびに変異体タンパク質では〜１９Ｕ／ｍｇ（Ｇ３９Ａ）および〜２０Ｕ／ｍｇ（Ｇ３９Ｓ）である。到達可能な最大酵素活性よりも、全細胞生体内変換に用いられる基質濃度において到達できる酵素活性がさらに興味深い。例として、これを１０ｍＭデヒドロコール酸の基質濃度において比較すると、野生型タンパク質では〜６．７Ｕ／ｍｇ、Ｇ３９Ａ変異体では〜１３Ｕ／ｍｇ、およびＧ３９Ｓ変異体では〜１８Ｕ／ｍｇであった。従って、１０ｍＭの基質濃度において、Ｇ３９Ａ変異体は野生型タンパク質の２倍の活性を有し、Ｇ３９Ｓ変異体は約３倍もの活性を有し得る。野生型タンパク質はＧ３９Ａ変異体よりも強い基質阻害を示し、同様にＧ３９Ａ変異体はＧ３９Ｓ変異体よりも強く基質阻害されたことから、これらの相違は比較的高い基質濃度でさらに明らかなはずである。
産生実施例４：ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ変異体の産生および性質決定
４．１ ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨのクローニング
４．１．１ マイコバクテリウム−バッカエ ギ酸デヒドロゲナーゼのＰＣＲ増幅
増幅に用いた鋳型は、ドイツ微生物・培養細胞コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＤＳＭＺ）、ブランズウィック、から入手したマイコバクテリウム−バッカエのゲノムＤＮＡである。
増幅のためのプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＧｍｂＨ、エーバースベルク、から入手した
ｆｄｈ＿ｆｏｒ（5'-CGATCATATGGCAAAGGTCCTGTGCGTTC-3'）（配列番号２３）および
ｆｄｈ＿ｒｅｖ（5'-GCTAGAATTCTCAGCCGCCTTCTTGAACT-3'）（配列番号２４）
である。制限酵素による認識部位に下線を施す。ｒｅｖ−プライマーはＥｃｏＲＩ切断部位を含み、ｆｏｒ−プライマーはＮｄｅＩ切断部位を含む。
ＰＣＲアッセイおよびＰＣＲプログラムを表に示す。
Figure 0006199742
Figure 0006199742
４．１．２ ｐＥＴ２１ａ（＋）およびＦＤＨ ＰＣＲ産物の制限酵素による消化
５μｌ １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ＥｃｏＲＩ、２．５μｌ ＮｄｅＩ（２０Ｕ／ｍＬ）、および２．５μｌ ＥｃｏＲＩ（２０Ｕ／ｍＬ）（それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト）を、水に溶解した１〜５μｇのＤＮＡ（ｐＥＴ２１ａ（＋）またはＦＤＨ ＰＣＲ産物）に加え、蒸留水で全量５０μｌまでにした。各々の場合、調製物を３７℃にて１時間インキュベートした。次に、切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル（１％（ｗ／ｖ）アガロース、０．０５％（ｖ／ｖ）エチジウムブロマイド）にアプライし、１２０Ｖにて５５分間電気泳動を行ってＤＮＡ断片を分離した。次に正確なサイズのバンド（ＦＤＨ−遺伝子は１．２ｋｂ、ｐＥＴ２１ａ（＋）プラスミドは５．４ｋｂ）をアガロースゲルからメスで切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン）を製造者のプロトコルに従って用いて分離した。
４．１．３ 切断したｐＥＴ２１ａ（＋）およびＦＤＨの連結
１μｌ Ｔ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）および１μｌ １０×リガーゼ緩衝液（それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルト）１００ｎｇの切断済みベクターＤＮＡおよび１１１ｎｇの切断済みＦＤＨ ＤＮＡに加え、蒸留水で全量１０μｌまでにした。連結調製物を４℃にて一晩インキュベートした。
４．１．４ 連結調製物による、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの形質転換
連結工程の最後に、１０μＬの連結調製物を、標準的なプロトコルによって調製した２００μｌの化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに加えた。次に、氷上でのインキュベーション工程を３０分間行い、続いて４２℃にて熱ショックを与えた（９０秒間）。次に、形質転換調製物に６００μｌの無菌ＬＢ培地を加え、細胞を振盪インキュベータ内で、２００ｒｐｍ、３７℃にて４５分間インキュベートした。次の工程では、調製物を卓上遠心機で３０００ｒｐｍにて６０秒間遠心し、上清７００μｌを廃棄し、細胞を残りの上清に再懸濁して、１００ｍｇ／ｌ アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにまいた。次に寒天プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。
４．２．ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇの産生
ＮＡＤＨのみではなく、ＮＡＤＨＰも再生できるＦＤＨ変異体の産生について、以下に変異体Ｄ２２１Ｇと共にさらに詳細に説明する。
アスパラギン酸（Ｄ）２２１は、アルギニン（Ｒ）残基に直接隣接して位置する、陰性に荷電した大きな側鎖を有するアミノ酸であり、これによってＮＡＤＰ＋が結合される。このため、これもまた陰性に荷電したＮＡＤＰ＋のリン酸基との反発が導かれ得る。従って、アスパラギン酸は小さな無電荷アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）によって置換される。
４．２．１ 使用したプライマー
ｍｔ１：5'- C CTG CAC TAC ACC GGC CGT CAC CGC CTG C-3'（配列番号３０）
ＮＩ＿ｆｄｈ＿Ｒ：5' -GCTCGAATTCTCAGACCGCCTTC--3'（配列番号３１）
４．２．２ 手順
まず、ｍｔ−プライマーおよびプライマーＮＩ＿ｆｄｈ＿Ｒを用いて、二つの相補的なメガプライマーの一組を作製した。
プラスミドpET21a(+)FDHを鋳型として用いた。使用したPCRプログラムを以下の表に示す。
Figure 0006199742
プライマーｍｔ１とプライマーＮＩ＿ｆｄｈ＿Ｒとの組み合わせによって、メガプライマーの長さは６５０ｂｐになる。第１のＰＣＲによるこのＰＣＲ産物に対して、ゲル電気泳動およびゲルからの所望のバンドの分離を行った。第２のＰＣＲは、プライマーとしてメガプライマーを用い、鋳型としてプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴｆｄｈ）を用いる全プラスミドＰＣＲとして行った。反応混合物および全プラスミドＰＣＲの温度概要を以下の表に示す。２×ＥＺＣｌｏｎｅ酵素ミックス、ＥＺＣｌｏｎｅ溶液１、１．１ｋｂマーカー、およびＤｐｎＩは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から得た。
Figure 0006199742
ＰＣＲプログラムの第１工程（６８℃、５分）は、Ｔａｑポリメラーゼによって非特異的に付加された塩基を、ＭＥＧＡ ＷＨＯＰ ＰＣＲに用いたポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって除去するためのものである。
Figure 0006199742
ＰＣＲ産物は一本鎖切断された二本鎖プラスミドであり、これはＥ．ｃｏｌｉ内でのみ閉じる。１０ＵのＤｐｎＩを５０μＬのＰＣＲ産物に加え、調製物を３７℃にて２時間インキュベートした。ＤｐｎＩは、メチル化ＤＮＡ、すなわち用いた鋳型ＤＮＡのみを分解して、メガプライマーまたは合成プラスミドは分解しない。鋳型プラスミドは、メチル化開始ＤＮＡを得るためにｄａｍ＋株（例えばＤＨ１０ＢまたはＪＭ１０９）によって産生されなければならない。
４．３ 変異体Ｄ２２１Ｇの発現および分離
最初にＬＢ前培養液に冷凍保管材料または寒天プレートからのコロニーを植え、該前培養液を一晩インキュベートした。インキュベーションは３７℃および２５０ｒｐｍで行った。前培養液のＯＤを決定し、ＯＤが０．１の際に植菌した。ＯＤが０．５〜１に達すると（約２．５時間後）、ＩＰＴＧによる誘導を行った（最終濃度 １ｍＭ）。誘導３時間後に細胞を回収した。
細胞をガラスビーズによって機械的に破砕した。このために、１．５−ｍＬの反応容器内で０．５ｍＬの細胞サンプルに０．５ｍＬのガラスビーズを加え、該反応容器をＲｅｔｓｃｈ振動ミル内で、最大数（３０ｓ−１）で３分間振盪した。細胞解離後、ガラスビーズを遠心分離した（２分間、１３０００ｒｐｍ）。振動ミル内でのサンプルの加熱によるタンパク質変性を最少にするため、解離の前後で、培養物を氷上に置いた。この解離プロトコルは、−２０℃において凍結したサンプルの使用のために最適化された。
４．４ 変異体Ｄ２２１Ｇの性質決定
Figure 0006199742
データは、産生された変異体が、補因子としてＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋の両方を利用できることを証明する。
産生実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉ ７α−ＨＳＤＨノックアウト変異体（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋）の産生
目的は、障害となる７α−ＨＳＤＨ活性の、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）発現株における欠失である。
以下に記載する方法により、７α−ＨＳＤＨの標的遺伝子内に、標的遺伝子がスイッチオフされるように抗生物質耐性遺伝子を挿入した。
５．１ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に由来する７α−ＨＳＤＨの配列情報
アミノ酸配列：（配列番号２６）
ヌクレオチド配列（配列番号２５）
受入番号：ＮＣ＿０１２９７１ ＲＥＧＩＯＮ：１６４２４７０．．１６４３２３７
５．２ 使用したプライマー
Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）由来の７α−ＨＳＤＨをスイッチオフするため、以下のプライマーを準備した：
Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンを再標的化するためのプライマー：
４６７｜４６８ａ−ＩＢＳ （配列番号２７）
AAAAAAGCTTATAATTATCCTTATAGGACGTCATGGTGCGCCCAGATAGGGTG
４６７｜４６８ａ−ＥＢＳ１ｄ （配列番号２８）
CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGTCATGTTTAACTTACCTTTCTTTGT
４６７｜４６８ａ−ＥＢＳ２ （配列番号２９）
TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTTCCTATCGATAGAGGAAAGTGTCT
挿入
位置
467｜468a GCAGCTTTAGATGATGCATAGGAAGTCATG - intron - TTTATATTTTTATTT。
５．３ ノックアウト変異体の調製
ノックアウト変異体は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈのキット、ＴａｒｇｅＴｒｏｎＴＭ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍを製造者の指示に従って用いることにより調製した。ＴａｒｇｅＴｒｏｎＴＭ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍの工程Ｂ．６．に従い、ＰＣＲ産物の精製にはＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩにより消化したイントロンＰＣＲ産物の、線状化ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃベクターへの連結を以下のように行った：反応は１６℃にて一晩行った。
２０μｌの調製：
２μｌ ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ線状ベクター（４０ｎｇ）
６μｌ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩにより消化したイントロンＰＣＲ産物
２μｌ ＡＴＰ（１０ｍＭ）
２μｌ リガーゼ緩衝液（１０×）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
２μｌ Ｔ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
６μｌ Ｈ２Ｏ
連結反応溶液５μｌを２００μｌの化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に加え、氷上で２０分間インキュベートした。製造者による記載に従ってさらなる形質転換を行った。
形質転換調製物を、３３μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにまいた。カナマイシン耐性細胞を選択し、これらをそれぞれ、ＬＢ中での一晩の培養により数晩にわたって植菌した（それぞれ５μｌのカナマイシン溶液（３３ｍｇ／ｍｌ）を含む）。最終的に２００ｍｌのＬＢ培養液（２００μｌのカナマイシン溶液（３３ｍｇ／ｍＬ）を含む）に一晩の培養物を植え、振盪インキュベータ内で、３７℃、１８０ｒｐｍにて５時間インキュベートした。次に温度を４２℃に上昇させて１時間インキュベートした。この培養物を５ｍＬ ＬＢに植えて一晩培養するために用いた（それぞれ５μｌのカナマイシン溶液（３３ｍｇ／ｍｌ）を含む）。３７℃、１８０ｒｐｍにて一晩インキュベーション後、培養物を３３μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに画線した。３７℃にて一晩インキュベーション後、コロニーを選択し、３３μｇ／ｍＬ カナマイシンおよび３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに画線した。
３７℃にて一晩インキュベーション後、クロラムフェニコール感受性変異体が見出された。これはノックアウトの誘導系により保持されるプラスミドの喪失を確認するために必要であり、ノックアウトの成功後はもう必要ではない。
５．４．ノックアウトの検出
７α−ＨＳＤＨ遺伝子は、以下のプライマーを用い、コロニーＰＣＲによって増幅した：
７ａｌｐｈａ−ｋｏ−ｃｈｅｃｋ＿ｆｗｄ（5' - TTAATTGAGCTCCTGTACCCCACCACC - 3'）配列番号３２および
７ａｌｐｈａ−ｋｏ−ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ（5' - GTGTTTAATTCTGACAACCTGAGACTCGAC - 3'）配列番号３３。
得られた断片は、長さがおおよそ２．５〜３ｋｂであり、プライマー７ａｌｐｈａ−ｋｏ−ｃｈｅｃｋ＿ｆｗｄを用いてこの配列決定を行った。配列決定により、７α−ＨＳＤＨのＤＮＡ配列はｐＡＣＤ４Ｋベクターの挿入によって妨げられていることが示され、これによって７α−ＨＳＤＨのノックアウトがもたらされた（配列決定データは未提示）。
反応実施例１：７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの酵素的変換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を確認するため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を行った。反応混合物２０ｍｌには、５０ｍＭ７−ケト−ＬＣＡ（おおよそ０．４ｇ）、５Ｕ／ｍｌ ７β−ＨＳＤＨ、および０．０５ｍＭ ＮＡＤＰ＋が含まれた。ＮＡＤＰＨの再生には４Ｕ／ｍｌ ＡＤＨおよび１％イソプロパノールを用いた（スキーム１を参照）。反応はヒュームフード内で、ｐＨ８、２４℃にて攪拌しながら行った。アセトンはイソプロパノールよりも迅速に蒸発することから、反応はＵＤＣＡの形成に向けて移行した。１％イソプロパノールをさらに、２４、４８、および７２時間後に加えた。生成物をＴＬＣ（シリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ、溶媒：石油エーテル及び酢酸エチル１：１０、ｖｏｌ：ｖｏｌ）によって分析した。ＴＬＣにおいて、生成物を標準参照物質である７−ケト−ＬＣＡ、ＵＤＣＡ及びＣＤＣＡと比較した。ＴＬＣ分析により、７β−ＨＳＤＨによって７−ケト−ＬＣＡからＵＤＣＡが形成されたことがわかる。ＴＬＣにおいて、鏡像異性体であるＣＤＣＡは検出されなかった。
Figure 0006199742
反応実施例２：７β−ＨＳＤＨによる、ＤＨＣＡからの３，１２−ジケト−７β−ＣＡの酵素的産生
ＤＨＣＡからの１２−ケト−ＵＤＣＡの調製に対する７β−ＨＳＤＨの有用性を確認するため、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの変換を行った。反応混合物５０ｍｌには、５０ｍＭ ＤＨＣＡ（１ｇ）、５Ｕ／ｍｌ ７β−ＨＳＤＨ、および０．０５ｍＭ ＮＡＤＰ＋が含まれた。ＮＡＤＰＨの再生には４Ｕ／ｍｌ ＡＤＨおよび１％イソプロパノールを用いた（スキーム２を参照）。反応はヒュームフード内で、ｐＨ８、２４℃にて攪拌しながら行った。アセトンはイソプロパノールよりも迅速に蒸発することから、反応は３，１２−ジケト−７β−ＣＡの形成に向けて移行した。完全な変換を達成するため、１％イソプロパノールをさらに、２４、４８、および７２時間後に加えた。中間体である３，１２−ジケト−７β−ＣＡをＴＬＣによって分析した。遊離ＤＨＣＡは、ＴＬＣ（シリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ；溶媒 クロロホルム：メタノール：酢酸 １０：１：０．０８ ｖｏｌ：ｖｏｌ：ｖｏｌ）においてもはや検出不可能であった。
Figure 0006199742
反応実施例３：３，１２−ジケト−７β−ＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換
中間体である３，１２−ジケト−７β−ＣＡ（反応実施例２により産生）を、コマモナス・テストステローニ由来の３α−ＨＳＤＨ（配列番号５および６）（Mobus, E. and E. Maser, Molecular Cloning, overexpression, and characterization of steroid-inducible 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni. A novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily. J Biol Chem, 1998. 273(47): p. 30888-96）によって、さらに１２−ケト−ＵＤＣＡへ変換した。この３α−ＨＳＤＨは、ＦＤＨによって再生された補因子ＮＡＤＨを必要とする（図３を参照）。４Ｕ／ｍｌ ３α−ＨＳＤＨ、１Ｕ／ｍｌ ＦＤＨ（ＮＡＤＨ依存性、Ｃｏｄｅｘｉｓ）、２００ｍＭギ酸ナトリウム、および０．０５ｍＭ ＮＡＤ＋を反応混合物に加えた。４０時間後、生成物を２Ｍ ＨＣｌによってｐＨ２に酸性化し、酢酸エチル６×１０ｍｌによって抽出した。蒸発後、生成物１．０７ｇを得た。生成物である１２−ケト−ＵＤＣＡを分析し、ＴＬＣおよびＮＭＲによって確認した。３α−ＨＳＤＨは７β−ＨＳＤＨの調製に関連して調製したが、プラスミドはｐＥＴ２２ｂ＋を用い、さらに精製することなく使用した。
Figure 0006199742
反応実施例４：ＣＡからＤＨＣＡへの化学反応
氷酢酸１３２０Ｌを２０００Ｌ攪拌容器に入れ、その中へコール酸（ＣＡ）１１０ｋｇ（２６０ｍｏｌ）を溶解させた。この溶液に次亜塩素酸ナトリウム溶液４２２Ｌ（２．３モル濃度）を２０〜４０℃にて加え、次に反応溶液を少なくともさらに１時間攪拌して反応を完了させた。遠心分離によってデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を分離し、収率は１００ｋｇ（９０％）であった。
反応実施例５：１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡへの化学反応
１２−ケト−ＵＤＣＡ１０５ｇ（０．２５８ｍｏｌ）をトリエチレングリコ―ル３８４ｍｌ、水酸化ナトリウム５２．２ｇ（１．３０４ｍｏｌ）、およびヒドラジン水和物７５．９５ｍｌ（１．５６３ｍｏｌ）に溶解し、１８０℃までゆっくりと加熱した。１６０℃からヒドラゾンの形成がみられ、これは窒素の分離によってＵＤＣＡへ変換された。反応混合物を１８０℃にて８時間保持し、反応を完了させた。反応混合物を１００℃未満に冷却し、水１５００ｍｌを加えた。次に塩酸で酸性化することによってＵＤＣＡを沈殿させた。生成物を収率９６．２ｇ〜９９．２ｇ（９５％〜９８％まで）で得た。
反応実施例６：７β−ＨＳＤＨ、ＦＨＤ Ｄ２２１Ｇ、および３α−ＨＳＤＨによる、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換
本実施例の目的は、本発明に従って用いるＦＤＨ変異体によって同時に補因子再生を行う、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの２工程の酵素的変換が可能であるか否かを調べることである。使用したＦＤＨ変異体Ｄ２２１Ｇは、ＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨに対してＮＡＤＰ＋およびＮＡＤ＋の両方を補因子として受け入れることから、反応混合物はさらに補因子再生系を含む必要がない。
以下に、二つの部分的反応の例を図示する。ＦＤＨ＊ 変異体ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇを意味する。
Figure 0006199742
このために、コリンゼラ・アエロファシエンス由来の酵素７β−ＨＳＤＨ、コマモナス・テストステローニ由来の酵素３α−ＨＳＤＨ、およびマイコバクテリウム−バッカエ由来のＦＤＨに由来するＦＤＨ変異体Ｄ２２１Ｇを互いに別々に改変Ｅ．ｃｏｌｉ発現株に発現させ、反応に用いた。発現に用いたＥ．ｃｏｌｉ株は、いずれの７α−ＨＳＤＨ酵素活性も発現しないように改変されたものである。Ｅ．ｃｏｌｉに広くみられるこの副次的活性は、この種の反応（７−ケト基の立体特異的な変換）において望ましくない副反応を導き、そのために生成する反応生成物の汚染を導く可能性がある。
次の実験では、本出願者による以前の欧州特許出願であるEP10164003.5号に記載された、ノックアウト株のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨを用いた。この特許出願の開示は本明細書において明確に参照される。
６．１ 使用したプラスミド
７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＦＨＤ Ｄ２２１Ｇの発現に用いたプラスミドは以下の通りである：
ｐＥＴ２８ａ（＋）−７β−ＨＳＤＨ、
ｐＥＴ２２ｂ（＋）−３α−ＨＳＤＨ、および
ｐＥＴ２１ａ（＋）−ＦＤＨ−Ｄ２２１Ｇ。
６．２ 細菌株および培養条件：
前述のノックアウト株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨは、必要な抗生物質を含むＬＢ培地中で、３７℃において培養した。ＯＤ６００＝０．８に達した際の０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導後、インキュベーションを１４０ｒｐｍ、２５℃において、１２時間継続した。
６．３ 酵素の過剰発現および精製
７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＦＤＨ変異体Ｄ２２１ＧのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨにおける過剰発現ならびに酵素精製は、上記の産生実施例２に記載したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）における７β−ＨＳＤＨの過剰発現および精製に対する条件と同じ条件により行った。培地１リットルあたりの収率（振盪フラスコ、ＯＤ６００〜６）は以下の通りである：
７β−ＨＳＤＨ：３８８３Ｕ（ＤＨＣＡおよびＮＡＤＰＨ）
３α−ＨＳＤＨ：６８５３Ｕ（ＤＨＣＡおよびＮＡＤＨ）
ＦＤＨ変異体：４７Ｕ（ギ酸ナトリウムおよびＮＡＤ＋）。
タンパク質の含量及び純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ、米国）を用いたデンシトメーター走査により決定した。
６．４ １２−ケト−ＵＤＣＡの調製用規模での酵素的合成
７β−ＨＳＤＨ（２．４Ｕ×ｍｌ−１）、３α−ＨＳＤＨ（２．４Ｕ×ｍｌ−１）、ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ（０．３２５Ｕ×ｍｌ−１）、ＮＡＤＰ＋（１０μＭ）、ＮＡＤ＋（１０μＭ）、ギ酸ナトリウム（２５０ｍＭ）、ＤＨＣＡ（１０ｍＭ、３．２ｇ）、およびリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６）を含む反応混合物８００ｍｌを２４℃にて撹拌した。この実験で用いた三つの酵素全ては、さらなる精製工程を経ていない、細胞からの未精製抽出物を用いた。１２時間後、孔径１０ｋＤａのメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を用いた限外濾過により、酵素を除去して反応を停止させた。濾過物中の産物は、塩酸でｐＨ２に酸性化した後、濾紙を通すことによって精製した。生成物を６０℃で一晩乾燥させた後、所望の生成物２．９ｇを得た。
生成物をＨＰＬＣおよびＮＭＲによって分析した。
分析データ（一部）：
１Ｈ ＮＭＲ（重水素化ＤＭＳＯ、５００ＭＨｚ）δ＝３．９２（２Ｈ、ｍ、Ｈ−３αおよびＨ−７β）および
１Ｈ ＮＭＲ（重水素化ＤＭＳＯ、１２５ＭＨｚ）δ＝６９．３８（ＣＨ、３−Ｃ）；δ＝６９．０９（ＣＨ、７−Ｃ）；δ＝２１３．８６（Ｃ、１２−Ｃ）
収率：９０．６％
純度：９９％
反応実施例７：２プラスミド系におけるＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ、７β−ＨＳＤＨ、および３α−ＨＳＤＨの共発現による、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの全細胞生体内変換
目的は、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）への、２工程の全細胞による還元（上記反応実施例６のスキームを参照）が可能であるか否かを調べることである。
このために、上記で調製したノックアウト株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨを用いたが、ここでは７β−ＨＳＤＨおよび変異体ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇに加え、コマモナス・テストステローニ由来の３α−ＨＳＤＨが組換え発現される。使用したＦＤＨ変異体は、ＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨに対してＮＡＤＰ＋およびＮＡＤ＋の両方を補因子として受け入れることから、いずれのさらなる補因子再生系も生体内変換株内に挿入する必要はなかった。
７．１ 使用した株：
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋
７．２ 使用した分子生物学的手順
７．２．１ ポリメラーゼ連鎖反応
７β−ＨＳＤＨのクローニングにはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた。７β−ＨＳＤＨを増幅するための鋳型としてプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）７β−ＨＳＤＨを用いた。
ＰＣＲ反応は、５００μＬ ＰＣＲチューブ内で、反応量２０μＬにより行った。反応はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて行った。７β−ＨＳＤＨの増幅のために、各々の場合に、４μＬ ＨＦ−緩衝液、１μＬ 鋳型ＤＮＡ、各１μＬの順方向および逆方向プライマー（１０μＭ）、デオキシヌクレオチド三リン酸溶液０．４μＬ（１０ｍＭ）、およびＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ０．２μＬ（２Ｕ／μＬ）を加えた。調製物の容量は、ＲＮａｓｅを含まない水によって２０μＬに調整した。
反応については、最初に２分間の変性工程を９８℃にて行った。次に、変性（９８℃にて３０秒）、プライマーハイブリダイゼーション（４８℃にて２分）、および伸長（７２℃にて２分）を３４サイクル行った。最後の工程で、１０分間の最終伸長を７２℃にて行い、次に４℃に冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。
７．２．２ ゲル抽出によるＤＮＡ断片の精製
ＤＮＡ断片の精製のため、最初にこれらをアガロースゲル電気泳動によって分離した。対応するバンドをＵＶ光で可視化し、サイズに基づいて同定後、メスを用いて切り出した。抽出はＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造者のプロトコルに従って用いて行った。精製ＤＮＡの溶出にはＨ２Ｏ３０〜５０μＬを用いた。
７．２．３ エンドヌクレアーゼによる制限切断
制限切断反応は全量２０〜５０μＬにおいて行った。このために、それぞれ１０〜２０Ｕの制限酵素を、切断するＤＮＡに加えた。加えて、製造者が推奨する反応緩衝液を用い、かつ製造者の推奨に基づき、任意にウシ血清アルブミン０．５μＬ（ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。制限消化を３７℃にて２時間行った。次に断片を、ゲル抽出（ベクター消化産物）によるか、またはＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（消化ＰＣＲ産物）を用いて精製した。
７．２．４ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを用いたＤＮＡ断片の精製
制限切断したＰＣＲ断片を精製するため、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを用いてＤＮＡを精製した。精製は製造者の指示に従って行い、精製したＤＮＡの溶出にはＨ２Ｏ３０〜５０μＬを用いた。
７．２．５ ＤＮＡ断片の連結
制限切断したＤＮＡ断片を発現ベクター内にクローニングするため、両ＤＮＡ分子を同じ制限酵素により切断した。二つの異なる酵素を用いることにより、一方ではベクターの再連結が防止され、もう一方では挿入断片を規定された配向で取り込むことができる。使用した酵素は、遊離の５’−リン酸基とデオキシリボ核酸の遊離の３’−ＯＨ末端との間のリン酸ジエステル結合を触媒する、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼである。
発現構築物のクローニングのため、各々の場合に、４μＬの、遺伝子をコードし、制限切断された末端を有する精製ＤＮＡ断片を、１２μＬの制限切断した精製ベクターに加えた。次に２μＬ １０×リガーゼ緩衝液、１μＬアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、１ｍＭ）、および１μＬ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μＬ）を加えた。反応は、１６℃にて一晩継続した。
７．３ 使用したベクター構築物
７．３．１ ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ
このベクター構築物のため、７ｂｅｔａ−ＨＳＤＨをコードする遺伝子がＦＤＨの下流に位置するように、７β−ＨＳＤＨをｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ内へクローン化した。この目的のため、停止コドンをＦＤＨ内の５’−末端に挿入する必要があった。元の配列（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ｓｔｏｐ）と比較して、この構築物ではＣ−末端のバリン残基がアラニン残基によって置換されており、さらに三つのアミノ酸が付加されることで、以下のＣ−末端配列：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｓｔｏｐがもたらされた。さらに、翻訳の増大のため、追加のリボソーム結合部位を７β−ＨＳＤＨに、ＦＤＨと７ｂｅｔａ−ＨＳＤＨの間において挿入した。
プライマー、７ｂｅｔａ＿ｆｗｄ＿ＥｃｏＲＩおよびＳ＿７ｂｅｔａ＿ｒｅｖ＿ＨｉｎｄＩＩＩを、７β−ＨＳＤＨのＰＣＲ増幅のために用いた。
Figure 0006199742
ハイブリダイズ配列領域（黒）、制限酵素部位（太字、下線）、リボソーム結合部位（下線）、およびフィリングヌクレオチド（斜体）を示す。プライマー ７ｂｅｔａ＿ｆｗｄ＿ＥｃｏＲＩでは、さらに停止コドン（二重下線）および読み枠シフトのためのヌクレオチド（太字）を加えた。
クローニングはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を通して行った。
７．３．２ ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨ
二つの工程でデヒドロコール酸の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への還元を可能にするためには、補因子再生系のＦＤＨに加えて、酵素７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨもまた細胞内に存在しなければならない。これを可能にするため、ｐＥＴベクターとの共形質転換が可能な、ｐＣＯＬＡ−ｄｕｅｔベクターの改変誘導体であるベクター構築物ｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨを調製した。
この目的のため、３α−ＨＳＤＨをコードする遺伝子を、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）３α−ＨＳＤＨのＮｄｅＩおよびＢｌｐＩ切断部位を通して切断し、次に同じ切断部位を通してｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）ベクターのＭＣＳ２内にクローン化した。配列決定後、ＤＮＡ配列の位置４５においてグアニンがシトシンに置換されていることが見出されたが、これはサイレント変異をもたらすものであった。この変異はアミノ酸配列に対して影響を及ぼさないため、いわゆるサイレント変異である。
両ベクターにより、以下に記載するように前述の株を共形質転換した。遺伝子はＩＰＴＧ誘導性である。
７．４ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の熱ショックによる形質転換
この目的のため、２００μＬの化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋またはＤＨ５αを融解し、ＤＮＡ１μＬを加えた。これらを最初に４５分間氷上でインキュベートした。次に細胞を、４２℃にて４５秒間の熱ショックに供した。次に、ＬＢ培地６００μＬを細胞に加え、これらが所望の抗生物質耐性を発生できるように、３７℃、２００ｒｐｍにおいて振盪した。次に細胞を卓上遠心機で３０００ｒｐｍにて２分間遠心し、その後、上清１５０μＬを廃棄した。細胞を残りの上清に再懸濁して、対応する抗生物質を含むＬＢ寒天プレートにまいた。次にプレートを３７℃にて一晩インキュベートした。
プラスミドｐＣＯＬＡ（ｍｏｄ）３α−ＨＳＤＨおよびｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨを含む株を作製するために必要な、二つの異なるプラスミドの共形質転換の場合、各々の場合に、挿入プラスミド２μＬを５０μＬの化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋に加えた。形質転換後、細胞を、対応する抗生物質を含むＬＢ培地５ｍＬと共に前培養チューブに加え、前培養振盪機内で３７℃、２００ｒｐｍにて１６〜４８時間、前培養チューブ内での細菌の増殖が検出されるまでインキュベートした。次に、懸濁液５μＬを、対応する抗生物質を含むＬＢ寒天プレートにまき、３７℃にて一晩インキュベートした。
７．５ 振盪フラスコ内での株の培養：
組換えタンパク質の発現のため、二つの発現プラスミドを含む、対応するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋を、対応する抗生物質を加えたＬＢ培地５ｍＬ中で、３７℃、２００ｒｐｍにて一晩インキュベートした。次に、この前培養物を、対応する抗生物質を加えたＴＢ培地２００ｍＬに植え、３７℃、２５０ｒｐｍにてインキュベートした。ＯＤ６００が０．６〜０．８に達すると、組換えタンパク質の発現を１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導し、培養物を２５℃、１６０ｒｐｍにてさらに２１時間インキュベートした。
７．６ 全細胞生体内変換の実施および試験結果
反応は２ｍＬ反応量の懸濁液中で、ｐＨ６．０にて、ＯＤ６００＝２０の細胞密度を用いて行った。２５ｍＭまたは５０ｍＭのデヒドロコール酸を基質濃度として選択し、使用した補助基質濃度は４００ｍＭであった。試験は２５℃にて、空気を排除して行った。４８時間後にサンプルを採取した。
ＨＰＬＣ法の較正を行ったサンプル中で、反応混合物が２５ｍＭの場合、基質はもはや検出不可能である一方、反応混合物が５０ｍＭデヒドロコール酸の場合、基質ピークは検出されるが、そのピーク面積は限界の１μｇ／ｍＬ基質未満であった。同じことは３，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸のピークにも当てはまる。クロマトグラムでの最大ピークは、１２−ケト−ウルソデオキシコール酸産物のピークであった。
従って驚くべきことに、デヒドロコール酸から３−ケト−ウルソデオキシコール酸への、２工程の全細胞による還元が可能であることを示すことができる。
ＨＰＬＣ測定のクロマトグラムを図７に示す。
ＨＰＬＣ分析は以下のように行った：使用したクロマトグラフィーカラムは、Ｍｅｒｃｋ社、ダルムシュタット、から入手した逆相クロマトグラフィーカラムＨｉ−ｂａｒ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ １２５−４ ＲＰ−１８ｅ（５μｍ）であった。この場合、無極性相は固定相として働くが、極性相は移動相を形成する。ＨＰＬＣ分析には勾配溶出の方法を用いた。アセトニトリルの割合を増大させながら溶離液であるリン酸水（ｐＨ２．６）に加えると、溶媒の酸性化により、分析物が均一な程度にプロトン化される。全ての成分の溶出後、クロマトグラフィーカラムを二つの溶媒の開始比によって平衡化した。勾配溶出は、最初に一定の組成、すなわち６５％（ｖ／ｖ）リン酸水および３５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを有する溶媒混合物を３分間ＨＰＬＣカラムへポンピングすることにより行った。３分目〜７．５分目から、アセトニトリルの割合を直線的に３９％（ｖ／ｖ）に増大させた。それとは別に、７．５分目と１０分目の間に、アセトニトリルの割合を直線的に４０％（ｖ／ｖ）に増大させた。全てのサンプル成分の溶出のため、アセトニトリルの割合を１０分目と１１分目の間にも直線的に７０％（ｖ／ｖ）に増大させ、この値をさらに２分間一定に保持した。その後１３分目〜１５分目に、アセトニトリルの割合を最初の値である３５％に減少させ、カラムをこの溶媒組成物で３分間平衡化した。全持続時間の間、フローは１．０００ｍＬ／分に設定した。溶出した分析物を、ＵＶ検出器により、波長２００ｎｍにおいて検出した。
反応実施例８：ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ、７β−ＨＳＤＨ、および３α−ＨＳＤＨの単一プラスミド系における共発現による、ＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡへの全細胞生体内変換
目的は、細胞の単一プラスミド系において、デヒドロコール酸の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への、２工程の全細胞による還元が可能であるか否かを調べることである。
８．１ 使用したプラスミド：
Figure 0006199742
８．２ ベクターの産生：
プラスミド構築物ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ）３α−ＨＳＤＨ（図８）は、以下のように調製した：プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨに始まり、野生型３α−ＨＳＤＨ（Ｃ．テストステローニ；配列番号５および６）を７β−ＨＳＤＨの後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ切断部位を通してクローン化した。３α−ＨＳＤＨの増幅のため、プライマー、３ａｌｐｈａ＿ｆｗｄ＿ＨｉｎｄＩＩＩおよび３ａｌｐｈａ＿ｒｅｖ＿ＮｏｔＩを用い、プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）３α−ＨＳＤＨをこのための鋳型とした。次に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロトコルに従った部位特異的変異誘発によって、Ｇ３９Ａ変異を７β−ＨＳＤＨに挿入した。変異誘発プライマーである、７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｆｗｄおよび７ｂｅｔａ＿ｍｕｔ＿Ｇ３９Ａ＿ｒｅｖを用いた。
８．３ 反応：
調製したプラスミドによりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋を形質転換した。得られたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ ７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ）３α−ＨＳＤＨ株を用いて、１５０ｍＬ規模で以下の条件により全細胞反応を行った：細胞密度ＯＤ３０、５０ｍＭ ＤＨＣＡ、７５０ｍＭギ酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した細胞および基質懸濁液。反応は２５℃にて３．５時間行った。ＨＰＬＣ分析の結果を図９に示す（手順については上記の反応実施例７を参照）。
産生実施例６：さらなる７β−ＨＳＤＳ変異体の産生およびその性質決定
ＮＡＤＨ特異的な７β−ＨＳＤＨを産生する一つの可能性は、変異誘発の様々な技術により、利用可能な酵素を改変することからなる。従って、部位特異的変異誘発を用い、７β−ＨＳＤＨの個々のアミノ酸を他と置換することで、ＮＡＤＰが安価なＮＡＤによって有利に置き換えられるように、７β−ＨＳＤＨの補因子特異性がＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ変化する。
６．１ プライマー
全部で、７β−ＨＳＤＨ変異体Ｇ３９Ｄ、Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｌ、Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｉ、およびＧ３９Ｄ／Ｒ４０Ｖを産生した。Ｇ３９Ｄ変異体はＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅを用いた変異誘発によって産生したが、その他の変異体はSanchisらによるＰＣＲ法（Sanchis J, Fernandez L, Carballeira JD, Drone J, Gumulya Y, Hobenreich H, Kahakeaw D, Kille S, Lohmer R, Peyralans JJ, Podtetenieff J, Prasad S, Soni P, Taglieber A, Wu S, Zilly FE, Reetz MT. Improved PCR method for the creation of saturation mutagenesis libraries in directed evolution: application to difficult-to-amplify templates. Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Nov; 81(2): 387-97）を用いて産生した。野生型と産生した変異体の配列比較を図１０に示す。変異誘発には以下のプライマーを用い、斜体で示す塩基はそれぞれ交換したアミノ酸をコードする：
Figure 0006199742
６．２ ７β−ＨＳＤＨ変異体の酵素反応速度調査
調製した変異体を酵素反応速度調査によって評価し、結果を図１１のグラフに示す。無改変の７β−ＨＳＤＨを調べるために０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨを補因子として用いたが、７β−ＨＳＤＨ変異体を調べるためには０．５ｍＭ ＮＡＤＨを用いた。７β−ＨＳＤＨ変異体の酵素反応速度調査において補因子濃度を増大させる必要があるのは、変異体において補因子ＮＡＤＨの半飽和濃度が増大しているためである。特異的酵素活性に対する基質濃度のプロットから、７β−ＨＳＤＨ変異体ではミカエリス・メンテンによる反応速度に特徴的な曲線が観察されたが、無改変の野生型７β−ＨＳＤＨについてのプロットからは、基質阻害を伴うミカエリス・メンテンによる反応速度の曲線が観察された。従って、古典的なミカエリス・メンテンモデル（方程式１）を７β−ＨＳＤＨ変異体に対する一連の測定の評価に用い、基質阻害を伴うミカエリス・メンテンモデルを、無改変の野生型７β−ＨＳＤＨに対する一連の測定の評価に用いた（方程式２）。
Figure 0006199742
ＥＡｘ：特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
νｍａｘ：最大特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
ｃＳ：基質または補因子濃度、ｍｏｌＬ−１
Ｋｍ：半飽和濃度、ｍｏｌＬ−１
Figure 0006199742
ＥＡｘ：特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
νｍａｘ：最大特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
ｃＳ：基質または補因子濃度、ｍｏｌＬ−１
Ｋｍ：半飽和濃度、ｍｏｌＬ−１
Ｋｉ：阻害定数、ｍｏｌＬ−１
以下の表に、無改変の野生型７β−ＨＳＤＨおよび補因子特異性が変化したその変異体の酵素反応速度パラメータを示す。野生型に対する補因子としてＮＡＤＰＨを用いる一方、変異体に対する補因子としてＮＡＤＨを用いた。
Figure 0006199742
産生実施例７：さらなる７β−ＨＳＤＳ変異体の産生およびその性質決定
産生実施例６に平行して調製を行い、さらなる７β−ＨＳＤＳ変異体を産生した。
７．１ プライマー
７β−ＨＳＤＨの部位特異的変異誘発には、以下に示す変異誘発プライマーを用いた。プライマーは、所望のアミノ酸交換がもたらされるように、７β−ＨＳＤＨ遺伝子配列に基づいて選択した。変異される塩基はプライマーの中心に位置し、プライマー対の融点は同じ範囲に位置することに留意した。
変異体の調製のために以下のプライマー対を用いた：
Figure 0006199742
７．２ ＰＣＲプログラム
反応中、最初に２分間の変性工程を９８℃にて行った。次に、変性（９８℃にて３０秒）、プライマーハイブリダイゼーション（６０〜６８℃にて１分）、および伸長（７２℃にて３．５分）を２３サイクル行った。最後の工程で、１０分間の最終伸長を７２℃にて行い、次に４℃に冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。
７．３ ＰＣＲアッセイ
Figure 0006199742
７．４ 手順
タンパク質配列中のアミノ酸の標的化された交換のため、対応する遺伝子のＤＮＡ配列を部位特異的変異に供した。このために、それらの配列中に所望の変異が含まれる、互いに相補的なプライマーを用いた。変異される遺伝子を有する、Ｎ６−アデニン−メチル化、二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用いた。Ｎ６−アデニン−メチル化プラスミドＤＮＡは、ｄａｍ＋Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５から分離した。
ポリメラーゼ連鎖反応は上記のように行った。所望の変異を有し、鎖を切断したプラスミドが形成されるように、プライマーを鋳型に対して相補的に伸長させた。その他のＰＣＲ反応とは対照的に、この場合、新たに形成されたＤＮＡ分子はＰＣＲ反応のための鋳型としては役立たないため、ＤＮＡ収率は直線的にのみ増大する。
ＰＣＲ反応が完了すると、ＰＣＲ−Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、親であるＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩによって消化した。この酵素は、非特異的にＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限切断するが、新たに形成された非メチル化ＤＮＡは制限切断しないという特色を有する。制限切断は、ＰＣＲ反応混合物に１μＬのＤｐｎＩを加え、３７℃にて２時間または一晩インキュベートして行った。
この調製物５μｌを、１００μｌの化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。プラスミド分離後、配列決定によって変異の成功を確認した。
７．５ 性質決定
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロトコルに従った部位特異的変異誘発により、７β−ＨＳＤＨに変異を導入した。７．１項の表に示す変異誘発プライマーを用いた。
活性の光度測定についての「方法」に示したアッセイを用い、変異酵素の活性をＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下に測定した。見出された活性を以下の表に示す。
Figure 0006199742
反応実施例９：デヒドロコール酸から３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの全細胞還元におけるＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨの使用
産生実施例６で産生したＮＡＤＨ−依存性７β−ＨＳＤＨの、ＤＨＣＡから３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの全細胞生体触媒的変換における使用について以下に示す。より良い理解のため、潜在的反応経路および反応産物の概要を図１２に示す。
この場合には、７β−ＨＳＤＨ変異体と、マイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤＨ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼとを共に発現ベクターへ挿入した。７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ）を挿入したベクターは、配列番号４９に相当するｐＦｒ７（Ｄ）；７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｌ）を挿入したベクターは、配列番号５０に相当するｐＦｒ７（ＤＬ）；７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｉ）を挿入したベクターは、配列番号５１に相当するｐＦｒ７（ＤＩ）、および７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｖ）を挿入したベクターは、配列番号５２に相当するｐＦｒ７（ＤＶ）である。これらのベクターの一般的なプラスミドマップを図１３に示す。
これらのベクターにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋に同じ）を形質転換した。これらの株から、最初に、５ｍＬの一晩培養した培地を、１００ｍｇＬ−１アンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させた。各々の場合に、これらの一晩の培養液１ｍＬを、次の日に、振盪フラスコ内の１００ｍｇＬ−１アンピシリンを含むＴＢ培地２００ｍＬに移した。これらを振盪インキュベータ内で、２５０ｒｐｍ、３７℃にて、ＯＤが０．６〜０．８に達するまで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導を行った。続く発現相を２５℃、１６０ｒｐｍにて２１時間行った。細胞を３２２０ｇで１０分間遠心分離した。
この方法で産生した細胞を用いて、全細胞生体内変換反応を設定した。様々な時点での、反応混合物中の基質ＤＨＣＡの濃度および産物である３，１２−ジケト−ＵＤＣＡの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
生体内変換のための反応混合物は、１７．７ｇＬ−１ ＢＴＭ 全細胞生体触媒、１００ｍＭ基質（ＤＨＣＡ）、５００ｍＭギ酸ナトリウムを含み、これらを５０ｍＭギ酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させた。使用した方法は、２０ｍＬ規模で、ｐＨモニターなしのバッチ法であった。２４時間後の産物および基質濃度を図１４に示す。全ての変異体は、ＤＨＣＡから３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの全細胞生体触媒的変換に適していることが分かる。
反応実施例１０：デヒドロコール酸から１２−ケト−ＵＤＣＡへの２工程の全細胞還元におけるＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨの使用
ＤＨＣＡから１２−ジケト−ＵＤＣＡへの２工程の全細胞生体触媒的変換におけるＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨの使用について以下に示す。変異体７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ）、マイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤＨ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびコマモナス・テストステローニ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨを共に発現ベクターへ挿入した。７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ）の使用例を、全てのＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨについて示す。ベクターはｐＦｒ３Ｔ７（Ｄ）と称され、これを図１５に示す。
これらのベクターにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋に同じ）を形質転換し；得られた株をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３Ｔ７（Ｄ）と命名した。この株を７Ｌのバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量４Ｌにて培養した。３７℃での短い初期相の後、３０℃における基質限定的な指数関数増殖相が続いた。吸光度が２５〜３０に達すると、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を２０℃にて２４時間行った。細胞（３２．０ｇＬ−１ ＢＴＭ）を遠心分離によって回収し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に再懸濁し、標準的なプロトコルに従い−２０℃にて保管した。
以下の反応条件で、２０ｍＬ規模において生体内変換を設定した：１００ｍＭ ＤＨＣＡ、１７．７ｇＬ−１ ＢＴＭの保管した生体触媒、５００ｍＭギ酸アンモニウム、２６％グリセロール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させた。ｐＨの調整はマニュアルで行い、生体内変換法の最初の５時間の間、ｐＨを６．５に維持した。胆汁酸塩濃度を時間の関数として図１６に示す。２４時間後、産物である１２−ケト−ＵＤＣＡが９２％形成された。ＤＨＣＡの３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの変換および７，１２−ジケト−ＵＤＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの変換により、図１２に示す７β−ＨＳＤＨの全ての反応が、実際に７β−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ｄ）によって触媒されることがわかる。
反応実施例１１：単一細胞系におけるデヒドロコール酸の２工程還元
ウルソデオキシコール酸合成の一経路は、コール酸のデヒドロコール酸への化学的酸化と、それに続く３−カルボニル基の３α−水酸基への非対称性の酵素的還元および７−カルボニル基の７β−水酸基への非対称性の酵素的還元、ならびにそれに続く１２−カルボニル基の化学的除去を含む。
この合成経路では、酵素的還元反応の触媒作用に、酵素７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）および３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）が必要とされる。反応中、添加した補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）は化学量論的に消費され、これらは経済的な方法において再生される必要がある。このために、しばしば酵素の再生の可能性が好まれる。適した酵素として、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）が挙げられる。
分離した酵素の使用とは対照的に、宿主生物、典型的には単細胞性微生物内の必要な酵素を用いる全細胞生体触媒作用において、個別の酵素を個別の濃度で反応培地に加えることは不可能である。この場合、酵素活性は、培養法または全細胞生体触媒の遺伝的改変により、関連する全ての酵素の発現レベルを改変することでバランスを取らなければならない。
本実施例では、本発明に従い、三つの遺伝子、７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＦＤＨを全て含むベクターを用いた。ベクターは、指定した宿主株、特に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に基づく全細胞生体触媒株において、三つの遺伝子の発現レベルを、三つの酵素全てが可能な限り同様な酵素活性となるように適応させて構築した。
デヒドロコール酸から１２−ケト−ウルソデオキシコール酸への全細胞還元において必要とされる三つの遺伝子は、同じ一つのベクターに位置する。これらは以下の酵素をコードする遺伝子である：コリンゼラ・アエロファシエンス由来のＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨ、コマモナス・テストステローニ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰの両方に依存性である、マイコバクテリウム−バッカエ由来の変異ＦＤＨ。これら三つの遺伝子の発現レベルは、最適な全細胞生体触媒作用が実施できるような遺伝的構築によってバランスを取ることができる。本実施例では、７β−ＨＳＤＨ変異体Ｇ３９ＡおよびＧ３９Ｓを、無改変の野生型酵素の代わりに全細胞生体触媒作用のためのベクターに挿入した。該ベクターをｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３およびｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３と命名し、図１７ａおよびｂにこれらを示す。図１８は、潜在的な反応経路および反応産物を示す略図である。
本発明のこれらのベクターにより、大腸菌の産生株を形質転換した。これらの株は全細胞生体触媒を代表する。使用した宿主株はＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９と称される改変Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）であるが、宿主生物はこの宿主株に限定されない。ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３と称し、ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３と称す。
１１．１ ２０ｍＬ規模における、デヒドロコール酸の２工程全細胞還元
２０ｍＬ規模において、全細胞生体内変換により生体触媒を比較した。このために、最初に、一晩培養した培地５ｍＬを、１００ｍｇＬ−１アンピシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。これらの一晩の培養液１ｍＬを、次の日に、振盪フラスコ内の１００ｍｇＬ−１アンピシリンを含むＴＢ培地２００ｍＬに移した。これらを振盪インキュベータ内で、２５０ｒｐｍ、３７℃にて、ＯＤが０．６〜０．８に達するまで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導を行った。続く発現相を２５℃、１６０ｒｐｍにて２１時間行った。細胞を３２２０ｇで１０分間遠心分離した。
この方法で産生した細胞を用いて、全細胞生体内変換反応を設定した。反応混合物中に形成された産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）の量は、細胞の評価に決定的であった。反応混合物中の基質ＤＨＣＡ、中間体である３，１２−ジケト−ＵＤＣＡおよび７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、ならびに産物である１２−ケト−ＵＤＣＡの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
生体内変換のための反応混合物は、１１．８ｇＬ−１ ＢＴＭ 全細胞生体触媒、１００ｍＭ基質（ＤＨＣＡ）、５００ｍＭギ酸ナトリウムを含み、これらを５０ｍＭギ酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させた。使用した方法は、２０ｍＬ規模で、ｐＨモニターなしのバッチ法であった。上記の全細胞生体内変換の５時間経過後の結果を以下の表に示す。二つの新規株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３を、参照株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７ ｐＣ３と比較した。参照株のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７ ｐＣ３によればわずかに５．７±１．０％の産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）が形成されたが、新規生体触媒では、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３株によって３８．４±８．２％の１２−ケト−ＵＤＣＡが形成され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３株によって４７．７±２．１％の１２−ケト−ＵＤＣＡが形成された。従って反応混合物における産物濃度は、参照株と比較して６．７倍（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３）および８．４倍（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３）増大した。
従って、１００ｍＭ基質（ＤＨＣＡ）を用いた際の、５時間後の生体内変換バッチ中の胆汁酸塩の割合を以下の表に示す。二つの新規株である生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ｓ）ｒ３によるバッチを、先行技術のＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７ ｐＣ３株との比較において示す。
Figure 0006199742
１１．２ １Ｌ規模における、デヒドロコール酸の２工程全細胞還元
方法の制御を通して、生体触媒Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）ｒ３による産物形成は、ミリリットル規模と比較して増大した。このために、該生体触媒を７Ｌバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量４Ｌにて培養した。３７℃での短い初期相の後、３０℃における基質限定的な指数関数増殖相がみられた。吸光度が２５〜３０に達すると、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を２５℃にて１０時間行った後、細胞を遠心分離によって回収し、−２０℃にて保管した。
以下の反応条件で、１Ｌバイオリアクターにおいて生体内変換を設定した：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、１７．７ｇＬ−１ ＢＴＭの保管した生体触媒、５００ｍＭギ酸ナトリウム、２６％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させた。ｐＨの調整により、生体内変換の間を通してｐＨを６．５に維持した。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図１９に示す。２１時間後、産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）が９９．４％形成され、副生成物である３，１２−ジケト−ＵＤＣＡは０．６％のみ検出可能であった。
反応実施例１２：補因子再生にグルコースデヒドロゲナーゼを用いた、単一細胞系におけるデヒドロコール酸の２工程還元
この実施例では、コリンゼラ・アエロファシエンス由来のＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨ（変異体Ｇ３９Ａ）およびコマモナス・テストステローニ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨに加え、補因子再生に対してＮＡＤおよびＮＡＤＰの両方に依存性である、枯草菌由来のＧＤＨを、ＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡへの２工程還元のために全細胞生体触媒（単一細胞系）に発現させた。このＧＤＨの核酸配列および関連するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４７および配列番号４８に示す。
このために用いたベクターは、ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧおよびｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧと称し、これらをそれぞれ図２０および図２１に示す。
本発明のベクターにより、大腸菌の産生株を形質転換した。これらの株は全細胞生体触媒を代表する。使用した宿主株はＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋に同じ）と称される改変Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）であるが、宿主生物はこの宿主株に限定されない。ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧと称し、ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧと称す。
新規に産生された生体触媒により、全量１７．７ｇ／Ｌ ＢＴＭの生体触媒を使用して、１００ｍＭ ＤＨＣＡを９８％まで１２−ケト−ＵＤＣＡに変換することができた。
１２．１ ２０ｍＬ規模における、デヒドロコール酸の２工程全細胞還元
２０ｍＬ規模において、全細胞生体内変換により生体触媒を比較した。基質ＤＨＣＡ、中間体である３，１２−ジケト−ＵＤＣＡおよび７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、ならびに産物である１２−ケト−ＵＤＣＡの培養および反応混合物中の濃度の決定については、反応実施例１１．１に記載したように行った。
生体内変換のための反応混合物は、１１．８ｇ／Ｌ ＢＴＭ 全細胞生体触媒、１００ｍＭ基質（ＤＨＣＡ）、５００ｍＭグルコースを含み、これらを５０ｍＭギ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁させた。使用した方法は、２０ｍＬ規模で、ｐＨモニターなしのバッチ法であった。生体触媒のパーフォレーションは必要ではない。以下の表は上記の全細胞生体内変換の２４時間経過後の結果を示すものであり、二つの株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧおよびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧによる全細胞生体内変換の結果を示す。新規生体触媒によれば、１１．８ｇＬ−１ ＢＴＭ の生体触媒を用いて、２４時間以内に１００ｍＭ デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を４６％まで（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧ）または６８％まで（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ）１２−ケト−ウルソデオキシコール酸 （１２−ケト−ＵＤＣＡ）に変換することができた。１００ｍＭ基質（ＤＨＣＡ）を用いた、２４時間後の生体内変換バッチ中の胆汁酸塩の割合を以下の表に示す（二つの新規株である生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ３Ｔ７（Ａ）ｒＧおよびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ）。
Figure 0006199742
１２．２ バイオリアクター内で２０ｍＬ規模にて培養したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ株細胞による、デヒドロコール酸の２工程全細胞還元
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ株を７Ｌのバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量４Ｌにて培養した。３７℃での短い初期相の後、３０℃における基質限定的な指数関数増殖相がみられた。吸光度が２５〜３０に達すると、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を２０℃にて２４時間行った細胞（４６．７ｇ／Ｌ ＢＴＭ）を遠心分離によって回収し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に再懸濁し、標準的なプロトコルに従い−２０℃にて保管した。回収時の酵素活性は、１６．４Ｕ／ｍＬ ７β−ＨＳＤＨ、３．６Ｕ／ｍＬ ３α−ＨＳＤＨ、４４．９Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ（ＮＡＤＰ）、１８．１Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ（ＮＡＤ）であった。
以下の反応条件で、２０ｍＬ規模において生体内変換を設定した：１００ｍＭ ＤＨＣＡ、１７．７ｇ／Ｌ ＢＴＭの保管した生体触媒、５００ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させた。ｐＨの調整はマニュアルで行い、生体内変換法の間を通してｐＨを７に維持した。反応は補因子の添加なしで、または０．１ｍＭ ＮＡＤを添加して行った。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図２２に示す。２時間後、ＮＡＤの添加および無添加のそれぞれにおいて、＞９８％の産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）が形成された。
１７．７ｇ／Ｌ ＢＴＭの生体触媒を完全に用いることで、１００ｍＭ ＤＨＣＡは９８％まで１２−ケト−ＵＤＣＡに変換された。
反応実施例１３：二つの異なる全細胞生体触媒の平行使用による、デヒドロコール酸の２工程還元
この実施例では、一つの全細胞生体触媒に代わって二つの全細胞生体触媒を用いた。この目的のため、マイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤＰ特異的ＦＤＨおよびコリンゼラ・アエロファシエンス由来のＮＡＤＰＨ特異的７β−ＨＳＤＨをこれらの生体触媒の一つに発現させ、一方でマイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤ依存性ＦＤＨおよびコマモナス・テストステローニ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨを別の生体触媒に発現させた。
具体的に本実施例では、マイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤＰ特異的ＦＤＨおよびコリンゼラ・アエロファシエンス由来のＮＡＤＰＨ特異的７β−ＨＳＤＨに対する遺伝子を含むベクターｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）、ならびにマイコバクテリウム−バッカエ由来のＮＡＤ依存性ＦＤＨおよびコマモナス・テストステローニ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨに対する遺伝子を含むベクターｐＦｒ３を使用した。ベクターｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）およびｐＦｒ３を図２３ａおよびｂに示す。図２４は、潜在的な経路および産物の反応スキームを示す。しかしながら、本発明は、記載したこれらの二つのベクターに限定されるものではなく、７β−ＨＳＤＨおよび適切な補因子再生酵素に対する遺伝子を含むベクターと、３α−ＨＳＤＨおよび適切な補因子再生酵素に対する遺伝子を含むベクターとの、考えられる全ての組合せを含むことができる。
１３．１ 二つの生体触媒を異なる混合比で用いた、ＤＨＣＡの全細胞還元
生体触媒であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３を異なる混合比で用いた、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの全細胞還元を以下の実施例に示す。この場合には、３バッチのそれぞれにおいて全量１７．７ｇＬ−１ ＢＴＭの生体触媒を用いた。しかしながらバッチにおいて二つの生体触媒を異なる割合で用いた。これらは以下の通りである：
−８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３
−１０．３３ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および７．３８ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３
−１１．８０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および５．９０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３。
これらの生体触媒作用反応は、作業容量２０ｍＬにて行った。バッチのさらなる構成物質は、７０ｍＭ ＤＨＣＡ、ギ酸ナトリウム５００ｍＬ、２６％グリセロール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、５０ｍＬリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させたものである。反応は２４時間行った。２４時間後の胆汁酸塩の割合を図２５に示す。
８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３の調製では、７９％ １２−ケト−ＵＤＣＡ、４％ ３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、および１７％ ７，１２−ジケト−ＵＤＣＡが形成され、１０．３３ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および７．３８ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３の調製では、８７％ １２−ケト−ＵＤＣＡ、９％ ３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、および４％ ７，１２−ジケト−ＵＤＣＡが形成され、１１．８０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および５．９０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３の調製では、７１％ １２−ケト−ＵＤＣＡおよび２９％ ３，１２−ジケト−ＵＤＣＡが形成された。形成された中間体の割合からみると、８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３による調製の場合には、中間体７，１２−ジケト−ＵＤＣＡが高い割合で形成されたことから、３α−ＨＳＤＨの反応が高率で起こったと考えられ、一方で１１．８０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および５．９０ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３による調製の場合には、７β−ＨＳＤＨの反応が高率で起こり、従って中間体３，１２−ジケト−ＵＤＣＡが高い割合で形成された。１０．３３ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および７．３８ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３による調製の場合には、中間体のほとんど均一に形成されたことにみられるように、７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨの反応は、両方が大体同じ比率で起こるように調整された。結果として産物１２−ケト−ＵＤＣＡ（８７％）は、この調製において最も高い割合で形成することができた。
この実施例により、それぞれの反応工程の比率は、使用する生体触媒の割合を調整することによって影響されることが示された。
１３．１ 二つの生体触媒を１Ｌ規模で用いた、ＤＨＣＡの全細胞還元
生体触媒であるＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３を用いた方法の制御を通し、産物形成はミリリットル規模と比較して増大した。以下の反応条件で、１Ｌバイオリアクターにおいて生体内変換を設定した：８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦ（Ｇ）ｒ７（Ａ）および８．８５ｇＬ−１ ＢＴＭ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐＦｒ３を含む９０ｍＭ ＤＨＣＡ、５００ｍＭギ酸アンモニウム、２６％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁させた。ギ酸を用いたｐＨの調整により、生体内変換の間を通してｐＨを６．５に維持した。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図２６に示す。２０時間後、産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）が９９．４％形成され、中間体である３，１２−ジケト−ＵＤＣＡおよび７，１２−ジケト−ＵＤＣＡは総量で０．６％のみ検出可能であった。
本発明の生体触媒を全量１７．７ｇＬ−１ ＢＴＭ使用することにより、９０ｍＭ ＤＨＣＡを９９．５％まで１２−ケト−ＵＤＣＡに変換することができた。
Figure 0006199742
Figure 0006199742
Figure 0006199742
本明細書において言及される文書の開示に対しては、明確な参照が為される。

Claims (13)

  1. 少なくとも立体特異的な酵素的還元により７−ケトステロイドを該７−ケトステロイドに対応する７−ヒドロキシステロイドへと触媒する７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）変異体であって、該変異体は、配列番号２の位置３９〜４１の配列モチーフＧＲＲにおいて少なくとも１つの置換を有し、且つ前記少なくとも１つの置換が
    ａ）単一置換群Ｇ３９Ｘ１及びＲ４０Ｘ２、
    ｂ）二重置換群Ｇ３９Ｘ１Ｒ４０Ｘ２、及びＲ４０Ｘ２Ｒ４１Ｘ ３ 、及び
    ｃ）三重置換Ｇ３９Ｘ１Ｒ４０Ｘ２Ｒ４１Ｘ３、
    からなる群から選択され、
    Ｘ １ はＡ、Ｓ、Ｅ及びＤのうちの一つを表し、
    Ｘ ２ はＬ、Ｉ、Ｖ及びＤのうちの一つを表し、
    Ｘ ３ はＮ、Ｉ、Ｌ及びＶのうちの一つを表し、
    前記変異体は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、上記７β−ＨＳＤＨ変異体。
  2. 前記置換が、
    ａ）単一置換群Ｇ３９Ｘ１（Ｘ１がＡ、Ｓ及びＤのうちの一つを表す）、
    ｂ）二重置換群Ｇ３９Ｘ１Ｒ４０Ｘ２（Ｘ１がＳ及びＤのうちの一つを表し、Ｘ２がＬ、Ｉ及びＶのうちの一つを表す）、Ｒ４０Ｘ２Ｒ４１Ｘ３（Ｘ２がＤ、Ｉ、Ｖ及びＬのうちの一つを表し、Ｘ３がＬ、Ｉ及びＶのうちの一つを表す）、及び
    ｃ）三重置換Ｇ３９Ｘ１Ｒ４０Ｘ２Ｒ４１Ｘ３（Ｘ１がＤ及びＥのうちの一つを表し、Ｘ２がＬ、Ｉ及びＶのうちの一つを表し、Ｘ３がＮ、Ｉ、Ｌ及びＶのうちの一つを表す）
    から選択される請求項１記載の７β−ＨＳＤＨ変異体。
  3. 前記置換が、
    ａ）単一置換群Ｇ３９Ｘ１（Ｘ１がＡ、Ｓ及びＤのうちの一つを表す）、
    ｂ）二重置換群Ｇ３９ＤＲ４０Ｉ、Ｇ３９ＤＲ４０Ｌ、Ｇ３９ＤＲ４０Ｖ、Ｇ３９ＥＲ４０Ｉ、Ｇ３９ＥＲ４０Ｌ、Ｇ３９ＥＲ４０Ｖ、Ｒ４０ＤＲ４１Ｉ、Ｒ４０ＤＲ４１Ｌ、Ｒ４０ＤＲ４１Ｖ、Ｒ４０ＩＲ４１Ｉ、Ｒ４０ＶＲ４１Ｉ、Ｒ４０ＬＲ４１Ｉ、及び
    ｃ）三重置換Ｇ３９ＤＲ４０ＩＲ４１Ｎ
    から選択される請求項１又は２記載の７β−ＨＳＤＨ変異体。
  4. 前記変異体が、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項１〜３のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体。
  5. 前記変異体が、配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体をコードする少なくとも１つの核酸配列又は該核酸配列に対応する少なくとも１つの発現カセット又は該核酸配列に対応する少なくとも１つのベクターを有するか、又は
    請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体をコードする少なくとも１つの核酸配列又は該核酸配列に対応する少なくとも１つの発現カセット又は該核酸配列に対応する少なくとも１つのベクターを有し且つヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ群及び補因子再生に用いられるデヒドロゲナーゼ群から選択される別の酵素をコードする配列をさらに有する、組換え微生物。
  7. ７β−ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に合成する方法であって、７β−ヒドロキシステロイドに対応する７−ケトステロイドを、請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下で、又は請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を発現する組換え微生物の存在下で反応させ、少なくとも１つの還元産物を形成する、上記方法。
  8. 還元を、ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの存在下、且つＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨの消費によって、生じさせる請求項７記載の方法。
  9. 消費されたＮＡＤＰＨを、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ群、アルコールデヒドロゲナーゼ群（ＡＤＨ）、並びにＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ群（ＦＤＨ）及びＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ群（ＧＤＨ）から選択されるＮＡＤＰＨ再生酵素との結合によって再生するか；及び／又は
    消費されたＮＡＤＨを、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ群、ＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ群（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ群（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ群（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ群（ＰｔＤＨ）及びＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ群（ＧＤＨ）から選択されるＮＡＤＨ再生酵素との結合によって再生する、請求項８記載の方法。
  10. 消費されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼの変異体（ＦＤＨ変異体）群から選択されるＮＡＤＰＨ再生酵素との結合によって再生され、該ＦＤＨ変異体は、酵素的酸化によりギ酸をＣＯ２へと少なくとも触媒し、前記ＦＤＨ変異体は、未変異のＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼと比較して、ＮＡＤＰ＋を補因子としてさらに受容し、ＮＡＤＰ＋受容性変異体を形成し、該ＮＡＤＰ＋受容性変異体は、配列番号３６の位置２２２の配列モチーフＤにおいて少なくとも１つの置換を有し、該少なくとも一つの置換がＤ２２２Ｇであり、且つ配列番号３６と少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項９記載の方法。
  11. ａ）ＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼの変異体群のいずれか（ＦＤＨ変異体）であって、その各々は、酵素的酸化によりギ酸をＣＯ ２ へと少なくとも触媒し、該ＦＤＨ変異体は、未変異のＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼと比較して、ＮＡＤＰ ＋ を補因子としてさらに受容し、ＮＡＤＰ ＋ 受容性変異体を形成し、該ＮＡＤＰ ＋ 受容性変異体は、配列番号３６の位置２２２の配列モチーフＤにおいて少なくとも１つの置換を有し、該少なくとも一つの置換がＤ２２２Ｇであり、且つ配列番号３６と少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＤＨ変異体及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードするか；又は
    ｃ）前記ＦＤＨ変異体及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質をコードするか；又は
    ｅ）ＦＤＨ野生型及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードするか；又は
    ｆ）ＦＤＨ野生型及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質をコードするか；又は
    ｉ）ＧＤＨ及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を同時にコードするか；又は
    ｋ）ＧＤＨ及び請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体を有する融合タンパク質をコードする；
    核酸配列群から選択される核酸。
  12. 請求項１１記載の核酸を少なくとも１つ有する組換え微生物。
  13. 請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体、並びに、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体及び／又は該ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体に対応するＦＤＨ野生型を同時発現するか；又は
    請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体、並びに、ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体及び／又は該ＮＡＤＰ＋受容性ＦＤＨ変異体に対応するＦＤＨ野生型を同時発現し且つ３α−ＨＳＤＨを同時発現するか；又は
    請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体及びＧＤＨを同時発現するか；又は
    請求項１〜５のいずれか１項記載の７β−ＨＳＤＨ変異体及びＧＤＨを同時発現し且つ３α−ＨＳＤＨを同時発現する、組換え微生物。
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