KR20190018675A - 케노데옥시콜산의 우르소데옥시콜산으로의 커플링된 생체내변환 및 이러한 방법에 적용가능한 효소 돌연변이체 - Google Patents
케노데옥시콜산의 우르소데옥시콜산으로의 커플링된 생체내변환 및 이러한 방법에 적용가능한 효소 돌연변이체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190018675A KR20190018675A KR1020197000652A KR20197000652A KR20190018675A KR 20190018675 A KR20190018675 A KR 20190018675A KR 1020197000652 A KR1020197000652 A KR 1020197000652A KR 20197000652 A KR20197000652 A KR 20197000652A KR 20190018675 A KR20190018675 A KR 20190018675A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hsdh
- seq
- nadp
- nad
- cofactor
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01159—7-Alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.159)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01201—7-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.201)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 관련된 화합물을 우르소데옥시콜산(UDCA) 및 관련 화합물로 전환시키는 커플링된 생체전환 방법에 관한 것이다. 이는 또한 클로스트리디움 디시실레(Clostridium difficile)로부터의 신규한 NADP+-의존성 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(7α-HSDH), 이의 보조인자 스위치 돌연변이체(switch mutant)의 클로닝, 발현, 및 생화학적 특성화, 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 이. 콜라이(E. coli)의 NADP+-의존성 7α-HSDH의 신규한 NADP-의존성 보조인자 스위치 돌연변이체 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid: CDCA) 및 관련 화합물의 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid: UDCA) 및 관련 화합물로의 커플링된 생체내변환 방법(coupled biotransformation process)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile)로부터의 신규한 NADP+-의존성 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(7α-HSDH), 이의 보조인자 스위치 돌연변이체(cofactor switch mutant)의 클로닝, 발현, 및 생화학적 특성화, 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 이. 콜라이(E. coli)의 NAD+ 의존성 7α-HSDH의 신규한 NADP-의존성 보조인자 스위치 돌연변이체 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용에 관한 것이다.
발명의 배경
담즙산은 지질의 흡수, 유화(emulsification), 및 소화를 위한 생화학적 성분이다. 이들은 간 속에서 콜레스테롤로부터 접합되지 않은(unconjugated) 담즙염으로서 합성된 후 글리신 및 타우린과 접합된다. 사람 담즙 속에서 1차 담즙산은 콜산(CA) 및 케노데옥시콜산(CDCA)인 반면, 2차 담즙산 데옥시콜산(DCA) 및 리토콜산(LCA)은 측쇄 아미드 결합의 가수분해 및 C-7에서의 데하이드록실화를 통해 장내 세균에 의해 CA 및 CDCA로부터 생산된다.
C-7에서 α-위치한 OH 그룹의 디하이드록실화 외에, CA 또는 CDCA의 이러한 알코올 그룹은 대안적으로 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(EC 1.1.1.159)(7α-HSDH)에 의해 장내 세균 총(bacterial flora)으로부터 각각 7-케토데옥시콜산 또는 7-케토리토콜산으로 산화될 수 있다. 2가지 유형의 미생물 효소는 NAD+ 또는 NADP+에 의존하는 것으로 기술되어 있다. NAD+-의존성 효소는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(T. Yoshimoto, H. Higashi, A. Kanatani, X. Lin, H. Nagai, H. Oyama, et al., Cloning and sequencing of the 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase gene from Escherichia coli HB101 and characterization of the expressed enzyme., J. Bacteriol. 173 (1991) 2173-2179), 박테리오이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)(M. Bennett, S. McKnight, J. Coleman, Cloning and Characterization of the NAD-dependent 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase from Bacteroides fragilis., Curr. Microbiol. 47 (2003) 475-484. doi:10.1007/s00284-003-4079-4), 브라비박테리운 푸스쿰(Brevibacterium fuscum)(V. Prabha, M. Ohri, Review: Bacterial transformations of bile acids, World J. Microb. Biot. 22 (2005) 191-196. doi:10.1007/s11274-005-9019-y), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(이전에는 크산토모나스 말포필리아(Xanthomonas maltophilia))(A. Medici, P. Pedrini, E. Bianchini, G. Fantin, A. Guerrini, B. Natalini, et al., 7α-OH epimerisation of bile acids via oxido-reduction with Xanthomonas maltophilia., steroids. 67 (2002) 51-6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11728521; P. Pedrini, E. Andreotti, A. Guerrini, M. Dean, G. Fantin, P. Giovannini, Xanthomonas maltophilia CBS 897.97 as a source of new 7β- and 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenases and cholylglycine hydrolase: improved biotransformations of bile acids, steroids. 71 (2005) 189-98. doi:10.1016/j.steroids.2005.10.002) 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus)(P. Giovannini, A. Grandini, D. Perrone, P. Pedrini, G. Fantin, M. Fogagnolo, 7α- and 12α-Hydroxysteroid Dehydrogenases from Acinetobacter calcoaceticus lwoffii: a new integrated chemo-enzymatic route to ursodeoxycholic acid., Steroids. 73 (2008) 1385-1390. doi:10.1016/j.steroids.2008.06.013)로부터 수득된 반면, NADP+-의존성 효소는 클로스트리디움(Clostridium)(J. Coleman, L. Hudson, M. Adams, Characterization and regulation of the NADP-linked 7alpha-Hydroxysteroid Dehydrogenase gene from Clostridium sordellii., J. Bacteriol. 176 (1994) 4865-74.), 유로박테리움 종( Eubacterium sp.) 균주 VPI 12708 ([9]
C. Franklund, Purification and Characterization of a microbial, NADP-dependent bile acid 7α-Hydroxysterod Dehydrogenase, J. Biol. Chem. (1990) 9842-9849; S. Baron, C. Franklund, P. Hylemon, Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for bile acid 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase from Eubacterium sp. strain VPI 12708., J. Bacteriol. 173 (1991) 4558-69.)에서 발견되었고 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)(W. Ji, Y. Chen, H. Zhang, X. Zhang, Z. Li, Y. Yu, Cloning, expression and characterization of a putative 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase in Comamonas testosteroni)에서 매우 최근에 발표되었다. 박테리오이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)의 일부 균주는 적어도 2개의 7α-HSDH를 함유하며, 하나는 NAD+에 의존하고 하나는 NADP+에 의존한다(P. Hylemon, J. Sherrod, Multiple Forms of 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase in Selected Strains of Bacteroides fragilis, J. Bacteriol. 122 (1975) 418-424.).
7α-HSDH는 알코올 데하이드로게나제(ADH)의 큰 계열에 속한다. 이들 반응의 높은 거울상 선택성(enantioselectivity)으로 인하여, 에난티오퓨어(enantiopure) 물질을 수득하기 위해 ADH가 매우 중요하게 수득되었다. 사이클릭 화합물들 중에서, 스테로이드는 이들의 융합 환-시스템(fused-ring system) 및 다양한 하이드록시 및 케토 그룹으로 인하여 예외적인 위치를 가지며, 생체촉매적 변형을 위해 레지오- 및 부분입체선택성 효소를 필요로 한다. 이러한 사실을 기반으로, 다량의 HSDH는 골격으로서 스테란(steran)을 갖는 기질 만을 수용한다. 비. 프라길리스(B. fragilis)로부터의 7α-HSDH와 같은 소수의 HSDH만이 비-스테로이드성 카보닐 화합물에 대해 무차별로 혼합되어 왔다(Y. Liu, T. Lv, J. Ren, M. Wang, Q. Wu, D. Zhu, The catalytic promiscuity of a microbial 7α-hydroxysteroid dehydrogenase. Reduction of non-steroidal carbonyl compounds., Steroids. 76 (2011) 1136-40. doi:10.1016/j.steroids.2011.05.001).
제조 적용을 위하여, 7α-HSDH는 CDCA를 우르소데옥시콜산(UDCA)으로 전환하는데 이목이 집중되고 있다(반응식 1). C-7에서 하이드록시 그룹의 에피머화(epimerization)는 7α-HSDH에 의해 이러한 그룹을 효소적 산화시킨 후 7β-HSDH를 적용하여 환원시킬 수 있다.
[반응식 1]
케노데옥시콜산(CDCA)의 우르소데옥시콜산(UDCA)으로의 에피머화
UDCA는 사람에서 천연적으로 낮게 발생하는 담즙산이며, 일반적으로 전체 담즙산의 4% 미만을 나타낸다(
Cayuela, et al., Isolates from normal human intestinal flora but not lactic acid bacteria exhibit 7α- and 7β-hydroxysteroid dehydrogenase activities, Microb. Ecol. Heal. Dis. 16 (2004) 195-201). 치료제로서 이는 원발쓸개관간경화증 또는 콜레스테롤 담석 용해 치료요법과 같은, 다양한 간 질환의 치료에 사용될 수 있다(A. Di Ciaula, D. Wang, H. Wang, L. Bonfrate, P. Portincasa, Targets for current pharmacologic therapy in cholesterol gallstone disease., Gastroenterol. Clin. N. 39 (2010) 245-264. doi:10.1016/j.gtc.2010.02.005; G. Kakiyama, W. Pandak, P. Gillevet, P. Hylemon, D. Heuman, K. Daita, et al., Modulation of the fecal bile acid profile by gut microbiota in cirrhosis., J. Hepatol. 58 (2013) 949-955. doi:10.1016/j.jhep.2013.01.003.). 다른 것들 중에서도 UDCA 및 CDCA는 수년 동안 담석증 질환의 약물 치료용으로 사용되어 왔다.
예를 들면, 클로스트리디움 앱소눔(Clostridium absonum (I.A. Macdonald, D.M. Hutchison, Epimerization versus dehydroxylation of the 7α-hydroxyl- group of primary bile acids: Competitive studies with Clostridium absonum and 7α-dehydroxylating bacteria (Eubacterium sp.), J Steroid Biochem. 17 (1982) 287-293. doi:10.1016/0022-4731(82)90203-5), 또는 유로박테리움 아에로파시엔스(Eubacterium aerofaciens)(현재는 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens))(I. Macdonald, Y. Rochon, L. Holdeman, Formation of ursodeoxycholic acid from chenodeoxycholic acid by a 7β-hydroxysteroid Dehydrogenase-elaborating Eubacterium aerofaciens strain cocultured with 7α-hydroxysteroid Dehydrogenase-elaborating organisms, Appl. Environ. Microbiol. 44 (1982) 1187-1195. doi:0099-2240/82/1 11187-09$02.00/0)의 전체 세포 또는 예를 들면, 크산토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia)(참고: 상기 Perdinie)(총괄적인 고찰을 위한 참고: T. Eggert, D. Bakonyi, W. Hummel, Enzymatic routes for the synthesis of ursodeoxycholic acid, J. Biotechnol. 191 (2014) 11-21. doi:10.1016/j.jbiotec.2014.08.006)로부터의 단리된 효소를 사용하는, CDCA의 효소-촉매된 에피머화에 관한 수가지 노력이 발표되었다. 한 가지 단점은 산화된 보조효소를 재생시키기 위한 적절한 방법의 사용이다. 지금까지 사용된 효소의 다른 단점은 7α-HSDH의 강력한 기질 억제로 인하여 CDCA의 불완전한 효소적 산화로부터 온다. 예를 들면, 클로스트리디움 압소늄으로부터의 효소를 사용함으로써 기질 억제의 효과가 관련되기 전에 최대 반응 속도를 약 1 mM의 범위에서의 낮은 기질 농도에서만 달성시킬 수 있다(E. Ferrandi, D. Monti, I. Patel, R. Kittl, D. Haltrich, S. Riva, et al., Exploitation of a Laccase/Meldola's Blue System for NAD+ Regeneration in Preparative Scale Hydroxysteroid Dehydrogenase-Catalyzed Oxidations, Adv. Synth. Catal. 354 (2012) 2821-2828. doi:10.1002/adsc.201200429.).
다양한 다른 방법이 UDCA의 제조를 위하여 선행 기술에 기재되어 있으며, 이는 화학적으로 순수하게 수행되거나 화학적 및 효소적 방법 단계의 조합으로 이루어진다. 각각의 경우에 출발 지점은 CA로부터 제조된 콜산(CA) 또는 CDCA이다.
따라서, UDCA 제조를 위한 전통적인 화학적 방법은 다음과 같이 개략적으로 나타낼 수 있다:
다른 것들 중에서도, 심각한 단점은 다음과 같다: 화학적 산화가 선택성이 아니므로, 카복실 그룹 및 3α 및 7α-하이드록실 그룹은 에스테르화에 의해 보호되어야만 한다.
효소 12α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(12α-HSDH)의 사용을 기반으로 하는 대안적인 화학적/효소적 방법은 다음과 같이 나타낼 수 있고 예를 들면, 본 출원인의 제PCT/EP2009/002190호에 기술되어 있다.
12α-HSDH는 CA를 12-케토-CDCA로 선택적으로 산화시킨다. 전통적인 화학 방법에 따라 요구된 2개의 보호 단계는 이후 생략된다.
또한, 몬티, 디.(Monti, D.) 등(One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009)은 대안적인 효소적-화학적 방법을 기술하고 있으며, 이는 다음과 같이 개략적으로 나타낼 수 있다:
CA는 우선 박테로이데스 프라길리스 ATCC 25285로부터의 7α-HSDH(Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydorxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539) 및 12α-HSDH로부터 7,12-디케토-LCA로 산화된다. 이들 2개의 효소는 각각 NADH-의존성이다. 클로스트리디움 압소눔 ATCC 27555(DSM 599)로부터의 7β-HSDH(NADPH-의존성)에 의한 환원 후(MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta-hydorxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9), 12-케토-UDCA가 형성된다. 목적 생성물은 볼프 키슈너(Wolff-Kishner) 환원에 의해 수득된다. 이러한 방법은 촉매된 반응의 평형 위치로 인하여, 완전한 반응이 가능하지 않고, 반응의 제1 단계 동안에 이러한 방법을 보다 비용이 많이 들도록 하는, 2개의 상이한 효소를 사용할 필요가 있다는 단점을 갖는다. 보조인자 재생을 위하여, 락테이트 데하이드로게나제(LDH; NAD+의 재생을 위해) 및 글루코즈 데하이드로게나제(GlcDH 또는 GDH, NADPH의 재생을 위해)가 사용된다. 사용되는 보조인자 재생을 사용한 단점은 수득되는 부산물이 반응 혼합물로부터 매우 어렵게만 제거될 수 있음으로서 반응 평형이 긍정적으로 영향받지 않을 수 있으며, 이는 추출물의 불완전한 반응을 야기한다.
균주 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986(DSM 3979; 이전에는 유박테리움 아에로파시엔스)로부터의 7β-HSDH는 1982년에 히라노(Hirano) 및 마스다(Masuda)(Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydorxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63)에 의해 기술되었다.
제WO2011/064404호는 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 신규한 7β-HSDH를 기술하고 있으며, 이는 약 28 내지 32 kDa의 분자량(SDS-겔 전기영동시), 약 53 내지 60 kDa의 분자량(특히 SDS의 부재하에서와 같은, 비변성 조건 하에서 겔 여과시), 및 7-케토-LCA의 7-카보닐 그룹의 7β-하이드록실 그룹으로의 입체선택적 환원을 위한 능력을 갖는다.
또한, 제WO2011/064404호에는, 다음과 같이 개략적으로 나타낼 수 있는, UDCA의 제조를 위한 방법이 제공된다:
이 경우 CA의 산화는 전통적인 화학적 경로에 의해, 간단하게 일어난다. DHCA는 개별적으로 효소 7β-HSDH 및 3α-HSDH의 쌍에 의해 연속적으로 또는 한번에 12-케토-UDCA로 환원된다. 볼프 키슈너 환원과 결합되어, UDCA는 따라서 단지 3개의 단계로 CA로부터 합성될 수 있다. 7β-HSDH는 보조인자 NADPH에 의존하는 반면, 3α-HSDH는 보조인자 NADH를 필요로 한다. 동일한 보조인자 또는 연장된 의존성(예컨대, 보조인자 NADH 및 NADPH)에 있어서 효소의 쌍의 이용가능성은 이것이 보조인자 재생을 단순화할 수 있으므로, 유리할 수 있다.
활성이 증진되고/되거나 보조인자 사용이 변경된 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens)로부터 7β-HSDH의 신규한 돌연변이체가 본 출원인의 제WO2012/080504호, 제WO2015/197698호 및 제WO2016/016213호에 기술되어 있으며, 이는 특히 본원에 언급된다.
본 발명에 의해 해결될 첫번째 문제는 UDCA 및 관련 화합물의 생체촉매적 제조를 위한 새로운 시도의 제공에 관한 것이다.
본 발명에 의해 해결될 추가의 문제는 UDCA 및 관련 화합물의 생체촉매적 제조를 위한 이러한 신규의 생체촉매적 시도에 적용가능한 신규하고, 개선된 생체촉매의 제공에 관한 것이다.
발명의 요약
상기 문제는 놀랍게도, 동일한 보조인자 시스템을 이용할 수 있는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 효소의 적합한 조합을 적용함으로써 CDCA의 UDCA로의 커플링된-자급자족가능한(self-sufficient) 생체촉매적 에피머화의 제공에 의해 해결되었다. 에피머화는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 효소의 적합한 조합을 발현하는 전체 세포 생체촉매의 단리된 효소를 사용하여 성공적으로 수행되었다.
상기 문제는 놀랍게도, 공지된 7β-HSDH 효소와 함께 이러한 에피머화 반응에 적용가능한 신규한 7α-HSDH 효소를 제공함으로써 해결되었다.
일 양태에서, 클로스트리디움 디피실레로부터 신규한 7α-특이적인 NADP+-의존성 HSDH를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 이스케리키아 콜라이내에서 이종 발현시켰다. 효소를 N-말단 헥사-his-태그를 사용하여 정제하고 생화학적으로 특성화하였다. 예를 들면, 클로스트리디움 사르디니엔세 또는 이. 콜라이로부터의 다른 공지된 7α-HSDH와는 대조적으로, 씨. 디피실레로부터의 효소는 기질 억제를 나타내지 않는다. 이러한 효소의 적용능을 입증하기 위하여, 담즙산 CDCA의 7-케토리토콜산(7-KLCA)으로의 생체내변환을 NADPH 옥시다제를 사용한 NADP+의 동시 재생으로 수행함으로써 완전히 전환시켰다(< 99 %). 또한, 구조-기반의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해, 클로스트리디움 디피실레로부터의 7α-HSDH의 보조인자 특이성을 NAD(H)를 수용하도록 변경시켰다.
다른 양태에서, 에스케리키아 콜라이로부터 NAD(H)-의존성 7α-HSDH의 신규 돌연변이체가 제공되며, 이러한 돌연변이체는 보조인자 NADP(H)를 이용한다. 돌연변이체는 또한 보다 우수한 정제를 위해 C- 또는 N-말단 헥사-his-태그를 제공한다.
도면의 설명:
도 1: 몇개의 발표된 7α-HSDH와 함께 씨. 디피실레(DSM 12056)로부터 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 아미노산 서열 정렬. 에스케리키아 콜라이, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 클로스트리디움 소르델리이(Clostridium sordellii)의 서열을 씨. 디피실레로부터의 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 단백질 서열과 비교한다. 보조효소 특이성에 관여하는 아미노산 잔기는 검정색 틀(black frame)으로 나타내고 세작용기 촉매(catalytic triade)는 별표로 나타낸다. 글리신-모티프 G(A)XXXGXG는 기술된 바와 같이 나타낸다. 검정색의 음영 박스(shaded box)는 보존된 아미노산을 나타내고, 회색의 음영 박스는 유사 아미노산을 강조한다. 정렬은 clustalOmega로 생성하였으며 가시화를 위해 jalview 정렬 도구를 사용하였다.
도 2: 씨. 디피실레로부터 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 이종 발현 및 정제의 SDS-PAGE 분석. 10 μg의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적용하였다. 레인 M, 분자량 마커, 레인 1 조 추출물(crude extract), 레인 2 정제된 Cd7α-HSDH.
도 3: 상이한 온도에서 7α-HSDH의 비 활성(specific activity). 효소 활성에 있어서 온도의 효과는 CDCA(pH 8.0에서 50 mM KPi 완충액, 1 mM CDCA 및 0.5 mM NADP + )의 산화에 대해 스펙토-측광학적 분석(specto-photometrical assay)을 사용함으로써 조 추출물로 측정하였다.
도 4: 7-KLCA의 0 내지 20 mM 범위에서 증가하는 농도의 생성물을 사용한 Cd7α-HSDH의 상대적인 활성. 기질로서 1 mM CDCA를 사용한 표준 활성 분석을 사용하였다.
도 5: 5 U Cd7α-HSDH 및 50 U NOX를 함유하는 수성 시스템(KPi, pH 7.0) 속에서 18.5 시간 동안 CDCA (10 mM)의 생체내변환. 3.5 h 및 7 h 후 추가의 50 U NOX를 반응에 가하였다. CDCA(
) 및 7-KLCA (
)의 농도를 HPLC로 측정하였다.
도 6: 엄격하게 NAD+-의존성인 HSDH의 NAD+-결합 영역의 아미노산 서열 정렬(클로스트리디움 디피실레로부터의 NADP+-의존성 효소와 비교한 이. 콜라이, 바실러스 프라길리스 및 슈도몬스 테스토스테로니). 보존된 NAD+-결합 모티프 G(A)XXXGXG는 별표로 표시하고, NADP+의 결합에 관여하는 중요한 음으로 하전된 잔기 18개 아미노산 다운스트림(downstream)은 검정색 틀로 나타낸다.
도 7: 주형으로서 비. 안트라키스(B. anthracis)(PDB: 4JRO)로부터의 fabG를 사용하여 SWISS-PROT로 모델링한, 7α-HSDH/NADP+ 복합체(사진 A) 및 7α-HSDH A37D/NAD(사진 B)의 구조. 단백질 골격은 2차 구조 구성성분에 의해 착색되어 있다: 적색의 α-나선, 황색의 β-시이트(sheet) 및 녹색의 단일 가닥. 원자는 유형에 따라 착색되어 있다: 산소는 적색으로, 질소는 청색으로, 탄소는 회색으로 및 인은 오렌지색으로 착색되어 있다.
도 8: 10 mM CDCA, 0.5 mM NAD+, 및 조 추출물 효소를 사용한 돌연변이체와 Cd7α-HSDH의 야생형의 NAD+-의존성 활성의 비교.
도 9: NADP+-의존성 돌연변이체와 이. 콜라이의 야생형 7α-HSDH의 활성의 비교(조 추출물을 사용한 활성 분석).
도 10: 조 추출물 및 정제된 단백질에 대해 관찰된 바와 같은 7α-HSDH(야생형 및 D42G/I43R 돌연변이체)의 발현 및 정제의 SDS-PAGE. 7α-HSDH의 발현은 의도된 단백질의 대략 80%를 생성한다. 샘플 크기는 약 10 μg 단백질이었다. 범례: M = 마커;
= 조 생성물; aufg. = 정제된 생성물.
도 11: 1 단계 방법에서 CDCA의 UDCA로의 생체내변환에 대한 반응 도식. 효소 둘 다는 동일한 보조인자를 사용하여야 한다. 도 11의 A는 보조 효소로서 NAD(H)를 기반으로 한 반응 변형을 나타내는 반면, 도 11의 B는 NADP(H)-기반의 변형을 나타낸다.
도 12: 1 단계 방법으로 이. 콜라이로부터의 NAD-의존성 7β-HSDH[G39E] 및 7α-HSDH를 사용한 CDCA의 전환.
도 13: 1 단계 방법으로 씨. 디피실레로부터의 7β-HSDH[G39S/R64E] 및 CD7α-HSDH를 사용한 CDCA의 전환.
도 14: 1 단계 방법으로 전체 세포 촉매 이. 콜라이 DB06(도 14의 A) 및 이. 콜라이 DB07(도 11의 B)을 사용한 CDCA의 전환.
발명의 구체적인 구현예
본 발명은 특히 다음의 구체적인 구현예에 관한 것이다:
1. a) 하기 화학식 1의 UDCA 화합물을 제조하기 위한, 커플링된, 바람직하게는 자급자족가능한, 생체촉매적 방법으로서, 상기 방법은
a) 하기 화학식 2의 CDCA 화합물을 7α-HSDH 및 7β-HSDH 및, 바람직하게는 적어도 촉매량의 NAD+ 및 NADP+로부터 선택된 보조인자의 존재하에서 반응시키는 단계로서, 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH는 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH로부터 선택된 동일한 보조인자 시스템을 이용하는 능력을 가지며, 여기서
a1) 상기 7α-HSDH는 상기 화학식 2의 CDCA 화합물의 하기 화학식 3의 상응하는 중간체 7-KLCA 화합물로의 산화를 촉진시키고,
a2) 상기 7β-HSDH는 반응 단계 a1)에서 형성된 바와 같은 상기 화학식 3의 7-KLCA 화합물의 상기 화학식 1의 UDCA 화합물로의 환원을 반응 단계 a1)에서 소비된 보조인자의 재생 하에서 촉매하는 단계; 및
b) 임의로 반응 생성물을 추가로 정제하는 단계를 포함한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1에서,
R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R3)4 +(여기서, 잔기 R3은 동일하거나 상이하고 H 또는 알킬을 나타낸다)을 나타내거나, 여기서 그룹 -CO2R은 산 아미드 그룹 -CONR1R2(여기서, R1 및 R2는 서로 독립적으로 알킬 잔기를 나타낸다)에 의해 대체되고; 여기서 R은 바람직하게는 H를 나타내고;
상기 화학식 2에서,
R은 그룹 -CO2R에 대해 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지거나 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체되며,
상기 화학식 3에서,
R은 상기 정의된 바와 같거나, 여기서 그룹 -CO2R은 상기 정의된 바와 같은 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체된다.
2. 구현예 1에서, 단계 a)가 단리된(정제된, 농축된 또는 조, 바람직하게는 순수한) 7α-HSDH 효소 및 단리된(정제된, 농축된 또는 조, 바람직하게는 순수한) β-HSDH 효소의 존재하에서 또는 상기 효소를 기능적으로 발현하는 하나 이상의 재조합 미생물의 존재하에서 수행되는 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하거나; 또는 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 방법.
4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 하나에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH을 이용하는 방법으로서; 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 에스케리키아 콜라이로부터 단리되고, 적어도 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NAD+/NADH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NAD+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용함으로써), 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하는 클로스트리디움 디피실레 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)로부터 선택되고(상기 돌연변이체들은 본원에서 하기에 추가로 정의된다),
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, R40, R41 및 K44로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내며, 이러한 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다)로부터 선택되는 방법.
5. 구현예 1 내지 구현예 3 중 하나에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 방법으로서, 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 클로스트리디움 디피실레로부터 단리된, 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는 능력을 보유한 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37을 지닌 에스케리키아 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서, 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내고, 상기 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다)로부터 선택되고;
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 서열 번호: 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 콜린셀라 아에로파시엔스로부터 단리된 7β-HSDS, 및 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 능력을 보유한 이의 돌연변이체;
(2) 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, 및 R64로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내고 상기 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다); 및
(3) 서열 번호: 56에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus)로부터 단리된 7β-HSDH, 및 서열 번호: 56에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체로부터 선택되는 방법.
6. 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37을 지닌 이. 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH로서, 여기서 상기 효소는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 아미노산 서열 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내는 7α-HSDH.
7. 구현예 6에 있어서, 아미노산 서열 돌연변이가:
a) D42X1(여기서 X1은 아스파르트산(D)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히, 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)및/또는
b) I43X2(여기서 X2는 이소루이신(I)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히, 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH.
8. 구현예 6 및 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
D42X1 및
I43X2 및
b) 이중 돌연변이
D42X1/I43 X2로부터 선택되고
여기서
X1는 G, A 또는 V를 나타내며
X2는 R, H 또는 K를 나타내는 7α-HSDH.
이러한 이중 돌연변이체의 비-제한적 예는 다음과 같다: (D42G/I43R); (D42G/I43H); (D42G/I43K); (D42A/I43R); (D42A/I43H); (D42A/I43K); (D42V/I43R); (D42V/I43H); (D42V/I43K).
9. 구현예 6 내지 구현예 8 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호: 37의 7α-HSDH와 비교하는 경우 다음의 프로파일(profile)을 나타내는 7α-HSDH:
a) 보조인자로서 NADP+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NADP+에 대한 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서, 비 활성은 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우, 적어도 1, 5 또는 10%, 특히 적어도 1-배, 보다 특히 2- 내지 10-배까지 증가된다);
b) 예를 들면, NADP(H)에 대해 보다 명백한 특이성, 및 NAD(H)에 대해 감소된, 보다 특히 약해지거나 잃어버린 특이성과 같이, NADH 및 NADPH와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
c) 여기서 특징 a) 및 b)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음.
10. 씨. 디피실레로부터 단리되고 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 갖는 7α-HSDH 또는 예를 들면, 서열 번호: 34에 대해 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내는 이의 기능성 변이체; 또는 보조인자로서 NAD+의 소비하에서(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH의 이용에 의해) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 씨. 디피실레 7α-HSDH의 돌연변이체(여기서, 효소 돌연변이체는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치내 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)인 7α-HSDH.
11. 구현예 10에 있어서, 아미노산 서열 돌연변이가:
a) K16X1
b) A37X2
c) R38X3
(여기서 X1은 라이신(K)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타내고;
X2는 알라닌(A)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타내며;
X3은 아르기닌(R)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH.
12. 구현예 10 및 구현예 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
K16X1
A37X2
R38X3
및
b) 이중 돌연변이
K16X1/A37X2 및
A37X2/R38X3
(여기서
X1은 A, G, 또는 D를 나타내고;
X2는 D 또는 E를 나타내며;
X3은 I를 나타낸다)로부터 선택되며,
이러한 이중 돌연변이체의 비-제한적 예가:
(K16A/A37D), (K16A/A37E); (K16G/A37D), (K16G/A37E) (K16D/A37D), (K16D/A37E); (A37D/R38I) 및 (A37E/R38I)인 7α-HSDH.
13. 구현예 10 내지 구현예 12 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호:34의 7α-HSDH와 비교하는 경우, 다음의 특징 프로파일을 나타내는 7α-HSDH:
a) CDCA에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서 비 활성은, 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우 적어도 1, 5 또는 10% , 특히 적어도 1배, 보다 특히 2배 내지 10배까지 증가된다);
c) 보조인자로서 NAD+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NAD+에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서, 비 활성은 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우, 적어도 1, 5 또는 10 % , 특히 적어도 1배, 보다 특히 2배 내지 10배까지 증가된다);
d) 예를 들면, NAD(H)에 대해 명백한 특이성, 및 감소된, 보다 특히 NADP(H)에 대해 약화되거나 잃어버린 특이성과 같은, NAD(H) 및 NADP(H)와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
e) 적어도 하나의 담즙산, 특히 CA 및/또는 CDCA 및/또는 7-KLCA, 특히 CDCA에 대해 감소되거나 바람직하게는 필수적으로 잃어버린, 보다 바람직하게는 잃어버린, 기질 억제;
예를 들면 1 내지 200 mM, 2 내지 150 mM, 2,5 내지 100 mM와 같이, 예를 들면, >1 mM의 범위의 Ki-값;
f) 여기서 특징 a) 내지 d)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음.
14. 구현예 6 내지 13 중 어느 하나에 따른 7α-HSDH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
15. 적어도 하나의 조절 서열의 제어, 구현예 14의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
16. 구현예 15의 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
17. 구현예 14에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 구현예 15에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 또는 구현예 16에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 갖는 재조합 미생물.
18. 구현예 17에 있어서, 보조인자 재생에 적합한 추가의 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)로부터 선택된, 적어도 하나의 추가의 효소에 대한 암호화 사열을 추가로 갖는 재조합 미생물.
19. 구현예 18에 있어서, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시-발현하거나; 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시 발현하는 재조합 미생물.
20. 구현예 19에 있어서, 구현예 4 및 구현예 5 중 하나에 정의된 바와 같은 7α-HSDH 및 7β-HSDH를 동시-발현하는 재조합 미생물.
적합한 재조합 미생물은 하나 이상의 발현 플라스미드 위에 본원에 정의된 바와 같은 이러한 7α-HSDH 및 7β-HSDH 효소의 하나 이상의 카피(copy)를 가질 수 있다. 단일 플라스미드 시스템 또는 다중-카피 플라스미드 시스템이 적용가능하다(참고: WO 2012/080504). 예로서 pET21a와 같은 단일 플라스미드 시스템 및 pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1, pRSFDuet-1 및 pCOLADuet-1과 같은 Novagenes Duet-벡터(또한 Novagen으로부터의 사용자 프로토콜 TB340 Rev. E0305 참고)와 같은 다중 카피 플라스미드를 언급할 수 있다.
21. 구현예 6 내지 구현예 13 중 어느 하나의 정의에 따른 7α-HSDH 돌연변이체의 존재하에서 또는 구현예 17 내지 구현예 20 중 어느 하나에 따른 상기 7α-HSDH 돌연변이체를 발현하는 재조합 미생물의 존재하에서 상응하는 7-하이드록시스테로이드를 산화시키고 임의로 형성된 반응 생성물 중 하나를 반응 혼합물로부터 단리함을 포함하는, 7α-케토스테로이드의 효소적 또는 미생물 합성을 위한 생체촉매 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 7-하이드록시스테로이드가
- 콜산(CA)
- 케노데옥시콜산(CDCA),
- 12-케토케노데옥시콜산(12-케토-CDCA) 및 바람직하게는 상기 산화가능한 7α-HSDH 돌연변이체, 특히 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택된 방법.
23. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 산화가 NAD+ 또는 NADP+의 존재 및 특히 소비 하에서 수행되는 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 소비된 NAD+ 또는 NADP+가 NAD+ 또는 NADP+-재생 효소와의 커플링에 의해 재생되고, 여기서 상기 효소는 7β-HSDH, 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 포르미에이트 데하이드로게나제(FDH), 글루코즈 데하이드로게나제(GDH), NADH-데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), 글루코즈-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH), 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH)로부터 선택되는 방법.
상기 본원의 구체적인 아미노산 서열(서열 번호: 34, 37, 40, 44, 47, 50, 54 및 56과 같은)에 대한 어떠한 참고도 또한, 달리 나타내지 않는 한, 특히 His-태그 서열, 특히 헥사-His 태그 서열에 의해 연장된 변이체와 같은 어떠한 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 연장된 이의 변이체에 관한 것이다.
이러한 His-태그 변이체의 비-제한적 예는 서열 번호: 35, 38, 41, 42, 45, 48, 51 및 52의 것이다.
본 발명의 추가의 양태 및 구현예
1. 사용된 일반적인 정의 및 약어
용어 "자급-자족하는"은 커플링된 효소 산화환원 반응(redox reaction)을 나타내며, 여기서 제1의 부분 환원 반응 또는 산화 반응에 의해 소비된 보조인자는 제2의 부분 산화 반응 또는 환원 반응 각각에 의해 필수적으로 완전히 재생된다.
달리 기술하지 않는 한, 용어 "7β-HSDH"는 데하이드로게나제 효소를 나타내며, 이는 특히 NAD(P)H의 화학량론적 소비 및 임의로 상응하는 역 반응을 사용하여 DHCA 또는 7,12-디케토-3α-CA(7,12-디케토-LCA)의 3,12-디케토-7β-CA 또는 12-케토-UDCA로의 적어도 입체특이적이고/이거나 위치특이적인 환원을 촉매한다. "7β-HSDH"는 또한 7-케토리토콜산 (7-KLCA)의 UDCA로의 환원, 및 임의로 상응하는 역 반응을 촉매한다. 효소는 천연의 또는 재조합적으로 생산된 효소일 수 있으며 이는 야생형 효소일 수 있거나 적합한 돌연변이 또는 His-태그 함유 서열과 같은 C- 및/또는 N-말단 아미노산 서열 연장에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 효소는 기본적으로 세포, 예를 들면, 단백질 불순물과 혼합될 수 있지만, 바람직하게는 순수한 형태이다. 적합한 검출 방법은 예를 들면, 하기 제공된 실험 단락에 기술되어 있거나 문헌에 공지되어 있다(예컨대, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydorxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982). 이러한 활성을 지닌 효소는 EC 번호매김 1.1.1.201 하에서 분류된다.
달리 기술하지 않는 한, 용어 "7α-HSDH"는 데하이드로게나제 효소를 나타내며, 이는 특히 NAD(P)+의 화학량론적 소비, 및 임의로 상응하는 역 반응으로, CDCA의 7,-KLCA)로의 적어도 입체특이적이고/이거나 위치특이적인 산화를 촉매한다. 효소는 천연의 또는 재조합적으로 생산된 효소일 수 있으며, 이는 야생형 효소일 수 있거나 적합한 돌연변이 또는 His-태그 함유 서열과 같이, C- 및/또는 N-말단 아미노산 서열 연장에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 효소는 기본적으로 세포, 예를 들면, 단백질 불순물과 혼합될 수 있지만, 바람직하게는 순수한 형태이다. 적합한 검출 방법은 예를 들면, 실험 단락에 기술되어 있으며 이러한 활성을 지닌 제공된 효소는 EC 번호 1.1.1.159 하에 분류된다.
"순수한 형태" 또는 "순수한" 또는 "실질적으로 순수한" 효소는 본 발명에 따라 단백질을 검출하는 일반적인 방법, 예를 들면, 뷰렛 방법(biuret method) 또는 로우리(Lowry) 등(cf. description in R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982))에 따른 단백질 검출법에 의해 측정된, 전체 단백질 함량에 대해, 순도가 80 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과, 특히 95 중량% 초과, 및 매우 특히 99 중량% 초과인 효소로서 이해되어야 한다.
"산화환원 등가물"은 전자 공여체 또는 전자 수용체로서 유용한 저-분자량 유기 화합물, 예를 들면, NAD+ 및 NADH+와 같은 니코틴아미드 유도체 또는 이들의 환원된 형태 NADH 및 NADPH 각각을 의미한다. "산화환원 등가물" 및 "보조인자"는 본 발명의 맥락에서 동의어로 사용된다. 따라서, 본 발명의 의미에서 "보조인자"는 또한 "산화환원-가능한 보조인자"로서, 즉, 환원된 형태 및 산화된 형태로 존재할 수 있는 보조인자로서 기술될 수 있다.
"소비된" 보조인자는 보조인자의 환원되거나 산화된 형태의 보조인자로서 이해되어야 하며, 이는 기질의 명시된 환원 또는 산화 반응의 과정 중에 상응하는 산화된 또는 환원된 형태로 변형된다. 재생에 의해, 반응 중 형성된 산화되거나 환원된 보조인자는 다시 환원되거나 산화된 출발 형태로 전환됨으로써, 이는 다시 기질의 반응에 이용가능하다.
"변경된 보조인자 용도"는 본 발명의 맥락에서 참고와 비교하여 정성적 또는 정량적 변화로서 이해되어야 한다. 특히, 변경된 보조인자의 사용은 아미노산 서열 돌연변이를 착수함으로써 관찰될 수 있다. 이러한 변화는 이후에 돌연변이되지 않은 출발 효소와 비교하여 측정될 수 있다. 더욱이, 특수한 보조인자와 관련한 활성은 돌연변이를 착수함에 의해 증가되거나 감소될 수 있거나 완전히 방지될 수 있다. 그러나, 변경된 보조인자 용법은 또한 개개 보조인자에 대한 특이성 대신에, 첫번째 보조인자와는 상이한, 현재 적어도 하나의 추가의 두번째 보조인자가 사용될 수 있도록 하는(즉, 연장된 보조인자 용법이 존재한다) 변화를 포함한다. 그러나, 역으로, 원래 존재하였던 2개의 상이한 보조인자의 사용 능력은 특이성이 이들 보조인자들 중 하나에 대해서만 증가하거나 이들 보조인자 중 하나에 대해서만 감소되거나 완전히 제거되도록 변경될 수 있다. 예를 들면, 보조인자 NAD(NADH)에 의존성인 효소는 이제 보조인자 사용의 변화로 인하여 NAD(NADH) 및 보조인자 NADP(NADPH) 둘 다에 의존성으로 될 수 있거나 NAD(NADH)에 대한 원래의 의존성은 NADP(NADPH)에 대한 의존성으로 완전히 변형될 수 있거나 역으로 변형될 수 있다.
용어 "NAD+/NADH 의존성" 또는 "NADP+/NADPH 의존성"은, 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따라 광의적으로 해석되어야 한다. 이들 용어는 둘 다 및 바람직하게는 "특이적인" 의존성, 즉, NAD+/NADH 또는 NADP+/NADPH에 대한 전적인 의존성 뿐만 아니라, 덜 바람직하게는, 보조인자 둘 다에 있어서 본 발명에 따라 사용된 효소의 의존성, 즉, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH에 대한 의존성도 포함한다.
이는 용어 "NAD+/NADH-수용성" 또는 "NADP+/NADPH-수용성"에 상응하게 적용된다.
용어 "NAD+/NADH-재생" 또는 "NADP+/NADPH-재생"은, 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따라 광의적으로 해석되어야 한다. 이러한 용어는 둘 다, 바람직하게는, 특이적인", 즉, 소비된 보조인자 NAD+/NADH 또는 NADP+/NADPH를 재생하는 배타적인 능력, 및, 덜 바람직하게는 보조인자 둘 다, 즉, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH를 재생하는 능력을 포함한다.
"단백질생성(Proteinogenic)" 아미노산은 특히 (단문자 코드): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R 및 H를 포함한다.
"고정화"는 본 발명에 따라서, 본 발명에 따라 사용된 생체촉매, 예를 들면, 즉 주변 액체 매질인, 담체 물질 속에서 필수적으로 불용성인, 고체 상의 7β-HSDH의 공유 또는 비공유 결합을 의미한다. 본 발명에 따라서, 본 발명에 따라 사용된 재조합 미생물과 같은 전체 세포는 또한 이러한 담체에 의해 상응하게 고정될 수 있다.
"돌연변이되지 않은 효소와 비교하여 감소된 기질 억제"는 특수한 기질에 대해 돌연변이되지 않은 효소로 관찰된 기질 억제가 더 이상 관찰되지 않는, 즉, 필수적으로 더 이상 측정가능하지 않거나, 보다 높은 기질 농도에서만 일어나는, 즉 Ki 값이 증가하는 것을 의미한다.
"콜산 화합물"은 탄소 골격 구조, 특히 콜산의 스테로이드 구조를 지니고 7번 환 위치 및 임의로 3번 및/또는 12번 환 위치에서 케토 및/또는 하이드록시 또는 아실옥시 그룹이 존재하는 본 발명에 따른 화합물을 의미한다.
특별한 유형의 화합물, 예를 들면, "콜산 화합물" 또는 "우르소데옥시콜산 화합물"은 특히 또한 근본적인 출발 화합물(예를 들면, 콜산 또는 우르소데옥시콜산)의 유도체를 의미한다.
이러한 유도체는 "염", 예를 들면, 화합물의 리튬, 나트륨 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염; 및 암모늄 염을 포함하며, 여기서 암모늄 염은 NH4 + 염 또는 적어도 하나의 수소 원자가 C1-C6-알킬 잔기로 치환될 수 있는 암모늄 염을 포함한다. 대표적인 알킬 잔기는 특히, 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필-, n-, 2급- 또는 3급-부틸, 및 n-펜틸 및 n-헥실과 같은 C1-C4-알킬 잔기 및 이의 단일 또는 다중 측쇄 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 "알킬 에스테르"는 특히 저급 알킬 에스테르, 예를 들면 C1-C6-알킬 에스테르이다. 비제한적인 예로서, 본 발명자들은 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필, n-, 2급- 또는 3급-부틸 에스테르, 또는 장쇄 에스테르, 예를 들면, n-펜틸 및 n-헥실 에스테르 및 이의 단일 또는 다중 측쇄된 유사체를 언급할 수 있다.
"아미드"는 특히, 본 발명에 따른 산과 암모니아 또는 1급 또는 2급 모노아민의 반응 생성물이다. 이러한 아민은 예를 들면, 모노- 또는 디-C1-C6-알킬 모노아민이며, 여기서 알킬 잔기는 서로 독립적으로 예를 들면, 카복실, 하이드록실, 할로겐(F, Cl, Br, I와 같음), 니트로 및 설포네이트 그룹으로 추가로 임의 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 "아실 그룹"은 특히 탄소수가 2 내지 4인 비방향족 그룹, 예를 들면, 아세틸, 프로피오닐 및 부티릴, 및 임의 치환된 단핵 방향족 환을 지닌 방향족 그룹이며, 여기서 적합한 치환체는 예를 들면, 하이드록실, 할로겐(F, Cl, Br, I와 같음), 니트로 및 C1-C6-알킬 그룹, 예를 들면, 벤조일 또는 톨루오일로부터 선택된다.
용어 "생체촉매 과정"은 본 발명에 따른 적어도 하나의 효소의 촉매 활성의 존재하에서 수행된 임의의 과정, 즉, 미가공되거나, 정제되거나, 용해되거나, 분산되거나 고정된 효소의 존재하에서, 또는 이러한 효소 활성을 가지거나 발현하는 전체 미생물 세포의 존재하에서의 과정을 지칭한다. 따라서, 생체촉매 과정은 효소 및 미생물 과정 둘 다를 포함한다.
용어 "입체특이적"은 본 발명에 따라 생산된 화합물의 수개의 가능한 입체이성체 중 하나가 본 발명에 따른 효소의 작용에 의해 적어도 하나의 비대칭 중심을 지니면서 고 "거울상이성체 과량" 또는 고 "거울상이성체 순도" 또는 "입체이성체 순도", 예를 들면, 적어도 90%ee, 특히 적어도 95%ee, 또는 적어도 98%ee, 또는 적어도 99%ee로 생산됨을 의미한다. ee% 값은 다음 식으로부터 계산된다:
ee% = [XA-XB]/[XA+XB]*100,
여기서 XA 및 XB는 거울상이성체 A 및 B 각각의 몰 분율(mole fraction)을 나타낸다.
본 발명에 따라 사용되거나 제조된 하이드록시스테로이드 화합물, 예를 들어, 콜산, 우르소데옥시콜산, 12-케토-케노데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 7-케토-리토콜산은 입체이성체적으로 순수한 형태로 또는 다른 입체이성체와의 혼합물로서 본 발명에 따른 과정에서 사용될 수 있거나 이로부터 수득될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사용되거나 제조된 화합물은 실질적으로 입체이성체적으로 순수한 형태로 사용되거나 단리된다.
다음의 표 A는 구조식, 화학명 및 본 발명의 기술 분야에 대해 관련성 있는 화학 화합물에 대해 사용된 약어를 제공한다.
[표 A]
2. 단백질 또는 효소
2.1 개관
본 발명은 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 단백질 또는 효소(서열 번호: 34, 37 40, 44, 47, 54 및 56과 같은) 또는 이의 돌연변이체에 한정되지 않지만, 오히려 이의 기능성 등가물로 확장된다.
명확하게 개시된 효소의 "기능성 등가물" 또는 동족체는, 본 발명의 맥락에서, 이들과는 상이하지만, 여전히 바람직한 생물학적 활성, 예를 들면, 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 폴리펩타이드이다.
예를 들면, "기능성 등가물"은 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성에 사용된 시험에서, 본원에 정의된 아미노산 서열을 포함하는, 출발 효소의 활성보다 적어도 1%, 예컨대, 적어도 10% 또는 20%, 예컨대, 적언도 50% 또는 75% 또는 90%까지 더 높거나 낮은 활성을 갖는 효소로 이해되어야 한다.
기능성 등가물은 또한 바람직하게는 4 내지 11의 pH 범위에서 안정하며 유리하게는 특히 8.5 내지 9.5와 같이, 6 내지 10의 pH 범위에서의 최적의 pH, 및 15℃ 내지 80℃ 또는 20℃ 내지 70℃, 예를 들면, 약 45 내지 60℃ 또는 약 50 내지 55℃의 범위의 최적 온도를 지닌다.
7β-HSDH 활성은 다양한 공지된 시험을 사용하여 검출할 수 있다. 이에 한정되지 않고, 본 발명자들은 교차-참조된 선행 기술 특허 문헌에 정의된 바와 같거나 실험 단락에서 기술된 바와 같은, 표준 조건 하에서 참고 기질, 예컨대, CA 또는 DHCA 또는 7-KLCA를 사용하는 시험을 언급할 수 있다.
7α-HSDH 활성을 측정하기 위한 시험은 또한 공지되어 있다. 이에 제한되지 않고, 본 발명자들은 실험 단락에서 정의된 바와 같은 표준화된 조건 하에서 참고 기질, 예컨대, CDCA를 사용하는 시험을 언급할 수 있다.
본 발명에 다른 "기능성 등가물"은 또한 특히, "돌연변이체"를 의미하며, 이는 전술한 아미노산 서열의 적어도 하나의 서열 위치 속에 명확하게 기술된 것 이외의 아미노산을 가지지만, 그럼에도 불구하고, 전술한 생물학적 활성 중 하나를 지닌다. 따라서 "기능성 등가물"은 하나 이상, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 첨가, 치환, 결실 및/또는 역위에 의해 수득가능한 돌연변이체를 포함하며, 여기서 기술된 변화는 어떠한 서열 위치에서도 일어날 수 있지만, 단 이들은 본 발명에 따른 특성 프로파일을 지닌 돌연변이체를 유도한다. 기능성 등가는 특히 돌연변이체와 변경되지 않은 폴리펩타이드 사이의 반응성 패턴이 정성적으로 일치하는 경우, 즉, 예를 들면 동일한 기질이 상이한 속도에서 전환되는 경우 또한 수득된다. 적합한 아미노산 치환의 예는 다음 표에 나타나 있다:
상기 의미에서 "기능성 등가물"은 또한 기술된 폴리펩타이드의 "전구체" 및 폴리펩타이드의 "기능성 유도체" 및 "염"이다.
"전구체"는 바람직한 생물학적 활성이 있거나 없는 폴리펩타이드의 천연 또는 합성 전구체이다.
표현 "염"은 본 발명에 따른 단백질 분자의 카복실 그룹의 염 및 아미노 그룹의 산 부가 염 둘 다를 의미한다. 카복실 그룹의 염은 그 자체로 공지된 방식으로 제조할 수 있으며 무기 염, 예를 들면, 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 및 아연 염, 및 유기 염기, 예를 들면, 트리에탄올아민, 아르기닌, 라이신, 피페리딘 등과 같은 아민과의 염을 포함한다. 산 부가 염, 예를 들먼, 염산 또는 황산과 같은 무기 산(mineral acid)과의 염 및 아세트산 및 옥살산과 같은 유기산과의 염이 또한 본 발명의 목적이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "기능성 유도체"는 또한 기능성 아미노산 측 그룹에서 또는 이들의 N- 또는 C-말단 끝에서 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들면, 암모니아와 또는 1급 또는 2급 아민과의 반응에 의해 수득가능한, 카복실산 그룹의 지방족 에스테르, 카복실산 그룹의 아미드; 아실 그룹과의 반응에 의해 제조된, 유리 아미노 그룹의 N-아실 유도체; 또는 아실 그룹과의 반응에 의해 제조된, 유리 하이드록실 그룹의 O-아실 유도체를 포함한다.
"기능성 등가물"은 천연적으로 또한 다른 유기체, 및 천연적으로 존재하는 변이체로부터 수득가능한 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 서열 비교에 의해, 상동성 서열 영역을 찾을 수 있고 등가 효소를 본 발명의 정확인 지시사항을 기반으로 측정할 수 있다.
"기능성 등가물"은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 단편, 바람직하게는 개개 도메인(domian) 또는 서열 모티프(sequence motif)를 포함하며, 이는 예를 들면, 바람직한 생물학적 기능을 가진다.
"기능성 등가물은 또한 상술한 폴리펩타이드 서열 중 하나 또는 이로부터 기원한 기능성 등가물 및 이와는 기능적으로 상이한, 기능성 N- 또는 C-말단 연결로(즉, 융합 단백질 부분의 상호간의 실질적인 기능적 손상없이) 적어도 하나의 추가의 이종 서열을 갖는다. 상기 이종 서열의 비제한적 예는 예컨대, 시그널 펩타이드(signal peptide) His-태그 또는 효소와 같은 히스티딘 앵커(anchor)이다.
본 발명에 따라서 또한 포함되는 "기능성 등가물"은 정확하게 개시된 단백질의 동족체이다. 이들은 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448의 알고리즘에 따라서 계산된, 명확하게 개시된 아미노산 서열 중 하나에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 85%, 예를 들면, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상동성(또는 서열 동일성)을 지닌다. 본 발명에 따른 상동성 폴리펩타이드의 상동성 퍼센트 또는 동일성은 특히, 본원에 명확하게 기술된 아미노산 서열 중 하나의 전체 길이와 관련된 아미노산 잔기의 동일성 퍼센트를 의미한다.
동일성 값의 퍼센트는 또한 BLAST 정렬, blastp(단백질-단백질 BLAST) 알고리즘을 기반으로, 또는 하기 제공된 클러스탈 세팅(Clustal settings)을 사용하여 측정할 수 있다.
가능한 단백질 글리코실화의 경우에, 본 발명에 따른 "기능성 등가물"은 탈글리코실화되거나 글리코실화된 형태 및 글리코실화 패턴을 변경시킴으로써 수득가능한 변형된 형태의 상기 지정된 유형의 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 동족체는 돌연변이유발, 예컨대, 단백질의 점 돌연변이, 신장(lengthening) 또는 단축(shortening)에 의해 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질의 동족체는 돌연변이, 예를 들면, 단축된 돌연변이의 조합 라이브러리(combinational library)를 스크리닝(screening)함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, 단백질 변이체의 다양화된 데이타베이스를 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물의 효소적 연결에 의해, 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발에 의해 생산할 수 있다. 변성된 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 잠재적인 동족체의 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있는 매우 많은 방법이 존재한다. 변성된 유전자 서열의 화학적 합성은 자동화된 DNA 합성기 속에서 수행될 수 있으며, 합성 유전자는 이후 적합한 발현 벡터로 연결될 수 있다. 유전자의 변성된 세트의 사용은 하나의 혼합물 내에서 모든 서열을 제공하는 것을 가능하도록 하며, 이는 잠재적인 단백질 서열의 바람직한 세트를 암호화한다. 변성된 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법은 당해 분야의 기술자에 의해 알려져 있다(예컨대, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
몇가지 기술이 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해 선행 기술에 알려져 있으며, 이는 점 돌연변이 또는 단축에 의해, 및 선택된 특성을 지닌 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 위해 생산되었다. 이들 기술은 본 발명에 따른 동족체의 조합 돌연변이유발에 의해 생산된 유전자 은행의 신속한 스크리닝에 채택될 수 있다. 고-처리량 분석을 기반으로 하는, 거대한 유전자 은행을 스크리닝하기 위해 가장 흔히 사용된 기술은 유전자 은행을 복제가능한 발현 벡터내로 클로닝하고, 적합한 세포를 수득되는 벡터 뱅크로 형질전환하며 조합 유전자를 바람직한 활성의 검출이 이의 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 단리를 촉진하는 조건 하에서 발현시킴을 포함한다. 은행에서 기능성 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술인, 반복된 앙상블 돌연변이유발(Recursive ensemble mutagenesis: (REM)을 스크리닝 시험과 함께 사용하여, 동종체를 확인할 수 있다(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
2.2 특수한 7β-HSDH 효소
2.2.1 야생형 콜린셀라 아에로파시엔스( Collinsella aerofaciens ) 7β-HSDH 및 기능성 등가물
본 발명은 본원에 의해 표현하여 지칭된, 출원인의 국제 특허원 제WO2011/064404호에 기술된 바와 같은 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 7β-HSDH 야생형의 용도를 추가로 포함한다.
콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터 수득가능한 이러한 7β-HSDH는 특히 다음의 특성들 중 적어도 하나의 다른 것, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 또는 모든 이러한 특성을 의해 특징으로 한다:
a) 분자량(SDS-겔 전기영동): 약 28-32 kDa, 특히 약 29 내지 31 kDa 또는 약 30 kDa;
b) 분자량(겔 여과, 특히 SDS가 없는 것과 같은 비변성 조건 속에서): 약 53 내지 60 kDa, 특히 56.1 kDa와 같은, 약 55 내지 57 kDa. 이는 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH의 이량체 특성을 입증한다;
c) 7-케토-LCA의 7β-하이드록실 그룹으로의 입체선택적 환원;
d) pH 8.5 내지 10.5, 특히 9 내지 10의 범위에서 UDCA의 산화를 위한 최적의 pH;
e) pH 3.5 내지 6.5, 특히 pH 4 내지 6의 범위에서 DHCA 및 7-케토-LCA의 환원을 위한 최적의 pH;
f) 언급된 기질/보조인자 중 적어도 하나에 대한 하기 표로부터의 적어도 하나의 적어도 동적 매개변수(kinetic parameter); 다음의 표에서 각각의 경우에 명확하게 기술된 값의 대략 ±20%, 특히 ±10%, ±5%, ±3%, ±2% 또는 ±1%의 범위내.
a) 매우 낮은 활성으로 인하여 측정 불가
b) 1 U = 1 μmol/min
g) 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus), 호모 사피엔스(Homo sapiens) 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus)를 포함하는, 동물 11β-HSDH 아그룹과 관련된, 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 원핵세포 7β-HSDH의 계통발생적 서열 유사성.
예를 들면, 이러한 7β-HSDH는 다음의 특성 또는 특성들의 조합을 나타낸다: a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).
이러한 유형 또는 이로부터 기원한 기능성 등가물의 7β-HSDH는 더욱이 다음을 특징으로 한다:
a) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 입체특이적인 환원, 및/또는
b) 특히 상응하는 3,12-디케토-7β-콜산으로 7-위치에서 데하이드로콜산(DHCA)에 의해 촉매되고, 예컨대, NADPH-의존성인 것과 같은, 7-위치에서 케토 그룹 및 스테로이드 골격에서 적어도 하나의 추가의 케토 그룹의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 위치특이적 하이드록실화.
상기 7β-HSDH는 특히 서열 번호: 54에 따른 아미노산 서열(수탁 번호 제ZP_01773061호) 또는 이러한 서열에 대해 적어도 60%, 예컨대 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90, 예컨대 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%의 동일성 정도를 지닌 이로부터 기원한 서열을 가지며; 임의로 다음의 특성들 중 하나 또는 특성들의 조합을 추가의 특징으로 한다: 상기 정의에 따르는 a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).
2.2.2 특수한 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH 돌연변이체
본 발명은 본원에 참고로 표현하여 지칭된, 제WO2012/080504호, 제WO2015/197698호 및 제WO2016/016213호에 기술된 바와 같은, 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 7β-HSDH 야생형의 돌연변이체의 용도를 추가로 포함한다.
[표 B]
7ß-HSDH 단일 및 다중 돌연변이체
WT = 야생형; S = 단일; D = 2중; T = 3중; Q = 4중.
상기 언급된 예는 또한 C- 및/또는 N-말단으로 연장된, 특히 His-태그 서열에 의해, 보다 특히 헥사-His-태그 서열에 의해 연장된 변이체를 포함한다.
상기 돌연변이체들 중 어느 것도 다음의 위치 K44, R53, K61, R64 중 어느 것에서 추가로 돌연변이될 수 있다.
2.2.3 추가의 7ß-HSDH
본 발명은 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus)로부터의 7β-HSDH 야생형 및 돌연변이체, 특히 본원에 표현하여 지칭된 제CN105274070호 하에 공개된 중국 특허원에 기술된 바와 같은, 이의 NADP+ 의존성 돌연변이체의 용도를 추가로 포함한다.
3. 핵산 및 작제물
3.1 핵산
본 발명은 또한 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 효소를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 정확한 서열에 대해 명시된 정도의 동일성을 지닌 핵산에 관한 것이다.
2개의 핵산 사이의 "동일성"은 각각의 경우에 전체 핵산 길이에 걸쳐 뉴클레오타이드의 동일성, 특히 다음의 매개변수를 설정하는 클러스터 방법(Clustal method)(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2): 151-1)을 사용하는 Informax 사(USA)의 Vector NTI Suite 7.1 소프트웨어의 수단에 의한 비교로 계산된 동일성을 의미한다:
다수의 정렬 매개변수:
갭 개방 패널티(Gap opening penalty) 10
갭 연장 패널티(Gap extension penalty) 10
갭 분리 패널티 범위(Gap separation penalty range) 8
갭 분리 패널티 없음
정렬 지연에 대한 동일성 % 40
잔기 특이적인 갭 없음
친수성 잔기 갭 없음
전이 가중치(trasition weighting) 0
쌍식 정렬(pairwise alignment) 매개변수:
FAST 알고리즘 작동
K-튜플 크기(tuple size) 1
갭 패널티 3
윈도우 크기(Window size) 5
가장 우수한 사선의 수 5
대안으로서, 동일성은 또한 Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500에 따라, 인터넷 주소: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#에 따라 및 다음의 매개변수를 사용하여 측정할 수 있다:
DNA 갭 개방 패널티 15.0
DNA 갭 연장 패널티 6.66
DNA 매트릭스 동일
단백질 갭 개방 패널티 10.0
단백질 갭 연장 패널티 0.2
단백질 매트릭스 Gonnet
단백질/DNA ENDGAP -1
단백질/DNA GAPDIST 4
본원에 언급된 모든 핵산 서열(단일- 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들면, cDNA 및 mRNA)은 예를 들면, 개개 오버랩핑(overlapping), 이중 나선의 상보성 핵산 빌딩 블록(building block)에 의해 뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 화학적 합성에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 예를 들면 포스포로아미디트 방법(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)에 의해 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오타이드의 첨가 및 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편(Klenow fragment) 및 일반적인 클로닝 기술을 사용한 갭의 충전은 Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 예를 들면, 인공 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 접근가능한, 상기 폴리펩타이드 및 이의 기능성 등가물 중 하나를 암호화하는 핵산 서열(단일- 및 이중-가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들면, cDNA 및 mRNA)에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 이의 생물학적으로 활성인 분절(segment), 및 예를 들면, 본 발명에 따른 핵산을 암호화핵산의 확인 및 증폭을 위한 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 핵산 단편 둘 다에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 더욱이 암호화 유전자 영역의 3'- 및/또는 5'-말단으로부터의 해독되지 않은 서열을 함유할 수 있다.
본 발명은 명확하게 기술된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 분절에 대해 상보성인 핵산 분자를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 다른 세포형 및 유기체 내에서 상동성 서열의 확인 및/또는 클로닝에 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 생산하는 것을 가능하도록 한다. 이러한 프로브 또는 프라이머는 일반적으로 뉴클레오타이드 서열 영역을 포함하며, 이는 "엄격한(stringent)" 조건(하기 참고) 하에서 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥(sense strand) 또는 상응하는 안티센스 가닥(antisense strand)의 적어도 적어도 약 12, 바람직하게는 적어도 약 25, 예를 들면 약 40, 50 또는 75개의 연속된 뉴클레오타이드에 하이브리드화한다.
"단리된(isolated)" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원 속에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되며 더욱이 재조합 기술에 의해 생산되는 경우, 다른 세포 물질 또는 배양 배지로부터 필수적으로 유리될 수 있거나, 화학적으로 합성되는 경우, 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 유리될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 분자 생물학의 표준 기술 및 본 발명에 따라 제공된 서열 정보를 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들면, cDNA는 하이브리드화 프로브로서 명확하게 개시된 완전한 서열 중 하나 또는 이의 분절 및 표준 하이브리드화 기술(예를 들면, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 사용하여, 적합한 cDNA 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 더욱이, 개시된 서열 들 중 하나 또는 이의 분절을 포함하는 핵산 분자는 이러한 서열을 기반으로 제조된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 단리할 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적합한 벡터내로 클로닝하고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 또한 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 표준 합성 기술로 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 유도체, 이들 서열의 동족체 또는 부분은 예를 들면 일반적인 하이브리드화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여 다른 세균으로부터 예컨대, 게놈성 또는 cDNA 라이브러리를 통해 단리할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 본 발명에 따르는 서열에 대하여 표준 조건 하에서 하이브리드화한다.
"하이브리드하다"는 표준 조건 하에서 거의 상보성인 서열에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 능력을 의미하는 반면, 이러한 조건하에서 비특이적 결합은 비상보성 파트너들 사이에 발생하지 않는다. 이를 위하여, 서열은 90 내지 100%까지 상보성일 수 있다. 다른 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 서열의 특성은 예를 들면, 노던(Northern) 또는 서던(Southern) 블롯팅에서 또는 PCR 또는 RT-PCR에서 프라이머 결합에서 이용된다.
유리하게는, 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화에 사용한다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산의 보다 긴 단편 또는 하이브리드화를 위한 완전한 서열을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이들 표준 조건은 사용된 핵산(올리고뉴클레오타이드, 보다 긴 단편 또는 완전한 서열)에 의존하여 또는 하이브리드화에 사용된 핵산, DNA 또는 RNA의 유형에 의존하여 변한다. 따라서, 예를 들면, DNA:DNA 하이브리드에 대한 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 것보다 대략 10℃ 더 낮다.
표준 조건은 예를 들면, 핵산에 따라, 0.1 내지 5 x SSC(1 X SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2)의 농도를 지닌 수성 완충액 용액 또는 추가로 예를 들면 5 x SSC, 50% 포름아미드 속에서 42℃와 같은 50% 포름아미드의 존재하에서 42 내지 58℃ 사이의 온도를 의미한다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드에 대한 하이브리드화 조건은 0.1 x SSC 및 약 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃ 사이의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드의 경우, 하이브리드화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 약 30℃ 내지 55℃의 온도, 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도이다. 하이브리드화를 위해 기술된 이러한 온도는 예를 들면, 길이가 대략 100개의 뉴클레오타이드이고 포름아미드의 존재하에서 G + C 함량이 50%인 핵산에 대해 계산된 융점 값이다. DNA 하이브리드화를 위한 실험 조건은 관련 유전학 교재, 예를 들면, Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989에 기술되어 있으며, 예를 들면, 핵산의 길이, 하이브리드의 유형 또는 G + C 함량에 따라 당해 분야의 기술자에게 공지된 식으로부터 계산할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 다음의 교재로부터 하이브리드하에 대한 추가의 정보를 찾을 수 있다: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
"하이브리드화"는 특히 엄격한 조건 하에서 일어날 수 있다. 이러한 하이브리드화 조건은 예를 들면, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에 기술되어 있다.
"엄격한" 하이브리드화 조건은 특히 다음과 같이 이해된다: 50% 포름아미드, 5 x SSC(750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH7.6), 5x 덴하르트 용액(Denhardt solution), 10% 덱스트란 설페이트 및 20 g/ml 변성된, 전단된(sheared) 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 속에서 밤새 42℃에서 항온처리한 후, 65℃에서 0.1x SSC를 사용한 여과기 세척 단계.
본 발명은 또한 명확하게 개시되거나 유도가능한 핵산 서열의 유도체에 관한 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 추가의 핵산 서열은 예컨대, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55로부터 기원할 수 있으며 개개 또는 수개의 뉴클레오타이드의 첨가, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들과는 상이하지만, 또한 바람직한 특성 프로파일을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 또한 소위 사일런트 돌연변이(silent mutation)를 포함하거나 명확하게 기술된 서열과 비교하여 구체적인 원래의 또는 숙주 유기체의 코돈 사용에 상응하게 변경된 핵산 서열 뿐만 아니라, 천연적으로 존재하는 변이체, 예를 들면, 이의 스플라이스 변이체(splice variant) 또는 대립형질 변이체를 포괄한다.
본 발명은 또한 보전성 뉴클레오타이드 치환에 의해 수득가능한 서열(즉, 문제의 아미노산은 동일한 전하, 크기, 극성 및/또는 가용성의 아미노산으로 대체된다)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 명확하게 개시된 핵산으로부터 서열 다형성에 의해 기원한 분자에 관한 것이다. 이들 유전적 다형성은 천연적인 변이로 인하여 집단 내에서 개체 사이에 존재할 수 있다. 이들 천연 변이체는 일반적으로 유전자의 뉴클레오타이드 서열 내에 약 1 내지 5%의 가변성을 가져온다.
서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55의 서열을 지닌 본 발명에 따른 핵산 서열의 유도체는 예를 들면, 전체 서열 영역에 걸쳐 유도된 아미노산 수준에서 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 매우 특히 바람직하게는 적어도 90% 상동성(아미노산 수준에서의 상동성과 관련하여, 폴리펩타이드에 대한 상기 정보에 관해 참고할 수 있다)을 갖는 대립형질 변이체를 의미한다. 상동성은 유리하게는 서열의 부분 영역에서 더 높을 수 있다.
또한, 유도체는 또한 본 발명에 따른 핵산 서열, 특히 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55, 예를 들면 진균 또는 세균 동족체, 단축된 서열, 암호화 및 비암호화 DNA 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA로서 이해되어야 한다. 예를 들어, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55에 대한 동족체는 DNA 수준에서, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55에 제공된 전체 DNA 영역에 걸쳐 적어도 40%의 상동성, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 매우 특히 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 지닌다.
또한, 유도체는 예를 들면, 프로모터를 지닌 융합체로서 이해되어야 한다. 기술된 뉴클레오타이드 서열 앞에 있는 프로모터는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 교환, 적어도 하나의 삽입, 역위 및/또는 결실에 의해 변경될 수 있지만, 프로모터의 기능성 또는 효능이 손상되지 않는다. 더욱이, 프로모터의 효능은 이들의 서열을 변경시킴으로써 증가시킬 수 있거나 이들은 심지어 상이한 종의 유기체의 보다 효과적인 프로모터로 완전히 교환될 수 있다.
또한, 기능성 돌연변이체를 생산하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다.
사용된 기술에 따라서, 당해 분야의 기술자는 유전자에 완전한 무작위 또는 심지어 보다 표적화된 돌연변이 또는 또한 비암호화 핵산 영역(이는 예를 들면, 발현의 조절을 위해 중요하다)을 삽입할 수 있으며 이후 유전자 은행을 제조할 수 있다. 이에 필요한 분자생물학의 방법은 당해 분야의 기술자에 의해 공지되어 있으며 예를 들면 Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001에 기술되어 있다.
유전자를 변형시킴으로써 이들이 암호화하는 단백질을 변형시키기위한 방법은 예를 들면 다음과 같이 당해 분야의 기술자에게 오랫동안 익숙해 왔다:
- 유전자의 개별 또는 수개의 뉴클레오타이드이 표적화된 교환을 제공하는 부위-지시된 돌연변이유발(Trower MK (Publ.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),
- 특정의 아미노산에 대한 코돈이 교환될 수 있거나 유전자의 임의의 부위에 첨가된 포화 돌연변이유발(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valc
rel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22: 541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3: 1),
- 뉴클레오타이드 서열이 부정확하게 기능하는 DNA 폴리머라제에 의해 돌연변이된 에러-프론 폴리머라제 연쇄 반응(error-prone polymerase chain reaction)(에러-프론 PCR)(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18: 3739);
- 예를 들면, 결핍성 DNA-복구 메카니즘 덕분에, 뉴클레오타이드 서열의 증가된 돌연변이율이 존재하는 돌연변이체 균주내 유전자의 계대배양(passaging)(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Publ.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), 또는
- 밀접하게 관련된 유전자의 혼주물(pool)이 형성되어 소화되고 단편이 폴리머라제 연쇄 반응에 대한 주형(template)으로서 사용되며, 여기서 반복된 가닥 분리 및 이들의 다시 합침을 통해, 최종적으로 전체 길이의 모자이크 유전자(mosaic gene)가 생산되는 DNA 셔플링(suffling)(Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747).
소위 지시된 진화(특히 Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200: 31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Publ.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology에 기술됨)를 사용하여, 당해 분야의 기술자는 표적화된 방식으로 및 대규모로 기능성 돌연변이체를 생산할 수 있다. 제1 단계에서, 각각의 단백질의 첫번째 유전자 뱅크를 예를 들면, 상기 제공된 방법을 사용하여 생산한다. 유전자 뱅크는 적합한 방식, 예를 들면, 세균 또는 파아지-디스플레이 시스템에 의해 발현시킨다.
바람직한 특성에 크게 상응하는 특성을 지닌 기능성 돌연변이체를 발현하는 숙주 유기체의 관련 유전자를 다른 돌연변이 라운드에 적용할 수 있다. 돌연변이 및 선택 또는 스크리닝 단계를 기능성 돌연변이체가 충분한 정도까지 바람직한 특성을 가질 때까지 교호적으로 반복할 수 있다. 이러한 교호적인 공정을 사용하여 제한된 수의 돌연변이, 예를 들면 1 내지 5회의 돌연변이를 단계별로 수행할 수 있으며 관련된 효소 특성에 있어서 이들의 영향을 평가하고 선택할 수 있다. 이후에, 선택된 돌연변이체를 동일한 방식으로 다른 돌연변이 단계에 제공할 수 있다. 그 결과, 시험할 다수의 개개 돌연변이체가 유의적으로 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 결과는 문제의 효소의 구조 및 서열과 관련하여 중요한 정보를 제공하며, 이는 바람직한 변형된 특성을 지닌 추가의 효소의 표적화된 생성에 필수적이다. 특히, 소위 "핫 스폿(hot spot)", 즉, 표적화된 돌연변이를 도입함으로써 효소 특성을 변형시키기에 잠재적으로 적합한 서열 분절을 정의할 수 있다.
3.2 작제물
본 발명은 또한 조절성 핵산 서열의 유전적 제어 하에서 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 작제물; 및 적어도 하나의 이들 발현 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"발현 단위"는 본 발명에 따라서, 발현 활성을 지닌 핵산을 의미하며, 이는 본원에 정의한 바와 같은 프로모터를 포함하고, 발현될 핵산 또는 유전자와의 기능적 연결후, 발현, 즉, 이러한 핵산 또는 이러한 유전자의 전사 및 해독을 조절한다. 따라서, 용어 "조절성 핵산 서열"이 또한 이러한 맥락에 사용된다. 프로모터 이외에, 다른 조절성 성분, 예를 들면, 인핸서(enhancer)가 존재할 수 있다.
"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 본 발명에 따라서, 발현될 핵산 또는 발현될 유전자에 기능적으로 연결되는 발현 단위를 의미한다. 발현 단위와는 대조적으로,발현 카세트는 따라서 전사 및 해독을 조절하는 핵산 서열 뿐만 아니라, 전사 및 해독의 결과로서 단백질로서 발현되어야 하는 핵산 서열도 포함한다.
용어 "발현" 또는 "과발현"은 본 발명의 맥락에서, 미생물 속에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 생산 또는 증가를 설명하며, 이는 상응하는 DNA에 의해 암호화된다. 이를 위해, 예를 들면, 유전자는 유기체 내에 삽입될 수 있고, 존재하는 유전자가 다른 유전자로 대체될 수 있므며, 유전자 또는 유전자들의 카피 수가 증가될 수 있고, 강력한 프로모터가 사용될 수 있거나, 고 활성을 지닌 상응하는 효소를 암호화하는 유전자가 사용될 수 있고, 이러한 척도는 임의로 조합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 작제물은 각각의 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결된, 각각의 암호화 서열의 프로모터 5'-상부 스트림 및 3'-하부 스트림 터미네이터 서열 및 임의로 추가의 일반적인 조절 성분을 포함한다.
"프로모터", "프로모터 활성을 지닌 핵산" 또는 "프로모터 서열"은 본 발명에 따라서, 전사될 핵산과의 기능적 연결이 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.
"기능적" 또는 "작동적" 연결은 이러한 맥락에서, 예를 들면 프로모터 활성을 지닌 핵산들 중 하나 및 전사될 핵산 서열 및 임의로 추가의 조절 성분, 예를 들면, 핵산의 전사를 보증하는 핵산 서열, 및 예를 들면 터미네이터가, 이들 조절 성분 각각이 핵산 서열의 전사 내에서 이의 기능을 충족할 수 있는 방식으로 있는, 순차적인 정렬을 의미한다. 이는 필수적으로 화학적 의미에서 직접 연결을 필요로 하지 않는다. 유전적 조절 서열, 예를 들어, 인핸서 서열은 심지어 보다 먼 위치로부터 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에서 이들의 기능을 발휘할 수 있다. 전사될 핵산 서열이 프로모터 서열의 뒤(즉, 3'-말단에) 위치함으로써, 2개의 서열이 서로 공유결합으로 연결된 정렬이 바람직하다. 전이유전자 발현을 겪어야 하는 핵산 서열과 프로모터 서열 사이의 거리는 200개 미만의 염기쌍, 또는 100개 미만의 염기쌍 또는 50개 미만의 염기쌍일 수 있다.
프로모터 및 터미네이터 외에도, 언급될 수 있는 다른 조절 성분의 예는 표적화 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 선택가능한 마커, 증폭 시그널, 복제 오리진(replication origin) 등이다. 적합한 조절 서열은 예를 들면, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 특히 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55의 서열 또는 이의 유도체 및 동족체, 및 이로부터 유도될 수 있는 핵산 서열을 포함하며, 이는 유리하게는 유전자 발현을 조절하기 위한, 예컨대, 증가시키기 위한 하나 이상의 조절 시그널과 작동적으로 또는 기능적으로 연결될 수 있다.
이러한 조절 서열 외에도, 이러한 서열의 천연 조절은 실제 구조 유전자 앞에 여전히 존재할 수 있으며 임의로 유전적으로 변형됨으로써, 천연 조절이 스위치 오프(switch off)되어 유전자의 발현이 증가될 수 있다. 그러나, 핵산 작제물은 또한 보다 단순한 작제일 수 있는데, 즉, 추가의 조절 시그널이 암호화 서열 앞에 삽입되지 않고 이의 조절을 지닌 천연 프로모터는 제거되지 않았다. 대신에, 조절 서열은 돌연변이됨으로써 조절이 더 이상 일어나지 않고 유전자 발현이 증가한다.
바람직한 핵산 작제물은 유리하게는 또한 프로모터에 기능적으로 연결된, 전술한 "인핸서" 서열 중 하나 이상을 함유하며, 이는 핵산 서열의 증가된 발현이 가능하도록 한다. 추가의 조절 성분 또는 터미네이터와 같은, 추가의 유리한 서열을 또한 DNA 서열의 3'-말단에 삽입할 수 있다. 작제물은 본 발명에 따른 핵산 하나 이상의 카피를 함유할 수 있다. 작제물은 또한 임의로 작제물의 선택을 위한, 항생제 내성 또는 영양요구성 상보성 유전자와 같은 추가의 마커를 함유할 수 있다.
적합한 조절 서열의 예가 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq-, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD)SP6, 람다-PR 또는 람다-PL 프로모터와 같은 프로모터 속에 함유되며, 이는 유리하게는 그람-음성 세균에서 적용된다. 또한 유리한 조절 서열이 예를 들면, 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2 속에, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH 속에 함유된다. 인공 프로모터 또한 조절에 사용될 수 있다.
숙주 유기체 내에서 발현을 위해, 핵산 작제물을 유리하게는 벡터, 예를 들면 플라스미드 또는 파아지 내로 삽입하며, 이는 숙주 내에서 유전자가 가능한 최적으로 발현하도록 한다. 플라스미드 및 파아지와는 별도로, 벡터는 또한 당해 분야의 기술자에 의해 공지된 모든 다른 벡터, 예컨대 SV40, CMV, 바쿨로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포손(transposon), IS 성분, 플라스미드, 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA와 같은 바이러스로 이해되어야 한다. 이러한 벡터는 숙주 유기체 내에서 자율적으로 복제될 수 있거나 염색체적으로 복제될 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 다른 구조를 나타낸다.
적합한 플라스미드는 예를 들면 이. 콜라이 내의 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스 내의 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스 내의 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 내의 pSA77 또는 pAJ667, 진균 내의 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모 내의 2알파M, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물 내의 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이다. 전술한 플라스미드는 가능한 플라스미드의 작은 선택을 나타낸다. 추가의 플라스미드는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 교재 Cloning Vectors (eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)에서 찾을 수 있다.
벡터의 다른 구조에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터가 또한 선형 DNA의 형태로 미생물 내에 삽입될 수 있으며 이종 또는 동종 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈내로 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터 또는 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 핵산 만으로 이루어질 수 있다.
유기체 내에서 이종 유전자의 최적의 발현을 위해, 유기체 내에서 사용된 특이적인 "코돈 사용"에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 유리하다. "코돈 사용"은 문제의 유기체의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 평가를 기반으로 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 적합한 프로모터의 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열 및 터미네이터 또는 폴리아데닐화 시그널의 융합에 의해 제조된다. 이를 위해, 예를 들면 T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)에 기술된 바와 같은, 일반적인 재조합 및 클로닝 기술이 사용될 수 있다.
적합한 숙주 유기체 내에서 발현을 위해, 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물은 숙주-특이적인 벡터내로 유리하게 삽입되며, 이는 숙주 내에서 유전자의 최적의 발현이 가능하도록 한다. 벡터는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며 예를 들면 "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Publ., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)에서 찾을 수 있다.
4. 미생물
문맥에 따라서, 용어 "미생물"은 출발(야생형) 미생물 또는 유전적으로 변형된 재조합 미생물, 또는 둘 다를 의미한다.
본 발명에 따른 벡터를 사용하여, 재조합 미생물을 생산할 수 있으며, 이는 예를 들면 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환시키고 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유리하게는, 상기 기술된 본 발명에 따른 재조합체 작제물은 적합한 숙주 시스템내로 도입되어 발현된다. 바람직하게는, 당해 분야의 기술자에게 공지된 일반적인 클로닝 및 형질감염 방법, 예를 들면, 동시침전, 원형질체 융합, 전기천공, 레트로바이러스 형질감염 등을 사용하여 각각의 발현 시스템 내에서 기술된 핵산을 발현시킬 수 있다. 적합한 시스템은 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기술되어 있다. 단백질의 이종 발현을 위한 세균 발현 시스템의 고찰은 예를 들면, Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222에 의해 제공된다.
원칙적으로, 모든 원핵 및 진핵 유기체가 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산 작제물을 위한 재조합 숙주 유기체로서 고려될 수 있다. 유리하게는, 세균, 진균 또는 효모와 같은 미생물을 숙주 유기체로서 사용한다. 유리하게는, 그람-양성 또는 그람-음성 세균, 바람직하게는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae) 또는 노카르디아세아에(Nocardiaceae) 과(family)의 세균, 특히 바람직하게는 에스케리키아, 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 노카르디아, 부르콜데리아, 살모넬라, 아그로박테리움, 클로스트리디움 또는 로도코쿠스 속(genus)의 세균이 사용된다. 에스케리키아 콜라이 속 및 종이 매우 특히 바람직하다. 추가로 유리한 세균은 더욱이 알파-프로테오박테리아, 베타-프로테오박테리아 또는 그람-프로테오박테리아의 그룹에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 숙주 유기체들은 바람직하게는 상기 정의에 따른 7β-HSDH 활성을 지닌 효소를 암호화하는, 본 발명에 기술된 핵산 서열, 핵산 작제물 또는 벡터 중 적어도 하나를 함유한다.
본 발명에 따른 과정에 사용된 유기체는 숙주 유기체에 의존하여, 당해 분야의 기술자에 의해 공지된 방식으로 성장하거나 배양된다. 미생물은 일반적으로 액체 배지 속에서 성장하며, 이는 일반적으로 당의 형태인 탄소원(carbon source), 효모 추출물과 같은 유기 질소원 또는 황산암모늄과 같은 염 형태의 질소원, 철, 망간, 마그네슘 염과 같은 미량 원소 및 임의로 비타민을 함유하는 액체 배지 속에서 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃의 온도에서 산소 통기 하에 성장시킨다. 액체 영양 배지의 pH는 고정된 값으로 유지시킬 수 있는데, 즉, 이것이 성장하는 동안 이를 조절하거나 조절하지 않을 수 있다. 배양은 배치식, 반-배치식 또는 연속식일 수 있다. 영양물은 발효 시작시에 공급될 수 있거나 반연속적으로 또는 연속적으로 보충될 수 있다.
5. 효소 및 돌연변이체의 재조합체 생산
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능성의, 생물학적으로 활성인 단편의 재조합적 생산 방법에 관한 것이며, 여기서, 폴리펩타이드-생산 미생물이 배양되고, 임의로, 폴리펩타이드의 발현이 유도되며 후자는 배양물로부터 단리된다. 폴리펩타이드는 또한 이것이 바람직한 경우, 이러한 방식으로 산업적 규모로 생산될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 미생물은 배치식 방법(배치식 배양)에서 또는 공급 배치식 또는 반복된 공급 배치식 방법에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 크미엘(Chmiel)의 교재(Bioprozeßtechnik 1. Einf
hrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess engineering] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 스토르하스(Storhas)의 교재(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment]) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))에서 찾을 수 있다.
사용될 배양 배지는 각각의 균주의 요건을 적합하게 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 기술은 매뉴얼 "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 제공된다.
본 발명에 따라 이용가능한 이들 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 및/또는 미량 성분을 포함한다.
바람직한 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 우수한 탄소원은 예를 들면 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 갈락토즈, 리보스, 소르보즈, 리불로즈, 락토즈, 말토즈, 슈크로즈, 라피노즈, 전분 또는 셀룰로즈이다. 당은 또한 당밀과 같은 복합체 화합물, 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지로 첨가될 수 있다. 또한 다양한 탄소원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소원은 대두 오일, 해바라기씨 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일, 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산과 같은 지방산과 같은 오일 및 지방, 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이들 화합물을 함유하는 물질이다. 질소원의 예는 암모니아 가스 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄 염, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 옥수수-대 액(corn-steep liquor), 대두분(soybean flour), 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 및 기타 물질과 같은 복합체 질소원을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
배지 속에 함유될 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 인 또는 설페이트 염을 포함한다.
사용된 황 공급원은 설페이트, 설파이트, 디티오니트, 테트라티오네이트, 티오설페이트, 설파이드와 같은 무기 황 화합물일 수 있으나 또한 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물일 수 있다.
사용된 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염일 수 있다.
킬레이팅제(chelating agent)를 배지에 가하여 용액 속에서 금속 이온을 유지시킬 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 카테콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디하이드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기 산을 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 발효 배지는 대개 또한 비타민 또는 성장 프로모터와 같은 다른 성장 인자를 함유하며, 이는 예를 들면 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 흔히 효모 추출물, 당밀, 옥수수-대 액 등과 같은 배지의 복합 성분으로부터 기원한다. 더욱이, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 배지 속의 화합물의 정확한 조성은 특수한 실험에 크게 의존하며 각각의 구체적인 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교재 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)에서 찾을 수 있다. 성장 배지는 또한 Standard 1(Merck) 또는 BHI(뇌 심장 주입액, DIFCO) 등과 같이, 상업적 공급업자로부터 입수할 수 있다.
배지의 모든 성분은 열(1.5 바아 및 121℃에서 20분)로 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 성분은 필요할 경우 함께 멸균시키거나 별도로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작시 존재할 수 있거나 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가할 수 있다.
배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며 실험 동안 일정하게 유지되거나 변할 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있다. 배양물 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 첨가함으로서 배양 동안 조절할 수 있다. 거품을 조절하기 위하여, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제(antifoaming agent)를 사용하는 것도 가능하다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 항생제와 같은, 적합한 선택적으로 작용하는 물질을 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 주위 공기와 같은 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 공급한다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 최대의 목적한 생성물이 형성될 때까지 지속한다. 이러한 목표는 일반적으로 10 시간 내지 160 시간 내에 도달한다.
발효 브로쓰(broth)를 이후에 추가로 진행한다. 요건에 따라서, 생물량(biomass)을 발효 브로쓰로부터 원심분리, 여과, 경사단리 또는 이들 방법의 조합에 의해 완전히 또는 부분적으로 제거하거나 이를 완전히 둘 수 있다.
폴리펩타이드가 배양 배지내로 분비되지 않는 경우, 세포를 또한 파괴하여 생성물을 단백질 단리의 공지된 방법으로 용해물로부터 수득할 수 있다. 세포는 임의로 고-주파 초음파를 사용하여, 고압에 의해, 예를 들면, 프렌치 프레스(French press)에 의해, 삼투압에 의해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화기를 사용하거나, 나열된 수개의 방법의 조합에 의해 파괴할 수 있다.
폴리펩타이드는 Q-세파로즈 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피와 같은, 분자 체(molecular seive) 크로마토그래피(겔 여과)와 같은, 공지된 크로마토그래피, 및 한외여과, 결정화, 염석(salting-out), 투석 및 천연 겔 전기영동과 같은 다른 일반적인 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들면 Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Methods of Biochemical Processing], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin에 기술되어 있다.
재조합 단백질을 단리하기 위하여, 정의된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 cDNA를 신장시킴으로서 변형된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 유리할 수 있으며, 이는 예를 들면 보다 용이한 정제를 위해 제공된다. 이러한 유형의 적합한 변형은 예를 들면 앵커(anchor)로서 소위 "태그" 기능화, 예를 들면 헥사-히스티딘 앵커로서 공지된 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인지될 수 있는 에피토프(epitope)(예를 들면, Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press에 기술됨)이다. 이들 앵커는 단백질을 고체 담체, 예를 들면 중합체 매트릭스에 부착시키기 위해 제공될 수 있으며, 이는 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼 속에 패킹(packing)될 수 있거나, 미세역가 플레이트 또는 일부 다른 지지체 상에서 사용될 수 있다.
동시에, 이들 앵커는 또한 단백질을 인식하는데 사용될 수 있다. 단백질의 인식을 위해, 또한 기질과의 반응 후 검출가능한 반응 생성물을 형성하는, 형광성 염료, 효소 마커와 같은 일반적인 마커, 또는 방사활성 마커를 단독으로 또는 단백질의 유도체화를 위한 앵커와 함께 사용할 수 있다.
6. 효소 고정화
본원에 기술된 방법에서, 본 발명에 따른 효소는 유리되거나 고정화될 수 있다. 고정화된 효소는 불활성 지지체에 고정된 효소로 이해되어야 한다. 적합한 지지체 물질 및 이에 고정된 효소는 제EP-A-1149849호, 제EP-A-1 069 183호 및 제DE-OS 100193773호로부터 및 이에 인용된 참고 문헌으로부터 공지되어 있다. 이와 관련하여, 모든 참고가 이들 문서의 개시내용에 대해 이루어진다. 적합한 지지체 물질은 예를 들면 점토, 카올리나이트(kaolinite)와 같은 점토 광물, 규조토, 진주암, 이산화규소, 산화알루미늄, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 셀룰로즈 분말, 음이온 교환체 물질, 합성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 아크릴 수지, 페놀-포름아미드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌을 포함한다. 지지된 효소를 제조하기 위하여, 지지체 물질은 일반적으로 미분된, 입상체 형태(particlulate form)로 사용되며, 다공성 형태가 바람직하다. 지지체 물질의 입자 크기는 일반적으로 5 mm 이하이며, 특히 2 mm(입자-크기 분포 곡선)이다. 유사하게, 전체-세포 촉매로서 데하이드로게나제를 사용하는 경우, 유리 또는 고정된 형태를 선택할 수 있다. 지지체 물질은 예를 들면 Ca-알기네이트 및 카라기난이다. 세포 뿐만 아니라 효소도 또한 글루타르알데하이드와 직접 가교결합될 수 있다(CLEA에 대한 가교결합). 상응하는 및 추가의 고정화 방법은 예를 들면 J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" and in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim에 기술되어 있다.
이제, 본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명될 것이다.
도 1: 몇개의 발표된 7α-HSDH와 함께 씨. 디피실레(DSM 12056)로부터 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 아미노산 서열 정렬. 에스케리키아 콜라이, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 클로스트리디움 소르델리이(Clostridium sordellii)의 서열을 씨. 디피실레로부터의 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 단백질 서열과 비교한다. 보조효소 특이성에 관여하는 아미노산 잔기는 검정색 틀(black frame)으로 나타내고 세작용기 촉매(catalytic triade)는 별표로 나타낸다. 글리신-모티프 G(A)XXXGXG는 기술된 바와 같이 나타낸다. 검정색의 음영 박스(shaded box)는 보존된 아미노산을 나타내고, 회색의 음영 박스는 유사 아미노산을 강조한다. 정렬은 clustalOmega로 생성하였으며 가시화를 위해 jalview 정렬 도구를 사용하였다.
도 2: 씨. 디피실레로부터 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 이종 발현 및 정제의 SDS-PAGE 분석. 10 μg의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적용하였다. 레인 M, 분자량 마커, 레인 1 조 추출물(crude extract), 레인 2 정제된 Cd7α-HSDH.
도 3: 상이한 온도에서 7α-HSDH의 비 활성(specific activity). 효소 활성에 있어서 온도의 효과는 CDCA(pH 8.0에서 50 mM KPi 완충액, 1 mM CDCA 및 0.5 mM NADP + )의 산화에 대해 스펙토-측광학적 분석(specto-photometrical assay)을 사용함으로써 조 추출물로 측정하였다.
도 4: 7-KLCA의 0 내지 20 mM 범위에서 증가하는 농도의 생성물을 사용한 Cd7α-HSDH의 상대적인 활성. 기질로서 1 mM CDCA를 사용한 표준 활성 분석을 사용하였다.
도 5: 5 U Cd7α-HSDH 및 50 U NOX를 함유하는 수성 시스템(KPi, pH 7.0) 속에서 18.5 시간 동안 CDCA (10 mM)의 생체내변환. 3.5 h 및 7 h 후 추가의 50 U NOX를 반응에 가하였다. CDCA(
도 6: 엄격하게 NAD+-의존성인 HSDH의 NAD+-결합 영역의 아미노산 서열 정렬(클로스트리디움 디피실레로부터의 NADP+-의존성 효소와 비교한 이. 콜라이, 바실러스 프라길리스 및 슈도몬스 테스토스테로니). 보존된 NAD+-결합 모티프 G(A)XXXGXG는 별표로 표시하고, NADP+의 결합에 관여하는 중요한 음으로 하전된 잔기 18개 아미노산 다운스트림(downstream)은 검정색 틀로 나타낸다.
도 7: 주형으로서 비. 안트라키스(B. anthracis)(PDB: 4JRO)로부터의 fabG를 사용하여 SWISS-PROT로 모델링한, 7α-HSDH/NADP+ 복합체(사진 A) 및 7α-HSDH A37D/NAD(사진 B)의 구조. 단백질 골격은 2차 구조 구성성분에 의해 착색되어 있다: 적색의 α-나선, 황색의 β-시이트(sheet) 및 녹색의 단일 가닥. 원자는 유형에 따라 착색되어 있다: 산소는 적색으로, 질소는 청색으로, 탄소는 회색으로 및 인은 오렌지색으로 착색되어 있다.
도 8: 10 mM CDCA, 0.5 mM NAD+, 및 조 추출물 효소를 사용한 돌연변이체와 Cd7α-HSDH의 야생형의 NAD+-의존성 활성의 비교.
도 9: NADP+-의존성 돌연변이체와 이. 콜라이의 야생형 7α-HSDH의 활성의 비교(조 추출물을 사용한 활성 분석).
도 10: 조 추출물 및 정제된 단백질에 대해 관찰된 바와 같은 7α-HSDH(야생형 및 D42G/I43R 돌연변이체)의 발현 및 정제의 SDS-PAGE. 7α-HSDH의 발현은 의도된 단백질의 대략 80%를 생성한다. 샘플 크기는 약 10 μg 단백질이었다. 범례: M = 마커;
도 11: 1 단계 방법에서 CDCA의 UDCA로의 생체내변환에 대한 반응 도식. 효소 둘 다는 동일한 보조인자를 사용하여야 한다. 도 11의 A는 보조 효소로서 NAD(H)를 기반으로 한 반응 변형을 나타내는 반면, 도 11의 B는 NADP(H)-기반의 변형을 나타낸다.
도 12: 1 단계 방법으로 이. 콜라이로부터의 NAD-의존성 7β-HSDH[G39E] 및 7α-HSDH를 사용한 CDCA의 전환.
도 13: 1 단계 방법으로 씨. 디피실레로부터의 7β-HSDH[G39S/R64E] 및 CD7α-HSDH를 사용한 CDCA의 전환.
도 14: 1 단계 방법으로 전체 세포 촉매 이. 콜라이 DB06(도 14의 A) 및 이. 콜라이 DB07(도 11의 B)을 사용한 CDCA의 전환.
발명의 구체적인 구현예
본 발명은 특히 다음의 구체적인 구현예에 관한 것이다:
1. a) 하기 화학식 1의 UDCA 화합물을 제조하기 위한, 커플링된, 바람직하게는 자급자족가능한, 생체촉매적 방법으로서, 상기 방법은
a) 하기 화학식 2의 CDCA 화합물을 7α-HSDH 및 7β-HSDH 및, 바람직하게는 적어도 촉매량의 NAD+ 및 NADP+로부터 선택된 보조인자의 존재하에서 반응시키는 단계로서, 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH는 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH로부터 선택된 동일한 보조인자 시스템을 이용하는 능력을 가지며, 여기서
a1) 상기 7α-HSDH는 상기 화학식 2의 CDCA 화합물의 하기 화학식 3의 상응하는 중간체 7-KLCA 화합물로의 산화를 촉진시키고,
a2) 상기 7β-HSDH는 반응 단계 a1)에서 형성된 바와 같은 상기 화학식 3의 7-KLCA 화합물의 상기 화학식 1의 UDCA 화합물로의 환원을 반응 단계 a1)에서 소비된 보조인자의 재생 하에서 촉매하는 단계; 및
b) 임의로 반응 생성물을 추가로 정제하는 단계를 포함한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1에서,
R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R3)4 +(여기서, 잔기 R3은 동일하거나 상이하고 H 또는 알킬을 나타낸다)을 나타내거나, 여기서 그룹 -CO2R은 산 아미드 그룹 -CONR1R2(여기서, R1 및 R2는 서로 독립적으로 알킬 잔기를 나타낸다)에 의해 대체되고; 여기서 R은 바람직하게는 H를 나타내고;
상기 화학식 2에서,
R은 그룹 -CO2R에 대해 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지거나 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체되며,
상기 화학식 3에서,
R은 상기 정의된 바와 같거나, 여기서 그룹 -CO2R은 상기 정의된 바와 같은 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체된다.
2. 구현예 1에서, 단계 a)가 단리된(정제된, 농축된 또는 조, 바람직하게는 순수한) 7α-HSDH 효소 및 단리된(정제된, 농축된 또는 조, 바람직하게는 순수한) β-HSDH 효소의 존재하에서 또는 상기 효소를 기능적으로 발현하는 하나 이상의 재조합 미생물의 존재하에서 수행되는 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하거나; 또는 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 방법.
4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 하나에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH을 이용하는 방법으로서; 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 에스케리키아 콜라이로부터 단리되고, 적어도 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NAD+/NADH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NAD+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용함으로써), 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하는 클로스트리디움 디피실레 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)로부터 선택되고(상기 돌연변이체들은 본원에서 하기에 추가로 정의된다),
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, R40, R41 및 K44로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내며, 이러한 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다)로부터 선택되는 방법.
5. 구현예 1 내지 구현예 3 중 하나에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 방법으로서, 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 클로스트리디움 디피실레로부터 단리된, 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는 능력을 보유한 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37을 지닌 에스케리키아 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서, 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내고, 상기 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다)로부터 선택되고;
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 서열 번호: 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 콜린셀라 아에로파시엔스로부터 단리된 7β-HSDS, 및 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%의 서열 동일성과 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 능력을 보유한 이의 돌연변이체;
(2) 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, 및 R64로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내고 상기 돌연변이체는 본원에서 하기에 추가로 정의된다); 및
(3) 서열 번호: 56에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 보조인자로서 NADPH의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의(특히 7-KCLA의 UDCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus)로부터 단리된 7β-HSDH, 및 서열 번호: 56에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉매하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체로부터 선택되는 방법.
6. 보조인자로서 NADP+의 소비 하에(즉, 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용함으로써) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 서열 번호: 37을 지닌 이. 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH로서, 여기서 상기 효소는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 아미노산 서열 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%와 같은, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내는 7α-HSDH.
7. 구현예 6에 있어서, 아미노산 서열 돌연변이가:
a) D42X1(여기서 X1은 아스파르트산(D)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히, 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)및/또는
b) I43X2(여기서 X2는 이소루이신(I)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히, 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH.
8. 구현예 6 및 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
D42X1 및
I43X2 및
b) 이중 돌연변이
D42X1/I43 X2로부터 선택되고
여기서
X1는 G, A 또는 V를 나타내며
X2는 R, H 또는 K를 나타내는 7α-HSDH.
이러한 이중 돌연변이체의 비-제한적 예는 다음과 같다: (D42G/I43R); (D42G/I43H); (D42G/I43K); (D42A/I43R); (D42A/I43H); (D42A/I43K); (D42V/I43R); (D42V/I43H); (D42V/I43K).
9. 구현예 6 내지 구현예 8 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호: 37의 7α-HSDH와 비교하는 경우 다음의 프로파일(profile)을 나타내는 7α-HSDH:
a) 보조인자로서 NADP+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NADP+에 대한 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서, 비 활성은 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우, 적어도 1, 5 또는 10%, 특히 적어도 1-배, 보다 특히 2- 내지 10-배까지 증가된다);
b) 예를 들면, NADP(H)에 대해 보다 명백한 특이성, 및 NAD(H)에 대해 감소된, 보다 특히 약해지거나 잃어버린 특이성과 같이, NADH 및 NADPH와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
c) 여기서 특징 a) 및 b)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음.
10. 씨. 디피실레로부터 단리되고 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 갖는 7α-HSDH 또는 예를 들면, 서열 번호: 34에 대해 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내는 이의 기능성 변이체; 또는 보조인자로서 NAD+의 소비하에서(즉, 보조인자 시스템 NAD+/NADH의 이용에 의해) 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의(특히 CDCA의 7-KLCA로의) 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉매하는, 씨. 디피실레 7α-HSDH의 돌연변이체(여기서, 효소 돌연변이체는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치내 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 34에 대해 예를 들면, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99,5%와 같이, 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)인 7α-HSDH.
11. 구현예 10에 있어서, 아미노산 서열 돌연변이가:
a) K16X1
b) A37X2
c) R38X3
(여기서 X1은 라이신(K)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타내고;
X2는 알라닌(A)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타내며;
X3은 아르기닌(R)과는 상이한 아미노산 잔기, 특히 단백질생성 아미노산 잔기, 특히 임의의, 특히 천연 아미노산을 증가시키는 비 활성 및/또는 이를 감소시키는 기질 억제 및/또는 이를 변형시키는 보조인자 이용 또는 보조인자 특이성을 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH.
12. 구현예 10 및 구현예 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
K16X1
A37X2
R38X3
및
b) 이중 돌연변이
K16X1/A37X2 및
A37X2/R38X3
(여기서
X1은 A, G, 또는 D를 나타내고;
X2는 D 또는 E를 나타내며;
X3은 I를 나타낸다)로부터 선택되며,
이러한 이중 돌연변이체의 비-제한적 예가:
(K16A/A37D), (K16A/A37E); (K16G/A37D), (K16G/A37E) (K16D/A37D), (K16D/A37E); (A37D/R38I) 및 (A37E/R38I)인 7α-HSDH.
13. 구현예 10 내지 구현예 12 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호:34의 7α-HSDH와 비교하는 경우, 다음의 특징 프로파일을 나타내는 7α-HSDH:
a) CDCA에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서 비 활성은, 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우 적어도 1, 5 또는 10% , 특히 적어도 1배, 보다 특히 2배 내지 10배까지 증가된다);
c) 보조인자로서 NAD+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NAD+에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg])(여기서, 비 활성은 돌연변이되지 않은 효소와 비교하는 경우, 적어도 1, 5 또는 10 % , 특히 적어도 1배, 보다 특히 2배 내지 10배까지 증가된다);
d) 예를 들면, NAD(H)에 대해 명백한 특이성, 및 감소된, 보다 특히 NADP(H)에 대해 약화되거나 잃어버린 특이성과 같은, NAD(H) 및 NADP(H)와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
e) 적어도 하나의 담즙산, 특히 CA 및/또는 CDCA 및/또는 7-KLCA, 특히 CDCA에 대해 감소되거나 바람직하게는 필수적으로 잃어버린, 보다 바람직하게는 잃어버린, 기질 억제;
예를 들면 1 내지 200 mM, 2 내지 150 mM, 2,5 내지 100 mM와 같이, 예를 들면, >1 mM의 범위의 Ki-값;
f) 여기서 특징 a) 내지 d)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음.
14. 구현예 6 내지 13 중 어느 하나에 따른 7α-HSDH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
15. 적어도 하나의 조절 서열의 제어, 구현예 14의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
16. 구현예 15의 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
17. 구현예 14에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 구현예 15에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 또는 구현예 16에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 갖는 재조합 미생물.
18. 구현예 17에 있어서, 보조인자 재생에 적합한 추가의 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)로부터 선택된, 적어도 하나의 추가의 효소에 대한 암호화 사열을 추가로 갖는 재조합 미생물.
19. 구현예 18에 있어서, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시-발현하거나; 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시 발현하는 재조합 미생물.
20. 구현예 19에 있어서, 구현예 4 및 구현예 5 중 하나에 정의된 바와 같은 7α-HSDH 및 7β-HSDH를 동시-발현하는 재조합 미생물.
적합한 재조합 미생물은 하나 이상의 발현 플라스미드 위에 본원에 정의된 바와 같은 이러한 7α-HSDH 및 7β-HSDH 효소의 하나 이상의 카피(copy)를 가질 수 있다. 단일 플라스미드 시스템 또는 다중-카피 플라스미드 시스템이 적용가능하다(참고: WO 2012/080504). 예로서 pET21a와 같은 단일 플라스미드 시스템 및 pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1, pRSFDuet-1 및 pCOLADuet-1과 같은 Novagenes Duet-벡터(또한 Novagen으로부터의 사용자 프로토콜 TB340 Rev. E0305 참고)와 같은 다중 카피 플라스미드를 언급할 수 있다.
21. 구현예 6 내지 구현예 13 중 어느 하나의 정의에 따른 7α-HSDH 돌연변이체의 존재하에서 또는 구현예 17 내지 구현예 20 중 어느 하나에 따른 상기 7α-HSDH 돌연변이체를 발현하는 재조합 미생물의 존재하에서 상응하는 7-하이드록시스테로이드를 산화시키고 임의로 형성된 반응 생성물 중 하나를 반응 혼합물로부터 단리함을 포함하는, 7α-케토스테로이드의 효소적 또는 미생물 합성을 위한 생체촉매 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 7-하이드록시스테로이드가
- 콜산(CA)
- 케노데옥시콜산(CDCA),
- 12-케토케노데옥시콜산(12-케토-CDCA) 및 바람직하게는 상기 산화가능한 7α-HSDH 돌연변이체, 특히 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택된 방법.
23. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 산화가 NAD+ 또는 NADP+의 존재 및 특히 소비 하에서 수행되는 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 소비된 NAD+ 또는 NADP+가 NAD+ 또는 NADP+-재생 효소와의 커플링에 의해 재생되고, 여기서 상기 효소는 7β-HSDH, 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 포르미에이트 데하이드로게나제(FDH), 글루코즈 데하이드로게나제(GDH), NADH-데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), 글루코즈-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH), 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH)로부터 선택되는 방법.
상기 본원의 구체적인 아미노산 서열(서열 번호: 34, 37, 40, 44, 47, 50, 54 및 56과 같은)에 대한 어떠한 참고도 또한, 달리 나타내지 않는 한, 특히 His-태그 서열, 특히 헥사-His 태그 서열에 의해 연장된 변이체와 같은 어떠한 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 연장된 이의 변이체에 관한 것이다.
이러한 His-태그 변이체의 비-제한적 예는 서열 번호: 35, 38, 41, 42, 45, 48, 51 및 52의 것이다.
본 발명의 추가의 양태 및 구현예
1. 사용된 일반적인 정의 및 약어
용어 "자급-자족하는"은 커플링된 효소 산화환원 반응(redox reaction)을 나타내며, 여기서 제1의 부분 환원 반응 또는 산화 반응에 의해 소비된 보조인자는 제2의 부분 산화 반응 또는 환원 반응 각각에 의해 필수적으로 완전히 재생된다.
달리 기술하지 않는 한, 용어 "7β-HSDH"는 데하이드로게나제 효소를 나타내며, 이는 특히 NAD(P)H의 화학량론적 소비 및 임의로 상응하는 역 반응을 사용하여 DHCA 또는 7,12-디케토-3α-CA(7,12-디케토-LCA)의 3,12-디케토-7β-CA 또는 12-케토-UDCA로의 적어도 입체특이적이고/이거나 위치특이적인 환원을 촉매한다. "7β-HSDH"는 또한 7-케토리토콜산 (7-KLCA)의 UDCA로의 환원, 및 임의로 상응하는 역 반응을 촉매한다. 효소는 천연의 또는 재조합적으로 생산된 효소일 수 있으며 이는 야생형 효소일 수 있거나 적합한 돌연변이 또는 His-태그 함유 서열과 같은 C- 및/또는 N-말단 아미노산 서열 연장에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 효소는 기본적으로 세포, 예를 들면, 단백질 불순물과 혼합될 수 있지만, 바람직하게는 순수한 형태이다. 적합한 검출 방법은 예를 들면, 하기 제공된 실험 단락에 기술되어 있거나 문헌에 공지되어 있다(예컨대, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydorxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982). 이러한 활성을 지닌 효소는 EC 번호매김 1.1.1.201 하에서 분류된다.
달리 기술하지 않는 한, 용어 "7α-HSDH"는 데하이드로게나제 효소를 나타내며, 이는 특히 NAD(P)+의 화학량론적 소비, 및 임의로 상응하는 역 반응으로, CDCA의 7,-KLCA)로의 적어도 입체특이적이고/이거나 위치특이적인 산화를 촉매한다. 효소는 천연의 또는 재조합적으로 생산된 효소일 수 있으며, 이는 야생형 효소일 수 있거나 적합한 돌연변이 또는 His-태그 함유 서열과 같이, C- 및/또는 N-말단 아미노산 서열 연장에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 효소는 기본적으로 세포, 예를 들면, 단백질 불순물과 혼합될 수 있지만, 바람직하게는 순수한 형태이다. 적합한 검출 방법은 예를 들면, 실험 단락에 기술되어 있으며 이러한 활성을 지닌 제공된 효소는 EC 번호 1.1.1.159 하에 분류된다.
"순수한 형태" 또는 "순수한" 또는 "실질적으로 순수한" 효소는 본 발명에 따라 단백질을 검출하는 일반적인 방법, 예를 들면, 뷰렛 방법(biuret method) 또는 로우리(Lowry) 등(cf. description in R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982))에 따른 단백질 검출법에 의해 측정된, 전체 단백질 함량에 대해, 순도가 80 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과, 특히 95 중량% 초과, 및 매우 특히 99 중량% 초과인 효소로서 이해되어야 한다.
"산화환원 등가물"은 전자 공여체 또는 전자 수용체로서 유용한 저-분자량 유기 화합물, 예를 들면, NAD+ 및 NADH+와 같은 니코틴아미드 유도체 또는 이들의 환원된 형태 NADH 및 NADPH 각각을 의미한다. "산화환원 등가물" 및 "보조인자"는 본 발명의 맥락에서 동의어로 사용된다. 따라서, 본 발명의 의미에서 "보조인자"는 또한 "산화환원-가능한 보조인자"로서, 즉, 환원된 형태 및 산화된 형태로 존재할 수 있는 보조인자로서 기술될 수 있다.
"소비된" 보조인자는 보조인자의 환원되거나 산화된 형태의 보조인자로서 이해되어야 하며, 이는 기질의 명시된 환원 또는 산화 반응의 과정 중에 상응하는 산화된 또는 환원된 형태로 변형된다. 재생에 의해, 반응 중 형성된 산화되거나 환원된 보조인자는 다시 환원되거나 산화된 출발 형태로 전환됨으로써, 이는 다시 기질의 반응에 이용가능하다.
"변경된 보조인자 용도"는 본 발명의 맥락에서 참고와 비교하여 정성적 또는 정량적 변화로서 이해되어야 한다. 특히, 변경된 보조인자의 사용은 아미노산 서열 돌연변이를 착수함으로써 관찰될 수 있다. 이러한 변화는 이후에 돌연변이되지 않은 출발 효소와 비교하여 측정될 수 있다. 더욱이, 특수한 보조인자와 관련한 활성은 돌연변이를 착수함에 의해 증가되거나 감소될 수 있거나 완전히 방지될 수 있다. 그러나, 변경된 보조인자 용법은 또한 개개 보조인자에 대한 특이성 대신에, 첫번째 보조인자와는 상이한, 현재 적어도 하나의 추가의 두번째 보조인자가 사용될 수 있도록 하는(즉, 연장된 보조인자 용법이 존재한다) 변화를 포함한다. 그러나, 역으로, 원래 존재하였던 2개의 상이한 보조인자의 사용 능력은 특이성이 이들 보조인자들 중 하나에 대해서만 증가하거나 이들 보조인자 중 하나에 대해서만 감소되거나 완전히 제거되도록 변경될 수 있다. 예를 들면, 보조인자 NAD(NADH)에 의존성인 효소는 이제 보조인자 사용의 변화로 인하여 NAD(NADH) 및 보조인자 NADP(NADPH) 둘 다에 의존성으로 될 수 있거나 NAD(NADH)에 대한 원래의 의존성은 NADP(NADPH)에 대한 의존성으로 완전히 변형될 수 있거나 역으로 변형될 수 있다.
용어 "NAD+/NADH 의존성" 또는 "NADP+/NADPH 의존성"은, 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따라 광의적으로 해석되어야 한다. 이들 용어는 둘 다 및 바람직하게는 "특이적인" 의존성, 즉, NAD+/NADH 또는 NADP+/NADPH에 대한 전적인 의존성 뿐만 아니라, 덜 바람직하게는, 보조인자 둘 다에 있어서 본 발명에 따라 사용된 효소의 의존성, 즉, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH에 대한 의존성도 포함한다.
이는 용어 "NAD+/NADH-수용성" 또는 "NADP+/NADPH-수용성"에 상응하게 적용된다.
용어 "NAD+/NADH-재생" 또는 "NADP+/NADPH-재생"은, 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따라 광의적으로 해석되어야 한다. 이러한 용어는 둘 다, 바람직하게는, 특이적인", 즉, 소비된 보조인자 NAD+/NADH 또는 NADP+/NADPH를 재생하는 배타적인 능력, 및, 덜 바람직하게는 보조인자 둘 다, 즉, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH를 재생하는 능력을 포함한다.
"단백질생성(Proteinogenic)" 아미노산은 특히 (단문자 코드): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R 및 H를 포함한다.
"고정화"는 본 발명에 따라서, 본 발명에 따라 사용된 생체촉매, 예를 들면, 즉 주변 액체 매질인, 담체 물질 속에서 필수적으로 불용성인, 고체 상의 7β-HSDH의 공유 또는 비공유 결합을 의미한다. 본 발명에 따라서, 본 발명에 따라 사용된 재조합 미생물과 같은 전체 세포는 또한 이러한 담체에 의해 상응하게 고정될 수 있다.
"돌연변이되지 않은 효소와 비교하여 감소된 기질 억제"는 특수한 기질에 대해 돌연변이되지 않은 효소로 관찰된 기질 억제가 더 이상 관찰되지 않는, 즉, 필수적으로 더 이상 측정가능하지 않거나, 보다 높은 기질 농도에서만 일어나는, 즉 Ki 값이 증가하는 것을 의미한다.
"콜산 화합물"은 탄소 골격 구조, 특히 콜산의 스테로이드 구조를 지니고 7번 환 위치 및 임의로 3번 및/또는 12번 환 위치에서 케토 및/또는 하이드록시 또는 아실옥시 그룹이 존재하는 본 발명에 따른 화합물을 의미한다.
특별한 유형의 화합물, 예를 들면, "콜산 화합물" 또는 "우르소데옥시콜산 화합물"은 특히 또한 근본적인 출발 화합물(예를 들면, 콜산 또는 우르소데옥시콜산)의 유도체를 의미한다.
이러한 유도체는 "염", 예를 들면, 화합물의 리튬, 나트륨 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염; 및 암모늄 염을 포함하며, 여기서 암모늄 염은 NH4 + 염 또는 적어도 하나의 수소 원자가 C1-C6-알킬 잔기로 치환될 수 있는 암모늄 염을 포함한다. 대표적인 알킬 잔기는 특히, 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필-, n-, 2급- 또는 3급-부틸, 및 n-펜틸 및 n-헥실과 같은 C1-C4-알킬 잔기 및 이의 단일 또는 다중 측쇄 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 "알킬 에스테르"는 특히 저급 알킬 에스테르, 예를 들면 C1-C6-알킬 에스테르이다. 비제한적인 예로서, 본 발명자들은 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필, n-, 2급- 또는 3급-부틸 에스테르, 또는 장쇄 에스테르, 예를 들면, n-펜틸 및 n-헥실 에스테르 및 이의 단일 또는 다중 측쇄된 유사체를 언급할 수 있다.
"아미드"는 특히, 본 발명에 따른 산과 암모니아 또는 1급 또는 2급 모노아민의 반응 생성물이다. 이러한 아민은 예를 들면, 모노- 또는 디-C1-C6-알킬 모노아민이며, 여기서 알킬 잔기는 서로 독립적으로 예를 들면, 카복실, 하이드록실, 할로겐(F, Cl, Br, I와 같음), 니트로 및 설포네이트 그룹으로 추가로 임의 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 "아실 그룹"은 특히 탄소수가 2 내지 4인 비방향족 그룹, 예를 들면, 아세틸, 프로피오닐 및 부티릴, 및 임의 치환된 단핵 방향족 환을 지닌 방향족 그룹이며, 여기서 적합한 치환체는 예를 들면, 하이드록실, 할로겐(F, Cl, Br, I와 같음), 니트로 및 C1-C6-알킬 그룹, 예를 들면, 벤조일 또는 톨루오일로부터 선택된다.
용어 "생체촉매 과정"은 본 발명에 따른 적어도 하나의 효소의 촉매 활성의 존재하에서 수행된 임의의 과정, 즉, 미가공되거나, 정제되거나, 용해되거나, 분산되거나 고정된 효소의 존재하에서, 또는 이러한 효소 활성을 가지거나 발현하는 전체 미생물 세포의 존재하에서의 과정을 지칭한다. 따라서, 생체촉매 과정은 효소 및 미생물 과정 둘 다를 포함한다.
용어 "입체특이적"은 본 발명에 따라 생산된 화합물의 수개의 가능한 입체이성체 중 하나가 본 발명에 따른 효소의 작용에 의해 적어도 하나의 비대칭 중심을 지니면서 고 "거울상이성체 과량" 또는 고 "거울상이성체 순도" 또는 "입체이성체 순도", 예를 들면, 적어도 90%ee, 특히 적어도 95%ee, 또는 적어도 98%ee, 또는 적어도 99%ee로 생산됨을 의미한다. ee% 값은 다음 식으로부터 계산된다:
ee% = [XA-XB]/[XA+XB]*100,
여기서 XA 및 XB는 거울상이성체 A 및 B 각각의 몰 분율(mole fraction)을 나타낸다.
본 발명에 따라 사용되거나 제조된 하이드록시스테로이드 화합물, 예를 들어, 콜산, 우르소데옥시콜산, 12-케토-케노데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 7-케토-리토콜산은 입체이성체적으로 순수한 형태로 또는 다른 입체이성체와의 혼합물로서 본 발명에 따른 과정에서 사용될 수 있거나 이로부터 수득될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사용되거나 제조된 화합물은 실질적으로 입체이성체적으로 순수한 형태로 사용되거나 단리된다.
다음의 표 A는 구조식, 화학명 및 본 발명의 기술 분야에 대해 관련성 있는 화학 화합물에 대해 사용된 약어를 제공한다.
[표 A]
2. 단백질 또는 효소
2.1 개관
본 발명은 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 단백질 또는 효소(서열 번호: 34, 37 40, 44, 47, 54 및 56과 같은) 또는 이의 돌연변이체에 한정되지 않지만, 오히려 이의 기능성 등가물로 확장된다.
명확하게 개시된 효소의 "기능성 등가물" 또는 동족체는, 본 발명의 맥락에서, 이들과는 상이하지만, 여전히 바람직한 생물학적 활성, 예를 들면, 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 폴리펩타이드이다.
예를 들면, "기능성 등가물"은 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성에 사용된 시험에서, 본원에 정의된 아미노산 서열을 포함하는, 출발 효소의 활성보다 적어도 1%, 예컨대, 적어도 10% 또는 20%, 예컨대, 적언도 50% 또는 75% 또는 90%까지 더 높거나 낮은 활성을 갖는 효소로 이해되어야 한다.
기능성 등가물은 또한 바람직하게는 4 내지 11의 pH 범위에서 안정하며 유리하게는 특히 8.5 내지 9.5와 같이, 6 내지 10의 pH 범위에서의 최적의 pH, 및 15℃ 내지 80℃ 또는 20℃ 내지 70℃, 예를 들면, 약 45 내지 60℃ 또는 약 50 내지 55℃의 범위의 최적 온도를 지닌다.
7β-HSDH 활성은 다양한 공지된 시험을 사용하여 검출할 수 있다. 이에 한정되지 않고, 본 발명자들은 교차-참조된 선행 기술 특허 문헌에 정의된 바와 같거나 실험 단락에서 기술된 바와 같은, 표준 조건 하에서 참고 기질, 예컨대, CA 또는 DHCA 또는 7-KLCA를 사용하는 시험을 언급할 수 있다.
7α-HSDH 활성을 측정하기 위한 시험은 또한 공지되어 있다. 이에 제한되지 않고, 본 발명자들은 실험 단락에서 정의된 바와 같은 표준화된 조건 하에서 참고 기질, 예컨대, CDCA를 사용하는 시험을 언급할 수 있다.
본 발명에 다른 "기능성 등가물"은 또한 특히, "돌연변이체"를 의미하며, 이는 전술한 아미노산 서열의 적어도 하나의 서열 위치 속에 명확하게 기술된 것 이외의 아미노산을 가지지만, 그럼에도 불구하고, 전술한 생물학적 활성 중 하나를 지닌다. 따라서 "기능성 등가물"은 하나 이상, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 첨가, 치환, 결실 및/또는 역위에 의해 수득가능한 돌연변이체를 포함하며, 여기서 기술된 변화는 어떠한 서열 위치에서도 일어날 수 있지만, 단 이들은 본 발명에 따른 특성 프로파일을 지닌 돌연변이체를 유도한다. 기능성 등가는 특히 돌연변이체와 변경되지 않은 폴리펩타이드 사이의 반응성 패턴이 정성적으로 일치하는 경우, 즉, 예를 들면 동일한 기질이 상이한 속도에서 전환되는 경우 또한 수득된다. 적합한 아미노산 치환의 예는 다음 표에 나타나 있다:
상기 의미에서 "기능성 등가물"은 또한 기술된 폴리펩타이드의 "전구체" 및 폴리펩타이드의 "기능성 유도체" 및 "염"이다.
"전구체"는 바람직한 생물학적 활성이 있거나 없는 폴리펩타이드의 천연 또는 합성 전구체이다.
표현 "염"은 본 발명에 따른 단백질 분자의 카복실 그룹의 염 및 아미노 그룹의 산 부가 염 둘 다를 의미한다. 카복실 그룹의 염은 그 자체로 공지된 방식으로 제조할 수 있으며 무기 염, 예를 들면, 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 및 아연 염, 및 유기 염기, 예를 들면, 트리에탄올아민, 아르기닌, 라이신, 피페리딘 등과 같은 아민과의 염을 포함한다. 산 부가 염, 예를 들먼, 염산 또는 황산과 같은 무기 산(mineral acid)과의 염 및 아세트산 및 옥살산과 같은 유기산과의 염이 또한 본 발명의 목적이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "기능성 유도체"는 또한 기능성 아미노산 측 그룹에서 또는 이들의 N- 또는 C-말단 끝에서 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들면, 암모니아와 또는 1급 또는 2급 아민과의 반응에 의해 수득가능한, 카복실산 그룹의 지방족 에스테르, 카복실산 그룹의 아미드; 아실 그룹과의 반응에 의해 제조된, 유리 아미노 그룹의 N-아실 유도체; 또는 아실 그룹과의 반응에 의해 제조된, 유리 하이드록실 그룹의 O-아실 유도체를 포함한다.
"기능성 등가물"은 천연적으로 또한 다른 유기체, 및 천연적으로 존재하는 변이체로부터 수득가능한 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 서열 비교에 의해, 상동성 서열 영역을 찾을 수 있고 등가 효소를 본 발명의 정확인 지시사항을 기반으로 측정할 수 있다.
"기능성 등가물"은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 단편, 바람직하게는 개개 도메인(domian) 또는 서열 모티프(sequence motif)를 포함하며, 이는 예를 들면, 바람직한 생물학적 기능을 가진다.
"기능성 등가물은 또한 상술한 폴리펩타이드 서열 중 하나 또는 이로부터 기원한 기능성 등가물 및 이와는 기능적으로 상이한, 기능성 N- 또는 C-말단 연결로(즉, 융합 단백질 부분의 상호간의 실질적인 기능적 손상없이) 적어도 하나의 추가의 이종 서열을 갖는다. 상기 이종 서열의 비제한적 예는 예컨대, 시그널 펩타이드(signal peptide) His-태그 또는 효소와 같은 히스티딘 앵커(anchor)이다.
본 발명에 따라서 또한 포함되는 "기능성 등가물"은 정확하게 개시된 단백질의 동족체이다. 이들은 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448의 알고리즘에 따라서 계산된, 명확하게 개시된 아미노산 서열 중 하나에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 85%, 예를 들면, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상동성(또는 서열 동일성)을 지닌다. 본 발명에 따른 상동성 폴리펩타이드의 상동성 퍼센트 또는 동일성은 특히, 본원에 명확하게 기술된 아미노산 서열 중 하나의 전체 길이와 관련된 아미노산 잔기의 동일성 퍼센트를 의미한다.
동일성 값의 퍼센트는 또한 BLAST 정렬, blastp(단백질-단백질 BLAST) 알고리즘을 기반으로, 또는 하기 제공된 클러스탈 세팅(Clustal settings)을 사용하여 측정할 수 있다.
가능한 단백질 글리코실화의 경우에, 본 발명에 따른 "기능성 등가물"은 탈글리코실화되거나 글리코실화된 형태 및 글리코실화 패턴을 변경시킴으로써 수득가능한 변형된 형태의 상기 지정된 유형의 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 동족체는 돌연변이유발, 예컨대, 단백질의 점 돌연변이, 신장(lengthening) 또는 단축(shortening)에 의해 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질의 동족체는 돌연변이, 예를 들면, 단축된 돌연변이의 조합 라이브러리(combinational library)를 스크리닝(screening)함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, 단백질 변이체의 다양화된 데이타베이스를 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물의 효소적 연결에 의해, 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발에 의해 생산할 수 있다. 변성된 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 잠재적인 동족체의 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있는 매우 많은 방법이 존재한다. 변성된 유전자 서열의 화학적 합성은 자동화된 DNA 합성기 속에서 수행될 수 있으며, 합성 유전자는 이후 적합한 발현 벡터로 연결될 수 있다. 유전자의 변성된 세트의 사용은 하나의 혼합물 내에서 모든 서열을 제공하는 것을 가능하도록 하며, 이는 잠재적인 단백질 서열의 바람직한 세트를 암호화한다. 변성된 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법은 당해 분야의 기술자에 의해 알려져 있다(예컨대, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
몇가지 기술이 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해 선행 기술에 알려져 있으며, 이는 점 돌연변이 또는 단축에 의해, 및 선택된 특성을 지닌 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 위해 생산되었다. 이들 기술은 본 발명에 따른 동족체의 조합 돌연변이유발에 의해 생산된 유전자 은행의 신속한 스크리닝에 채택될 수 있다. 고-처리량 분석을 기반으로 하는, 거대한 유전자 은행을 스크리닝하기 위해 가장 흔히 사용된 기술은 유전자 은행을 복제가능한 발현 벡터내로 클로닝하고, 적합한 세포를 수득되는 벡터 뱅크로 형질전환하며 조합 유전자를 바람직한 활성의 검출이 이의 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 단리를 촉진하는 조건 하에서 발현시킴을 포함한다. 은행에서 기능성 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술인, 반복된 앙상블 돌연변이유발(Recursive ensemble mutagenesis: (REM)을 스크리닝 시험과 함께 사용하여, 동종체를 확인할 수 있다(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
2.2 특수한 7β-HSDH 효소
2.2.1 야생형 콜린셀라 아에로파시엔스( Collinsella aerofaciens ) 7β-HSDH 및 기능성 등가물
본 발명은 본원에 의해 표현하여 지칭된, 출원인의 국제 특허원 제WO2011/064404호에 기술된 바와 같은 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 7β-HSDH 야생형의 용도를 추가로 포함한다.
콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터 수득가능한 이러한 7β-HSDH는 특히 다음의 특성들 중 적어도 하나의 다른 것, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 또는 모든 이러한 특성을 의해 특징으로 한다:
a) 분자량(SDS-겔 전기영동): 약 28-32 kDa, 특히 약 29 내지 31 kDa 또는 약 30 kDa;
b) 분자량(겔 여과, 특히 SDS가 없는 것과 같은 비변성 조건 속에서): 약 53 내지 60 kDa, 특히 56.1 kDa와 같은, 약 55 내지 57 kDa. 이는 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 7β-HSDH의 이량체 특성을 입증한다;
c) 7-케토-LCA의 7β-하이드록실 그룹으로의 입체선택적 환원;
d) pH 8.5 내지 10.5, 특히 9 내지 10의 범위에서 UDCA의 산화를 위한 최적의 pH;
e) pH 3.5 내지 6.5, 특히 pH 4 내지 6의 범위에서 DHCA 및 7-케토-LCA의 환원을 위한 최적의 pH;
f) 언급된 기질/보조인자 중 적어도 하나에 대한 하기 표로부터의 적어도 하나의 적어도 동적 매개변수(kinetic parameter); 다음의 표에서 각각의 경우에 명확하게 기술된 값의 대략 ±20%, 특히 ±10%, ±5%, ±3%, ±2% 또는 ±1%의 범위내.
a) 매우 낮은 활성으로 인하여 측정 불가
b) 1 U = 1 μmol/min
g) 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus), 호모 사피엔스(Homo sapiens) 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus)를 포함하는, 동물 11β-HSDH 아그룹과 관련된, 콜린셀라 아에로파시엔스 DSM 3979로부터의 원핵세포 7β-HSDH의 계통발생적 서열 유사성.
예를 들면, 이러한 7β-HSDH는 다음의 특성 또는 특성들의 조합을 나타낸다: a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).
이러한 유형 또는 이로부터 기원한 기능성 등가물의 7β-HSDH는 더욱이 다음을 특징으로 한다:
a) 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 입체특이적인 환원, 및/또는
b) 특히 상응하는 3,12-디케토-7β-콜산으로 7-위치에서 데하이드로콜산(DHCA)에 의해 촉매되고, 예컨대, NADPH-의존성인 것과 같은, 7-위치에서 케토 그룹 및 스테로이드 골격에서 적어도 하나의 추가의 케토 그룹의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 위치특이적 하이드록실화.
상기 7β-HSDH는 특히 서열 번호: 54에 따른 아미노산 서열(수탁 번호 제ZP_01773061호) 또는 이러한 서열에 대해 적어도 60%, 예컨대 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90, 예컨대 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%의 동일성 정도를 지닌 이로부터 기원한 서열을 가지며; 임의로 다음의 특성들 중 하나 또는 특성들의 조합을 추가의 특징으로 한다: 상기 정의에 따르는 a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).
2.2.2 특수한 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH 돌연변이체
본 발명은 본원에 참고로 표현하여 지칭된, 제WO2012/080504호, 제WO2015/197698호 및 제WO2016/016213호에 기술된 바와 같은, 콜린셀라 아에로파시엔스 ATCC 25986으로부터의 7β-HSDH 야생형의 돌연변이체의 용도를 추가로 포함한다.
[표 B]
7ß-HSDH 단일 및 다중 돌연변이체
WT = 야생형; S = 단일; D = 2중; T = 3중; Q = 4중.
상기 언급된 예는 또한 C- 및/또는 N-말단으로 연장된, 특히 His-태그 서열에 의해, 보다 특히 헥사-His-태그 서열에 의해 연장된 변이체를 포함한다.
상기 돌연변이체들 중 어느 것도 다음의 위치 K44, R53, K61, R64 중 어느 것에서 추가로 돌연변이될 수 있다.
2.2.3 추가의 7ß-HSDH
본 발명은 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus)로부터의 7β-HSDH 야생형 및 돌연변이체, 특히 본원에 표현하여 지칭된 제CN105274070호 하에 공개된 중국 특허원에 기술된 바와 같은, 이의 NADP+ 의존성 돌연변이체의 용도를 추가로 포함한다.
3. 핵산 및 작제물
3.1 핵산
본 발명은 또한 7β-HSDH 또는 7α-HSDH 활성을 지닌 효소를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 정확한 서열에 대해 명시된 정도의 동일성을 지닌 핵산에 관한 것이다.
2개의 핵산 사이의 "동일성"은 각각의 경우에 전체 핵산 길이에 걸쳐 뉴클레오타이드의 동일성, 특히 다음의 매개변수를 설정하는 클러스터 방법(Clustal method)(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2): 151-1)을 사용하는 Informax 사(USA)의 Vector NTI Suite 7.1 소프트웨어의 수단에 의한 비교로 계산된 동일성을 의미한다:
다수의 정렬 매개변수:
갭 개방 패널티(Gap opening penalty) 10
갭 연장 패널티(Gap extension penalty) 10
갭 분리 패널티 범위(Gap separation penalty range) 8
갭 분리 패널티 없음
정렬 지연에 대한 동일성 % 40
잔기 특이적인 갭 없음
친수성 잔기 갭 없음
전이 가중치(trasition weighting) 0
쌍식 정렬(pairwise alignment) 매개변수:
FAST 알고리즘 작동
K-튜플 크기(tuple size) 1
갭 패널티 3
윈도우 크기(Window size) 5
가장 우수한 사선의 수 5
대안으로서, 동일성은 또한 Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500에 따라, 인터넷 주소: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#에 따라 및 다음의 매개변수를 사용하여 측정할 수 있다:
DNA 갭 개방 패널티 15.0
DNA 갭 연장 패널티 6.66
DNA 매트릭스 동일
단백질 갭 개방 패널티 10.0
단백질 갭 연장 패널티 0.2
단백질 매트릭스 Gonnet
단백질/DNA ENDGAP -1
단백질/DNA GAPDIST 4
본원에 언급된 모든 핵산 서열(단일- 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들면, cDNA 및 mRNA)은 예를 들면, 개개 오버랩핑(overlapping), 이중 나선의 상보성 핵산 빌딩 블록(building block)에 의해 뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 화학적 합성에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 예를 들면 포스포로아미디트 방법(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)에 의해 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오타이드의 첨가 및 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편(Klenow fragment) 및 일반적인 클로닝 기술을 사용한 갭의 충전은 Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 예를 들면, 인공 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 접근가능한, 상기 폴리펩타이드 및 이의 기능성 등가물 중 하나를 암호화하는 핵산 서열(단일- 및 이중-가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들면, cDNA 및 mRNA)에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 이의 생물학적으로 활성인 분절(segment), 및 예를 들면, 본 발명에 따른 핵산을 암호화핵산의 확인 및 증폭을 위한 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 핵산 단편 둘 다에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 더욱이 암호화 유전자 영역의 3'- 및/또는 5'-말단으로부터의 해독되지 않은 서열을 함유할 수 있다.
본 발명은 명확하게 기술된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 분절에 대해 상보성인 핵산 분자를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 다른 세포형 및 유기체 내에서 상동성 서열의 확인 및/또는 클로닝에 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 생산하는 것을 가능하도록 한다. 이러한 프로브 또는 프라이머는 일반적으로 뉴클레오타이드 서열 영역을 포함하며, 이는 "엄격한(stringent)" 조건(하기 참고) 하에서 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥(sense strand) 또는 상응하는 안티센스 가닥(antisense strand)의 적어도 적어도 약 12, 바람직하게는 적어도 약 25, 예를 들면 약 40, 50 또는 75개의 연속된 뉴클레오타이드에 하이브리드화한다.
"단리된(isolated)" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원 속에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되며 더욱이 재조합 기술에 의해 생산되는 경우, 다른 세포 물질 또는 배양 배지로부터 필수적으로 유리될 수 있거나, 화학적으로 합성되는 경우, 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 유리될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 분자 생물학의 표준 기술 및 본 발명에 따라 제공된 서열 정보를 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들면, cDNA는 하이브리드화 프로브로서 명확하게 개시된 완전한 서열 중 하나 또는 이의 분절 및 표준 하이브리드화 기술(예를 들면, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 사용하여, 적합한 cDNA 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 더욱이, 개시된 서열 들 중 하나 또는 이의 분절을 포함하는 핵산 분자는 이러한 서열을 기반으로 제조된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 단리할 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적합한 벡터내로 클로닝하고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 또한 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 표준 합성 기술로 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 유도체, 이들 서열의 동족체 또는 부분은 예를 들면 일반적인 하이브리드화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여 다른 세균으로부터 예컨대, 게놈성 또는 cDNA 라이브러리를 통해 단리할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 본 발명에 따르는 서열에 대하여 표준 조건 하에서 하이브리드화한다.
"하이브리드하다"는 표준 조건 하에서 거의 상보성인 서열에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 능력을 의미하는 반면, 이러한 조건하에서 비특이적 결합은 비상보성 파트너들 사이에 발생하지 않는다. 이를 위하여, 서열은 90 내지 100%까지 상보성일 수 있다. 다른 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 서열의 특성은 예를 들면, 노던(Northern) 또는 서던(Southern) 블롯팅에서 또는 PCR 또는 RT-PCR에서 프라이머 결합에서 이용된다.
유리하게는, 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화에 사용한다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산의 보다 긴 단편 또는 하이브리드화를 위한 완전한 서열을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이들 표준 조건은 사용된 핵산(올리고뉴클레오타이드, 보다 긴 단편 또는 완전한 서열)에 의존하여 또는 하이브리드화에 사용된 핵산, DNA 또는 RNA의 유형에 의존하여 변한다. 따라서, 예를 들면, DNA:DNA 하이브리드에 대한 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 것보다 대략 10℃ 더 낮다.
표준 조건은 예를 들면, 핵산에 따라, 0.1 내지 5 x SSC(1 X SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2)의 농도를 지닌 수성 완충액 용액 또는 추가로 예를 들면 5 x SSC, 50% 포름아미드 속에서 42℃와 같은 50% 포름아미드의 존재하에서 42 내지 58℃ 사이의 온도를 의미한다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드에 대한 하이브리드화 조건은 0.1 x SSC 및 약 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃ 사이의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드의 경우, 하이브리드화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 약 30℃ 내지 55℃의 온도, 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도이다. 하이브리드화를 위해 기술된 이러한 온도는 예를 들면, 길이가 대략 100개의 뉴클레오타이드이고 포름아미드의 존재하에서 G + C 함량이 50%인 핵산에 대해 계산된 융점 값이다. DNA 하이브리드화를 위한 실험 조건은 관련 유전학 교재, 예를 들면, Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989에 기술되어 있으며, 예를 들면, 핵산의 길이, 하이브리드의 유형 또는 G + C 함량에 따라 당해 분야의 기술자에게 공지된 식으로부터 계산할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 다음의 교재로부터 하이브리드하에 대한 추가의 정보를 찾을 수 있다: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
"하이브리드화"는 특히 엄격한 조건 하에서 일어날 수 있다. 이러한 하이브리드화 조건은 예를 들면, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에 기술되어 있다.
"엄격한" 하이브리드화 조건은 특히 다음과 같이 이해된다: 50% 포름아미드, 5 x SSC(750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH7.6), 5x 덴하르트 용액(Denhardt solution), 10% 덱스트란 설페이트 및 20 g/ml 변성된, 전단된(sheared) 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 속에서 밤새 42℃에서 항온처리한 후, 65℃에서 0.1x SSC를 사용한 여과기 세척 단계.
본 발명은 또한 명확하게 개시되거나 유도가능한 핵산 서열의 유도체에 관한 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 추가의 핵산 서열은 예컨대, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55로부터 기원할 수 있으며 개개 또는 수개의 뉴클레오타이드의 첨가, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들과는 상이하지만, 또한 바람직한 특성 프로파일을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명은 또한 소위 사일런트 돌연변이(silent mutation)를 포함하거나 명확하게 기술된 서열과 비교하여 구체적인 원래의 또는 숙주 유기체의 코돈 사용에 상응하게 변경된 핵산 서열 뿐만 아니라, 천연적으로 존재하는 변이체, 예를 들면, 이의 스플라이스 변이체(splice variant) 또는 대립형질 변이체를 포괄한다.
본 발명은 또한 보전성 뉴클레오타이드 치환에 의해 수득가능한 서열(즉, 문제의 아미노산은 동일한 전하, 크기, 극성 및/또는 가용성의 아미노산으로 대체된다)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 명확하게 개시된 핵산으로부터 서열 다형성에 의해 기원한 분자에 관한 것이다. 이들 유전적 다형성은 천연적인 변이로 인하여 집단 내에서 개체 사이에 존재할 수 있다. 이들 천연 변이체는 일반적으로 유전자의 뉴클레오타이드 서열 내에 약 1 내지 5%의 가변성을 가져온다.
서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55의 서열을 지닌 본 발명에 따른 핵산 서열의 유도체는 예를 들면, 전체 서열 영역에 걸쳐 유도된 아미노산 수준에서 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 매우 특히 바람직하게는 적어도 90% 상동성(아미노산 수준에서의 상동성과 관련하여, 폴리펩타이드에 대한 상기 정보에 관해 참고할 수 있다)을 갖는 대립형질 변이체를 의미한다. 상동성은 유리하게는 서열의 부분 영역에서 더 높을 수 있다.
또한, 유도체는 또한 본 발명에 따른 핵산 서열, 특히 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55, 예를 들면 진균 또는 세균 동족체, 단축된 서열, 암호화 및 비암호화 DNA 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA로서 이해되어야 한다. 예를 들어, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55에 대한 동족체는 DNA 수준에서, 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55에 제공된 전체 DNA 영역에 걸쳐 적어도 40%의 상동성, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 매우 특히 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 지닌다.
또한, 유도체는 예를 들면, 프로모터를 지닌 융합체로서 이해되어야 한다. 기술된 뉴클레오타이드 서열 앞에 있는 프로모터는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 교환, 적어도 하나의 삽입, 역위 및/또는 결실에 의해 변경될 수 있지만, 프로모터의 기능성 또는 효능이 손상되지 않는다. 더욱이, 프로모터의 효능은 이들의 서열을 변경시킴으로써 증가시킬 수 있거나 이들은 심지어 상이한 종의 유기체의 보다 효과적인 프로모터로 완전히 교환될 수 있다.
또한, 기능성 돌연변이체를 생산하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다.
사용된 기술에 따라서, 당해 분야의 기술자는 유전자에 완전한 무작위 또는 심지어 보다 표적화된 돌연변이 또는 또한 비암호화 핵산 영역(이는 예를 들면, 발현의 조절을 위해 중요하다)을 삽입할 수 있으며 이후 유전자 은행을 제조할 수 있다. 이에 필요한 분자생물학의 방법은 당해 분야의 기술자에 의해 공지되어 있으며 예를 들면 Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001에 기술되어 있다.
유전자를 변형시킴으로써 이들이 암호화하는 단백질을 변형시키기위한 방법은 예를 들면 다음과 같이 당해 분야의 기술자에게 오랫동안 익숙해 왔다:
- 유전자의 개별 또는 수개의 뉴클레오타이드이 표적화된 교환을 제공하는 부위-지시된 돌연변이유발(Trower MK (Publ.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),
- 특정의 아미노산에 대한 코돈이 교환될 수 있거나 유전자의 임의의 부위에 첨가된 포화 돌연변이유발(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valc
- 뉴클레오타이드 서열이 부정확하게 기능하는 DNA 폴리머라제에 의해 돌연변이된 에러-프론 폴리머라제 연쇄 반응(error-prone polymerase chain reaction)(에러-프론 PCR)(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18: 3739);
- 예를 들면, 결핍성 DNA-복구 메카니즘 덕분에, 뉴클레오타이드 서열의 증가된 돌연변이율이 존재하는 돌연변이체 균주내 유전자의 계대배양(passaging)(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Publ.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), 또는
- 밀접하게 관련된 유전자의 혼주물(pool)이 형성되어 소화되고 단편이 폴리머라제 연쇄 반응에 대한 주형(template)으로서 사용되며, 여기서 반복된 가닥 분리 및 이들의 다시 합침을 통해, 최종적으로 전체 길이의 모자이크 유전자(mosaic gene)가 생산되는 DNA 셔플링(suffling)(Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747).
소위 지시된 진화(특히 Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200: 31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Publ.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology에 기술됨)를 사용하여, 당해 분야의 기술자는 표적화된 방식으로 및 대규모로 기능성 돌연변이체를 생산할 수 있다. 제1 단계에서, 각각의 단백질의 첫번째 유전자 뱅크를 예를 들면, 상기 제공된 방법을 사용하여 생산한다. 유전자 뱅크는 적합한 방식, 예를 들면, 세균 또는 파아지-디스플레이 시스템에 의해 발현시킨다.
바람직한 특성에 크게 상응하는 특성을 지닌 기능성 돌연변이체를 발현하는 숙주 유기체의 관련 유전자를 다른 돌연변이 라운드에 적용할 수 있다. 돌연변이 및 선택 또는 스크리닝 단계를 기능성 돌연변이체가 충분한 정도까지 바람직한 특성을 가질 때까지 교호적으로 반복할 수 있다. 이러한 교호적인 공정을 사용하여 제한된 수의 돌연변이, 예를 들면 1 내지 5회의 돌연변이를 단계별로 수행할 수 있으며 관련된 효소 특성에 있어서 이들의 영향을 평가하고 선택할 수 있다. 이후에, 선택된 돌연변이체를 동일한 방식으로 다른 돌연변이 단계에 제공할 수 있다. 그 결과, 시험할 다수의 개개 돌연변이체가 유의적으로 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 결과는 문제의 효소의 구조 및 서열과 관련하여 중요한 정보를 제공하며, 이는 바람직한 변형된 특성을 지닌 추가의 효소의 표적화된 생성에 필수적이다. 특히, 소위 "핫 스폿(hot spot)", 즉, 표적화된 돌연변이를 도입함으로써 효소 특성을 변형시키기에 잠재적으로 적합한 서열 분절을 정의할 수 있다.
3.2 작제물
본 발명은 또한 조절성 핵산 서열의 유전적 제어 하에서 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 작제물; 및 적어도 하나의 이들 발현 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"발현 단위"는 본 발명에 따라서, 발현 활성을 지닌 핵산을 의미하며, 이는 본원에 정의한 바와 같은 프로모터를 포함하고, 발현될 핵산 또는 유전자와의 기능적 연결후, 발현, 즉, 이러한 핵산 또는 이러한 유전자의 전사 및 해독을 조절한다. 따라서, 용어 "조절성 핵산 서열"이 또한 이러한 맥락에 사용된다. 프로모터 이외에, 다른 조절성 성분, 예를 들면, 인핸서(enhancer)가 존재할 수 있다.
"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 본 발명에 따라서, 발현될 핵산 또는 발현될 유전자에 기능적으로 연결되는 발현 단위를 의미한다. 발현 단위와는 대조적으로,발현 카세트는 따라서 전사 및 해독을 조절하는 핵산 서열 뿐만 아니라, 전사 및 해독의 결과로서 단백질로서 발현되어야 하는 핵산 서열도 포함한다.
용어 "발현" 또는 "과발현"은 본 발명의 맥락에서, 미생물 속에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 생산 또는 증가를 설명하며, 이는 상응하는 DNA에 의해 암호화된다. 이를 위해, 예를 들면, 유전자는 유기체 내에 삽입될 수 있고, 존재하는 유전자가 다른 유전자로 대체될 수 있므며, 유전자 또는 유전자들의 카피 수가 증가될 수 있고, 강력한 프로모터가 사용될 수 있거나, 고 활성을 지닌 상응하는 효소를 암호화하는 유전자가 사용될 수 있고, 이러한 척도는 임의로 조합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 작제물은 각각의 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결된, 각각의 암호화 서열의 프로모터 5'-상부 스트림 및 3'-하부 스트림 터미네이터 서열 및 임의로 추가의 일반적인 조절 성분을 포함한다.
"프로모터", "프로모터 활성을 지닌 핵산" 또는 "프로모터 서열"은 본 발명에 따라서, 전사될 핵산과의 기능적 연결이 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.
"기능적" 또는 "작동적" 연결은 이러한 맥락에서, 예를 들면 프로모터 활성을 지닌 핵산들 중 하나 및 전사될 핵산 서열 및 임의로 추가의 조절 성분, 예를 들면, 핵산의 전사를 보증하는 핵산 서열, 및 예를 들면 터미네이터가, 이들 조절 성분 각각이 핵산 서열의 전사 내에서 이의 기능을 충족할 수 있는 방식으로 있는, 순차적인 정렬을 의미한다. 이는 필수적으로 화학적 의미에서 직접 연결을 필요로 하지 않는다. 유전적 조절 서열, 예를 들어, 인핸서 서열은 심지어 보다 먼 위치로부터 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터 표적 서열에서 이들의 기능을 발휘할 수 있다. 전사될 핵산 서열이 프로모터 서열의 뒤(즉, 3'-말단에) 위치함으로써, 2개의 서열이 서로 공유결합으로 연결된 정렬이 바람직하다. 전이유전자 발현을 겪어야 하는 핵산 서열과 프로모터 서열 사이의 거리는 200개 미만의 염기쌍, 또는 100개 미만의 염기쌍 또는 50개 미만의 염기쌍일 수 있다.
프로모터 및 터미네이터 외에도, 언급될 수 있는 다른 조절 성분의 예는 표적화 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 선택가능한 마커, 증폭 시그널, 복제 오리진(replication origin) 등이다. 적합한 조절 서열은 예를 들면, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 특히 서열 번호: 33, 36, 39, 43, 46, 49, 53 또는 55의 서열 또는 이의 유도체 및 동족체, 및 이로부터 유도될 수 있는 핵산 서열을 포함하며, 이는 유리하게는 유전자 발현을 조절하기 위한, 예컨대, 증가시키기 위한 하나 이상의 조절 시그널과 작동적으로 또는 기능적으로 연결될 수 있다.
이러한 조절 서열 외에도, 이러한 서열의 천연 조절은 실제 구조 유전자 앞에 여전히 존재할 수 있으며 임의로 유전적으로 변형됨으로써, 천연 조절이 스위치 오프(switch off)되어 유전자의 발현이 증가될 수 있다. 그러나, 핵산 작제물은 또한 보다 단순한 작제일 수 있는데, 즉, 추가의 조절 시그널이 암호화 서열 앞에 삽입되지 않고 이의 조절을 지닌 천연 프로모터는 제거되지 않았다. 대신에, 조절 서열은 돌연변이됨으로써 조절이 더 이상 일어나지 않고 유전자 발현이 증가한다.
바람직한 핵산 작제물은 유리하게는 또한 프로모터에 기능적으로 연결된, 전술한 "인핸서" 서열 중 하나 이상을 함유하며, 이는 핵산 서열의 증가된 발현이 가능하도록 한다. 추가의 조절 성분 또는 터미네이터와 같은, 추가의 유리한 서열을 또한 DNA 서열의 3'-말단에 삽입할 수 있다. 작제물은 본 발명에 따른 핵산 하나 이상의 카피를 함유할 수 있다. 작제물은 또한 임의로 작제물의 선택을 위한, 항생제 내성 또는 영양요구성 상보성 유전자와 같은 추가의 마커를 함유할 수 있다.
적합한 조절 서열의 예가 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq-, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD)SP6, 람다-PR 또는 람다-PL 프로모터와 같은 프로모터 속에 함유되며, 이는 유리하게는 그람-음성 세균에서 적용된다. 또한 유리한 조절 서열이 예를 들면, 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2 속에, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH 속에 함유된다. 인공 프로모터 또한 조절에 사용될 수 있다.
숙주 유기체 내에서 발현을 위해, 핵산 작제물을 유리하게는 벡터, 예를 들면 플라스미드 또는 파아지 내로 삽입하며, 이는 숙주 내에서 유전자가 가능한 최적으로 발현하도록 한다. 플라스미드 및 파아지와는 별도로, 벡터는 또한 당해 분야의 기술자에 의해 공지된 모든 다른 벡터, 예컨대 SV40, CMV, 바쿨로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포손(transposon), IS 성분, 플라스미드, 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA와 같은 바이러스로 이해되어야 한다. 이러한 벡터는 숙주 유기체 내에서 자율적으로 복제될 수 있거나 염색체적으로 복제될 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 다른 구조를 나타낸다.
적합한 플라스미드는 예를 들면 이. 콜라이 내의 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스 내의 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스 내의 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 내의 pSA77 또는 pAJ667, 진균 내의 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모 내의 2알파M, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물 내의 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이다. 전술한 플라스미드는 가능한 플라스미드의 작은 선택을 나타낸다. 추가의 플라스미드는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 교재 Cloning Vectors (eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)에서 찾을 수 있다.
벡터의 다른 구조에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터가 또한 선형 DNA의 형태로 미생물 내에 삽입될 수 있으며 이종 또는 동종 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈내로 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터 또는 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 핵산 만으로 이루어질 수 있다.
유기체 내에서 이종 유전자의 최적의 발현을 위해, 유기체 내에서 사용된 특이적인 "코돈 사용"에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 유리하다. "코돈 사용"은 문제의 유기체의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 평가를 기반으로 용이하게 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 적합한 프로모터의 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열 및 터미네이터 또는 폴리아데닐화 시그널의 융합에 의해 제조된다. 이를 위해, 예를 들면 T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)에 기술된 바와 같은, 일반적인 재조합 및 클로닝 기술이 사용될 수 있다.
적합한 숙주 유기체 내에서 발현을 위해, 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물은 숙주-특이적인 벡터내로 유리하게 삽입되며, 이는 숙주 내에서 유전자의 최적의 발현이 가능하도록 한다. 벡터는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며 예를 들면 "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Publ., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)에서 찾을 수 있다.
4. 미생물
문맥에 따라서, 용어 "미생물"은 출발(야생형) 미생물 또는 유전적으로 변형된 재조합 미생물, 또는 둘 다를 의미한다.
본 발명에 따른 벡터를 사용하여, 재조합 미생물을 생산할 수 있으며, 이는 예를 들면 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환시키고 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 유리하게는, 상기 기술된 본 발명에 따른 재조합체 작제물은 적합한 숙주 시스템내로 도입되어 발현된다. 바람직하게는, 당해 분야의 기술자에게 공지된 일반적인 클로닝 및 형질감염 방법, 예를 들면, 동시침전, 원형질체 융합, 전기천공, 레트로바이러스 형질감염 등을 사용하여 각각의 발현 시스템 내에서 기술된 핵산을 발현시킬 수 있다. 적합한 시스템은 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기술되어 있다. 단백질의 이종 발현을 위한 세균 발현 시스템의 고찰은 예를 들면, Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222에 의해 제공된다.
원칙적으로, 모든 원핵 및 진핵 유기체가 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산 작제물을 위한 재조합 숙주 유기체로서 고려될 수 있다. 유리하게는, 세균, 진균 또는 효모와 같은 미생물을 숙주 유기체로서 사용한다. 유리하게는, 그람-양성 또는 그람-음성 세균, 바람직하게는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae) 또는 노카르디아세아에(Nocardiaceae) 과(family)의 세균, 특히 바람직하게는 에스케리키아, 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 노카르디아, 부르콜데리아, 살모넬라, 아그로박테리움, 클로스트리디움 또는 로도코쿠스 속(genus)의 세균이 사용된다. 에스케리키아 콜라이 속 및 종이 매우 특히 바람직하다. 추가로 유리한 세균은 더욱이 알파-프로테오박테리아, 베타-프로테오박테리아 또는 그람-프로테오박테리아의 그룹에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 숙주 유기체들은 바람직하게는 상기 정의에 따른 7β-HSDH 활성을 지닌 효소를 암호화하는, 본 발명에 기술된 핵산 서열, 핵산 작제물 또는 벡터 중 적어도 하나를 함유한다.
본 발명에 따른 과정에 사용된 유기체는 숙주 유기체에 의존하여, 당해 분야의 기술자에 의해 공지된 방식으로 성장하거나 배양된다. 미생물은 일반적으로 액체 배지 속에서 성장하며, 이는 일반적으로 당의 형태인 탄소원(carbon source), 효모 추출물과 같은 유기 질소원 또는 황산암모늄과 같은 염 형태의 질소원, 철, 망간, 마그네슘 염과 같은 미량 원소 및 임의로 비타민을 함유하는 액체 배지 속에서 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃의 온도에서 산소 통기 하에 성장시킨다. 액체 영양 배지의 pH는 고정된 값으로 유지시킬 수 있는데, 즉, 이것이 성장하는 동안 이를 조절하거나 조절하지 않을 수 있다. 배양은 배치식, 반-배치식 또는 연속식일 수 있다. 영양물은 발효 시작시에 공급될 수 있거나 반연속적으로 또는 연속적으로 보충될 수 있다.
5. 효소 및 돌연변이체의 재조합체 생산
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능성의, 생물학적으로 활성인 단편의 재조합적 생산 방법에 관한 것이며, 여기서, 폴리펩타이드-생산 미생물이 배양되고, 임의로, 폴리펩타이드의 발현이 유도되며 후자는 배양물로부터 단리된다. 폴리펩타이드는 또한 이것이 바람직한 경우, 이러한 방식으로 산업적 규모로 생산될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 미생물은 배치식 방법(배치식 배양)에서 또는 공급 배치식 또는 반복된 공급 배치식 방법에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 크미엘(Chmiel)의 교재(Bioprozeßtechnik 1. Einf
사용될 배양 배지는 각각의 균주의 요건을 적합하게 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 기술은 매뉴얼 "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 제공된다.
본 발명에 따라 이용가능한 이들 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 및/또는 미량 성분을 포함한다.
바람직한 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 우수한 탄소원은 예를 들면 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 갈락토즈, 리보스, 소르보즈, 리불로즈, 락토즈, 말토즈, 슈크로즈, 라피노즈, 전분 또는 셀룰로즈이다. 당은 또한 당밀과 같은 복합체 화합물, 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지로 첨가될 수 있다. 또한 다양한 탄소원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소원은 대두 오일, 해바라기씨 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일, 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산과 같은 지방산과 같은 오일 및 지방, 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이들 화합물을 함유하는 물질이다. 질소원의 예는 암모니아 가스 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄 염, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 옥수수-대 액(corn-steep liquor), 대두분(soybean flour), 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 및 기타 물질과 같은 복합체 질소원을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
배지 속에 함유될 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 인 또는 설페이트 염을 포함한다.
사용된 황 공급원은 설페이트, 설파이트, 디티오니트, 테트라티오네이트, 티오설페이트, 설파이드와 같은 무기 황 화합물일 수 있으나 또한 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물일 수 있다.
사용된 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염일 수 있다.
킬레이팅제(chelating agent)를 배지에 가하여 용액 속에서 금속 이온을 유지시킬 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 카테콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디하이드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기 산을 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 발효 배지는 대개 또한 비타민 또는 성장 프로모터와 같은 다른 성장 인자를 함유하며, 이는 예를 들면 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 흔히 효모 추출물, 당밀, 옥수수-대 액 등과 같은 배지의 복합 성분으로부터 기원한다. 더욱이, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 배지 속의 화합물의 정확한 조성은 특수한 실험에 크게 의존하며 각각의 구체적인 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교재 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)에서 찾을 수 있다. 성장 배지는 또한 Standard 1(Merck) 또는 BHI(뇌 심장 주입액, DIFCO) 등과 같이, 상업적 공급업자로부터 입수할 수 있다.
배지의 모든 성분은 열(1.5 바아 및 121℃에서 20분)로 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 성분은 필요할 경우 함께 멸균시키거나 별도로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작시 존재할 수 있거나 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가할 수 있다.
배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며 실험 동안 일정하게 유지되거나 변할 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있다. 배양물 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 첨가함으로서 배양 동안 조절할 수 있다. 거품을 조절하기 위하여, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제(antifoaming agent)를 사용하는 것도 가능하다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 항생제와 같은, 적합한 선택적으로 작용하는 물질을 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 주위 공기와 같은 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 공급한다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 최대의 목적한 생성물이 형성될 때까지 지속한다. 이러한 목표는 일반적으로 10 시간 내지 160 시간 내에 도달한다.
발효 브로쓰(broth)를 이후에 추가로 진행한다. 요건에 따라서, 생물량(biomass)을 발효 브로쓰로부터 원심분리, 여과, 경사단리 또는 이들 방법의 조합에 의해 완전히 또는 부분적으로 제거하거나 이를 완전히 둘 수 있다.
폴리펩타이드가 배양 배지내로 분비되지 않는 경우, 세포를 또한 파괴하여 생성물을 단백질 단리의 공지된 방법으로 용해물로부터 수득할 수 있다. 세포는 임의로 고-주파 초음파를 사용하여, 고압에 의해, 예를 들면, 프렌치 프레스(French press)에 의해, 삼투압에 의해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화기를 사용하거나, 나열된 수개의 방법의 조합에 의해 파괴할 수 있다.
폴리펩타이드는 Q-세파로즈 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피와 같은, 분자 체(molecular seive) 크로마토그래피(겔 여과)와 같은, 공지된 크로마토그래피, 및 한외여과, 결정화, 염석(salting-out), 투석 및 천연 겔 전기영동과 같은 다른 일반적인 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들면 Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Methods of Biochemical Processing], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin에 기술되어 있다.
재조합 단백질을 단리하기 위하여, 정의된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 cDNA를 신장시킴으로서 변형된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 유리할 수 있으며, 이는 예를 들면 보다 용이한 정제를 위해 제공된다. 이러한 유형의 적합한 변형은 예를 들면 앵커(anchor)로서 소위 "태그" 기능화, 예를 들면 헥사-히스티딘 앵커로서 공지된 변형, 또는 항체에 의해 항원으로서 인지될 수 있는 에피토프(epitope)(예를 들면, Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press에 기술됨)이다. 이들 앵커는 단백질을 고체 담체, 예를 들면 중합체 매트릭스에 부착시키기 위해 제공될 수 있으며, 이는 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼 속에 패킹(packing)될 수 있거나, 미세역가 플레이트 또는 일부 다른 지지체 상에서 사용될 수 있다.
동시에, 이들 앵커는 또한 단백질을 인식하는데 사용될 수 있다. 단백질의 인식을 위해, 또한 기질과의 반응 후 검출가능한 반응 생성물을 형성하는, 형광성 염료, 효소 마커와 같은 일반적인 마커, 또는 방사활성 마커를 단독으로 또는 단백질의 유도체화를 위한 앵커와 함께 사용할 수 있다.
6. 효소 고정화
본원에 기술된 방법에서, 본 발명에 따른 효소는 유리되거나 고정화될 수 있다. 고정화된 효소는 불활성 지지체에 고정된 효소로 이해되어야 한다. 적합한 지지체 물질 및 이에 고정된 효소는 제EP-A-1149849호, 제EP-A-1 069 183호 및 제DE-OS 100193773호로부터 및 이에 인용된 참고 문헌으로부터 공지되어 있다. 이와 관련하여, 모든 참고가 이들 문서의 개시내용에 대해 이루어진다. 적합한 지지체 물질은 예를 들면 점토, 카올리나이트(kaolinite)와 같은 점토 광물, 규조토, 진주암, 이산화규소, 산화알루미늄, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 셀룰로즈 분말, 음이온 교환체 물질, 합성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 아크릴 수지, 페놀-포름아미드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌을 포함한다. 지지된 효소를 제조하기 위하여, 지지체 물질은 일반적으로 미분된, 입상체 형태(particlulate form)로 사용되며, 다공성 형태가 바람직하다. 지지체 물질의 입자 크기는 일반적으로 5 mm 이하이며, 특히 2 mm(입자-크기 분포 곡선)이다. 유사하게, 전체-세포 촉매로서 데하이드로게나제를 사용하는 경우, 유리 또는 고정된 형태를 선택할 수 있다. 지지체 물질은 예를 들면 Ca-알기네이트 및 카라기난이다. 세포 뿐만 아니라 효소도 또한 글루타르알데하이드와 직접 가교결합될 수 있다(CLEA에 대한 가교결합). 상응하는 및 추가의 고정화 방법은 예를 들면 J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" and in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim에 기술되어 있다.
이제, 본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명될 것이다.
실험 부분
달리 기술하지 않는 한, 본 발명의 맥락에서 수행된 클로닝 단계, 예를 들어, 제한 절단, 아가로즈 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 핵산의 니트로셀룰로즈 및 나일론 막으로의 전달, DNA 단편의 연결, 미생물의 형질전환, 미생물의 배양, 파아지의 증식 및 재조합 DNA의 서열 분석은 달리 기술되지 않는 경우, 예를 들면, Sambrook et al. (1989)(상기 참고)에 기술된 바와 같이, 잘 공지된 기술을 적용함으로써 수행된다.
실시예 I:
클로스트리디움 디피실레로부터의 신규한 NADP-의존성 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제, 이의 돌연변이체, 특히 보조인자 스위치 돌연변이체의 클로닝, 발현, 및 생화학적 특성화, 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용
당해 실시예에서, 씨. 디피실레(DSM 12056)로부터의 신규한 7α-HSDH를 성공적으로 클로닝하고, 발현시키며, 정제하고, 생화학적으로 특성화하였다. 모든 공지된 7α-HSDH와는 달리, 이러한 효소는 담즙산에 대한 기질 억제를 나타내지 않는다. 이러한 Cd7α-HSDH는 추정된 스테로이드 옥시도리덕타제로서 주석이 달려 있으며 이. 콜라이 (NAD+-의존성)로부터 7α-HSDH의 단백질 서열에 대해 30% 상동성(N. Tanaka, T. Nonaka, T. Tanabe, T. Yoshimoto, D. Tsuru, Y. Mitsui, Crystal structures of the binary and ternary complexes of 7α-hydorxysteroid dehydrogenase from Escherichia coli., J. Am. Chem. Soc. 35 (1996) 7715-30. doi:10.1021/bi951904d)을 나타내었고, 씨. 소르델리이(C. sordellii)(NADP+-의존성)로부터의 7α-HSDH에 대해 55% 상동성(J. Coleman, L. Hudson, M. Adams, Characterization and regulation of the NADP-linked 7alpha-hydorxysteroid Dehydrogenase gene from Clostridium sordellii., J. Bacteriol. 176 (1994) 4865-74)을 나타내었다. 7-KLCA의 생체전환의 HPLC-분석은 클로닝된 효소가 담즙산의 7α-하이드록시 그룹으로 가역성의, 입체특이적인 환원을 촉매함을 확인하였다.
1. 물질 및 방법
1.1 화학물질
달리 명시하지 않는 한, 모든 화학물질은 Sigma Aldrich 또는 Carl Roth로부터 구입하였다. 담즙산은 PharmaZell GmbH(독일, 라우블링 소재)로부터 구입하였다. 단백질 정제를 위한 Ni-NTA는 MCLAB(네덜란드 니마겐 소재)로부터, Sephadex G 25는 GE Healthcare로부터의 것을 사용하였다. 원심단리는 원심단리 RC5BPlus, Mikro22 및 Rotina 35 R(Thermo Scientific, 독일 드리이흐 소재)를 사용하여 수행하였다. 분석 방법을 위해 HPLC-컬럼은 Merck(독일 아름슈타트 소재)로부터 구입하였다. 제한 효소는 Thermo Scientific(독일 드라이라이히 소재)로부터 구입하였다.
1.2 분자 클로닝
7α-hsdh 유전자(Genbank: YP_001086529.1)는 표준 PCR-기술을 통해 도이치 삼믈릉 폰 미크로오르가니지멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorgansimen und Zellkulturen)(DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재)에 의해 제공된 클로스트리디움 디피실레(DSM 12056)로부터의 게놈 DNA로부터 수득하였다. 다음의 클로닝 단계를 위해 제한 효소 NdeI 및 NotI에 대한 인식 부위를 지닌 프라이머를 증폭을 위해 사용하였다(전방: 5'-CCGCCGCAT ATG GAAAAATTACAAGGAAAAATT-3' 서열 번호: 1 및 역방: 5'-CGCCTAGCGGCCGC TTATCCTAATTATCCTAATATAT-3' 서열 번호: 2). NdeI 및 NotI에 대한 제한 엔도뉴클레아제 부위는 굵은 글씨체로 씌어 있으며 메티오닌/정지-코돈은 밑줄쳐져 있었다. 생성된 NdeI-NotI 단편은 T7-프로모터의 제어 하에 있는 시판되는 벡터 pET28a(+)(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)내로 연결시켰다. 이로써 작제된 벡터는 N-말단에 6xHis-태그를 가지며 pET28a_Cd7α-HSDH로 명명하였다.
nox2 유전자(NAD(P)H 옥시다제를 암호화함)를 주형으로서 락토바실러스 산트란시스켄시스(Lactobacillus sanfranciscensis)(DSM 20451)로부터의 게놈 DNA를 사용하여 증폭시키고, 제한 효소 NcoI 및 XhoI에 대한 인식 부위를 지닌 프라이머를 pET28a(+) 내에 C-말단 6xHis-태그를 지닌 효소의 작제를 위해 사용하였다(전방: 5'-AACCAACCATGGGAATGAAAGTTATTGTAGTA-3' 서열 번호: 3, 역방: 5'-ATAATAACTCGAGCGTATAGTTTAAGAC-3' 서열 번호: 4). NcoI 및 XhoI에 대한 제한 엔도뉴클레아제 부위는 굵은 글씨이었으며 메티오닌-코돈은 밑줄쳐져 있었다. 생성된 NcoI-XhoI 단편을 시판되는 벡터 pET28a(+)(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)내로 연결하였으며, 이는 T7-프로모터의 제어 하에 있다. 작제된 벡터는 pET28a_LsNOX로 명명된다. 프레임내 DNA 서열의 정확성 및 임의의 돌연변이의 부재는 서열분석에 의해 확인하였다. 락토바실러스 산프란시스켄시스(Lactobacillus sanfranciscensis)로부터의 상기 NAD(P)H 옥시다제의 상응하는 뉴클레오타이드- 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 49 및 50으로 나타낸다.
1.3 Cd7α-HSDH의 부위-지시된 돌연변이유발
단일 돌연변이를 서열 번호: 34의 잔기 Lys16 및 Ala37에서 수행하고 이중 돌연변이를 이의 잔기 Ala37/Arg38에서 Quikchange® PCR 프로토콜을 통해 수행하였다. 돌연변이의 도입을 위해 사용된 전방 및 이들의 상보성 역방 프라이머는 표 2에 나타낸다. PCR로부터 수득된 플라스미드를 이. 콜라이 DH5α 내로 형질전환시키고 콜로니를 플라스미드 제조를 수행하기 위해 LB-아가 플레이트(agar plate)로부터 집어올린 후 LGC Genomics(독일 베를린 소재)에 의해 서열분석하였다.
[표 2]
NAD+-의존성 돌연변이체의 생성을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드. 삼중체(triplet)를 도입하는 돌연변이는 강조하였다.
돌연변이 위치는 천연 효소(서열 번호: 34)의 아미노산을 지칭한다.
1.4 세균 균주 및 성장 조건
에스케리키아 콜라이 균주 DH5α(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 37℃에서 50 μg/ml 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 루리아 버타니(Luria Bertani)(LB)-배지 속에서 성장시켰다. 재조합 플라스미드를 수반하는 이. 콜라이 BL21(DE3) △7α-HSDH 세포의 출발 배양물을 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는, 5 mL의 LB 배지 속에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이들 배양물을 사용하여 주 배양물을 진탕 플라스크 속에서 발현을 위해 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB- 또는 TB-배지(TB: 100 mM 인산칼륨 완충제(KPi) pH 7.0 중 24 g L-1 효모 추출물, 12 g L-1 카제인 가수분해물, 5 g L-1 글리세롤) 속에 600 nm(OD600)에서 0.05 광학 밀도(optical density)의 최종 농도로 접종하였다. OD600이 0.6 내지 0.8의 값에 도달하면, 재조합 7α-HSDH의 생산을 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 유도하였다. 배양물을 25℃에서 20시간 동안 진탕시키고 원심단리하여 수거하였다.
1.5 세포-유리된 추출물의 제조
세균 배양물을 4℃에서 30분 동안 10,000 x g에서 원심단리로 수거하였다. 세포 현탁액(20 %)을 50 mM KPi 완충액 pH 8.0 또는 분해 완충액(300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 50 mM NaH2PO4, pH 8,0) 각각 속에서 제조하였다. 세포를 중간의 냉각 기간과 함께 1분(25% 분말 배출)의 3회 초음파 주기로 파괴하였다. 용해된 세포를 18,000 xg에서 30분 동안 4℃에서 원심단리하고, 상층액을 각각 HSDH 또는 NOX 활성의 측정을 위해 사용하였다. 단백질 농도를 표준물(Bradford 1976)로서 BSA를 사용하여 브래드포드(Bradford)에 따라 측정하였다.
1.6 효소의 정제
정제된 Cd7α-HSDH를 Ni-NTA 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 수득하였다. 컬럼을 25 mL 용해 완충액(10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8)으로 평형화시켰다. Cd7α-HSDH his-태그(서열 번호: 35) 융합 단백질을 함유하는 세포 용해물을 컬럼에 적용하고 40 mL 세척 완충액(20 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8,0)으로 세척하였다. 결합된 단백질을 10 mL의 용리 완충액(250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 세척하였다. PD10 컬럼(Sephadex G25, GE healthcare, 독일 소재)을 사용한 겔 여과에 의한 탈염 단계 후, 효소를 50 mM KPi pH 8,0 속에 저장하고 사용할 때까지 +4℃에서 유지시켰다.
NAD(P)H 옥시다제는 추가로 정제하지 않고 조 추출물을 사용하였다.
1.7 SDS-PAGE에 의한 단백질 분해
단백질 과발현을 표준물로서 BSA를 사용하여 브래드포드에 따라 SDS-PAGE로 모니터링하였다. 30 kDa의 예측된 덩어리의 경우, 15% 아크릴아미드를 함유하는 트리스-글리신 겔을 사용하였다. 샘플을 로딩 완충액 속에서 95℃에서 10분 동안 항온처리하고, 10μg을 겔 위에 로딩하였다. 겔을 Coomassie® Brilliant Blue R-250로 염색하고 변성 조건 하에서 분자량을 표준 마커(Thermo Scientific, 독일 드라이라이히 소재)와 비교하여 측정하였다.
1.8 효소 검정
Cd7α-HSDH에 대한 효소 검정 혼합물은 1 mL의 총 용적 속에, 50 mM KPi(pH 8.0), 0.5 mM NADP+ 각각 0.2 mM NADPH, 10 mM 담즙산 및 단백질을 큐베트 속에 함유하였다. NOX용의 효소 검정 혼합물은 50 mM KPi(pH 7.0), 0.2 mM NADPH 및 단백질을 큐베트 속에 1 mL의 총 용적으로 함유하였다. 1 단위의 활성은 표준 조건(340 nm, 30℃, pH 8.0) 하에서 분광광도계(UV-1700 PharmaSpec, Shimadzu)를 사용하여 1 μmol의 NADP+의 환원 또는 1 μmol의 NADPH의 산화 각각을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 환원 검정 혼합물은 874μL의 완충액(50 mM KPi 완충액 pH 8.0), 100 μL의 7-KLCA(50 mM KPi 완충액 pH 8.0 중 100 mM), 16 μL NADPH(12.5 mM in a. dest.) 및 Cd7α-HSDH용의 10 μL의 효소를 함유하였다. NOX에 대한 검정물은 974 μL의 완충액(50 mM KPi 완충액 pH 7.0), 16 μL NADPH(25 mM in a. dest) 및 10 μL의 효소 용액을 함유한다. 산화 검정 혼합물은 870 μL의 완충액(50 mM KPi 완충액 pH 8.0), 100 μL의 CDCA 또는 CA를 각각(50 mM KPi 완충액 pH 8.0 중 100 mM), 20 μL의 NADP+(25 mM in a. dest) 및 10 μL의 효소 용액을 함유하였다. 반응을 효소 용액을 첨가함으로써 개시하고 30초에 걸쳐 측정하였다. 속도 상수(kinetic constant)의 측정을 위해 (K M 및 v max) 매개변수를 다수의 측정(적어도 3회)으로부터 미카엘리스 멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)에 따라 비-선형 핏팅 알고리즘(non-linear fitting algorithm)(Graph pad software)을 사용하여 계산하였다.
1.9 생성물의 크로마토그래피 측정
HPLC 분석을 HPLC LC-2010AHT-시스템(Shimadzu, 일본 소재) 위의 Purospher® STAR RP-18 컬럼(Merck, 독일 소재)에서 1 ml/min의 유속으로 수행하였다. 이동 상은 2개의 용리액으로 이루어졌다. 용리액 A는 증류수(오르토인산 85%로 조절된 pH 2.6) 및 용리액 B는 HPLC-등급의 아세토니트릴이었다. 구배 프로그램(gradient program)의 출발 조건은 65% 용리액 A 및 35% 용리액 B이었다. 시스템은 UV 검출기로 200 nm에서 모니터링하였다. 전체적으로, 담즙산 농도가 1 mg/ml인, 20 μl의 샘플을 분석하였다. 동일한 농도에서 CDCA, 7-KLCA 및 UDCA의 기준 샘플(authentic sample)을 참고로서 사용하였다.
1.10 소-규모 생체내변환
KPi-완충액(100 mM, pH 7.0) 속에서 소 규모 10 mM CDCA의 생체내변환을 위하여, 0.1 mM NADP+, 0.5 U mL-1 Cd7α-HSDH 및 5 U mL-1 NADPH-옥시다제를 25℃에서 항온처리하였다. 생체내변환을 교반 바아(stirring bar)가 들어있는 유리 바이알(glass vial) 속에서 500 rpm의 교반기 속도로 18시간 동안 수행하였다. 샘플을 주기적으로 취하여 HPLC-분석을 위해 메탄올-물(pH 2.6) (9:1 v/v)로 희석하였다.
1.11 구조 모델링
Cd7α-HSDH의 구조를 주형으로서 fabG(PDB 코드: 4JRO)를 사용하는 "스위스 모델(Swiss-model)"로 모델화하였다[22-25]. FabG [바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis)로부터의 3-옥소아실-(아실-담체-단백질) 리덕타제]를 모델링을 위한 최고 유사성(38%)으로 인해 출발 점으로서 선택하였다. 3DLigandSite를 사용하여, 보조인자 NAD(P)H를 단백질에 대한 구조로 통합하였다[26]. 구조적 정렬 및 구조 비교를 Yasara (Yasara 분자 그패픽스 및 모델링 프로그램(molecular graphics and modelling program), 버젼 12.11.25)를 사용하여 수행하였다.
2. 실시예 I의 실험 결과
CDCA는 C-7에서 하이드록실 그룹만이 α-로부터 β-위치로 전환되어야만 하므로 UDCA를 합성하기 위한 매력적인 출발 물질을 나타낸다. 이러한 에피머화는 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)에 의해 촉매된 C-7에서 CDCA의 NAD(P)H-생산 산화(producing oxidation)를 7β-HSDH에 의해 7-케토 그룹의 NAD(P)H-소모 환원과 커플링시킴으로서 산화환원-중성 캐스캐이드 반응에서 도달될 수 있다.
2.1 서열 및 구조 비교
이. 콜라이, 씨. 페르프린겐스(C. perfringens), 씨 소르델리이(C. sordellii) 및 비. 프라길리스(B. fragillis)로부터의 4개의 7α-HSDH 및 본 발명의 씨. 디피실레로부터의 HSDH의 아미노산 서열 정렬을 "Clustal Omega" 정렬 도구를 사용하여 수행하였다(도 1).
고려할만한 서열 동일성이 이. 콜라이 및 비. 프라길리스 각각으로부터의 시험한 효소의 상이한 기원과 관련하여 전체 서열에 걸쳐 관찰되었다. 또한, 몇가지 고도로 보존된 영역이 존재한다. 이러한 결과를 기반으로 Cd7α-HSDH는 단-쇄 데하이드로게나제/리덕타제(SDR)의 대표적인 구성원으로 분류할 수 있다(P. Lepercq, P. G
rard, F. B
guet, J.-P. Grill, P. Relano, C. Cayuela, et al., Isolates from normal human intestinal flora but not lactic acid bacteria exhibit 7α- and 7β-hydorxysteroid dehydrogenase activities, Microb. Ecol. Heal. Dis. 16 (2004) 195-201. doi:10.1080/08910600410033393). 더욱이, 본 발명자들은 효소와 보조효소 사이의 상호작용을 이해하여 NADP(H)로부터 NAD(H)로 특이성을 변경시키기 위해 Cd7α-HSDH의 구조를 모델링하였다.
2.2 클로닝, 과발현 및 정제
Cd7α-HSDH 및 이의 돌연변이체의 재조합 과발현을 위해, 이. 콜라이 BL21(DE3) hsd- kan+ 녹-아웃 돌연변이체(knock-out mutant)(이. 콜라이 BL21(DE3) △7α-HSDH)를 숙주로 사용하여 고 수준의 재조합 Cd7α-HSDH를 유도하였다. 계산된 분자량이 30,154.3 Da(N-말단 6xhis-태그 포함)인 정제된 Cd7α-HSDH (서열 번호: 35)를 SDS-PAGE 분석에 의해 판단된 바와 같은 30 kDa에서 단일 밴드로서 확인였다다(도 2). 이미 조 추출물(레인 1)에서, 이러한 효소의 고 과-발현이 이러한 방법에 의해 입증될 수 있었다.
2.3 효소 활성 및 운동 상수(kinetic constant)
Cd7α-HSDH의 활성을 기질로서 CDCA를 사용하여 연구하였다. 세포-유리된 조 추출물 속에서 활성은 3.6 U mg-1 및 5.5 U mg-1의 CDCA 및 NADP+로 측정된 정제된 샘플인 것으로 밝혀졌다. NAD+를 사용하여 0.11 U mg-1 차수의 약간의 배경 활성을 검출할 수 있었다. TB-배지에서의 발현은 4.5 U mg-1(조 추출물) 및 7.7 U mg-1(정제됨)(보조인자로서 NADP+)의 약간 증가된 활성을 생성하였다.
기질 및 보조인자에 대한 동적 매개변수(K M 및 v max)를 표 3에 요약한다. 이러한 데이타는 CA가 CDCA보다 10배 더 높은 활성으로 산화됨을 나타낸다. 기대하지 않게도, NADPH를 사용한 7-케토리토콜산(7-KLCA)의 환원으로 CDCA로 이끄는 것은 CDCA의 산화에 대해 8.5 U mg-1과 비교하여 1.1 U mg-1의 매우 낮은 활성으로 일어난다. 더 높은 농도의 CDCA 또는 NADP+에 대해서 기질 억제는 관찰되지 않았음이 주목가능하다. 연구들은 Cd7α-HSDH의 보조인자 의존성이 NAD+ 보다는 NADP+를 선호하였다는 것에 관한 것이었다. NADP+를 사용하여, 고 CDCA의 기질 농도(≥ 2.5 mM CDCA)에서 활성의 100배 증가가 동일한 농도의 NAD+를 사용하여 달성된 활성과 비교하여 관찰되었다. 이러한 거동의 이유는 보조인자 NAD+를 사용하여 관찰된 일반적이지 않은 강력한 기질 억제이다. 최대 활성은 0.1 mM CDCA에서 작은 범위내에서만 발생하였고 보다 높은 농도에서는 급격히 강하하였으며; 이미 2.5 mM에서 약 10% 만의 잔류 활성이 측정되었다.
[표 3]
야생형 Cd7α-HSDH에 대한 동적 매개변수. 기질 농도를 변화시켜 K M 및 v max를 측정하였으며, 보조-기질은 일정한 농도에서 유지시켰다.
측정은 5 μM 내지 30 mM 담즙산의 기질 농도 범위에서 산화의 경우 상수 0.5 mM NAD(P)+ 및 환원의 경우 0.2 mM NADPH를 사용하여 수행하였다. 보조인자의 경우 측정은 1 μM 내지 10 mM NADP+의 범위에서 일정한 1 mM 담즙산에서 수행하였다. a) =0.1 mM CDCA 초과의 농도에서 강력한 기질 억제에 따라, 겉보기 v max를 사용하여 동적 매개변수를 측정하였다.
2.4 온도에 대한 Cd7α-HSDH 활성의 의존성
효소 활성에 대한 온도의 영향을 15 내지 65 ℃에서 기질로서 CDCA를 사용하여 시험하였다(도 3). 모든 측정은 정제된 단백질(N-His-태그를 지님)을 사용하여 수행하였다. Cd7α-HSDH는 11 U mg-1를 사용하여 45℃까지 활성에 있어서 약간의 증가를 나타내었다. 45℃ 내지 60℃로부터 활성은 최대 60℃ (77 U mg-1)로 급속하게 증가한 후 단백질 변성으로 인하여 급속히 감소하였다. 온도 안정성과 관련하여 단지 5%의 잔류 활성이 60℃에서 5분 동안의 항온처리시 검출되었다.
2.5 생성물 농도에 있어서 Cd7α-HSDH 활성의 의존성
Cd7α-HSDH에 대한 생성물 7-KLCA의 억제 효과는 CDCA를 UDCA로 전환시키는 과정에서 중요한 매개변수이다. 따라서, 본 발명자들은 상이한 농도의 7-KLCA의 존재하에 데하이드로게나제의 잔류 활성을 측정하였다. 광도계 검정은 표준 활성 검정과 유사하며, 단지 CDCA가 10 mM 대신 1 mM에서 사용되었다. 도 4는 생성물 7-KLCA가 Cd7α-HSDH(N-His-태그 사용)의 강력한 억제제임을 나타낸다. 이미 1 mM의 생성물의 존재하에서의 활성은 28%로 감소하며 2.5 mM에서 단지 약 10%의 잔류 활성이 측정될 수 있었다.
2.6 CDCA의 생체내변환
이러한 효소의 적용능을 확인하기 위하여, 39 mg(10 mM)의 CDCA의 10 mL 규모의 생체내변환을 반응식 2에 따른 NADP+의 재생에 대해 락토바실러스 산프란시스켄시스로부터의 NAD(P)H 옥시다제(서열 번호: 51)(C-His-태그 지님)와 조합된 Cd7α-HSDH (N-His-태그를 지님)(서열 번호: 35)를 사용하여 수행하였다.
[반응식 2]
반응식 2. 락토바실러스 산프란시스켄시스로부터의 NAD(P)H 옥시다제(NOX)에 의한 NADP+의 동시 재생과 함께 Cd7α-HSDH를 사용한 케노데옥시콜산(CDCA)의 7-케토리토콜산(7-KLCA)으로의 산화.
HPLC 분석은 7-KLCA가 18.5 시간 후 전환률이 >99%인 CDCA로부터의 유일한 생성물이었음을 나타낸다(도 5). 완전한 전환은 비가역성 및 NAD(P)H 옥시다제의 높은 구동력에 기인한 경우에만 가능하다. 불행히도, 옥시다제는 제한된 안정성을 나타내므로, 이러한 효소는 3 및 7시간 후 보충되어 완전한 전환을 보증하였다.
2.7 보조효소 특이성의 변경
야생형 Cd7α-HSDH(본 발명자의 N-His-태그 없음; 서열 번호: 34 또는 35)는 NADP+에 대해 보조효소 선호도를 나타며 NAD+와는 작은 측면 활성(<0.1 %)을 나타낸다. 그러나, NAD+의 보다 낮은 비용 및 보다 높은 안정성으로 인하여, 산업적 용도에서 이러한 보조효소의 적용은 유리할 수 있다. NAD+ 활성을 증가시키기 위하여, 상이한 유기체로부터의 NAD-의존성 HSDH를 사용하여 NADP+-의존성 Cd7α-HSDH의 보조인자 결합 영역의 아미노산 서열 정렬을 수행하였다(도 6). 이러한 정렬은 보조인자 결합 부위가 대표적인 글리신 모티프(G/A)XXXGXG(여기서 X는 임의의 아미노산이다)를 나타내며 고도로 보존되어 있음을 나타내었다. Ala37 및 Arg38을 위치 Ala37에서 산 잔기 및 Arg38 대신 작은 소수성 잔기의 도입을 목표로 하는 돌연변이를 위해 표적화하였다. 도 7은 Ala37의 예측가능한 기능이 2'-포스페이트-그룹에 대한 공간을 제공하는 것임을 입증한다. 전하 반발로 인한 불리한 상호작용 또는 입체장애에 의한 NADP+-결합의 식별의 경우 효과는 아스파르트산 또는 글루탐산의 도입에 의해 가능할 수 있었다(도 7, B).
실제로, 단일 돌연변이체 A37E 및 A37D는 0.04 U mg-1(NAD+) 및 NADP+로 3.2 U mg-1를 지닌 야생형 효소와 비교하여 NAD+에 대해 증가된 활성(0.2 및 0.9 U mg-1)뿐만 아니라 NADP+에 대해 감소된 활성(0.2 및 0.4 U mg-1)을 나타내었다. 이는 야생형과 관련된 돌연변이체 A37D의 경우 NAD+를 사용한 활성의 22배 증가에 상응한다. 이러한 단일 돌연변이는 이중 돌연변이체 A37D/R38I 또는 A37D/R38L(NAD+를 사용한 돌연변이체 둘 다의 경우 0.1 U/mg)보다 더 우수한 NAD+-특이적인 활성을 생성하였다.
이러한 효소의 구조 모델링으로 인하여, 다른 아미노산인, Lys16(서열 번호: 34)이 NADP+의 2'-포스페이트 그룹과 가능하게 상호작용하는 것으로 확인되었다. 이러한 고려사항은 16번 위치에서 변경된 아미노산과 함께 새로운 단일(K16A, K16G 및 K16D) 및 이중 돌연변이체(K16A/A37D 및 K16G/A37D)의 생성을 초래하였다. 실제로, 글리신으로부터의 작은 잔기는 야생형 효소를 사용한 것과 비교하여 NAD+를 사용한 활성을 약 6배(0.2 U mg-1) 증가시킨 반면 알라닌 또는 아스파르트산의 도입은(글리신과 비교하여) 활성을 감소시켰다(각각 0.09 및 0.01 U mg-1). 그러나, 모든 돌연변이체(K16A, K16G 및 K16D)는 야생형과 비교하여 보다 높은 활성을 갖는다. 이중 돌연변이체 K16G/A37D 및 K16A/A37D는 보조인자로서 NAD+를 사용한 활성에 있어서 증가된 효과를 가지지 않는다. 도 8은 돌연변이체에 대한 NAD+-활성을 요약한다.
또한, 동적 매개변수를 가장 우수한 NAD+-돌연변이체 A37D에 대해 측정하였다.
CDCA에 대한 정제된 재조합 Cd7α-HSDH의 동적 매개변수를 25℃에서 50 mM KPi-완충액(pH 8.0) 속에서 CDCA 농도를 0.05로부터 30 mM까지 증가시킴으로써 0.5 mM의 고정된 NAD+ 농도에서 측정하였다. 각각의 시험은 3회 수행하였다. 보조인자 NAD+를 사용한 강력한 기질 억제로 인하여, 표준 미카엘리스-멘텐 방정식을 사용한 조정(fit)은 가능하지 않았다. 따라서, 동적 매개변수는 겉보기 v max를 사용하여 계산하였다. 결과는 표 4에 요약한다:
[표 4]
Cd7α-HSDH[A37D] 돌연변이체에 대한 동적 상수. 기질 농도를 변화시켜 K M 및 v max를 측정하고, 보조-기질의 농도를 일정하게 유지시켰다. n.e. = 존재하지 않음.
측정은 5 μM 내지 30 mM CDCA의 기질 농도 범위에서 일정한 0.5 mM NAD+로 수행하였다. 보조인자 측정은 1 μM 내지 7.5 mM NAD+의 범위에서 일정한 0.1 mM CDCA에서 수행하였다. a) = 약 0.1 mM CDCA 초과의 농도에서 강력한 기질 억제에 따라 겉보기 v max를 사용하여 동적 매개변수를 측정하였다.
3. 요약
구조-기반 부위-지시된 돌연변이유발에 의한 NADP+로부터 NAD+로의 보조효소 특이성을 스위치하기 위한 본 발명자들의 시도는 몇가지 돌연변이체, 및 특히 야생형과 비교하여 NAD+를 사용한 활성에 있어 유의적으로 증가된 2개의 효소 단일 돌연변이체(A37E 및 A37D)를 생성하였다. 특히, A37D는 0.9 U/mg의 비 활성을 나타내었다. 더욱이, 이는 이러한 돌연변이체의 경우 보조 효소 NADP+를 사용한 활성에 있어 강력한 감소를 생성하였다(야행형의 경우 3.2 U/mg과 비교시 0.4 U/mg의 잔류 활성). 요약하면, 수득된 돌연변이체, 및 특히 A37D 효소 변이체는 본 발명에 의해 7α-HSDH 활성을 NADH 옥시다제와 결합시켜 7-KLCA를 수득하거나 NADH-의존성 7β-HSDH와 결합시켜 UDCA를 수득할 가능성을 제공한다.
실시예 II:
에스케리키아 콜라이로부터 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제의 신규한 NADP-의존성 돌연변이체, 특히 보조인자 스위치 돌연변이체의 클로닝, 발현, 및 생화학적 특성화 및 담즙산의 산화를 위한 이들의 적용
1. 물질 및 방법
1.1 화학물질
예를 들면, 항생제와 같은 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich 또는 Carl Roth(독일)로부터 입수하였다. 모든 제한 엔도뉴클레아제 및 T4 DNA 리가제는 ThermoScientific(독일)으로부터 구입하였고 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG)는 Gerbu(네덜란드)로부터 구입하였다.
1.2 배지 및 완충액:
LB 배지: 배지 리터당 트립토판 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g
KPi 완충액: (50 mM, pH 8) 완충액 리터당 8.3 g의 K2HPO4 및 0.3 g의 KH2PO4 함유
붕해 완충액(disintegration buffer): 10 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
세척 완충액: 20 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
용출 완충액: 250 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
1.3 미생물:
[표 5]
적용된 에스케리키아 콜라이 균주
이. 콜라이 균주 DH5α(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지 속에서 37℃에서 성장시켰다.
이.콜라이 균주 BL21(DE3) △7α-HSDH(특히 7α-HSDH 녹 아웃 돌연변이체와 관련하여 Pharmazell GmbH 특허원 제WO 2011/147957호 참고)를 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지 속에서 37℃에서 성장시키고 OD600 = 0.6 - 0.8에서 0.5 mM IPTG로 25℃에서 및 130 rpm에서 20시간 동안 유도한 후 항온처리하였다.
1.4 발현 벡터 및 벡터 작제물:
재조합 7α-HSDH를 발현시키기 위해, 발현 벡터 pET28a(+)(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 적용시키고, 이후의 벡터 작제물을 생성하였다:
· pET28a(+)_7α-HSDH(-): pET28a(+)-벡터, 여기서 상응하는 이. 콜라이 7α-HSDH 유전자는 표준 공정에 의해 절단 부위 NcoI 및 XhoI 내로 클로닝되었다. 작제물은 6xHis-태그를 함유하지 않는다.
· pET28a(+)_7α-HSDH(N): pET28a(+)-벡터, 여기서 상응하는 이. 콜라이 7α-HSDH 유전자는 표준 공정에 의해 절단 부위 NdeI 및 XhoI내로 클로닝되었다. 이러한 작제물은 N-말단 6xHis-태그를 함유한다.
· pET28a(+)_7α-HSDH(C): pET28a(+)-벡터, 여기서 상응하는 이. 콜라이 7α-HSDH 유전자는 표준 공정에 의해 절단 부위 NcoI 및 XhoI 내로 클로닝되었다. 상기 작제물은 C-말단 6xHis-태그를 함유한다.
1.5 배양
배양을 진탕 플라스크 속에서 LB 배지 내에서 37℃에서 수행하였다. OD600 = 0.6 내지 0.8에서, 유전자 발현을 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 이후에, 세포를 25℃에서 20시간 동안 성장시킨 후 수거하였다.
1.6 조 추출물의 생산
배양된 세포는 초음파(25% (w/v) 세포 현탁액)를 사용하여 파괴시켰으며 이에 따라 수득된 조 추출물을 활성 검정에 적용시켰다.
1.7 7α-HSDH 활성 측정을 위한 표준 조건
반응 혼합물은 1 ml의 총 용적 속에 다음을 함유하였다:
880 μl 50 mM 인산칼륨(KPi) 완충액, pH 8.0
100 μl 100 mM CDCA(50 mM KPi 속에 용해됨, pH 8)
10 μl 효소 용액(상기 완충액 속에서 2 내지 6 U/ml의 범위)
10 μl 50 mM NAD+ 또는 NADP+(ddH2O 속에 용해됨)
흡광도(extinction)의 증가는 30초의 기간에 걸쳐 340 nm에서 측정하였고 활성은 효소 단위(1 U는 1 μmol NAD(P)H/min의 전환에 상응한다)로서 나타내었다. 몰 흡광 계수는 6.22 mM-1Хcm-1이었다.
1.8 브래드포드 방법에 의한 단백질 측정
샘플(100 μl)을 900 μl의 브래드포드 시약과 혼합하고 적어도 15분 동안 암실 속에서 항온처리하였다. 단백질 함량을 적용된 검정의 농도 범위 내에서 캘리브레이터(calibrator)로서 BSA를 사용하여 595 nm에서 측정하였다.
1.9 분자 생물학적 방법
달리 나타내지 않는 한, 확립된 방법은 예를 들면 다음에 개시된 바와 같이 적용하였다: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
1.10.
QuikChange®-PCR
QuikChange®-PCR(QC-PCR)을 사용하여, 개개 아미노산 잔기의 직접적인 교환을 수행하였다. 적용된 프라이머는 후속적인 표 6에 요약한다. 상기 프라이머는 42 및/또는 43번 위치에서 의도된 아미노산 교환을 유발한다.
[표 6]
QuikChange-PCR용 프라이머
상기 반응을 수행하기 위해, 제1 단계에서, 변성 단계를 95℃에서 2분 동안 수행하였다. 이후에, 23주기의 변성(95℃에서 30초)에 이어서, 프라이머 하이브리드화 및 신장(72℃에서 11분)을 수행하였다. 마지막 단계로서, 최종 신장을 폴리머라제 연쇄 반응을 15℃로 냉각시켜 종결시키기 전에 72℃에서 10분 동안 수행하였다.
[표 7]
상이한 7α-HSDH 변이체를 생성하기 위한 PCR 반응 혼합물
주형으로서, 7α-HSDH(야생형) 암호화 서열을 지닌 pET28a-벡터를 적용시켰다. 특히, 돌연변이될 유전자의 N6-아데닌-메틸화된 이중 가닥 플라스미드 DNA를 적용하였다. N6-아데닌-메틸화된 플라스미드 DNA는 dam+ 이. 콜라이 균주 이. 콜라이 DH5α(상기 나열한 바와 같음)로부터 단리하였다.
PCR을 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 이후에, PCR 생성물을 Analytik Jena의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 모(parental) N6-아데닌-메틸화된 DNA를 제한 효소 dpnI를 사용하여 분해하였다. 이러한 효소는 이것이 비-특이적으로 N6-아데닌-메틸화된 DNA를 제한한다는 구체적인 특징을 갖는다. 그러나, 이는 새로이 형성된 비-메틸화된 DNA와 반응하지 않는다. 제한은 1 μl의 dpnI을 정제된 PCR 반응 생성물에 적어도 2시간 동안 또는 37℃에서 밤새 가함으로써 수행하였다.
8 μl의 상기 반응 혼합물을 100 μl의 화학적으로 상보성인 DH5α 세포의 형질전환을 위해 적용하였다.
1.11. 발현 및 정제
이. 콜라이 BL21(DE3)△7α-HSDH를 상응하는 발현 작제물로 형질전환시켰다. 이러한 목적을 위해, 발현 작제물을 함유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)△7α-HSDH 균주를 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지 속에서 증식시켰다. 세포를 원심단리(10.000 x g, 30 min, 4℃)에 의해 수거하였다. 펠렛(pellet)을 붕해 완충액(25% (w/v) 세포 현탁액) 속에 현탁시켰다. 세포를 2분 동안 냉각(30W, 10 내지 25%의 작업 간격 및 1 min 정지 시간) 하에 초음파처리하였다. 초음파 장치 Sonopuls HD2070(Bandelin, 독일)를 적용하였다. 붕해를 3회 동안 반복하였다. 세포 추출물을 원심단리(20.000 x g, 30 min, 4oC)하였다. 상층액을 25ml의 붕해 완충액으로 평형화시킨 컬럼(Thermo Scientific, 미국 소재) 위에 적용하였다. 약하게 결합하는 단백질을 40 내지 50 ml의 세척 완충액으로 세척하여 용출시켰다. His-태그-7α-HSDH 단백질을 10 ml의 용출 완충액을 사용하여 용리시켰다. 과정을 실온에서 수행하였다. 용출물을 Centricon 한외여과 모듈을 사용하여 농축시키고 완충액 교환은 PD10 컬럼을 사용하여 수행하여 이미다졸을 제거하였다.
단백질 농도는 항목 1.8 하에 상술한 바와 같이 측정하였다. 또한, 각각의 샘플을 15% SDS-PAGE 및 꼬마지에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색잉 사용하여 분석하였다.
2. 실시예 II의 실험 결과
2.1 광도계 활성 검정
조 추출물의 광도계 활성 검정을 UV-1700 분광광도계(Shimadzu, 일본 소재)를 사용하여 수행하였다(항목 1.7 하의 상술된 방법 참고). 표 8에서, NAD+ 및 NADP+에 대해 수득된 개개 돌연변이체의 비 활성 값을 요약한다.
[표 8]
기질 CDCA 및 보조인자 NAD+ 및 NADP+ 중 하나에 대해 관찰된 개개 돌연변이체(조 추출물)의 활성
가장 우수한 돌연변이체(4번)는 원래의 보조인자 NAD+의 경우 유일하게 미미한 활성을 나타내며 보조인자 NADP+의 경우 약 6.3 U/mg의 활성을 나타낸다. 도 9는 결과의 그래프적 표시를 나타낸다.
2.2. 생화학적 특성화
SDS-PAGE를 수행하여 동족체 발현의 발현력 뿐만 아니라 정제 품질도 평가하였다. 도 10은 돌연변이체 7α-HSDH[D42G/I43R]의 SDS 겔을 나타낸다. 야생형 및 또한 NADP+ 돌연변이체(N-말단 6xHis-태그 지님)(서열 번호: 41)의 분자량은 약 약 28.9 kDa이다. 도 10은 7α-HSDH가 이론적인 분자량을 나타내지 않음을 나타낸다. 오히려, 밴드는 약 25 kDa의 분자량을 나타낸다.
2.3. 미카엘리스-멘텐-동력학
동적 상수 v max 및 K M을 각각의 돌연변이체에 대해서 뿐만 아니라 야생형 효소에 대해서도 측정하였다. 측정은 기질 CDCA 및 보조-효소 NAD(P)+에 대해 수행하였다. 결과는 또한 표 9에 요약한다. 측정은 정제된 단백질(항목 7에 따라)을 사용하여 CDCA의 경우 10 μM 및 30 mM의 범위의 상이한 기질 농도에서 0.5 mM NAD(P)+의 보조인자의 고정 농도로 수행하였다. 보조인자에 대한 상응하는 상수는 1 mM의 CDCA 농도 및 10 μM 내지 5 mM의 범위의 보조인자 농도에서 수행하였다.
[표 9]
7α-HSDH(야생형 및 NADP-의존성 돌연변이체)에 대한 동적 상수. X = 억제 없음; n.d. = 측정되지 않음
a) = 겉보기 값
미카엘리스-멘텐 그래프(나타내지 않음)은 상기 2개의 효소 변이체 각각에 대한 CDCA에 대한 기질 억제를 나타낸다. 돌연변이체의 경우, 억제가 보다 더 현저하였다.
실시예 III:
CDCA의 UDCA로의 커플링된 자가-충분한 1단계 전환
1. 물질 및 방법
1.1 화학물질
예를 들면, 항생제와 같은 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich, Carl Roth 또는 Biomol(독일)로부터 구입하였다. 모든 제한 엔도뉴클레아제 및 T4 DNA 리가제는 ThermoScientific(독일)으로부터 입수하였고, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 Gerbu(네덜란드)로부터 입수하였다.
1.2 배지 및 완충액:
LB 배지: 배지 리터당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g
KPi 완충액(50 mM, pH 8): 완충액 리터당 8.3 g K2HPO4 및 0.3 g KH2PO4
붕해 완충액: 10 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
세척 완충액: 20 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
용출 완충액: 250 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 8
1.3 미생물:
[표 10]
적용된 이. 콜라이 균주
이. 콜라이 균주 DH5α(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지 속에서 배양하였다.
이. 콜라이 균주 BL21(DE3)△7α-HSDH를 PharmaZell GmbH로부터 입수하였다(참고: WO 2011/147957).
1.4 발현 벡터 및 벡터 작제물:
재조합 7α 및 7β-HSDH 효소의 발현을 위해, 그 자체로 공지된 발현 벡터 pET28a(+) 및 또한 pACYCDuet(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 다음의 벡터 작제물을 제조하였다:
· pET28a(+)_7α-HSDH(N)[D42G/I43R]: pET28a(+) 벡터, 여기서 이. 콜라이로부터의 7α-HSDH의 유전자는 제한 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 잘 공지된 방식으로 클로닝되었다. QuikChange®-PCR를 사용하여, 돌연변이 D42G 및 I43R을 도입하였다. 이러한 작제물은 N-말단 6xHis-태그(서열 번호: 41)를 함유한다.
· pET28a(+)_Cd7α-HSDH(N): pET28a(+) 벡터, 여기서 씨. 디피실레로부터의 7α-HSDH의 유전자는 제한 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 잘 공지된 방식으로 클로닝되었다. 이러한 작제물은 N 말단 6xHis-태그(서열 번호: 35)를 함유한다.
· pA_7β-HSDH: pACYCDuet 벡터, 여기서 씨. 아에로파시엔스로부터의 7β-HSDH의 유전자는 제한 부위 NcoI 및 XhoI를 통해 잘 공지된 방식으로 클로닝되었다. 상기 작제물은 6xHis-태그를 함유하지 않는다(서열 번호: 52).
· pA_7β-HSDH [G39S/R64E]: pACYCDuet 벡터, 여기서 씨. 아에로파시엔스의 7β-HSDH 유전자는 제한 부위 NcoI 및 XhoI를 통해 잘 공지된 방식으로 클로닝되었다. QuikChange®-PCR을 사용하여 돌연변이 G39S 및 R64E를 도입하였다. 이러한 작제물은 6xHis-태그를 함유하지 않는다(서열 번호: 45).
· pET28a(+)_7β-HSDH(C) [G39E]: pET28a(+) 벡터, 여기서 이. 콜라이로부터의 7α-HSDH의 유전자는 제한 부위 NcoI 및 XhoI를 통해 잘 공지된 방식으로 클로닝되었다. QuikChange®-PCR을 사용하여, 돌연변이 G39E를 도입하였다. 이러한 작제물은 C 말단 6xHis-태그를 함유한다(서열 번호: 48)
CDCA로부터 UDCA의 1 단계 합성에 사용된 재조합 균주는 표 11에 나열되어 있다.
[표 11]
적용된 재조합 균주
균주 이. 콜라이 BL21(DE3)△7α-HSDH는 PharmaZell GmbH로부터 입수하여 상기 DB06 및 DB07 균주를 제조하는데 사용하였다(하기 설명 참고).
1.5 배양
배양을 진탕 플라스크 속에서 LB 배지 속에서 37℃에서 수행하였다. 0.6 내지 0.8의 OD600에서, 유전자 발현을 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 이후에, 세포를 20 시간 동안 25℃에서 성장시킨 후 수거하였다.
1.6. 조 추출물의 제조
배양된 세포를 초음파 처리(25% (w/v) 세포 현탁액)하고 수득된 조 추출물을 원심단리(20.000 g, 30분, 4℃)하여 세포 단편을 제거하였다.
1.7.
HSDH 활성 검정을 위한 표준 조건
반응 혼합물은 총 1 ml의 용적 속에 다음을 함유하였다:
880 μl
50 mM의 인산칼륨(KPi) 완충액, pH 8.0
100 μl
100 mM CDCA 또는 7-KLCA(50 mM KPi 속에 용해됨, pH 8)
10 μl
효소 용액(1 내지 5 U/ml의 범위로 안충액 속에 희석됨)
10 μl
50 mM NAD+ 또는 NADP+(ddH2O 속에 용해됨)
흡광도의 증가를 340 nm에서 30초의 기간에 걸쳐 측정하고 활성을 효소 단위(1 U는 1 μmol 기질/min의 전환에 상응한다)로 나타내었다. 몰 흡광도 계수는 6.22 mM-1Хcm-1이었다.
1.8 브래드포드 방법을 사용한 단백질 측정
샘플(100 μl)을 900 μl의 브래드포드 시약과 혼합하고 적어도 15분 동안 암실 속에서 항온처리하였다. 단백질 함량을 적용된 검정의 농도 범위 내에서 캘리브레이터로서 BSA를 사용하여 595 nm에서 측정하였다.
1.9 분자 생물학적 방법
달리 나타내지 않는 한, 확립된 방법은 예를 들면 다음에 개시된 바와 같이 적용하였다: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
1.10.
QuikChange®-PCR
QuikChange®-PCR(QC-PCR)을 사용하여, 개개 아미노산 잔기의 직접적인 교환을 수행하였다. 적용된 프라이머는 후속적인 표 12에 요약한다. 상기 프라이머는 42 및/또는 43번 위치에서 의도된 아미노산 교환을 유발한다.
[표 12]
QuikChange-PCR을 위한 프라이머
상기 반응을 수행하기 위해, 제1 단계에서, 변성 단계를 95℃에서 2분 동안 수행하였다. 이후에, 23주기의 변성(95℃에서 30초)에 이어서, 프라이머 하이브리드화 및 신장(72℃에서 11분)을 수행하였다. 마지막 단계로서, 최종 신장을 폴리머라제 쇄 반응을 15℃로 냉각시켜 종결시키기 전에 72℃에서 10분 동안 수행하였다.
[표 13]
상이한 7α-HSDH 변이체를 생성하기 위한 PCR 반응 혼합물
주형으로서, 상응하는 유전자를 지닌 pET28a-벡터를 적용시켰다. 특히, 돌연변이될 유전자의 N6-알라닌-메틸화된 이중 가닥 플라스미드 DNA를 적용하였다. N6-아데닌-메틸화된 플라스미드 DNA는 dam+ 이. 콜라이 균주, 예를 들면, 균주 이. 콜라이 DH5α로부터 단리하였다.
PCR을 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. PCR을 위에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이후에, PCR 생성물을 Analytik Jena의 PCR 정제 키트(kit)를 사용하여 정제하였다. 모 N6-아데닌-메틸화된 DNA를 제한 효소 dpnI를 사용하여 분해하였다. 이러한 효소는 이것이 비-특이적으로 N6-아데닌-메틸화된 DNA를 제한한다는 구체적인 특징을 갖는다. 그러나, 이는 새로이 형성된 비-메틸화된 DNA와 반응하지 않는다. 제한은 1 μl의 dpnI를 정제된 PCR 반응 생성물에 적어도 2시간 동안 또는 밤새 37℃에서 가함으로써 수행하였다.
8 μl의 상기 반응 혼합물을 100 μl의 화학적으로 상보성인 DH5α 세포의 형질전환을 위해 적용하였다.
1.11. 개개 유전자 및 또한 전체 세포 생물 촉매의 발현
이. 콜라이 BL21(DE3)△7α-HSDH를 발현 작제물로 형질전환시켰다. 이러한 목적을 위해, 발현 작제물을 함유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)△7α-HSDH 균주를 LB 배지 속에서 상응하는 항생제(pET28a의 경우 50 μg/ml 카나마이신, pACYCDuet의 경우 36 μ/ml 클로람페니콜 또는 전체 세포 생체촉매의 경우 40 μg/ml 카나마이신 + 29 μg/ml 클로람페니콜)의 존재하에서 배양하였다(참고: 상기 이. 콜라이 DB 06 및 DB07).
세포의 배양은 LB 배지 속에서 37℃로 밤새 수행하였다. 이러한 배양으로부터, 발현 배양물(1% 용적의 밤샘 배양물)을 접종하고 약 0.6 내지 0.8의 OD600에서 유전자 발현을 0.5 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 이후에, 세포를 수거할 때까지 25℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 세포를 원심단리(10.000Хg, 30분, 4℃)로 수거하였다. 단백질 농도를 상술한 바와 같이 측정하였다.
1.12.
HPLC 분석: 방법 및 조건
담즙산 및 수득되는 생체내변환 생성물은 정상 상 RP-HPLC(HPLC-시스템 LC-2010AHT, Shimadzu)에 의해 아세토니트릴/물(인산을 사용하여 pH 2.6으로 조절됨)의 구배를 사용하여 분석하였다.
구배는:
0 내지 15분간 일정한 40% 아세토니트릴
15 내지 17분간 90% 아세토니트릴로 선형 증가,
17 내지 27분간 일정한 90% 아세토니트릴,
27 내지 29분간 40% 아세토니트릴로 선형 증가,
29 내지 35분간 일정한 40% 아세토니트릴.
정지 상(stationary phase)으로서 제공된 말단캡핑된(endcapped) Purospher STAR® 컬럼 RP-18(Merck, 독일 다름슈타트) 및 20 μl의 희석된(90% v/v 메탄올 사용) 샘플을 컬럼에 로딩(loading)하였다.
유동속도를 1 mL min-1에서 유지시키고 용리액을 200 nm의 파장에서 UV-검출기로 검출하였다.
보유 시간: UDCA: 8,0 min; 7-KLCA: 11,7 min; CDCA: 17,5 min
2. 실시예 III의 실험 결과
2.1 CDCA의 1-단계 생체내변환의 반응 원리
도 11에 묘사한 바와 같은 2개의 커플 시스템을 확립하였다. CDCA를 7α-HSDH를 사용하여 7-KLCA로 산화시킨 후 7-KCLA를 보조인자 재생 하에서 7β-HSDH를 사용하여 UDCA로 환원시킨다. 도 11a는 조효소로서 NAD(H)를 기반으로 한 반응 변형을 나타내는 반면, 도 11b는 NADP(H)-기반 변형을 나타낸다. 커플링된 과정을 단리된 효소 또는 전체 세포로 수행하여 필요한 HSDH 효소를 발현시켰다.
2.2 단리된 효소를 사용한 UDCA의 합성
단리된 효소를 사용한 UDCA의 효소 합성을 25℃에서 100 mM KPi 완충액(pH 7.0) 속에서 표준화하여 수행하였다. 반응 혼합물을 500 내지 700 rpm에서 자기적으로 교반하였다. 보조인자 농도는 0.25 mM NAD+이었다. 보조인자로서 NAD+를 사용한 생체내변환을 위해, 반응을 1 U/ml 효소를 사용하여 수행하고, 보조인자로서 NADP+를 사용한 생체내변환을 위해 반응을 0.5 U/ml 7α-HSDH 및 1.0 U/ml 7β-HSDH로 수행하였다. 예정된 시간 간격 후, 샘플을 취하고 HPLC를 사용하여 분석하였다.
첫번째 실험에서 25 mM CDCA의 전환을 100 mM KPi 완충액 pH 7.0 속에서 25℃에서 NAD(H)-의존성 7β-HSDH [G39E](서열 번호: 48)(7-KLCA 환원의 경우) 및 이. 콜라이로부터의 7α-HSDH(야생형 서열 번호: 37)(CDCA 산화의 경우)를 사용하여 커플링된 1-단계 과정에서 수행하였다. 보조인자 농도는 0.25 mM NAD+이었다. 결과를 도 12에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, NAD+-의존성 7β-HSDH를 사용하여 직접적으로 커플링된 산화 및 환원 반응의 1-단계 전환은 작동가능하다.
두번째 실험에서, 생체내변환을 보조인자로서 NADP(H)를 사용하여 1-단계 과정으로 수행하였다. 10 mM CDCA의 효소 전환을 100 mM KPi 완충액 pH 6.0 속에서 25℃에서 7β-HSDH[G39S/R64E](서열 번호: 45) 및 씨. 디피실레로부터의 Cd7α-HSDH(서열 번호: 35)를 사용하여 1-단계 과정으로 수행하였다. 보조인자 농도는 0.5 mM NADP+이었다. 결과는 도 13에 나타낸다. 7-KLCA 환원을 위해, 씨. 아에로파시엔스로부터의 NADP+-의존성 7β-HSDH를 적용하고 CDCA 산화 단계를 위해, 씨. 디피실레로부터의 7α-HSDH를 적용시켰다. 나타낸 바와 같이, NADP+-의존성 7β-HSDH를 사용한 직접적으로 커플링된 산화 및 환원 반응에서 CDCA의 1단계 전환은 작동가능하였다.
2.3 NADP-의존성 7β-HSDH 및 7α-HSDH 효소를 발현하는 재조합체 전체 세포 촉매를 사용한 UDCA 합성
5 mg/ml 세포(CWW = 세포 습윤 중량)를 사용한 UDCA의 합성을 100 mM KPi 완충액(pH 6.0) 속에서 25℃에서 표준화하여 수행하였다. 반응 혼합물을 700 rpm에서 자기적으로 교반하였다. 반응 혼합물은 보조인자로서 0.5 mM NADP+를 함유하였다. 예정된 시간 간격 후, 샘플을 취하고 HPLC를 사용하여 분석하였다.
다음의 전체 세포 촉매를 적용하였다:
· 씨. 디피실레로부터의 NADP+ 의존성 야생형 7α-HSDH(서열 번호: 35) 및 씨. 아에로파시엔스로부터의 NADP+ 의존성 7β-HSDH 이중 돌연변이체[G39S/R64E](서열 번호: 44)를 발현하는 이. 콜라이 DB06(pET28a_CD7α(N) + pA_7β-HSDH [G39S/R64E])
및
· 이. 콜라이로부터의 NADP+ 의존성 7α-HSDH 이중 돌연변이체[D42G/I43R](서열 번호: 41) 및 씨. 아에로파시엔스로부터의 NADP+ 의존성 7β-HSDH 이중 돌연변이체[G39S/R64E](서열 번호: 44)를 발현하는 이. 콜라이 DB07 (pET28a_7α-HSDH(N) [D42G/I43R] + pA_7β-HSDH [G39S/R64E]).
사용 전에, 세포를 투과를 위해 적어도 1회 동안 동결시켰다. 도 14는 25 ℃에서 100 mM KPi 완충액 pH 6.0 속에서 전체 세포 촉매 이. 콜라이 DB06(도 A) 및 이. 콜라이 DB07(도 B)를 사용한 25 mM CDCA의 상응하는 전환의 결과를 나타낸다. 보조인자 농도는 0.5 mM NADP+이었으며 반응 시간은 48시간이었다.
서열 번호의 지정:
AS = 아미노산 서열
NS = 핵산 서열
WT = 야생형
참고는 본원에 언급된 문서의 개시내용에 대해 명확하게 이루어져 있다.
Claims (24)
- 하기 화학식 1의 우르소데옥시콜산(UDCA) 화합물을 제조하기 위한, 커플링된 생체촉매적 방법(coupled biocatalytic process)으로서, 상기 방법은
a) 하기 화학식 2의 체노데옥시콜산(CDCA) 화합물을 7α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(7α-HSDH) 및 7β-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(7β-HSDH) 및, NAD+ 및 NADP+로부터 선택된 보조인자의 존재하에서 반응시키는 단계로서, 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH는 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH로부터 선택된 동일한 보조인자 시스템을 이용하는 능력을 가지며, 여기서
a1) 상기 7α-HSDH는 상기 화학식 2의 CDCA 화합물의 하기 화학식 3의 상응하는 중간체 7-케토리토콜산(7-KLCA) 화합물로의 산화를 촉진시키고,
a2) 상기 7β-HSDH는 반응 단계 a1)에서 형성된 바와 같은 상기 화학식 3의 7-KLCA 화합물의 상기 화학식 1의 UDCA 화합물로의 환원을 반응 단계 a1)에서 소비된 보조인자의 재생 하에서 촉진시키는 단계; 및
b) 임의로 반응 생성물을 추가로 정제하는 단계를 포함하는, 커플링된 생체촉매적 방법:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
상기 화학식 1에서,
R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R3)4 +(여기서, 잔기 R3은 동일하거나 상이하고 H 또는 알킬을 나타낸다)을 나타내거나, 여기서 그룹 -CO2R은 산 아미드 그룹 -CONR1R2(여기서, R1 및 R2는 서로 독립적으로 알킬 잔기를 나타낸다)에 의해 대체되고; 여기서 R은 바람직하게는 H를 나타내고;
상기 화학식 2에서,
R은 그룹 -CO2R에 대해 상기 정의된 바와 동일한 의미를 가지거나 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체되며,
상기 화학식 3에서,
R은 상기 정의된 바와 같거나, 여기서 그룹 -CO2R은 상기 정의된 바와 같은 산 아미드 그룹 -CONR1R2로 대체된다. - 제1항에 있어서, 단계 a)가 단리된 7α-HSDH 효소 및 7β-HSDH 효소의 존재하에서 또는 상기 효소를 기능적으로 발현하는 하나 이상의 재조합 미생물의 존재하에서 수행되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하거나; 여기서 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADHP를 이용하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하는 방법으로서; 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 단리되고, 적어도 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는, 서열 번호: 37에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 37에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NAD+/NADH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NAD+의 소비 하에, 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는, 서열 번호: 34를 갖는 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서, 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며 서열 번호: 34에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)로부터 선택되고,
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADH의 소비 하에 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens) 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, R40, R41 및 K44로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)로부터 선택되는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 7α-HSDH 및 상기 7β-HSDH 둘 다가 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 방법으로서, 여기서
a) 상기 7α-HSDH는
(1) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는, 클로스트리디움 디피실레로부터 단리된, 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하는 7α-HSDH, 및 서열 번호: 34에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는 능력을 보유한 이의 돌연변이체; 및
(2) 보조인자로서 NADP+의 소비 하에 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는, 서열 번호: 37을 지닌 에스케리키아 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH(여기서, 상기 7α-HSDH는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)로부터 선택되고;
b) 상기 7β-HSDH는
(1) 서열 번호: 54에 따른 아미노산 서열을 포함하고 보조인자로서 NADPH의 소비 하에 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는, 콜린셀라 아에로파시엔스로부터 단리된 7β-HSDS, 및 서열 번호: 54에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADPH를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는 능력을 보유한 이의 돌연변이체;
(2) 보조인자로서 NADPH의 소비 하에 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는, 서열 번호: 54를 지닌 콜린셀라 아에로파시엔스 7β-HSDH의 돌연변이체인 7β-HSDH(여기서, 상기 7β-HSDH는 서열 번호: 54의 T17, G39, 및 R64로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 54에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다); 및
(3) 서열 번호: 56에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 보조인자로서 NADPH의 소비 하에 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드 하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는 루미노코쿠스 그나부스(Ruminococcus gnavus)로부터 단리된 7β-HSDH, 및 서열 번호: 56에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고 NADP+/NADHP를 이용하는 능력 및 7-케토스테로이드의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 환원을 촉진시키는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체로부터 선택되는 방법. - 보조인자로서 NADP+의 소비 하에 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키는, 서열 번호: 37을 지닌 이. 콜라이 7α-HSDH의 돌연변이체인 7α-HSDH로서, 여기서 상기 효소는 서열 번호: 37의 D42 및 I43으로부터 선택된 아미노산 서열 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 37에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타내는 7α-HSDH.
- 제6항에 있어서, 상기 아미노산 서열 돌연변이가:
a) D42X1 및/또는
b) I43X2(여기서, X1은 아스파르트산(D)와는 상이한 아미노산 잔기를 나타내고 X2는 이소루이신(I)과는 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH. - 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
D42X1 및
I43X2 및
b) 이중 돌연변이
D42X1/I43 X2로부터 선택되고
여기서
X1는 G, A 또는 V를 나타내며
X2는 R, H 또는 K를 나타내는 7α-HSDH. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 37의 7α-HSDH와 비교하는 경우 다음의 프로파일(profile)을 나타내는 7α-HSDH:
a) 보조인자로서 NADP+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NADP+에 대한 증가된 비 활성(Vmax [U/mg]);
b) NADH 및 NADPH와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
c) 여기서 특징 a) 및 b)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음. - 씨. 디피실레(C. fifficile)로부터 단리되고 서열 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 갖는 7α-HSDH; 또는 서열 번호: 34를 지닌 씨. 디피실레 7α-HSDH의 돌연변이체(이러한 돌연변이체는 보조인자로서 NAD+의 소비하에서 7α-하이드록시스테로이드의 상응하는 7-케토스테로이드로의 적어도 입체특이적인 효소적 산화를 촉진시키며하며, 여기서, 효소 돌연변이체는 서열 번호: 34의 K16, A37 및 R38로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치내 돌연변이를 포함하고 서열 번호: 34에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 나타낸다)인 7α-HSDH.
- 제10항에 있어서, 상기 아미노산 서열 돌연변이가:
a) K16X1
b) A37X2
c) R38X3
(여기서 X1은 라이신(K)과는 상이한 아미노산 잔기를 나타내고 X2는 알라닌(A)과는 상이한 아미노산 잔기를 나타내며; X3은 아르기닌(R)과는 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다)를 포함하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 선택되는 7α-HSDH. - 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 돌연변이가
a) 단일 돌연변이
K16X1
A37X2
R38X3
및
b) 이중 돌연변이
K16X1/A37X2 및
A37X2/R38X3
(여기서
X1은 A, G, 또는 D를 나타내고;
X2는 D 또는 E를 나타내며;
X3은 I를 나타낸다)로부터 선택되는 7α-HSDH. - 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호:34의 7α-HSDH와 비교하는 경우, 다음의 특징 프로파일을 나타내는 7α-HSDH:
a) 케노데속시콜산(CDCA)에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg]);
b) 보조인자로서 NAD+를 사용한 CDCA의 효소적 산화 동안 NAD+에 대해 증가된 비 활성(Vmax [U/mg]);
c) NAD(H) 및 NADP(H)와 관련하여 변형된 보조인자 특이성,
d) 적어도 하나의 담즙산, 특히 콜산(CA) 및/또는 CDCA 및/또는 7-KLCA에 대해 감소되거나 잃어버린 기질 억제;
e) 여기서 특징 a) 내지 d)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음. - 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 7α-HSDH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
- 적어도 하나의 조절 서열의 제어, 제14항에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
- 제15항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
- 제14항에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 제15항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 또는 제16항에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 갖는 재조합 미생물.
- 제17항에 있어서, 보조인자 재생에 적합한 추가의 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)로부터 선택된, 적어도 하나의 추가의 효소에 대한 암호화 사열을 추가로 갖는 재조합 미생물.
- 제18항에 있어서, 보조인자 시스템 NAD+/NADH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시-발현하거나; 보조인자 시스템 NADP+/NADPH를 이용하는 7α-HSDH 및 7β-HSDH 둘 다를 동시 발현하는 재조합 미생물.
- 제19항에 있어서, 제4항 또는 제5항에 정의된 바와 같은 7α-HSDH 및 7β-HSDH를 동시-발현하는 재조합 미생물.
- 7α-케토스테로이드의 효소적 또는 미생물 합성을 위한 생체촉매적 방법으로서, 여기서 상응하는 7-하이드록시스테로이드를 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항의 정의에 따르는 7α-HSDH 돌연변이체의 존재하에서 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 상기 7α-HSDH 돌연변이체를 발현하는 재조합 미생물의 존재하에서 산화시키고 임의로 형성된 반응 생성물 중 하나를 반응 혼합물로부터 단리하는 생체촉매적 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 7-하이드록시스테로이드가
- 콜산(CA),
- 케노데옥시콜산(CDCA),
- 12-케토-케노데옥시콜산(12-케토-CDCA) 및, 바람직하게는 상기 산화가능한 7α-HSDH 돌연변이체에 의한, 이의 유도체, 특히 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택되는 방법. - 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 산화가 NAD+ 또는 NADP+의 존재 및 특히 이의 소비 하에서 수행되는 방법.
- 제23항에 있어서, 소비된 NAD+ 또는 NADP+가 NAD+ 또는 NADP+-재생 효소와의 커플링에 의해 재생되고, 여기서 상기 효소가 7β-HSDH, 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 포르미에이트 데하이드로게나제(FDH), 글루코즈 데하이드로게나제(GDH), NADH-데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), 글루코즈-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH), 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH)로부터 선택되는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16175318 | 2016-06-20 | ||
| EP16175318.1 | 2016-06-20 | ||
| PCT/EP2017/064924 WO2017220486A2 (en) | 2016-06-20 | 2017-06-19 | Coupled, self-sufficient biotransformation of chenodeoxycholic acid to ursodeoxycholic acid and novel enzyme mutants applicable in said process |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190018675A true KR20190018675A (ko) | 2019-02-25 |
Family
ID=56148232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020197000652A KR20190018675A (ko) | 2016-06-20 | 2017-06-19 | 케노데옥시콜산의 우르소데옥시콜산으로의 커플링된 생체내변환 및 이러한 방법에 적용가능한 효소 돌연변이체 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11634743B2 (ko) |
| EP (1) | EP3472339B1 (ko) |
| JP (1) | JP7035034B2 (ko) |
| KR (1) | KR20190018675A (ko) |
| PT (1) | PT3472339T (ko) |
| WO (1) | WO2017220486A2 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210050479A (ko) * | 2019-10-28 | 2021-05-07 | 한국화학연구원 | 공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법 |
| KR20230045755A (ko) | 2021-09-28 | 2023-04-05 | 경희대학교 산학협력단 | 신규한 콜린산 유도체 및 이의 용도 |
| WO2023075295A1 (ko) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | 에이스바이오팜 주식회사 | 7-keto-lca에서 우르소데옥시콜산으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스 균주 유래 7-beta-hsdh의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7209699B2 (ja) * | 2017-09-12 | 2023-01-20 | ユニケム ラボラトリーズ リミテッド | 高効率酵素法による（ｒ）－３－キヌクリジノールの製造方法 |
| CN108218943B (zh) * | 2018-03-05 | 2020-06-05 | 常德云港生物科技有限公司 | 将鸡胆中的鹅去氧胆酸和胆酸合成熊去氧胆酸的方法 |
| CN108546691B (zh) * | 2018-05-09 | 2020-02-21 | 华东理工大学 | 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用 |
| CN109055473A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-21 | 湖南宝利士生物技术有限公司 | 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法 |
| US20210340504A1 (en) * | 2018-10-09 | 2021-11-04 | Intrexon Corporation | Cells and Methods for the Production of Ursodeoxycholic Acid and Precursors Thereof |
| CN109402212B (zh) * | 2018-11-29 | 2021-01-05 | 江苏邦泽生物医药技术股份有限公司 | 生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用 |
| CN110387360B (zh) * | 2019-06-18 | 2021-12-28 | 华东理工大学 | 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 |
| CN110643556A (zh) * | 2019-08-23 | 2020-01-03 | 浙江工业大学 | 一种共表达烯醛还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组基因工程菌及其应用 |
| CN113025587B (zh) * | 2019-12-25 | 2023-11-21 | 上海奥博生物医药股份有限公司 | 7β-羟基类固醇脱氢酶筛选方法、编码基因及应用 |
| US20230243819A1 (en) * | 2020-01-07 | 2023-08-03 | Beijing Strong Biotechnologies, Inc. | Glucose-6-phosphate dehydrogenase mutant and use thereof in preparing detection reagent |
| CN113430183B (zh) * | 2021-08-16 | 2022-08-23 | 重庆大学 | 7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A |
| CN113832122B (zh) * | 2021-10-19 | 2023-06-16 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用 |
| CN114134067A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-04 | 山东睿智医药科技有限公司 | 一种大肠杆菌及应用 |
| CN114015740B (zh) * | 2021-11-18 | 2023-07-21 | 常德云港生物科技股份有限公司 | 一种猪胆盐的生产方法 |
| KR20240066502A (ko) | 2022-10-31 | 2024-05-16 | 에이스바이오팜 주식회사 | 7-beta-HSDH의 변이체 및 7-alpha-HSDH를 이용한 단일 용기 반응 우르소데옥시콜산 생산방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19931847A1 (de) | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Basf Ag | Immobilisierte Lipase |
| DE10019377A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien und Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Materialien für chirale Synthesen |
| DE10019380A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von kovalent gebundenen biologisch aktiven Stoffen an Polyurethanschaumstoffen sowie Verwendung der geträgerten Polyurethanschaumstoffe für chirale Synthesen |
| EP2105500A1 (de) * | 2008-03-26 | 2009-09-30 | Pharmazell GmbH | Neue 12alpha-Hydroxysteroiddehydrogenasen, deren Herstellung und deren Verwendung |
| CN102791876B (zh) | 2009-11-30 | 2016-06-08 | 细胞制药有限公司 | 新的7β-羟类固醇脱氢酶及它们的用途 |
| EP2576600B1 (de) | 2010-05-27 | 2018-01-24 | Pharmazell GmbH | Neuartige 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase-knockout-mutanten und deren verwendung |
| US20140087421A1 (en) | 2010-12-16 | 2014-03-27 | Pharmazell Gmbh | NOVEL 7Beta-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE MUTANTS AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF URSODEOXYCHOLIC ACID |
| KR102640531B1 (ko) | 2014-06-24 | 2024-02-23 | 파마젤 게엠베하 | 디하이드로콜린산 화합물의 생체촉매적 전세포 환원을 위한 방법, 7β-히드록시스테로이드 탈수소효소 변이체들 및 우르소데스옥시콜린산을 제조하기 위한 개선된 생체촉매 방법 |
| JP6582040B2 (ja) | 2014-07-29 | 2019-09-25 | ファルマツェル、ゲーエムベーハー | ７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体およびウルソデオキシコール酸の製造方法 |
| CN105274070B (zh) | 2015-10-20 | 2019-01-22 | 苏州天绿生物制药有限公司 | 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法 |
-
2017
- 2017-06-19 KR KR1020197000652A patent/KR20190018675A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-06-19 PT PT177320777T patent/PT3472339T/pt unknown
- 2017-06-19 JP JP2019518138A patent/JP7035034B2/ja active Active
- 2017-06-19 US US16/309,580 patent/US11634743B2/en active Active
- 2017-06-19 EP EP17732077.7A patent/EP3472339B1/en active Active
- 2017-06-19 WO PCT/EP2017/064924 patent/WO2017220486A2/en active Search and Examination
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210050479A (ko) * | 2019-10-28 | 2021-05-07 | 한국화학연구원 | 공융용매를 이용한 우르소데옥시콜산의 제조방법 |
| KR20230045755A (ko) | 2021-09-28 | 2023-04-05 | 경희대학교 산학협력단 | 신규한 콜린산 유도체 및 이의 용도 |
| WO2023075295A1 (ko) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | 에이스바이오팜 주식회사 | 7-keto-lca에서 우르소데옥시콜산으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스 균주 유래 7-beta-hsdh의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017220486A3 (en) | 2018-02-08 |
| US20200407766A1 (en) | 2020-12-31 |
| EP3472339B1 (en) | 2020-09-02 |
| US11634743B2 (en) | 2023-04-25 |
| WO2017220486A2 (en) | 2017-12-28 |
| EP3472339A2 (en) | 2019-04-24 |
| JP7035034B2 (ja) | 2022-03-14 |
| PT3472339T (pt) | 2020-12-04 |
| JP2019517826A (ja) | 2019-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7035034B2 (ja) | ケノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸への共役自己完結型（ｓｅｌｆ－ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）生体内変換および前記方法において適用可能な新規酵素突然変異体 | |
| US11981935B2 (en) | 7β-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and process for the preparation of ursodeoxycholic acid | |
| US11198896B2 (en) | 7-beta-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and process for the preparation of ursodeoxycholic acid | |
| JP6305451B2 (ja) | 新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその使用 | |
| US11306343B2 (en) | 3α-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and process for the preparation of ursodeoxycholic acid | |
| KR20110014980A (ko) | 신규의 １２ 알파-히드록시스테로이드 탈수소효소, 그의 제조 및 용도 | |
| NZ727548A (en) | Transponder module and access module for activating and configuring such transponder module | |
| NZ728430B2 (en) | 3-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and process for the preparation of ursodeoxycholic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |