KR20110014980A - 신규의 １２ 알파-히드록시스테로이드 탈수소효소, 그의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소, 그를 코딩하는 핵산 서열, 발현 카세트 및 벡터, 상응하는 코딩 핵산 서열을 함유하는 재조합 미생물, 상기 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 제조 방법, 상기 효소를 사용한 12α-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법, 상기 효소를 사용한 12-케토스테로이드의 효소적 환원 방법, 상기 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용한 12-케토스테로이드 및/또는 12α-히드록시스테로이드의 정성적 또는 정량적 결정 방법, 및 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용한 효소-촉매화 콜린산 산화를 포함하는 우르소데옥시콜린산의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규의 １２ 알파-히드록시스테로이드 탈수소효소, 그의 제조 및 용도{NOVEL 12 ALPHA-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASES, PRODUCTION AND USE THEREOF}

본 발명은 신규의 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소, 핵산 서열, 그를 코딩하는 발현 카세트 및 벡터; 적절한 코딩 핵산 서열을 포함한 재조합 미생물; 이러한 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 제조 방법; 이러한 효소를 사용한 12α-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법; 이러한 효소를 사용한 12-케토스테로이드의 효소적 환원 방법, 본 발명에 따른 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용한 12-케토스테로이드 또는 12α-히드록시스테로이드의 정성적 또는 정량적 결정 방법; 및 본 발명에 따른 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 사용한 효소-촉매화 콜린산 산화를 포함하는 우르소데옥시콜린산의 제조 방법에 관한 것이다.

12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 (12α-HSDH) (E.C.1.1.1.176)는 입체특이적 합성, 예를 들어 콜린산의 산화를 위해 중요한 생체촉매이다.

클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50으로부터의 12α-HSDH, 및 NAD⁺ 및 NADP⁺ 세파로즈 크로마토그래피에 의한 그의 부분 정제에 관한 연구는 마호니(Mahony) 등에 의해 문헌 [Mahony, D.E. et al. Appl Environ Microbiol, 1977, 34(4): p.419-23] 및 [MacDonald et al. (MacDonald, I.A. et al. Journal of Lipid Research, 1979, 20234-239]에 기재되어 있다.

콜린산으로부터 우르소데옥시콜린산의 3개의 상이한 합성 경로 과정에서 서더랜드(Sutherland) 등에 의하여 클로스트리듐 군 P로부터 상응하여 제조된 12α-HSDH-함유 단백질 추출물이 사용되었다. 여기에서 합성 경로의 하나는 콜린산의 12-케토-케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)으로의 효소-촉매화 산화를 포함하였다 [Sutherland, J.D. et al., Prep Biochem, 1982, 12(4): p.307-21]. 클로스트리듐 종. 군 P 균주 48-50 DSM 4029로부터의 세포 용해물을 여기에서 효소 제제로서 사용하였다. 반응은 화학양론적 양의 보조인자 NADP⁺를 필요로 한다.

보조인자의 필요성은 보조인자-재생 효소와의 결합에 의해 감소될 수 있다. 이를 위하여, 선행 기술은 예를 들어 글루타메이트 탈수소효소 (GLDH)의 사용을 교시하며, 12α-HSDH-함유 단백질 추출물 클로스트리듐 군 P와 함께 동시-고정화된다 [Carrea, G. et al., Biotechnology and Bioengineering, 1984, 26(5): p.560-563]. GLDH는 α-케토글루타레이트를 글루타메이트로 환원적 아민화하는 동시에 NADPH를 NADP⁺로 재산화시킨다. 이것에 대안적으로, 알콜 탈수소효소 ADH-Tb, ADH-Lb 및 ADH-ms가 보조인자 재생을 위해 제안된다 [Fossati, E. et al., Biotechnol Bioeng, 2006, 93(6): p.1216-20]. ADH는 NADP⁺의 재생과 함께 아세톤을 2-프로판올로 전환시킨다. 10 ml 규모에서의 반응을 위하여, 순수한 단백질이 아니라, 통상적인 제제 (ASA Spezialenzyme, Wolfenbuettel, Germany)로부터 더욱 풍부하게 된 12 U/단백질 mg의 비활성을 가진 12α-HSDH-함유 단백질 분획이 여기에서 다시 사용되었다.

12α-HSDH의 공급원이 병원성이고 혐기성인 균주 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50이라는 것은, 상기 기재된 모든 연구에 공통적이다. 전체 단백질 내에서 효소의 작은 비율 (클로스트리듐 종의 총 단백질의 최대 1%) 때문에, 한편으로는 산업적으로 이용가능한 양의 효소를 얻는 것이 어렵다. 다른 한편으로는, 병원성 생성 균주의 전체 배양 및 저장은 위험군 2의 미생물 작업 면허를 가진 플랜트에서 수행되어야 하기 때문에, 이것의 산업적 제조는 복잡하고 고 비용인 것으로 판명된다 (BioStoffV 참조).

추가로, 이러한 생성 균주의 병원성은 문제가 되는 제약학적 중간체의 합성에서 12α-HSDH를 사용한다. GMP 규제 요건에 따른 제조 방법의 면허를 위하여, 비병원성 효소 공급원이 필요하다.

락테이트 탈수소효소 (LDH; NAD⁺의 재생과 함께 피루베이트의 락테이트로의 전환)에 의한 보조인자 재생과 함께, NAD⁺-의존성 12α-HSDH에 의해 촉매화된 콜린산 산화가 EP-A-1 731 618에 기재되어 있다.

클로스트리듐 종. 군 P 균주 48-50으로부터의 야생형 효소 및 N-말단 아미노산 서열 및 N-말단 아미노산 서열을 위한 염료 컬럼 친화성 크로마토그래피를 기초로 하는 2단계 정제 방법이 또한 제안되었다 [Braun, M. et al., Eur J Biochem. 1991, 196(2): p.439-50]. 공개된 N-말단 서열은 29개 아미노산 잔기를 포함하는 부분 서열이고, 그의 N-말단은 다음과 같다: Met-Ile-Phe-Asp-Gly-Lys-Val-……. 또한, 이러한 연구 군에 의한 정제를 위해서는 상업적으로 입수가능한 컬럼 물질이 사용되지 않았다.

현재, 클로스트리듐 종. 군 P 균주 48-50으로부터의 12α-HSDH-함유 추출물은 ASA Spezialenzyme (Wolfenbuettel, Germany)에 의해 시판된다. 그러나, 연구는 다량의 총 단백질이 사용되기 때문에 이러한 상업적인 제제의 낮은 비활성이 12α-HSDH-촉매화 효소 반응의 반응 생성물의 추출 및 처리를 복잡하게 한다는 것을 밝히고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 콜린산을 12-케토케노데옥시콜린산(12-케토-CDCA)로 효소-촉매화 산화시키는데 있어서 산업적 규모로 제약학적 활성 성분 합성에서 제조적 사용에 적절한 형태로 12α-HSDH (특히 NADP⁺-의존성 효소)를 이용가능하게 하는 것이다.

<도면의 간단한 설명>

첨부된 도면에서,

도 1은 본 발명에 따른 12α-HSDH의 장쇄 형태 (HSDH_장쇄)의 유전자 및 단백질 서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 12α-HSDH의 단쇄 형태 (HSDH_단쇄)의 유전자 및 단백질 서열 및 그에 비교하여 문헌 [Braun, M. et al, loc.cit.]에 따른 공개된 불완전 부분 서열을 나타낸다.

도 3은 공지된 미생물 HSDH 및 본 발명에 따른 HSDH의 다중-서열 정렬 부분을 나타낸다. 고 보존 위치는 "*"로 표시되며, 가변 위치는 ":"로 표시된다. 단백질 수준에서 기능을 조사하거나 밀접하게 관련된 종에서 종분화적 상동성(orthology)을 갖는 미생물 히드록시스테로이드 탈수소효소 (좌측 컬럼은 관련된 획득 번호 및 근원 유기체를 나타낸다)를 본 발명에 따라 결정된 서열 HSDH_단쇄 (Csp2594)와 비교하였다. 공지된 HSDH 균주는 에스케리키아 콜리 (ECOLI), 버크홀데리아 말레이(BURM), 박테로이데스 프라길리스 (BACFR), 클로스트리듐 소르델리 (CLOSO), 클로스트리듐 디피실 (CLOD), 유박테리움 종 (EUBSP), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (MYCTU) 및 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스 (STREX)로부터 유래된다.

도 4는 BL21 및 로제타^TM (DE3) 세포의 세포 용해물에서 4 또는 22시간 후에 본 발명에 따른 12α-HSDH 효소의 발현을 나타낸다. 12α-HSDH ("장쇄" 및 "단쇄")를 4 또는 22시간 동안 BL21 및 로제타^TM (DE3) 세포에서 발현시켰다. 이어서, 세포를 붕괴시키고 20 ㎍의 단백질을 적용하였다. 표적 단백질 (12α-HSDH)가 27 kDa에서 발견된다.

도 5는 500 ml 규모에서 12K-CDCA의 제조 동안에 340 nm에서 흡광도 과정을 나타낸다.

도 6은 12α-HSDH의 위치선택성의 확인을 위해 반응 배치의 박층 크로마토그램을 나타내고, 여기에서 콜린산(1) 및 12-케토-케노데옥시콜린산(2)을 참조로서 사용하며; 반응 배치를 HSDH_장쇄 (3) 및 HSDH_단쇄 (4)와 비교하였다.

도 7은 12α-HSDH 변이체 37D12의 단백질 및 핵산 서열을 나타낸다.

도 8은 결합된 NADPH, 결합된 기질 및 돌연변이 위치 97 (Gln 97)을 가진 클로스트리듐 종. DSM 4029로부터의 12α-HSDH의 상동성 모델을 나타낸다.

도 9는 12α-HSDH 및 변이체 37D1의 활성의 비교를 나타낸다. 콜린산 및 12-케토케노데옥시콜린산 (총 농도 5 mM)의 다양한 비율 백분율 (전환율 %)에서 12α-HSDH 및 변이체 37D12의 활성을 나타낸다. 0.25 mM NADP⁺에서 반응을 시작하였다. 60초에 걸쳐 흡광도 변화를 결정하고, 최고의 선형성을 가진 30초의 범위에 걸쳐 활성을 계산하였다 (야생형 0-30초, 37D12 30-60초). 상대적 HSDH 활성이란 5 mM 콜린산 (0% 전환율)을 가진 활성을 가리키고, 그의 절대 활성을 100%로 설정하였다. N=3에서 활성 측정의 평균 값 및 표준 오차를 나타낸다.

발명의 요약

상기 목적은 놀랍게도 코딩 핵산 서열의 첫 번째 해설 및 클로스트리듐 군 P 균주 C48-50에서 발생하는 12α-HSDH 효소의 올바르고 완전한 아미노산 서열의 설명에 의해 달성되었다.

놀랍게도, 특히, 문헌에 기재된 N-말단 아미노산 서열은 실제 N-말단 아미노산 서열에 상응하지 않고, 추가로 12α-HSDH는 장쇄 형태 (HSDH_장쇄) 및 N-말단 절단된 단쇄 형태 (HSDH_단쇄)로 존재한다는 것이 밝혀졌다.

본 발명에 따라 상기 목적을 달성하는 것은, 선행 기술에서 상이한 길이, 특히 상이한 N 말단을 가진 12α-HSDH 효소가 존재한다는 것을 인식하지 못했고 선행 기술로부터의 잘못된 서열 정보가 올바른 프라이머 합성과 코딩 서열의 위치결정 및 증폭을 방해했기 때문에 더욱 놀라운 것으로 보인다.

또한, 문헌 [Braun, M. et al., loc.cit.]의 연구에 추가로, 단쇄 탈수소효소/환원효소의 부류에 속하는 효소를 위해 공개된 서열을 가진 더욱 체계적인 연구를 수행하였으며, 여기에 특히 12α-HSDH가 속한다. 이러한 효소 군을 위하여, 특징적인 N-말단 서열 모티프, 즉 T-G-X₃-G-X-G는 문헌 [Oppermann et al. Chemo-Biological Interactions, 2003, 143-144, 247-253]에 자명하게 기재되어 있다. 이러한 서열 모티프는 1991년 [Braun, M. et al., loc.cit.]로부터 공개된 12α-HSDH 서열에서 찾아볼 수 없으며, 이 때문에 12α-HSDH를 위해 원래 개시된 부분 서열 정보의 신뢰성이 당업자의 시각에서 지금까지 문제시되고 있다.

1. 바람직한 구현양태

본 발명의 주된 주제는, 환원 조건 하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 결정된 약 26 kD 초과, 특히 약 26.5 초과, 예컨대 약 27 내지 30 kD 범위의 분자량, 및 HSDH_장쇄에 대하여 약 29 kD 초과, 특히 약 29.1 내지 29.5 kD, 예컨대 특히 29.359 kD, 또는 HSDH_단쇄에 대하여 대략 27.8의 계산된 분자량을 가진, 클로스트리듐 종으로부터 수득가능한 순수한, 특히 재조합으로 생성된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 (12α-HSDH)에 관한 것이다. 분자량 세부사항은 효소의 단백질 소단위의 분자량에 관한 것이고; 여기에 제한되지 않고 천연 단백질은 예를 들어 이러한 유형의 4개, 특히 대략 동일한 크기의 소단위로 구성된다.

특히, 이러한 단백질은 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50 (DSM4029)로부터 수득가능하다. 효소는 예를 들어 약 10, 15, 20 또는 25 U/mg 이상, 예컨대 20 내지 100 U/mg, 또는 25 내지 80 U/mg 범위의 비활성으로 제조될 수 있다. 비활성의 결정은 실험 부분에 규정된 표준 조건 하에서 수행된다.

본 발명은 특히, 하기 아미노산 서열 모티프 중 적어도 하나를 포함하는, 이러한 유형의 순수한, 특히 재조합으로 생성된 12α-HSDH에 관한 것이다:

a)

b)

c)

으로부터 선택된 N-말단 서열

d)

또는 그로부터 유래된 서열, 예를 들어: GDPELDI, FGDPELD, DPELDI, FGDPEL, GDPEL, DPELD, GDPELD.

또한, 본 발명에 따른 효소는, 이들이 유형 TGX₃GXG (여기에서 X는 원하는 아미노산 잔기를 나타낸다)의 N-말단 (즉, 약 1 내지 30 아미노산 잔기의 N-말단 범위) 서열 모티프를 갖지 않음을 특징으로 한다.

본 발명은 특히

a) 위치 +1 또는 +2에서 시작하는 각각의 경우에, 서열 2 또는 4에 따른 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나; 또는

b) 적어도 60%의 서열 동일성 백분율을 갖는, a)에 따른 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는

c) a) 및 b)에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나; 또는

d) 서열 1 또는 3에 따른 코딩 핵산 서열에 의해; 또는 발현을 위해 사용되는 유기체의 개개의 코돈 이용에 적응하여 그로부터 유래된 서열에 의해 코딩되거나; 또는

e) 적어도 60%의 서열 동일성 백분율을 갖는, 서열 1 또는 3에 따른 핵산 서열로부터 유래된 코딩 서열에 의해 코딩되는,

순수한, 특히 재조합 제조된 12α-HSDH에 관한 것이다.

코돈 이용에 핵산 서열을 적응시키는 것은 통상적인 방법, 예를 들어 http://slam.bs.jhml.edu/cgi-bin/gd/gdRevTrans.cgi로부터 입수가능한 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 변형된 공-기질 이용 및/또는 감소된 생성물 억제를 가진 12α-HSDH 변이체; 및 특히 서열 모티프 VLTGRNE (서열 12)에서의 공-기질 이용을 변형시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는, 특히 상기 정의에 따른 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소로부터 유래된 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체의 비제한적인 예는, 서열 12에서 하기 아미노산 치환: G→D; R→A 중 적어도 하나를 가진 것; 및 효소의 기질 결합 포켓을 형성하는 아미노산 잔기 영역에서 생성물 억제를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 가진 변이체; 예를 들어 적어도 서열 4의 위치 97 및/또는 99에 상응하는 (서열 22의 위치 98 또는 100에 상응하는) 아미노산 Q의 돌연변이; 특히 서열 4에서 Q97H에 상응하는 (서열 22에서 Q98H에 상응하는) 돌연변이를 포함하는 것을 포함한다.

(서열 22에 비해) 위치 98에서 추가의 잠재적인 아미노산 치환기는 A, N, D, C, E, G, H, M, S, T, V를 포함한다. 본 발명에 따른 HSDH의 상동성 모델을 기준으로 하여, 치환에 의해 생성물의 카르복실 결합이 약해지는 것으로 추측된다. 따라서, 인접한 위치 S100 (서열 22 기준)이 하기 아미노산: A, N, D, C, Q, E, G, H, M, T, V, K로 돌연변이되었다.

본 발명에 따른 변이체의 군은 다음 중에서 선택되는 위치 97 또는 99 (서열 4에 따름) 또는 위치 98 또는 100 (서열 22에 따름)에서 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함한다:

본 발명은 특히, 상기 기재된 12α-HSDH-코딩 핵산 서열 중 적어도 하나의 이종 발현에 의해 수득가능한 상기 정의에 따른 12α-HSDH, 특히 비병원성 미생물, 예컨대 예를 들어 에스케리키아 속의 세균, 특히 종 이.콜리에서 발현되는 재조합으로 제조되는 효소에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의에 따른 핵산 서열; 적어도 하나의 조절 핵산 서열의 유전적 조절 하에 적어도 하나의 코딩 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트; 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터; 및 적어도 하나의 핵산 서열 또는 발현 카세트를 보유하거나, 또는 적어도 하나의 벡터와 함께 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하고, 발현된 12α-HSDH를 배양액으로부터 단리하는, 상기 정의에 따른 12α-HSDH의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 히드록시스테로이드를 본 발명에 따른 12α-HSDH의 존재하에서 반응시키고, 형성된 적어도 하나의 산화 생성물을 반응 배치로부터 임의로 단리시키는, 12α-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법에 관한 것이다. 반응은 여기에서 호기적으로 (즉, 산소의 존재 하) 또는 혐기적으로 (즉, 필수적으로 산소의 배제와 함께), 특히 호기적으로 수행될 수 있다.

특히, 여기에서 히드록시스테로이드는 콜린산 (CA) 또는 콜린산 유도체, 예컨대 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르일 수 있다. 바람직하게는, CA 또는 그의 유도체는 반응하여 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)을 제공하거나 또는 상응하는 유도체를 제공한다. 특히, 상기 반응은 NADP⁺ 또는 NAD⁺의 존재하에 또한 이들의 화학양론적 소비에 의해 수행된다.

본 발명은 또한, 케토스테로이드를 본 발명에 따른 12α-HSDH의 존재하에 반응시키고, 형성된 환원 생성물을 반응 배치로부터 임의로 단리시키는, 12-케토스테로이드의 효소적 환원 방법에 관한 것이다. 상기 반응은 호기적으로 또는 혐기적으로, 특히 호기적으로 수행될 수 있다.

여기에서 케토스테로이드는 특히 12-케토-CDCA 또는 그의 유도체, 예를 들면 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르이다. 케토스테로이드 또는 그의 유도체는 상응하는 12α-히드록시스테로이드 또는 그의 유도체로 환원된다. 특히, 여기에서 NADPH 또는 NADH의 존재 하에서 반응을 수행한다.

상기 산화환원 반응의 바람직한 구현양태에서, 소모된 산화환원 균등물은 전기화학적 또는 효소적으로 재생될 수 있다. 적절한 효소적 재생 체계는 시작 부분에 이미 설명되었다. 본 발명자들은 이러한 공보의 개시내용을 참조한다. 적절한 효소의 비제한적인 예는 글루타메이트 탈수소효소, 알콜 탈수소효소 및 락테이트 탈수소효소이다. 예를 들어 WO-A-01/88172 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 전기화학적 재생 방법은 예를 들어 히드리도로듐 산화환원 촉매를 기초로 한다.

상기 산화환원 반응의 추가의 구현양태에서, 이들은 고정화 형태로 12α-HSDH를 이용하여 수행될 수 있다. 보조인자 재생을 위해 임의로 사용된 효소가 마찬가지로 고정화될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 산화환원 반응 또는 합성 전체 과정에서 부분적인 반응 단계를 수행하기 위한 바이오반응기에 관한 것이다.

본 발명은 또한 12-케토스테로이드 또는 12α-히드록시스테로이드의 정량적 또는 정성적 검출 방법에 관한 것이고, 여기에서 본 발명에 따른 12α-HSDH에 의해 촉매화된 산화환원 반응의 스테로이드를 산화환원 균등물의 존재 하에서 수행하고, 산화환원 균등물의 농도 변화를 결정하고 그로부터 12-케토스테로이드 또는 12α-히드록시스테로이드의 함량을 정성적 또는 정량적으로 결정한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 12α-HSDH에 의해 촉매화된 적어도 하나의 반응 단계를 포함하는, 콜린산(CA)으로부터 우르소데옥시콜린산(UDCA)의 합성 방법에 관한 것이다. 이 반응 단계는 호기적 또는 혐기적으로, 특히 호기적으로 수행될 수 있다. 3개의 적절한 반응 서열은 예를 들어 문헌 [Sutherland et al., loc.cit.] (여기에서 참고문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. 하기 합성 경로 1 내지 3 (여기에서 UCA는 우르소콜린산을 나타내고 CDCA는 케노데옥시콜린산을 나타낸다)이 기재되어 있다:

제1 경로

CA → 12-케토-CDCA (12α-HSDH에 의해 효소적으로)

12-케토-CDCA → 12-케토-UDCA (7α- 및 7β- HSDH에 의해 효소적으로)

12-케토-UDCA → UDCA (화학적으로, 울프-키시너 환원)

제2 경로

CA → UCA (7α- 및 7β- HSDH에 의해 효소적으로)

UCA → 12-케토-UDCA (12α-HSDH에 의해 효소적으로)

12-케토-UDCA → UDCA (화학적으로, 울프-키시너 환원)

제3 경로

CA → 12-케토-CDCA (12α-HSDH에 의해 효소적으로)

12-케토-CDCA → 12-CDCA (화학적으로, 울프-키시너 환원)

CDCA → UDCA (전체 클로스트리듐 앱소눔 세포)

그러나, 본 발명은 특히 하기 제4 경로에 관한 것이다.

제4 경로

이것은 하기 화학식 1의 우르소데옥시콜린산의 제조에 관한 것이며

(상기 식에서,

R은 알킬, NR¹R², H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺를 나타내고, 여기에서 라디칼 R³은 동일하거나 상이하며 H 또는 알킬을 나타낸다),

여기에서

a) 하기 화학식 2의 콜린산(CA)을 본 발명에 따른 12α-HSDH의 존재 하에 화학식 3의 상응하는 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)으로 산화시키고

(상기 식에서, R은 상기 나타낸 의미를 갖고, 라디칼 R_a은 동일하거나 상이하고 H 또는 아실을 나타낸다)

(상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다);

b) 화학식 3의 12-케토-CDCA를 탈산소화에 의해, 예를 들어 울프-키시너 환원에 의해 반응시켜 화학식 4의 케노데옥시콜린산(CDCA)을 수득하고

(상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다);

c) 화학식 4의 CDCA를 위치 7에서 화학식 5의 7-케토리소콜린산(KLCA)로 화학적 산화시키고

(상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다);

d) 화학식 5의 KLCA를 환원시키고, R_a가 아실을 나타낸다면 이 아실을 임의로 제거하고;

e) 반응 생성물을 임의로 더 정제하는 것을 포함한다.

여기에서, R_a가 아실을 나타낸다면, 이러한 아실 기는 반응 단계 b) 또는 d)를 수행한 후에 임의로 제거될 수 있다.

또한, 단계 a)의 반응은 NAD(P)⁺의 존재 하에서 일어날 수 있다.

또한, 소모된 NAD(P)⁺를 자체로 공지된 방식으로 전기화학적 또는 효소적으로 재생할 수 있고/있거나 사용된 효소가 고정화 형태로 발생할 수 있다.

2. 일반적인 정의

다른 세부사항이 주어지지 않는다면, 용어 "12α-HSDH"는 NAD⁺ 또는 NADP⁺의 화학양론적 사용에 의해, 적어도 콜린산의 12-케토케노데옥시콜린산으로의 입체특이적 산화를 촉매화하는 탈수소효소를 나타낸다. 여기에서 효소는 천연 또는 재조합으로 제조된 효소일 수 있다. 효소는 원칙적으로 세포, 예를 들어 단백질 불순물과의 혼합물로, 그러나 바람직하게는 순수한 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따르면, "순수한 형태" 또는 "순수한" 또는 "필수적으로 순수한" 효소는, 통상적인 단백질 검출 방법, 예를 들어 비우레트 방법 또는 로우리(Lowry) 등의 단백질 검출 방법 (cf. [R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)] 설명)의 도움을 받아 결정 시에 전체 단백질 함량을 기준으로 하여, 80 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과, 특히 95 중량% 초과, 특히 99 중량% 초과의 순도를 가진 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 여기에서 본 발명에 따른 12α-HSDH 효소의 비활성은 상기 나타낸 범위 내이다.

"산화환원 균등물"은 전자 공여체 또는 전자 수용체, 예를 들어 니코틴아미드 유도체, 예컨대 NAD⁺ 및 NADH⁺ 또는 그들의 환원된 형태 NADH 또는 NADPH로서 이용가능한 저 분자량 유기 화합물을 의미하는 것으로 이해된다.

특정한 유형의 화합물, 예를 들어 "콜린산 화합물" 또는 "우르소데옥시콜린산 화합물"은 특히 기초 출발 화합물 (예를 들어, 콜린산 또는 우르소데옥시콜린산)의 유도체를 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 유도체는 "염", 예를 들어 알칼리 금속 염, 예컨대 화합물의 리튬, 소듐 및 포타슘 염; 및 암모늄 염을 포함하고, 여기에서 암모늄 염은 NH₄ ⁺ 염 또는 적어도 하나의 수소 원자가 C₁-C₆-알킬 라디칼로 치환될 수 있는 암모늄 염을 포함한다. 전형적인 알킬 라디칼은 특히 C₁-C₄-알킬 라디칼, 예컨대 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸, 및 n-펜틸 및 n-헥실 및 그의 단일 또는 다중 분지화 유사체이다.

본 발명에 따른 화합물의 "알킬 에스테르"는 특히 저-알킬 에스테르, 예를 들어 C₁-C₆-알킬 에스테르이다. 언급될 수 있는 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸 에스테르, 또는 장쇄 에스테르, 예를 들어 n-펜틸 및 n-헥실 에스테르 및 그의 단일 또는 다중 분지화 유사체이다.

"아미드"는 특히 본 발명에 따른 산과 암모니아 또는 1차 또는 2차 모노아민의 반응 생성물이다. 이러한 아민은 예를 들어 모노- 또는 디-C₁-C₆-알킬 모노아민이고, 여기에서 알킬 라디칼은 예를 들어 카르복실, 히드록실, 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br, I), 니트로 및 술포네이트 기에 의하여 서로 독립적으로 임의로 더욱 치환될 수 있다.

본 발명에 따른 "아실 기"는 특히 2 내지 4개 탄소 원자를 가진 비방향족 기, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐 및 부티릴, 및 임의로 치환된 단일핵 방향족 고리를 가진 방향족 기이고, 여기에서 적절한 치환기는 예를 들어 히드록실, 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br, I), 니트로 및 C₁-C₆-알킬 기, 예를 들어 벤조일 또는 톨루오일로부터 선택된다.

본 발명에 따라 사용되거나 제조된 히드록시스테로이드 화합물, 예컨대 콜린산, 글리코콜린산, 타우로콜린산, 우르소데옥시콜린산, 12-케토케노데옥시콜린산, 케노데옥시콜린산 및 7-케토리소콜린산이 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있거나, 또는 입체이성질적으로 순수한 형태로 또는 다른 입체이성질체와의 혼합물로 그로부터 수득될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 사용되거나 제조된 화합물은 필수적으로 입체이성질적으로 순수한 형태로 사용되고/되거나 단리된다.

본 발명에 따르면 "고정화"는 고체 담체 물질, 즉 주변 액체 배지에 필수적으로 불용성인 물질에 본 발명에 따라 사용되는 생체촉매, 예를 들어 12α-HSDH를 공유 또는 비공유 결합하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

12α-HSDH의 "생성물 억제"는 효소에 의해 촉매화된 효소 반응에서 형성되는 생성물의 존재 하에서 효소 활성의 감소를 설명한다. CA를 제공하기 위한 반응의 경우에, 예를 들어 12-케토-CDCA에 의한 억제가 관찰되어야 한다. "생성물 억제의 감소"는, 각각의 경우에 0% 전환율 (5 mM CA에 상응함)에서 결정되는 100% 활성 값으로서의 효소 활성에 대하여, 참조 체계, 예를 들어 천연 HSDH 효소에 비하여 본 발명에 따른 효소 변이체의 효소 활성에서의 감소된 백분율 저하를 설명한다. 이러한 감소는 실험 항목 또는 도 9의 설명에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 생성물 억제의 감소는 변이체의 잔류 활성 대 참조 체계의 비율로 표현될 수 있고, 각각의 경우에 동일한 전환율 백분율에서 결정된다. 따라서, 본 발명에 따른 변이체는 계수 1.1 내지 100, 예를 들어 1.5 내지 20 또는 2 내지 10 만큼 증가되는 활성을 가질 수 있다.

3. 본 발명의 추가의 구현양태

3.1 단백질

본 발명은 실제로 개시된 12α-HSDH 활성을 가진 단백질 및/또는 효소에 제한되지 않으며, 반대로 그의 작용성 균등물까지 확장된다.

본 발명의 내용에서, "작용성 균등물" 또는 실제로 개시된 효소의 유사체는 그와는 상이한 폴리펩티드이고, 이것은 원하는 생물학적 활성, 예를 들어 12α-HSDH 활성을 더욱 갖는다.

따라서, "작용성 균등물"은 예를 들어 12α-HSDH 활성을 위해 사용되는 시험에서 여기에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 효소의 적어도 1%, 예를 들어 적어도 10% 또는 20%, 예를 들어 적어도 50% 또는 75% 또는 90%의 높거나 낮은 활성을 가진 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 작용성 균등물은 또한 바람직하게는 pH 4 내지 11에서 안정하고 유리하게는 pH 6 내지 10, 바람직하게는 특히 8.5 내지 9.5의 범위에서 최적의 pH를 갖고 15 ℃ 내지 80 ℃ 또는 20 ℃ 내지 70 ℃, 예를 들어 약 45 ℃ 내지 60 ℃ 또는 대략 50 ℃ 내지 55 ℃ 범위에서 최적의 온도를 갖는다.

다양한 공지된 시험에 의해 12α-HSDH 활성이 검출될 수 있다. 이에 제한되지 않지만, 실험 항목에서 정의된 것과 같은 표준화 조건 하에서 참조 기질, 예를 들어 콜린산을 사용한 시험을 언급할 수 있다.

본 발명에 따르면, "작용성 균등물"이란, 특히 상기 언급된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 서열 위치에서 실제로 언급된 것 이외의 아미노산을 함유하지만 그럼에도 불구하고 상기 언급된 생물학적 활성의 하나를 갖는 "변이체"를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, "작용성 균등물"은 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환, 결실 및/또는 역전에 의해 수득가능한 변이체를 포함하고, 여기에서 언급된 변화는 본 발명에 따른 성질 양상을 가진 변이체를 유도하는 이상 어떠한 서열 위치에서 일어날 수 있다. 변이체와 비변화 폴리펩티드 간의 반응성 패턴이 정성적으로 일치한다면, 다시 말해서 예를 들어 동일한 기질이 상이한 비율로 전환된다면, 작용성 균등물이 특히 부여된다. 적절한 아미노산 치환의 예를 하기 표에 요약한다:

상기 의미에서 "작용성 균등물"은 기재된 폴리펩티드의 "전구체" 및 폴리펩티드의 "작용성 유도체" 및 "염"이다.

여기에서 "전구체"는 바람직한 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않은 폴리펩티드의 천연 또는 합성 전구체이다.

표현 "염"은 카르복실 기의 염 및 본 발명에 따른 단백질 분자의 아미노기의 산 부가 염 양쪽 모두를 의미하는 것으로 이해된다. 카르복실 기의 염은 자체로 공지된 방법으로 제조될 수 있고, 무기 염, 예를 들어 소듐, 칼슘, 암모늄, 철 및 아연 염, 및 유기 염기와의 염, 예를 들어 아민, 예컨대 트리에틸아민, 아르기닌, 리신, 피페리딘 등을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 산 부가 염, 예를 들어 미네랄 산과의 염, 예컨대 염산 또는 황산과의 염, 및 유기 산과의 염, 예컨대 아세트산 및 옥살산과의 염에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드의 "작용성 유도체"는 마찬가지로 공지된 기술에 따라 작용성 아미노산 측쇄 기 또는 그의 N- 또는 C-말단에서 생성될 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어 카르복실산 기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1차 또는 2차 아민과의 반응에 의해 수득가능한 카르복실산 기의 아미드; 아실 기와의 반응에 의해 제조되는 유리 아미노 기의 N-아실 유도체; 또는 아실 기와의 반응에 의해 제조되는, 유리 히드록실 기의 O-아실 유도체를 포함한다.

"작용성 균등물"은 다른 유기체로부터 입수가능한 폴리펩티드, 및 천연 발생 변이체를 물론 포함한다. 예를 들어, 상동성 서열 영역의 범위는 서열 비교에 의해 확립될 수 있고, 본 발명의 정확한 설명에 따라 균등한 효소가 결정될 수 있다.

"작용성 균등물"은 마찬가지로 예를 들어 원하는 생물학적 기능을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편, 바람직하게는 개개의 도메인 또는 서열 모티프를 포함한다.

"작용성 균등물"은 또한 상기 언급된 폴리펩티드 서열 또는 그로부터 유래된 작용성 균등물의 하나 및 작용성 N- 또는 C-말단 결합에 그와는 작용적으로 상이한 (즉, 융합 단백질 부분의 상호 의미있는 작용적 손상을 갖지 않는) 적어도 하나의 추가의 이종 서열을 함유하는 융합 단백질이다. 이러한 이종 서열의 비제한적인 예는 예를 들어 시그날 펩티드, 히스티딘 앵커(anchor) 또는 효소이다.

본 발명에 따라 추가로 포함되는 "작용성 균등물"은 실제로 개시된 단백질에 대한 상동체이다. 이들은 실제로 개시된 아미노산 서열 중 하나에 대해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448]의 연산에 따라 계산하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 85%, 예를 들어 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 상동성 (또는 동일성)을 갖는다. 본 발명에 따른 상동성 폴리펩티드의 상동성 또는 동일성 백분율은 특히 여기에 실제로 기재된 아미노산 서열 중 하나의 전체 길이에 대해 아미노산 잔기의 동일성 백분율을 의미한다.

동일성 백분율 값은 BLAST 정렬, 연산 blastp (단백질-단백질 BLAST), 또는 하기 나타낸 클러스탈(Clustal) 조절의 사용에 의해 결정될 수 있다.

가능한 단백질 글리코실화의 경우에, 본 발명에 따른 "작용성 균등물"은 탈글리코실화 또는 글리코실화 형태로 상기 나타낸 형태의 단백질 및 글리코실화 패턴의 변형에 의해 수득가능한 변형된 형태를 포함한다.

본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩티드의 상동체는 돌연변이유발에 의해, 예를 들어 단백질의 점 돌연변이, 신장, 또는 절단에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질의 상동성은 변이체, 예를 들어 절단 변이체의 조합 뱅크의 선별에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질 변이체의 변화된 뱅크는 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 효소 결찰에 의하여 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 상동체 뱅크를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 변성 유전자 서열의 화학 합성을 DNA 합성장치에서 수행할 수 있고, 이어서 합성 유전자를 적절한 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다. 변성 유전자 집합의 사용은 잠재적인 단백질 서열의 원하는 집합을 코딩하는 혼합물 내의 모든 서열을 제조할 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, [Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3]; [Itakura et al. (1984), Annu.Rev.Biochem. 53: 323]; [Itakura et al. (1984) Science 198; 1056]; [Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477]).

점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조된 조합 뱅크의 유전자 생성물을 선별하고, 선택된 성질을 가진 유전자 생성물을 위한 cDNA 뱅크를 선별하기 위한 몇 가지 기술이 선행 기술에 공지되어 있다. 이러한 기술은 본 발명에 따른 상동체의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 뱅크를 빠르게 선별하는데 적합할 수 있다. 높은 처리량으로 분석될 수 있는 큰 유전자 뱅크를 선별하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 기술은, 유전자 뱅크를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고, 적절한 세포를 얻어지는 벡터 뱅크로 형질전환하고, 원하는 활성을 검출하는 것이, 검출되는 생성물의 유전자를 코딩하는 벡터를 수월하게 단리시키는 조건하에서, 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 상동체를 확인하기 위하여 뱅크에서 작용성 변이체의 빈도를 증가시키는 기술인 재귀적-앙상블 돌연변이유발(REM)을 선별 시험과 조합하여 사용할 수 있다 ([Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815]; [Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331]).

3.2 핵산 및 구조물

3.2.1 핵산

본 발명은 또한 12α-HSDH 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명은 또한 여기에 기재된 실제 서열에 특정한 동일성 정도를 가진 핵산에 관한 것이다.

2개의 핵산 사이의 "동일성"은 하기 매개변수의 조절과 함께 전체 핵산 길이에 걸쳐 뉴클레오티드의 동일성, 특히 각각의 경우에 클러스탈(Clustal) 방법 [Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2): 151-1]을 사용하여 인포맥스사 (USA)의 벡터 NTI 수트 7.1 소프트웨어의 도움을 받아 비교로 계산되는 동일성을 의미하는 것으로 이해된다.

다중 정렬 매개변수:

갭 시작 벌점 10

갭 연장 벌점 10

갭 분리 벌점 범위 8

갭 분리 벌점 오프

정렬 지연에 대한 % 동일성 40

잔기 특이적 갭 오프

친수성 잔기 갭 오프

전이 가중 0

이중 정렬 매개변수:

FAST 알고리즘 온

K-터플 크기 1

갭 벌점 3

윈도우 크기 5

최고의 항 수 5

이것에 대안적으로, 동일성은 문헌 [Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500]에 따라 인터넷 주소: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#에 따라 하기 매개변수로 결정될 수 있다.

DNA 갭 시작 벌점 15.0

DNA 갭 연장 벌점 6.66

DNA 기질 동일성

단백질 갭 시작 벌점 10.0

단백질 갭 연장 벌점 0.2

단백질 기질 Gonnet

단백질/DNA ENDGAP -1

단백질/DNA GAPDIST 4

여기에서 언급된 모든 핵산 서열 (단일 및 이중-가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들어 cDNA 및 mRNA)은 뉴클레오티드 구조 단위로부터의 화학적 합성에 의해 공지된 방식으로, 예를 들어 이중 나선의 개개의 중복되는 상보적 핵산 구조 단위의 단편 축합에 의하여 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학 합성은 예를 들어 공지된 방식으로 포스포아미디트 방법에 따라 수행될 수 있다 [Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, p.896-897]. 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편 및 결찰 반응의 도움을 받은 갭의 충진 및 일반적인 클론화 방법이 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드의 하나 및 합성 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 획득될 수 있는 그들의 작용성 균등물을 코딩하는, 핵산 서열 (단일- 및 이중-가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들어 cDNA 및 mRNA)에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 예를 들어 본 발명에 따른 코딩 핵산의 확인 또는 증폭을 위하여 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 사용하기 위해 사용될 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 코딩 유전자 영역의 3'- 및/또는 5'-말단의 비번역 서열을 더욱 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 실제로 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보성인 핵산 분자 또는 그의 일부를 포함한다.

본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 다른 세포 유형 및 유기체에서 상동성 서열의 확인 및/또는 클론화를 위해 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 제조할 수 있도록 한다. 이러한 프로브 또는 프라이머는 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥 또는 상응하는 안티센스 가닥의 적어도 대략 12, 바람직하게는 적어도 대략 25, 예를 들어 대략 40, 50 또는 75의 연속 뉴클레오티드에서 보통 "엄격한" 조건 (하기 참조) 하에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.

"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되고, 재조합 기술에 의해 제조된다면 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 필수적으로 갖지 않을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성된다면 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 갖지 않을 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 분자 생물학적 표준 기술 및 본 발명에 따라 입수가능한 서열 정보에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, cDNA는 하이브리드화 프로브로서 실제로 개시된 완전한 서열 또는 그의 단편의 하나 및 표준 하이브리드화 기술을 사용함으로써 적절한 cDNA 뱅크로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis,T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재됨). 또한, 개시된 서열 또는 그의 단편의 하나를 포함하는 핵산 분자는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있고, 이 서열을 기초로 하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용된다. 이러한 방식으로 증폭된 핵산을 적절한 벡터에 클론화할 수 있고 DNA 서열 분석에 의해 특징화할 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 또한 표준 합성 방법에 의해, 예를 들어 자동 DNA 합성장치에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 서열 또는 그의 유도체, 상동체 또는 이러한 서열의 일부는 예를 들어 통상적인 하이브리드화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여, 예를 들어 게놈 또는 cDNA 뱅크에 의하여 다른 세균으로부터 단리될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 본 발명에 따른 서열과 함께 표준 조건 하에서 하이브리드화된다.

"하이브리드화"는 표준 조건 하에서 거의 상보성인 서열에 결합하는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드의 능력을 의미하는 것으로 이해되는 반면, 비상보성 파트너 간의 비특이적 결합은 이러한 조건 하에 억제된다. 이를 위하여, 서열은 90 내지 100%까지 상보성일 수 있다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 서열의 성질은 예를 들어 노던 또는 서던 블롯 기술에서 또는 PCR 또는 RT-PCR에서의 프라이머 결합에서 사용될 수 있다.

하이브리드화를 위하여, 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용된다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산의 더욱 긴 단편 또는 하이브리드화를 위해 완전한 서열을 사용하는 것도 가능하다. 이러한 표준 조건은 사용되는 핵산 (올리고뉴클레오티드, 더욱 긴 단편 또는 완전한 서열)에 따라 또는 하이브리드화를 위해 핵산 유형 DNA 또는 RNA가 사용되는지에 의존하여 바뀐다. 따라서, 예를 들어 DNA:DNA 하이브리드를 위한 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드에 비하여 약 10℃ 더 낮다.

표준 조건은 예를 들어 핵산에 따라서 0.1 내지 5 x SSC (1 x SSC = 0.15M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2)의 농도를 가진 수성 완충액에서 42 내지 58℃의 온도, 또는 추가로 50% 포름아미드의 존재 하에서, 예를 들어 5× SSC, 50% 포름아미드에서 42 ℃이다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드를 위한 하이브리드화 조건은 0.1 x SSC 및 대략 20 ℃ 내지 45 ℃의 온도이고, 바람직하게는 대략 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드를 위하여, 하이브리드화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 대략 30 내지 55 ℃의 온도, 바람직하게는 대략 45 내지 55 ℃의 온도이다. 하이브리드화를 위해 규정된 온도는 일례로서 포름아미드의 부재 하에서 약 100 뉴클레오티드 길이 및 50%의 G+C 함량을 가진 핵산을 위한 계산된 융점 값이다. DNA 하이브리드화를 위한 실험 조건은 관련된 유전자 문헌, 예를 들어 [Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기재되어 있고 예를 들어 핵산의 길이, 하이브리드의 성질 또는 G+C 함량에 의존하여 당업자에게 공지된 식에 따라 계산될 수 있다. 당업자라면 하기 문헌으로부터 하이브리드화에 관한 추가의 정보를 추론할 수 있다: [Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]; [Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford]; [Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford].

"하이브리드화'는 특히 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. 이러한 하이브리드화 조건은 예를 들어 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, p. 9.31-9.57] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.

"엄격한" 하이브리드화 조건은 특히 50% 포름아미드, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 황산염 및 20 g/ml 변성 전단된 연어 정액 DNA로 구성된 용액 중에서 42 ℃에서 밤새 배양한 다음 65 ℃에서 0.1 x SSC로 필터를 세척하는 단계를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명은 또한 실제로 개시되거나 유래될 수 있는 핵산 서열의 유도체에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 추가의 핵산 서열은 예를 들어 서열 1 또는 3으로부터 유래될 수 있고 단일 또는 다중 뉴클레오티드의 첨가, 치환, 삽입 또는 결실에 의하여 그로부터 상이하지만, 원하는 성질 양상을 가진 폴리펩티드를 코딩한다.

또한, 본 발명에 따르면 "블런트" 돌연변이를 포함하거나 실제로 언급된 서열에 비하여 특별한 기원 또는 숙주 유기체의 코돈 이용에 상응하도록 변형된 핵산 서열뿐만 아니라 천연 발생 변형체, 예를 들어 스플라이스 변형체 또는 그의 대립 변형체가 포함된다.

본 발명은 마찬가지로 보존 뉴클레오티드 치환에 의해 수득가능한 서열에 관한 것이다 (즉, 관련된 아미노산은 동일한 하전, 크기, 극성 및/또는 용해성의 아미노산으로 대체된다).

본 발명은 또한 실제로 개시된 핵산의 서열 다형체에 의해 유래된 분자에 관한 것이다. 이러한 유전자 다형체는 천연 변형 때문에 집단 내에 있는 개개의 것 사이에 존재할 수 있다. 이러한 천연 변형은 보통 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1 내지 5%의 분산을 일으킨다.

서열 1 또는 3을 가진 본 발명에 따른 핵산 서열의 유도체는 예를 들어 유래된 아미노산 수준에서 전체 서열 범위에 걸쳐서 적어도 60% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 매우 특히 바람직하게는 적어도 90% 상동성을 가진 대립 변형체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다 (아미노산 수준에서의 상동성에 대하여, 폴리펩티드를 위한 상기 설명을 참조할 수도 있다). 서열의 부분 영역에 걸쳐서, 상동성이 유리하게는 더 높을 수 있다.

또한, 유도체는 본 발명에 따른 핵산 서열, 특히 서열 1 및 3, 예를 들어 진균 또는 세균 상동체, 절단된 서열, 코딩 및 비코딩 DNA 서열의 단일-가닥 DNA 또는 RNA의 상동체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 DNA 수준에서 서열 7의 상동체는 서열 7에 나타낸 전체 DNA 범위에 걸쳐서 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 매우 특히 바람직하게는 적어도 80%의 상동성을 갖는다.

또한, 유도체는 예를 들어 프로모터와의 융합을 의미하는 것으로 이해된다. 나타낸 뉴클레오티드 서열 전에 첨가된 프로모터는 적어도 하나의 뉴클레오티드 교환, 적어도 하나의 삽입, 역전 및/또는 결실에 의해 변형될 수 있지만, 프로모터의 작용성 또는 활성이 악영향을 받지 않는다. 추가로, 프로모터는 그들의 서열의 변형에 의해 활성이 증가될 수 있거나 외래 유기체의 더욱 활성의 프로모터에 의해 완전히 대체될 수 있다.

또한, 작용성 변이체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

사용된 기술에 따르면, 당업자는 완전히 무작위 또는 대안적으로 더욱 특이적인 돌연변이를 유전자 또는 대안적으로 비코딩 핵산 영역에 도입할 수 있고 (예를 들어 발현의 조절을 위해 중요하다) 이어서 유전자 뱅크를 제조한다. 이를 위해 필요한 분자 생물학적 방법은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001]에 기재되어 있다.

유전자의 변형 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 변형 방법은 장 기간 동안 당업자에게 친숙하였으며, 예를 들어 다음과 같다.

- 유전자의 단일 또는 다중 뉴클레오티드가 구체적으로 치환되는, 부위-특이적 돌연변이유발 [Trower MK (editor) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey],

- 바람직한 아미노산의 코돈이 유전자의 원하는 부위에서 대체되거나 첨가될 수 있는 포화 돌연변이유발 [Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593]; [Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1],

- 뉴클레오티드 서열이 실수로 작동하는 DNA 폴리머라제에 의해 돌연변이되는, 실수-유발(error-prone) 폴리머라제 연쇄 반응 (실수-유발 PCR) [Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739];

- 돌연변이체 균주로 유전자의 계대, 여기에서 방어 DNA 복구 메카니즘 때문에 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 증가된 돌연변이 비율이 일어난다 (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (editor) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), 또는

- DNA 셔플링, 여기에서 밀접하게 관련된 유전자의 풀을 형성하고 소화시키고 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 주형으로서 사용하며, 반복된 가닥 분리 및 재접근에 의해 최종적으로 전체 길이의 모자이크 유전자가 생성된다 (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747).

"지정된 진화" (특히 문헌 [Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, in: Demain AL, Davies JE (eds.) Manual of industrial microbiology and biotechnology, American Society for Microbiology]에 기재됨)를 사용하여, 당업자라면 선택적 방식으로 또한 대규모로 작용적 변이체를 생성할 수 있다. 여기에서, 첫 번째 단계에서 각각의 단백질의 유전자 뱅크를 먼저 제조하고, 예를 들어 상기 나타낸 방법을 사용할 수 있다. 유전자 뱅크를 적절한 방식으로, 예를 들어 세균 또는 파지 디스플레이 체계에 의해 발현시킨다.

원하는 성질에 대부분 상응하는 성질을 가진 작용성 변이체를 발현하는 숙주 유기체의 관련된 유전자를 추가로 돌연변이시킨다. 현재의 작용성 변이체가 적절한 수단으로 원하는 성질을 갖는 이상 돌연변이 및 선택 또는 선별 단계를 반복적으로 반복할 수 있다. 이러한 반복적 절차의 결과로서, 제한된 수의 돌연변이, 예를 들어 1 내지 5회 돌연변이를 단계적으로 수행하고 평가하고 관련된 효소 성질에 대한 영향에 관해 선택한다. 선택된 변이체를 동일한 방식으로 추가로 돌연변이 단계로 처리할 수 있다. 이에 의해 조사된 각각의 변이체의 수가 상당히 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 결과는 관련된 효소의 구조 및 서열에 관해 중요한 정보를 제공하며, 원하는 변형된 성질을 가진 효소를 더욱 생성하기 위해 필요하다. 특히, 다시 말해서 특정한 돌연변이유발의 도입에 의해 효소 성질을 변형시키기 위해 잠재적으로 적절한 서열 영역인 "열점"이 정의될 수 있다.

본 발명에 다른 HSDH의 이러한 열점 영역의 비제한적인 예를 이하에 요약한다:

35-40, 특히 37-38 (각각의 경우에, HSDH_단쇄 (서열 4)의 아미노산 서열에 대해).

90-105, 93-100 또는 96-100, 특히 97 및/또는 98 (각각의 경우에 HSDH_단쇄 (서열 4)의 아미노산 서열에 대해)

3.2.2. 구조물

본 발명은 조절 핵산 서열의 유전적 조절 하에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물; 및 이러한 발현 구조물 중 적어도 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"발현 단위"는, 본 발명에 따르면, 여기에서 정의된 것과 같은 프로모터를 포함하고, 발현되어지는 핵산 또는 유전자와의 작용적 결합 후에 발현, 다시 말해서 핵산 또는 유전자의 전사 및 번역을 조절하는, 발현 활성을 가진 핵산을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 이와 관련하여 "조절 핵산 서열"이라고 언급된다. 프로모터에 추가로, 예를 들어 인핸서와 같은 조절 요소가 존재할 수 있다.

"발현 카세트" 또는 "발현 구조물"은, 본 발명에 따르면, 발현되어지는 핵산 또는 발현되어지는 유전자와 작용적으로 결합된 발현 단위를 의미하는 것으로 이해된다. 발현 단위와는 반대로, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열뿐만 아니라 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "발현" 또는 "과다발현"은 미생물에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성에서의 생성 및 증가를 설명하고, 이것은 상응하는 DNA에 의해 코딩된다. 이를 위하여, 예를 들어, 유전자를 유기체 내에 도입할 수 있고, 존재하는 유전자가 다른 유전자에 의해 치환될 수 있으며, 유전자 또는 유전자들의 복제 수가 증가될 수 있고, 강력한 프로모터가 사용될 수 있거나 또는 고 활성을 가진 상응하는 효소를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있고 이러한 수단이 임의로 조합될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 구조물은 각각의 코딩 서열의 5'-상류에 있는 프로모터 및 3'-하류에 있는 터미네이터 서열 및 임의로 추가의 통상적인 조절 요소, 즉 각각의 경우 코딩 서열과 작동적으로 연결된 요소를 포함한다.

본 발명에 따르면 "프로모터", "프로모터 활성을 가진 핵산" 또는 "프로모터 서열"은 전사되는 핵산과 작용적으로 연결된 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다.

이와 관련하여, "작용적" 또는 "작동적" 연결은 예를 들어 프로모터 활성을 가진 핵산 및 전사되어질 핵산 서열 및 임의로 조절 요소, 예를 들어 핵산의 전사를 보장하는 핵산 서열, 및 예를 들어 터미네이터의 연속 배열을 의미하는 것이고 이해되고, 각각의 조절 요소들은 핵산 서열의 전사에서 그 기능을 수행할 수 있다. 이를 위하여, 화학적 의미에서 직접적인 연결이 반드시 필요하지는 않다. 유전적 조절 서열, 예를 들어 인핸서 서열이 추가의 제거된 위치로부터 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터 표적 서열 위에서 그들의 기능을 발휘할 수 있다. 전사되는 핵산 서열이 프로모터 서열의 뒤 (즉, 3'-말단)에 위치하는 배열이 바람직하고, 그 결과 양쪽 서열이 서로 공유 결합된다. 여기에서, 유전자도입에 의해 발현되는 프로모터 서열과 핵산 서열 간의 거리는 200 염기 쌍 미만, 또는 100개 염기 쌍 미만 또는 50개 염기 쌍 미만일 수 있다.

프로모터 및 터미네이터에 추가로, 언급될 수 있는 추가의 조절 요소의 예는 표적 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 선택가능한 마커, 증폭 시그날, 복제 기원 등이다. 적절한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.

특히 본 발명에 따른 핵산 구조물은 서열 1 또는 3 또는 그의 유도체 및 상동체, 및 그로부터 유래가능한 핵산 서열을 포함하고, 이것이 유전자 발현의 조절, 예를 들어 증가를 위해 하나 이상의 조절 시그날과 함께 작동적 또는 작용적으로 유리하게 연결된다.

이러한 조절 서열에 추가로, 이러한 서열의 자연적 조절이 실제 구조 유전자 앞에 추가로 존재할 수 있고, 임의로 유전자 변형될 수 있으며, 그 결과 자연 조절이 중단되고 유전자의 발현의 증가된다. 그러나, 핵산 구조물이 더욱 단순하게 구성될 수 있고, 다시 말해서 추가의 조절 시그날이 코딩 서열 앞에 삽입되지 않으며, 그의 조절을 가진 자연 프로모터가 제거되지 않는다. 이것 대신에, 조절이 더 이상이 일어나지 않고 유전자 발현이 증가되도록 자연 조절 서열을 돌연변이시킨다.

바람직한 핵산 구조물은 유리하게는 하나 이상의 이미 언급된 "인핸서' 서열을 함유하고, 프로모터와 작용적으로 연결되며, 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가의 유리한 서열이 추가의 조절 요소 또는 터미네이터와 같은 DNA 서열의 3'-말단에 삽입될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 복제로 구조물에 존재할 수 있다. 임의로 구조물 위에서의 선택을 위하여, 추가의 마커가 구조물, 예컨대 항생물질 내성 또는 영양요구성을 보충하는 유전자에 존재할 수 있다.

적절한 조절 서열의 예는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacl^q, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaP_BAD)SP6, 람다-P_R 또는 람다-P_L 프로모터와 같은 프로모터에 존재하고, 그램-음성 세균에서 유리하게 사용된다. 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 및 ADH에서,추가의 유리한 조절 서열이 예를 들어 그램-양성 프로모터 amy 및 SPO2에 존재한다. 인공적인 프로모터가 조절을 위해 또한 사용될 수 있다.

숙주 유기체에서의 발현을 위하여, 핵산 구조물이 벡터, 예를 들어 숙주에서 유전자의 최적의 발현을 가능하게 만드는 플라스미드 또는 파지 내에 유리하게 삽입된다. 플라스미드 및 파지와는 별개로, 벡터는 당업자에게 공지된 모든 다른 벡터를 의미하는 것으로 이해되고, 다시 말해서 예를 들어 바이러스, 예컨대 SV40, CMV, 바쿨로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포손, IS 요소, 플라스미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA이다. 이러한 벡터는 숙주 유기체에서 자율 복제되거나 염색체에 의해 복제될 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 추가의 구현양태를 나타낸다.

적절한 플라스미드는 예를 들어 이.콜리에서의 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스에서의 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스에서의 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움에서의 pSA77 또는 pAJ667, 진균에서의 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모에서의 2alphaM, pAG1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물에서의 pLGV23, pGHIac⁺, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이다. 언급된 플라스미드는 가능한 플라스미드의 일부 선택이다. 추가의 플라스미드가 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018]으로부터 유추될 수 있다.

벡터의 추가의 구현양태에서, 본 발명에 따른 핵산 구조물 또는 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터가 선형 DNA의 형태로 미생물 내에 유리하게 도입될 수 있고 이종 또는 동종 재조합에 의하여 숙주 유기체의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 선형화 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 단지 핵산 구조물 또는 본 발명에 따른 핵산으로 구성될 수 있다.

유기체에서 이종 유전자의 최적의 발현을 위하여, 유기체에서 사용되는 특정한 "코돈 이용"에 상응하는 핵산 서열을 변형시키는 것이 유리하다. "코돈 이용"은 관련된 유기체의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 분석에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트의 제조는 적절한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터 또는 폴리아데닐화 시그날과 함께 적절한 프로모터의 융합에 의해 수행된다. 이를 위하여, 통상적인 재조합 및 클론화 기술이 사용되며, 예를 들어 문헌 [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 [T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재되어 있다.

적절한 숙주 유기체에서의 발현을 위하여, 재조합 핵산 구조물 또는 유전자 구조물을 숙주 내에서 유전자의 최적의 발현을 가능하게 하는 숙주-특이적 벡터 내로 유리하게 삽입한다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 ["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., editor, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에 기재되어 있다.

3.3 미생물

명세서 내용에 의존하여, 용어 "미생물"은 출발 미생물 (야생형) 또는 유전자 변형된 재조합 미생물 또는 양쪽 모두를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터의 도움을 받아, 예를 들어 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제조할 수 있고, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조를 위해 사용할 수 있다. 유리하게는, 상기 기재된 본 발명에 따른 재조합 구조물을 적절한 숙주 체계 내로 도입하고 발현시킨다. 여기에서, 개개의 발현 체계에 언급되어 있는 핵산을 발현하기 위하여, 당업자에게 공지되어 있는 친숙한 클론화 및 형질감염 방법, 예를 들어 공침전, 원형질체 융합, 에렉트로포레이션, 레트로바이러스 형질감염 등이 바람직하게 사용된다. 적절한 체계는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., editor, Wiley Interscience, New York 1997] 또는 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 핵산을 위해 가능한 재조합 숙주 유기체 또는 핵산 구조물은 원칙적으로 모두 원시핵 또는 진핵 유기체이다. 유리하게는, 사용된 숙주 유기체는 세균, 진균 또는 효모와 같은 미생물이다. 그람-양성 또는 그람-음성 세균, 바람직하게는 엔테로박테리아시애, 슈도모나다시애, 리조비아시애, 스트렙토마이세타시애 또는 노카르디아시애 계, 특히 바람직하게는 에스케리키아, 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 노카르디아, 버크홀데리아, 살모넬라, 아그로박테리움, 클로스티리듐 또는 로도코쿠스 속의 세균이 유리하게 사용된다. 에스케리키아 코리 속 및 종이 매우 특히 바람직하다. 추가의 유리한 세균은 알파-프로테오박테리아, 베타-프로테오박테리아 또는 감마-프로테오박테리아로 구성된 군에서 발견된다.

본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 숙주 유기체들은 상기 정의에 따라 12α-HSDH 활성을 가진 효소를 코딩하는 본 발명에 기재된 적어도 하나의 핵산 서열, 핵산 구조물 또는 벡터를 함유한다.

본 발명에 따른 방법에서 사용되는 유기체를 숙주 유기체에 따라 당업자에게 공지된 방식으로 생육시키거나 배양한다. 미생물을 일반적으로 보통 당류 형태의 탄소 공급원, 효모 추출물과 같은 유기 질소 공급원 형태의 질소 공급원, 또는 황산암모늄과 같은 염류, 철, 망간 또는 마그네슘 염과 같은 미량 원소, 및 임의로 비타민을 함유하는 액체 배지에서 0 내지 100 ℃, 바람직하게는 10 내지 60 ℃의 온도에서 산소 기체를 공급하면서 생육시킨다. 영양소 액체의 pH를 고정된 값으로 유지할 수 있고, 이것을 생육 동안에 조절하거나 조절하지 않는다. 생육은 배치식, 반-배치식 또는 연속식으로 일어날 수 있다. 영양소를 발효 개시에 도입할 수 있거나 이어서 반-연속식 또는 연속식으로 공급한다.

3.4. UDCA 의 제조

3.4.1 도입

활성 물질 우르소데옥시콜린산 (UDCA) 및 특히 관련된 부분입체이성질체 케토데옥시콜린산 (CDCA)은 담석증의 의학적 치료를 위해 수년 동안 사용되어 왔다. 양쪽 화합물은 C 원자 7에서 히드록실 기의 배열 만이 상이하다 (UDCA: β-배열, CDCA: α-배열). 통상적인 양의 UDCA를 제조하기 위하여, CDCA를 원료로서 사용하는 방법이 종래 바람직하게 사용되어 왔다. CDCA는 다시 콜린산(CA)으로부터 바람직하게 제조된다.

3.4.2 CDCA 의 생성

CA (CAS 81-25-4)는 CDCA (CAS 474-25-9)의 생성을 위한 원료로서 사용된다. 전통적인 화학 경로 1은 독점적으로 화학 처리 단계를 이용한다. 이러한 경우에, CA를 CDCA로 전환시키기 위하여 4개 단계가 필요하다. 대안적인 경로 2는 효소-촉매화 반응을 포함한다. 이러한 경로는 단지 2개 단계로 CA로부터 CDCA로 유도한다.

3.4.2.1. 경로 1 (화학 경로)

이러한 첫 번째 합성 단계에서, CA의 카르복실산 기를 에스테르화하여 메틸 에스테르 (CDCA I, CAS 1448-36-8)를 수득한다. 위치 3 및 7에서 히드록실 기의 위치선택적으로 진행된 아세틸화는 다음과 같다. 아세틸화 생성물, 메틸 3,7-디-O-아세틸콜레이트 (CDCA II, CAS 3749-87-9)는 결정성으로 수득되고 단리된다. 하기 단계 (단계 3)에서, 위치 12에서 유리 히드록실 기를 산화시킨다. 메틸 3,7-디-O-아세틸-12-케토콜라네이트 (CDCA III, CAS 4651-67-6)을 울프-키시너 환원에서 제 4 단계 및 마지막 단계에서 CDCA로 탈산소화시킨다.

제1 단계: 에스테르화

제 2 단계: 아세틸화

제3 단계: 산화

제4 단계: 탈산소화

상세하게, 방법은 다음과 같이 수행된다:

단계 1에서, CA를 산 촉매작용 하에서 메탄올로 에스테르화하여 메틸 콜레이트 (CDCA I)을 수득한다. 위치 3 및 7에서 아세트 안히드라이드와 히드록실 기의 위치선택적 아세틸화는 다음과 같다. 유기 질소 염기 및 아실화 촉매를 반응을 위해 임의로 사용한다. 반응 시간의 최적화에 의하여, 디아세틸 화합물 (CDCA II)의 최대값이 달성된다. 결정화 후에 생성물을 단리하고 건조시킨다. 아세틸화 조건, 특히 조합 아세트 안히드라이드, 트리에틸아민 및 DMAP가 EP 0 424 232에 기재되어 있다. 아세틸화의 선택성은 (중간체) 생성물 CDCA의 이후 품질을 결정한다. 부산물 메틸 3-O-모노아세틸콜레이트는 리소콜린산으로의 합성 과정에서 유도된다. 이것은 독성이고 최종 생성물 UDCA의 논문에서 낮은 값으로 제한된다 (Ph.Eur 0.1%, USP 0.05%). 메틸 3,7,12-트리-O-아세틸콜레이트로의 과다아세틸화 경우에, 이후에 수득된 CDCA는 불순물로서 비례적으로 더욱 많은 CA를 함유한다.

차아염소산나트륨 수용액을 사용하여 CDCA II의 CDCA III으로의 산화를 수행한다. 반응 용액으로부터 생성물이 침전되고 이것을 여과해 내고 건조시킨다. 이러한 절차는 EP 0 424 232에 기재되어 있다. 일반적으로, 크롬산과 같은 또 다른 산화제를 대안으로서 문헌에서 찾아볼 수 있다.

CDCA III를 CDCA로 탈산소화시키기 위하여, 울프-키시너 환원의 다양한 변형이 공지되어 있다. 이 방법에서, CDCA III를 200 ℃에서 트리에틸렌 글리콜 중에서 히드라진 및 수산화나트륨과 반응시킨다. 염산으로 산성화시킴으로써 반응 용액으로부터 생성물을 침전시키고 이어서 여과 제거하고 건조시킨다. 다른 방법은 EP 0 424 232에 기재되어 있고 낮은 처리에서 작업한다. CDCA III을 2-부탄올 중에서 히드라진 및 수산화칼륨과 반응시킨다. 염산의 첨가에 의하여 변형체 1에서와 같이 물로부터 생성물을 침전시킨다.

이 방법에 의해 수득된 CDCA는 이후 기재된 방법에 의하여 약전 품질로 UDCA를 제조하기 위해 적절한 한정되고 규정된 품질을 갖는다.

3.4.2.2 경로 2 (효소 경로)

배타적인 화학 공정에 대한 대안으로서, 본 발명에 따르면 CA를 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA, CAS 2458-08-4)으로 효소-촉매화 산화시키고 이어서 더욱 반응시켜 CDCA를 수득하는 방법이 제공된다. 이러한 합성 경로는 단지 2개의 단계를 포함하고, 순수한 화학 경로에 비교하여 더욱 단순하게 수행된다.

제1 단계: 효소적 산화

제2 단계: 탈산소화

단계 1에 따르면, 콜린산을 12α-HSDH에 의해 NADP⁺-의존적으로 산화하여 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)을 수득한다. 이러한 반응은 가역적이다. 12α-HSDH는 효소 부류 1.1.1.176에 속하고, 클로스트리듐 속의 세균에서 주로 발견된다. NADP⁺-의존적 [Harris and Hylemon (1978) Biochim Biophys Acta 528 (1): 148-57] 및 NAD⁺-의존적인 전형적인 예가 존재한다 [MacDonald et al. 1976, Biochim Biophys Acta 450(2): 142-53].

다른 HSDH의 부재하에서 높은 12α-HSDH 활성을 발현하는 유일하게 공지된 미생물은 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50 DSM 4029이다 [MacDonald et al. 1979, loc.cit.]. 따라서, 이러한 유기체가 12α-HSDH의 생산자로서 종래 사용되었으며, 요구에 따라 비용-집약적 배지를 가진 혐기성 발효가 필요하다 [MacDonald 1981, Experientia 37(5): 451-2]. 그러나, 효모 자가분해물에 의해 이것을 대체하는 것이 가능하였다 [Braun, M. et al. 1991, loc.cit.].

본 발명에 따른 12α-HSDH (장쇄 형태 또는 단쇄 형태) 및 ADH, 예를 들어 ADH ms 또는 ADH t에 의한 보조인자 재생에 의하여 바람직하게는 본 발명에 따라 효소적 산화를 수행한다.

단계 2에 따른 탈산소화는 전통적인 화학적 울프-키시너 환원이고 상기 기재된 CDCA III의 탈산소화와 유사하게 수행된다. 이러한 경로의 필수적인 장점은, 효소의 선택성의 결과로서 불순물인 리소콜린산이 형성되지 않는다는 것이다.

3.4.3.3 UDCA 의 제조

CDCA를 UDCA를 위한 원료로서 사용한다 (CAS 128-13-2). 첫 번째 합성 단계에서, CDCA의 위치 7에서 히드록실 기를 산화시켜 상응하는 케톤을 수득한다. 7-케토리소콜린산 (3α-히드록시-7-케토콜란산, 간단하게: KLCA, CAS 4651-67-6)이 얻어진다. 위치 7에서 케토 기의 위치선택적 환원이 두 번째 단계에서 뒤따른다. 목적은, 가능한 한 높은 부분입체선택성을 가진 UDCA를 수득하는 것이다. 일반적으로, 환원 직후의 UDCA는 여전히 수 %의 부분입체이성질체 CDCA를 함유한다. 활성 물질 UDCA에 이르르기 위하여, 조 UDCA를 세 번째 단계에서 정제해야 한다.

제1 단계: 산화

제2 단계: 환원

제3 단계: 정제

조 UDCA → 순수한 UDCA

CDCA의 산화를 차아염소산나트륨 수용액에서 통상적으로 수행한다. 문헌에서, 대안으로서 크롬산 산화가 추가로 발견된다. KLCA는 고체로서 수득되고 이어서 두 번째 단계에서 더욱 처리된다. 알콜 중에서 소듐 금속으로의 환원을 수행할 수 있다. 약 85:15의 UDCA:CDCA의 조성을 가진 조 생성물이 얻어진다. 대안적인 방법에서, KLCA를 염기, 예컨대 t-부톡시화칼륨 또는 수산화칼륨 (EP-A-0 230 085)과 함께 용매로서 알콜 (예를 들어, 지방족 알콜) 중에서 니켈 촉매(라니 니켈) 위에서 수소로 환원시킨다. 추가로, 포타슘 및 리튬 [소듐에 비해 높은 선택성, C. Giordano et al., Angew.Chem. 1985, 97, 510], 및 아연 (ES 489661) 및 전기화학적 (US 4 547 271)으로의 환원이 또한 가능하다.

순수한 UDCA를 제공하기 위한 조 UDCA의 정제는 부분입체이성질체 염의 분리를 포함한다. 이것은 UDCA의 적절한 염의 제조, 단리 및 이후의 절단에 의해 수행된다. 하기 대안적인 정제 방법이 문헌에 언급되어 있다: 상응하는 UDCA 에스테르의 제조, 재결정화 및 절단 (EP-A-0 386 538), 추출 (JP 60006699) 및 크로마토그래피 방법 (IT 2000MI1177).

3.5 12α- HSDH 의 재조합 제조

본 발명은 또한, 폴리펩티드-생성 미생물을 배양하고, 폴리펩티드의 발현을 임의로 유도하고 배양물로부터 이것을 단리하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 작용적, 생물학적 활성 단편의 재조합 제조 방법에 관한 것이다. 원한다면, 폴리펩티드를 공업적 규모로 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 미생물을 배치 공정 (배치 배양) 또는 공급 배치 또는 반복 공급 배치 공정에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약을 문헌 [Chmiel (Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 [Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral devices]) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wienbaden, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.

사용되는 배양 배지는 각각의 균주의 수요를 적절히 충족해야한다. 다양한 미생물의 배양 배지의 설명은 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C.,USA, 1981)]에 포함된다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 이러한 배지는 보통 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량원소를 포함한다.

바람직한 탄소 공급원은 당류, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 매우 양호한 탄소 공급원은 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 슈크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 몰라스와 같은 착물 화합물 또는 당 정련의 부산물에 의하여 당류를 또한 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 유지, 예컨대 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유, 지방산, 예컨대 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산, 알콜, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올 및 유기 산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산이다.

질소 공급원은 보통 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이러한 화합물을 함유하는 물질이다. 일례의 질소 공급원은 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 질산염, 우레아, 아미노산 또는 착물 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지 액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 등을 포함한다. 질소 공급원이 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 소듐, 코발트, 몰리브덴, 포타슘, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인 또는 황산염을 포함한다.

황 공급원으로서, 예를 들어 황산염, 아황산염, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오황산염, 황화물과 같은 무기 황-함유 화합물 뿐만 아니라 메르캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물을 사용할 수 있다.

인 공급원으로서, 인산, 이수소인산칼륨 또는 수소인산이칼륨 또는 상응하는 소듐-함유 염을 사용할 수 있다.

용액 중에 금속 이온을 유지하기 위하여 킬레이트화 제를 배지에 첨가할 수 있다. 특히 적절한 킬레이트화 제는 디히드록시페놀, 예컨대 카테콜 또는 프로토카테큐에이트, 또는 유기 산, 예컨대 시트르산을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 통상적으로 다른 생육 인자, 예컨대 비타민 또는 생육 프로모터를 함유하며, 이것은 예를 들어 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 종종 복합 배지 성분, 예컨대 효모 추출물, 몰라스, 옥수수 침지액 등으로부터 유래된다. 또한, 적절한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 배지의 실제 조성은 특정한 실험에 강하게 의존되고 각각의 특별한 경우를 위해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed.P.M.Rhodes, P.F.Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3]로부터 얻을 수 있다. 생육 배지는 또한 상업적 공급업자, 예컨대 스탠다드 1 (Merck) 또는 BHI (Brain heart infusion, DIFCO) 등으로부터 수득될 수 있다.

모든 배지 성분은 열 (1.5 바아 및 121 ℃에서 20분)에 의해 살균되거나 무균 여과에 의해 살균된다. 성분을 함께 또는 필요하다면 개별적으로 살균할 수 있다. 모든 배지 성분은 생육 초기에 존재할 수 있거나 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.

배양액의 온도는 보통 15 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이고, 실험 동안에 일정하게 유지되거나 변화될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 약 7.0의 범위이어야 한다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물의 첨가에 의하여 증식 동안에 증식을 위한 pH를 조절할 수 있다. 기포 발생을 조절하기 위하여, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 발포방지제를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 적절한 선택적 작용 물질, 예를 들어 항생물질을 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 주변 공기를 배양액에 도입한다. 배양액의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃이다. 원하는 생성물의 최대값이 형성될 때까지 배양을 계속한다. 이러한 목적은 보통 10시간 내지 160 시간 내에 달성된다.

이어서 발효 브로쓰를 더욱 처리한다. 요구에 따라서, 분리 방법, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리 또는 이러한 방법의 조합에 의하여 발효 브로쓰로부터 생체를 완전히 또는 부분적으로 제거할 수 있거나 그 안에 완전히 남겨둔다.

폴리펩티드가 배양 배지에 분비되지 않는다면 세포를 붕괴시킬 수 있고 생성물을 공지된 단백질 단리 방법에 따라 용해물로부터 회수한다. 대안적으로, 고-주파 초음파에 의해, 예컨대 프렌치 가압 셀에서의 고압에 의해, 삼투압에 의해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화제에 의해 또는 언급된 몇몇 방법의 조합에 의해 세포를 붕괴시킬 수 있다.

공지된 크로마토그래피 방법, 예컨대 분자 체 크로마토그래피 (겔 여과), 예컨대 Q-세파로스 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 사용하고, 한외여과, 결정화, 염석, 투석 및 천연 겔 전기영동과 같은 다른 통상적인 방법을 사용하여, 폴리펩티드의 정제를 달성할 수 있다. 적절한 방법은 예를 들어 문헌 [Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Working Methods], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York] 또는 [Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기재되어 있다.

재조합 단백질의 단리를 위하여, 특정한 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA를 연장시키고, 예를 들어 단순한 정제를 위해 사용되는 변형된 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터 체계 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 유형의 적절한 변형은 예를 들어 앵커로서 작용하는 "태그", 예컨대 항체에 의해 항원으로서 인식될 수 있는 헥사-히스티딘 앵커 또는 에피토프로서 공지된 변형이다 (예를 들어 문헌 [Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press]에 기재됨). 이러한 앵커는 단백질을 예를 들어 크로마토그래피 컬럼 내로 충진되거나 또는 마이크로적정 평판 또는 일부 다른 담체에서 사용될 수 있는 고체 담체, 예를 들어 중합체 기질에 부착시키는 역할을 한다.

동시에, 이러한 앵커는 단백질의 인식을 위해 사용될 수 있다. 단백질의 인식을 위하여, 통상적인 마커, 예컨대 형광 염료, 기질과의 반응 후에 검출가능한 반응 생성물을 형성하는 효소 마커, 또는 방사능 마커를 단독으로 또는 단백질의 유도체화를 위한 앵커와 조합하여 사용할 수 있다.

3.6 효소 고정화

본 발명에 따른 효소는 여기에 기재된 방법에서 자유 또는 고정화 형태로 사용될 수 있다. 고정화 효소는 불활성 담체에 고정된 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 적절한 담체 물질 및 그 위에 고정화된 효소는 EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 및 DE-A 100193773 및 그에 인용된 참고문헌으로부터 공지되어 있다. 이러한 점에서 이들 명세서의 개시내용을 충분히 참고한다. 적절한 담체 물질은 예를 들어 점토, 점토 미네랄, 예컨대 카올리나이트, 규조토, 펄라이트, 실리카, 알루미나, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 셀룰로스 분말, 음이온 교환 물질, 합성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 아크릴 수지, 페놀-포름알데히드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌을 포함한다. 담체 물질은 지지된 효소의 제조를 위하여 미세 분리된 입상 형태로 통상적으로 사용되고 다공성 형태가 바람직하다. 담체 물질의 입자 크기는 통상적으로 5 mm 이하, 특히 2 mm 이하 (등급 곡선)이다. 유사하게, 전 세포 촉매로서 탈수소효소를 사용할 때 자유 또는 고정화 형태가 선택될 수 있다. 담체 물질은 예를 들어 Ca 알기네이트 및 카라기난이다. 글루타르알데히드 (CLEA에 가교됨)를 사용하여 효소뿐만 아니라 세포도 직접적으로 가교될 수 있다. 상응하는 추가의 고정화 방법이 예를 들어 [J.Lalonde and A.Margolin "Immobilization of Enzymes" K.Drauz and H.Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim]에 기재되어 있다.

실험 항목

다른 정보가 주어지지 않는다면, 본 발명의 내용에서 수행된 클론화 단계, 예를 들어 제한효소 절단, 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 핵산 전달, DNA 단편의 연결, 미생물의 형질전환, 미생물의 전파, 파지의 복제 및 재조합 DNA의 서열 분석을 문헌 [Sambrook et al. (1989) loc.cit.]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.

A. 일반적 정보

재료:

문헌 [Fermentas, St.Leon-Rot or NEB, Frankfurt]로부터 효소 및 효소 완충액을 수득하였다.

LB 배지:

박토 트립톤 10 g

효모 추출물 5 g

염화나트륨 5 g

이중-증류수 1000 ml까지

TB 배지:

용액 I:

박토 트립톤 12 g

효모 추출물 24 g

글리세롤, 무수 4 ml

이중-증류수 900 ml까지

용액 II:

인산이수소칼륨 0.17M

인산수소칼륨 0.72M

이중-증류수 100 ml까지

오토클레이브 후에 2개의 용액을 합하였다.

발현 벡터

12α-HSDH의 발현을 위하여, 벡터 pET22b(+), 노바겐, 다름스타트를 사용하였으며, 이것은 T7 프로모터 및 전사 개시 및 T7 터미네이터의 조절 하에 MCS를 함유한다. 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)에 의하여 발현을 유도한다.

이를 위하여, 12α-HSDH-코딩 서열을 PCR-증폭시켰다. 주형으로서 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50의 게놈 DNA 및 이하 더욱 정확히 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 생성물을 수득하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔에 적용하고 분리하고 이로부터 잘라내었다. 이어서, 이들을 NdeI 및 BamHI의 도움을 받아 제한하고, 마찬가지로 NdeI 및 BamHI으로 절단된 pET22b(+) 벡터로 결찰시켰다.

미생물

균주 유전자형

클로스트리듐 종. 군 P 균주 48-50

에스케리키아 콜리 BL21 (DE3) F^-ompT gal dcm Ion hsdS_B (r_B ^-m_B ^-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 유전자 1 ind1 sam7 nin5])

에스케리키아 콜리 로제타^TM (DE3) F^-ompT hsdS_B (R_B ^-m_B ^-) gal dcm λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 유전자 1 ind1 sam7 nin5]) pLysS-RARE (Cam^R)

방법

1. 12α- HSDH 활성 결정을 위한 표준 조건

활성을 다음과 같이 정의한다: 1U의 효소는 실온 (즉, 약 20 ℃-23 ℃)에서 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 8.0)에서 1 μmol/분의 5 mM 콜린산 용액의 반응을 촉매화하는 효소의 양에 상응한다.

활성 결정을 위하여, 790 ㎕의 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 8.0), 100 ㎕의 콜린산 (인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 8.0) 중의 50 mM) 및 측정된 10 ㎕의 효소 용액을 큐벳에서 혼합하였다. 반응의 시작에서 100 ㎕의 NADP⁺ (2.5 mM)을 첨가하고 340 nm에서의 흡광도 증가를 광도계로 결정하였다. 30초에 걸친 구배를 RT에서 결정하였다. 램버트-비어 법칙에 따라 활성의 결정을 수행하였다.

2. BCA 분석에 의한 단백질 농도 결정

200 ㎕의 BCA 용액 (용액 A:용액 B 50:1) 중에서 562 nm에서 바이오-래드 (Munich)의 분석 키트를 초음파 붕괴시킨 후에 20 ㎕의 단백질 용액, 예를 들어 세포 용해물 희석액 또는 재현탁된 세포 파편 펠릿의 흡광도를 측정함으로써 용액의 단백질 농도를 결정하였다. 여기에서, 단백질에 의해 2가 구리 이온의 환원으로부터 정량적으로 얻어지는 1가 구리 이온을 가진 비신코닌산 (BCA)이 이것은 562 nm에서의 흡광도를 광도계로 측정할 수 있는 보라색 착물 화합물이다. 소 혈청 알부민(BSA) 검정 곡선에 의하여 농도의 결정을 수행하였다.

B. 유전자 단리를 위한 예비 실험

모든 실험 연구의 목적은 효소 12α-HSDH로의 변형된 접근을 찾아내는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따라서 12α-HSDH를 코딩하는 유전자의 서열을 밝혔다.

1.1. 먼저, 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의하여 이것을 시도하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 한편으로는 12α-HSDH의 공개된 N-말단 아미노산 서열 (참조, Braun et al., loc.cit.)을 기초로 하여 만들어졌다. 변성 정도가 낮게 유지되도록 하기 위하여, N-말단 메티오닌으로 시작하여 프라이머가 유래되었다 (단지 하나의 코돈) (프라이머 서열을 나타내지 않음). 다른 한편, 데이터뱅크-지지된 서열 비교는 보존된 아미노산 모티프 "LVNN"이 HSDH에 존재함을 나타내었다. 이 영역은 역 프라이머의 구조를 위해 사용되었다. 추가로, 덜 강하게 보존된 서열 모티프 PE(Q)DIAN를 변성 프라이머의 설계를 위해 사용하였다 (프라이머 서열을 나타내지 않음). 추가의 변성 올리고뉴클레오티드는 자유롭게 접근가능한 프로그램 CODEHOP에 의해 버려졌다 [Rose,T.M. et al., Nucleic Acids Research, 1998, 26(7), 1628-1635].

상기 나타낸 변성 프라이머 쌍의 모든 조합을 사용하여 유전자를 증폭시키는 것은 가능하지 않았다.

1.2. 12α-HSDH의 추가의 펩티드 서열 단편을 결정하기 위한 실험에서, 2개의 친화성 크로마토그래피 단계의 조합에 의하여 클로스트리듐 종 군 P의 용해물로부터 효소를 정제하려는 시도를 행하였다. 이러한 방법은 문헌 [Braun et al., loc.cit.]에 기재되어 있지만 재작업할 수 없다.

C. 코딩 12α- HSDH 서열의 단리 및 12α- HSDH 효소의 특징화

실시예 1: 서열 상동성 연구

12α-HSDH 서열로의 접근을 수득하기 위하여, 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50 DSM 4029의 게놈을 서열결정하였다. 모든 개방 판독 프레임(ORF)에서 공개된 N-말단 서열에 관한 조사 및 모티프 "LVNN"에 관한 조사는 12α-HSDH를 코딩하는 유전자의 서열을 유도하지 않았다.

변형된 형태로 공개된 부분 서열 정보를 함유하는 유전자를 확인하는 것은 단지 서열 상동성 비교에 의해 가능하였다. TBLASTX (Tatusova and Madden (1999) FEMS Microbiol Lett 174(2), 247-250]로 하기 조건 하에서 비교를 수행하였다.

시작 갭: 5

연장 갭: 2

갭 x_ 드롭오프 : 50

예상: 10.0

워드 크기: 11

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Translations&PROGRAM=tblastx&BLAST PROGRAMS = tblastx & PAGE TYPE = Blast의 표준 조건

Search & SHOW DEFAULTS = on #i가 사용되었다; "Algorithm parameters" 하에서 매개변수를 찾아볼 수 있다

발견된 유전자 (서열 3)에서, 공개된 부분 서열에 나타낸 N-말단 메티오닌이 빠져있다; 또한, 공개된 부분 서열은 단백질의 N-말단에서 찾아볼 수 없다 (미국 매릴랜드 GLIMMER CBCB에서 시작된 유전자의 생체정보 예측). 보존된 모티프 "LVNN"은 또한 "LINN"에 대해 12α-HSDH에서 변형된다 (서열 5).

이러한 이유 때문에, 변성 올리고뉴클레오티드를 사용한 서열 설명을 위하여 원래의 접근법을 성공적으로 시행할 수 없었다. 하나의 염기 트리플렛에 의해서만 코딩되기 때문에, 변성 프라이머를 유도하기 위하여 특히 메티오닌이 규칙적으로 사용된다. 동일한 방식으로, 클로스트리듐 종으로부터 계산된 12α-HSDH가 보존된 서열 "LVNN"에서 일탈을 나타낼 것으로 예측되지 않았다.

도 3은 공지된 미생물 HSDH와 본 발명에 따른 HSDH 간의 부분적 다중-서열 정렬을 나타낸다.

실시예 2: 12α- HSDH 유전자의 증폭 및 12α- HSDH 의 발현

1. 증폭

이를 위하여 하기 프라이머가 사용되었다:

정방향 장쇄 (긴 효소 형태, NdeI 절단 부위):

정방향 단쇄 (짧은 효소 형태, NdeI 절단 부위):

역방향 프라이머 (BamH1 절단 부위)

Pfu 폴리머라제를 사용한 PCR에 의해 표적 유전자를 증폭시켰다.

주형으로서, 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50 DSM 4029의 게놈 DNA (29.4 ng/㎕)를 사용하였으며, 이 중에서 1 ㎕를 사용하였다. 증폭을 위하여, 1 ㎕의 Pfu 폴리머라제를 사용하였다. 사용된 완충액은 Pfu 완충액 (MgSO₄로 10x)이었다 (Fermentas, St.Leon-Rot). 각각의 경우에, 1.5 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머 (10 μM)를 사용하였으며, 2 ㎕의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (20 μM)가 사용되었다. 배치를 RN아제-비함유 물로 50 ㎕까지 조절하였다. 에펜도르프 열순환계에서 반응을 수행하였다. DNA를 변성시키기 위하여 PCR 배치를 95 ℃에서 5분 동안 먼저 시작하였다. 이어서, 알려지지 않은 DNA 서열을 클론화함에 있어서, 95 ℃에서 30초 동안 변성으로 시작하여 30회 주기를 수행하였다. 이어서, 표적 DNA에서 변성 프라이머의 어닐링을 보장하기 위하여 (53 ℃의 일정한 어닐링 온도), 배치를 각각의 경우에 온도 구배에 의하여 30초 동안 25 내지 45 ℃로 냉각하였다. 이때, 사용된 폴리머라제의 최적의 활성이 여기에서 존재하기 때문에 프라이머 연장을 위하여 90초 동안 72 ℃의 온도를 조절하였다. 마지막으로, 배치를 72 ℃에서 10분 동안 배양하고 장치로부터 꺼낼 때까지 4 ℃에서 냉각하였다.

2. 발현

폴리머라제 연쇄 반응에 의한 증폭 후에, 표적 유전자를 절단 부위 NdeI 및 BamHI에 의하여 발현 벡터 pET22b+ 내로 클론화하고, 이.콜리 로제타 DE3^TM 및 이.콜리 BL21 DE3 세포 내로 도입하고 발현시켰다. 이들은 다량의 효소를 생성할 수 있는 비병원성 균주이다 (150 000 U/ 배양액 ℓ까지).

발현을 위하여, 5 ml의 LB 배지 (100 ㎍/ml 암피실린을 가짐)을 이.콜리 BL21 (DE) 또는 로제타^TM 클론과 함께 37 ℃에서 180 rpm에서 배양하고, 발현 벡터로 16시간 동안 형질전환하였다. 200 ml의 TB 배지 (100 ㎍/ml 암피실린)을 접종하고 37 ℃ 및 180 rpm에서 배양하였다. 12α-HSDH의 발현을 0.6-0.8의 OD₆₀₀에서 1mM IPTG로 유도하였다. 다양한 시간에서, 0.25의 OD₆₀₀을 가진 1 ml의 세포 현탁액을 제거하고, 13000 rpm에서 1분 동안 펠릿화하고 추가의 사용까지 -20 ℃에서 저장하였다. 4 ℃에서 2700 g에서 10분 동안 세포를 펠릿화함으로써 4 또는 22시간 후에 발현을 끝내고 이어서 동결건조시켰다.

먼저 펠릿을 4 내지 10 ml의 인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 8.0)에 재현탁함으로써 초음파의 도움을 받아 세포를 붕괴시켰다. 세포를 빙욕에서 초음파 붕해장치(Branson)에서 30%의 강도로 각각의 경우에 2분씩 휴지하면서 1분간 4회 처리하였다. 이어서, 4220 g 및 4 ℃에서 1시간 동안 원심분리에 의하여 세포 파편을 제거하였다.

도 4는 본 발명에 따른 효소 (HSDH_단쇄 및 HSDH_장쇄)의 4시간 및 22시간 발현 후에 세포 용해물의 SDS-PAGE (12.5% 강도 겔, β-메르캅토에탄올)의 결과를 나타낸다 (각각의 경우에 대략 27 kDa에서의 밴드).

단백질 함량 및 효소 활성을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.

이.콜리 세포의 붕괴 후에 달성된 효소 활성을 하기 표에 요약한다.

고 발현 수준에 기인하여, 세포 붕괴 및 원심분리 후에 효소 제제의 부피 및 비활성은 클로스트리듐 종. 군 P 균주 48-50으로부터 비롯된 것에 비하여 이미 현저히 높다 (36800 U/배양 배지의 l). 따라서, 이미 기재된 방법과 반대로, 단백질 정제를 없앨 수도 있다.

BL21 (DE3) 세포의 단백질 총량에서 표적 단백질의 높은 비율은 하기 표에 의해 예증된다.

실시예 3: 콜린산으로부터 12- 케토케노데옥시 - 콜린산의 제조 합성

12-케토케노데옥시콜린산의 제조 합성을 위하여 발현된 효소 (단쇄 형태)를 ADH t (Codexis, Juelich)와 조합하여 사용하였다. 이를 위하여, 500 ml의 콜린산 (인산칼륨 완충액 (50 mM, pH 8.0)에서 400 mM, 10% 아세톤), 0.25 M NADP⁺, 이.콜리 BL 21 (DE3)로부터의 2000 U의 12α-HSDH_단쇄 (참조. 상기 실시예 2) 및 보조인자 재생을 위하여 550 U의 ADH t (서모언에어로박터 종, Codexis, Juelich)를 1 리터의 둥근-바닥 플라스크에서 혼합하였다. 반응을 연속하여 교반하고 환류 냉각하면서 RT에서 수행하였다. 27시간 후에, 추가의 550U의 12α-HSDH 및 138U의 ADH t를 첨가하고 혼합물을 총 117시간 동안 배양하였다. 반응 동안에, 광도계 흡광도를 340 nm에서 결정하고, 반응 과정을 검토하기 위하여 1ml 샘플을 제거하고, 이것을 100 ㎕의 염산 (1M)으로 중지하고 에틸 아세테이트에서 증발시키거나 추출하였다. 흡광도를 도 5에 나타낸다.

반응 파트너의 완전한 침전 때까지 발연 염산 (37%)의 첨가에 의하여 반응을 산성화하였다. 상층액을 제거하고 각각의 경우에 50 ml 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 침전된 콜린산 유도체를 염산의 첨가 및 가온과 함께 아세톤에 완전히 용해시켰다. 유기 상을 합하고 용매가 없어질 때까지 건조시켰다.

여기에서, 생성물 추출은 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50으로부터 직접적으로 통상적인 생성물 (ASA 스페잘엔자임)을 사용할 때보다 더욱 간단하게 일어난다는 것이 판명되었다. 이러한 이유는 동일한 HSDH 활성을 가진 현저히 낮은 총 단백질 함량 때문이다.

실시예 4 : 발현된 효소의 특징화

발현된 효소를 그들의 활성에 대해 특징화하였다. 12-케토케노데옥시콜린산으로의 콜린산의 선택적 산화가 촉매화되는 것으로 밝혀졌다.

참조 물질 콜린산 및 12-케토케노데옥시콜린산 및 반응 배치의 추출물 (실시예 3)을 TLC 실리카 겔 60 F₂₅₄ 알루미늄 호일 (머크, Darmstadt)에 유리 모세관에 의하여 적용하였다. 40:40:3 비율의 디클로로메탄:아세톤:아세트산(농축)의 혼합물을 용리제로서 함유하는 크로마토그래피 챔버에 호일을 가능한 한 수직으로 놓았다. 용리제 앞쪽이 평판의 윗쪽 가장자리에 거의 닿을 때까지 분리를 수행하였다. 몰리브데이토인산 분무 시약 (40 mM 몰리브데이토인산, 95.2% 진한 아세트산, 4.8% 진한 황산)으로 분무하고 이어서 가열함으로써 물질의 착색을 수행하였다.

결과를 도 6에 나타낸다.

실시예 5: NADPH 결합에 관련된 아미노산 잔기의 위치

NADH 및 NADPH-의존성 "단쇄 탈수소효소" (SDR)와의 상동성 비교에 의하여, 보조인자 인식 및 가능하다면 미래의 보조인자 식별을 위해 중요한 2개의 아미노산 측쇄를 확인할 수 있었다: 부위-특이적 돌연변이유발 ([Tanaka et al. (1996) Biochemistry 35(24): 7715-30] 및 [Carugo and Argos (1997) Proteins 28(1): 10-28]을 기초로 하여 치환이 제조되었다)에 의하여, 치환 G37D 및 R38L (서열 3을 기초로 함)을 수행하였다. 스트라타진 GmbH의 퀵체인지 부위-특이적 돌연변이유발 키트를 위한 실험 세부사항에 따라 실험을 수행하였다.

바람직한 아미노산 교환이 일어나도록 12α-HSDH 유전자 서열을 기초로 하여 부위-특이적 돌연변이유발을 위한 프라이머 (하기 표 참조)를 선택하였다. 돌연변이(밑줄로 표시)가 프라이머의 중심에 위치하고 2개의 프라이머 쌍의 융점이 동일한 범위에 위치하도록 주위를 기울였다. 하기 조합이 사용되었다:

pET22b(+)-HSDH_단쇄를 가진 MBr_QC_HSDH_G37D_forw/MBr_QC_HSDH_G37D_rev 및

pET22b(+)-HSDH_단쇄_G37D를 가진 MBr_QC_HSDH_R38L_forw/ MBr_QC_HSDH_R38L_rev

얻어진 단백질 변형체가 더 이상 NADPH와 함께 활성을 나타내지 않는 것으로 판명되었다. 이것은, 보조인자 결합을 위해 확인된 위치의 중요성을 강조한다. 종래 이렇게 제조된 변형체는 NADH와의 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 기재된 위치 또는 추가의 위치에서 포화 돌연변이유발에 의해 NADH-의존성 HSDH 변형체가 수득될 수 있다.

실시예 6: 생성물 억제 변이체 37 D12 의 특징화

연구된 12α-HSDH에서, 생성물 12-케토케노데옥시콜린산에 의한 억제가 관찰되어야 하고, 이것은 공정에서 반응 속도에 미치는 부정적인 효과를 가질 수 있다. 12α-HSDH의 생성물 억제를 감소시키기 위하여, 4000개 변이체를 가진 무작위 12α-HSDH 라이브러리를 실수-유발 PCR에 의해 제조하였다. 적절한 방법이 원칙적으로 공지되어 있고, 예를 들어 [Cadwell, R. C. et al., Randomization of Genes by PCR Mutagenesis]; [(1992) PCR Methods and Applications, 2:28-33, Cold Spring Harbor Laboratory]; [Arnold, F. H. et al., Current Opinion in Chemical Biology (1999) 3:54-59]; 또는 [Liebeton, K. et al., Chemistry & Biology, (2000), 7:709-718]에 기재되어 있다. kb 당 4.5 돌연변이의 돌연변이 비율이 달성되도록 실수-유발 PCR의 표적 DNA의 출발 양을 선택하였다. 생성물을 pET22b (+) 벡터 내로 결찰시키고 이.콜리 노바 블루(DE3)에서 형질전환시켰다.

다수의 대략 4000개 변이체를 마이크로티터 평판(MTP)에 찍어넣고, 이것을 주 배양액의 접종을 위해 사용하였다. 유도, 발현 및 세포 붕괴를 위하여, 깊은 공동을 가진 MTP를 사용하였다. 생성물의 존재 하에서 마이크로티터 규모에서 모든 4000개 변이체의 세포 용해물의 선별을 수행하였다. 몇 개의 변이체를 여기에서 확인하였으며, 변이체 37D12를 더욱 사용하였다.

12α-HSDH 상동성 모델에서 변이체 37D12의 돌연변이를 도 8에 나타낼 수 있다. 이것은 히스티딘을 글루타민으로 교환하는 것이고 (참조, 도 7에 따른 서열) 기질과 보조인자 결합 포켓 사이의 활성 중심 영역에 위치한다.

변이체 37D12가 야생형에 비해 변형된 반응속도를 갖기 때문에, 생성물 억제의 추가 분석을 위하여, 활성의 계산을 위해 최고의 선형성이 달성되는 반응 개시 후 처음 1분 이내에 30초의 시간 범위가 사용되도록 활성을 정의하였다. 야생형 및 변이체 37D12를 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 후에, 이러한 조건을 사용하여 생성물 억제를 다시 조사하였다. 도 9에 나타낸 것과 같이, 변이체는 1%의 대사회전에서도 현저히 감소된 억제를 나타낸다. 5% 대사회전에서, 야생형 효소는 변이체 37D12에 대해 20%와는 반대로 60%의 손실을 나타내었다. 25%의 대사회전에서 야생형에 비하여 변이체 37D12의 경우에 3-배 활성이 유지되었다.

정제 후에, 변이체의 비활성이 15.71 U/mg이고 야생형의 비활성이 30.87 U/mg인 것으로 계산할 수 있다. 따라서, 돌연변이는 약 50%의 활성 손실을 가져온다.

여기에서 본 명세서에 인용된 공보의 개시내용을 참조한다.

SEQUENCE LISTING <110> PHARMAZELL GmbH <120> 12alpha-HSDH <130> M/48429-PCT <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 813 <212> DNA <213> Clostridium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(813) <400> 1 atg gat ttt att gat ttt aag gag atg ggc aga atg ggg atc ttt gac 48 Met Asp Phe Ile Asp Phe Lys Glu Met Gly Arg Met Gly Ile Phe Asp 1 5 10 15 gga aag gtc gca atc att act ggc ggg ggc aag gcc aaa tcg atc ggc 96 Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys Ser Ile Gly 20 25 30 tac ggc att gcc gtg gcc tat gct aag gag ggg gcc aac ctg gtc ctg 144 Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Asn Leu Val Leu 35 40 45 acc ggc aga aac gag cag aaa ctg ctg gac gcc aag gag gag ctg gag 192 Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys Glu Glu Leu Glu 50 55 60 cgc ctc tac ggc atc aag gtg ttg ccg ctg gcg gtg gac gtc acc ccc 240 Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val Asp Val Thr Pro 65 70 75 80 agc gat gag tcg gag gac cgg gtc aag gaa gcc gtg cag aag gtc atc 288 Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val Gln Lys Val Ile 85 90 95 gcc gaa ttc ggc cgc atc gac gtg ctg atc aac aac gcc cag gcg tcg 336 Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gln Ala Ser 100 105 110 gcc tcg ggc atc ccc ctg tcc atg cag acc aaa gac cac ttt gac ctg 384 Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp His Phe Asp Leu 115 120 125 ggc atc tac tcc ggg ctc tac gcc acc ttc tac tac atg agg gag tgc 432 Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr Met Arg Glu Cys 130 135 140 tat ccc tac ctg aag gag acc cag ggc tcg gtc atc aac ttc gcc tcc 480 Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile Asn Phe Ala Ser 145 150 155 160 ggc gcc ggc ctc ttc ggc aac gtg ggt cag tgc tcc tac gcc gcc gcc 528 Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser Tyr Ala Ala Ala 165 170 175 aaa gag ggc atc cgc ggc ctc tcc cgc gtc gcg gcc acc gag tgg ggc 576 Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala Thr Glu Trp Gly 180 185 190 aag gac aac atc aac gtc aac gtg gtc tgc ccc ctg gcc atg acc gcc 624 Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu Ala Met Thr Ala 195 200 205 cag ctg gag aac ttc aag ctc tcc tac cct gag gcc tac gag aaa aac 672 Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Asn 210 215 220 ctc aga ggg gtg ccc atg ggc cgc ttc ggt gac ccc gag ctg gac atc 720 Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro Glu Leu Asp Ile 225 230 235 240 ggc cgg gtc tgc gtg cag ctc ggc tcg ccc gac ttc aag tac atg tcc 768 Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe Lys Tyr Met Ser 245 250 255 ggc gag acc ctc acc ctg gaa ggc ggc atg ggt cag cgc ccc tag 813 Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln Arg Pro 260 265 270 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Clostridium sp. <400> 2 Met Asp Phe Ile Asp Phe Lys Glu Met Gly Arg Met Gly Ile Phe Asp 1 5 10 15 Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys Ser Ile Gly 20 25 30 Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Asn Leu Val Leu 35 40 45 Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys Glu Glu Leu Glu 50 55 60 Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val Asp Val Thr Pro 65 70 75 80 Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val Gln Lys Val Ile 85 90 95 Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gln Ala Ser 100 105 110 Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp His Phe Asp Leu 115 120 125 Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr Met Arg Glu Cys 130 135 140 Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile Asn Phe Ala Ser 145 150 155 160 Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser Tyr Ala Ala Ala 165 170 175 Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala Thr Glu Trp Gly 180 185 190 Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu Ala Met Thr Ala 195 200 205 Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Asn 210 215 220 Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro Glu Leu Asp Ile 225 230 235 240 Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe Lys Tyr Met Ser 245 250 255 Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln Arg Pro 260 265 270 <210> 3 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> K?stliche Kurzsequenz <220> <221> CDS <222> (1)..(774) <400> 3 atc ttt gac gga aag gtc gca atc att act ggc ggg ggc aag gcc aaa 48 Ile Phe Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys 1 5 10 15 tcg atc ggc tac ggc att gcc gtg gcc tat gct aag gag ggg gcc aac 96 Ser Ile Gly Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Asn 20 25 30 ctg gtc ctg acc ggc aga aac gag cag aaa ctg ctg gac gcc aag gag 144 Leu Val Leu Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys Glu 35 40 45 gag ctg gag cgc ctc tac ggc atc aag gtg ttg ccg ctg gcg gtg gac 192 Glu Leu Glu Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val Asp 50 55 60 gtc acc ccc agc gat gag tcg gag gac cgg gtc aag gaa gcc gtg cag 240 Val Thr Pro Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val Gln 65 70 75 80 aag gtc atc gcc gaa ttc ggc cgc atc gac gtg ctg atc aac aac gcc 288 Lys Val Ile Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala 85 90 95 cag gcg tcg gcc tcg ggc atc ccc ctg tcc atg cag acc aaa gac cac 336 Gln Ala Ser Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp His 100 105 110 ttt gac ctg ggc atc tac tcc ggg ctc tac gcc acc ttc tac tac atg 384 Phe Asp Leu Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr Met 115 120 125 agg gag tgc tat ccc tac ctg aag gag acc cag ggc tcg gtc atc aac 432 Arg Glu Cys Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile Asn 130 135 140 ttc gcc tcc ggc gcc ggc ctc ttc ggc aac gtg ggt cag tgc tcc tac 480 Phe Ala Ser Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser Tyr 145 150 155 160 gcc gcc gcc aaa gag ggc atc cgc ggc ctc tcc cgc gtc gcg gcc acc 528 Ala Ala Ala Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala Thr 165 170 175 gag tgg ggc aag gac aac atc aac gtc aac gtg gtc tgc ccc ctg gcc 576 Glu Trp Gly Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu Ala 180 185 190 atg acc gcc cag ctg gag aac ttc aag ctc tcc tac cct gag gcc tac 624 Met Thr Ala Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr 195 200 205 gag aaa aac ctc aga ggg gtg ccc atg ggc cgc ttc ggt gac ccc gag 672 Glu Lys Asn Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro Glu 210 215 220 ctg gac atc ggc cgg gtc tgc gtg cag ctc ggc tcg ccc gac ttc aag 720 Leu Asp Ile Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe Lys 225 230 235 240 tac atg tcc ggc gag acc ctc acc ctg gaa ggc ggc atg ggt cag cgc 768 Tyr Met Ser Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln Arg 245 250 255 ccc tag 774 Pro <210> 4 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ile Phe Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys 1 5 10 15 Ser Ile Gly Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Asn 20 25 30 Leu Val Leu Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys Glu 35 40 45 Glu Leu Glu Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val Asp 50 55 60 Val Thr Pro Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val Gln 65 70 75 80 Lys Val Ile Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala 85 90 95 Gln Ala Ser Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp His 100 105 110 Phe Asp Leu Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr Met 115 120 125 Arg Glu Cys Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile Asn 130 135 140 Phe Ala Ser Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser Tyr 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala Thr 165 170 175 Glu Trp Gly Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu Ala 180 185 190 Met Thr Ala Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr 195 200 205 Glu Lys Asn Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro Glu 210 215 220 Leu Asp Ile Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe Lys 225 230 235 240 Tyr Met Ser Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln Arg 245 250 255 Pro <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Teilsequenz <400> 5 Leu Ile Asn Asn 1 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminale Teilsequenz Langversion <400> 6 Met Asp Phe Ile Asp Phe Lys Glu Met Gly Arg Met Gly Ile Phe Asp 1 5 10 15 Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys Ser Ile Gly 20 25 30 Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys 35 40 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminale Teilsequenz Langversion <400> 7 Met Asp Phe Ile Asp Phe Lys Glu Met Gly Arg Met Gly Ile 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminale Teilsequenz Kurzversion <400> 8 Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala Lys Ser Ile Gly Tyr Gly Ile Ala 1 5 10 15 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminale Teilsequenz Kurzversion <400> 9 Ile Phe Asp Gly Lys 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminale Teilsequenz Kurzversion <400> 10 Gly Ile Phe Asp Gly Lys 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Teilsequenz 2 <400> 11 Arg Met Gly Ile Phe Asp 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Teilsequenzmotiv <400> 12 Val Leu Thr Gly Arg Asn Glu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminale Teilsequenz <400> 13 Phe Gly Asp Pro Glu Leu Asp Ile 1 5 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer forward lang <400> 14 ggtattccat atggatttta ttgattttaa ggagatg 37 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer Forward kurz <400> 15 ggtattccat atgatctttg acggaaaggt cgc 33 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer Revers <400> 16 cgggatccct aggggcgctg accc 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 17 ctggtcctga ccgacagaaa cgagc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 18 gctcgtttct gtcggtcagg accag 25 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 19 gtcctgaccg acttaaacga gcagaaac 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 20 gtttctgctc gtttaagtcg gtcaggac 28 <210> 21 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant Q97H <220> <221> CDS <222> (1)..(777) <400> 21 atg atc ttt gac gga aag gtc gca atc att act ggc ggg ggc aag gcc 48 Met Ile Phe Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 aaa tcg atc ggc tac ggc att gcc gtg gcc tat gct aag gag ggg gcc 96 Lys Ser Ile Gly Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala 20 25 30 aac ctg gtc ctg acc ggc aga aac gag cag aaa ctg ctg gac gcc aag 144 Asn Leu Val Leu Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys 35 40 45 gag gag ctg gag cgc ctc tac ggc atc aag gtg ttg ccg ctg gcg gtg 192 Glu Glu Leu Glu Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val 50 55 60 gac gtc acc ccc agc gat gag tcg gag gac cgg gtc aag gaa gcc gtg 240 Asp Val Thr Pro Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val 65 70 75 80 cag aag gtc atc gcc gaa ttc ggc cgc atc gac gtg ctg atc aac aac 288 Gln Lys Val Ile Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn 85 90 95 gcc cat gcg tcg gcc tcg ggc atc ccc ctg tcc atg cag acc aaa gac 336 Ala His Ala Ser Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp 100 105 110 cac ttt gac ctg ggc atc tac tcc ggg ctc tac gcc acc ttc tac tac 384 His Phe Asp Leu Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr 115 120 125 atg agg gag tgc tat ccc tac ctg aag gag act cag ggc tcg gtc atc 432 Met Arg Glu Cys Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile 130 135 140 aac ttc gcc tcc ggc gcc ggc ctc ttc ggc aac gtg ggt cag tgc tcc 480 Asn Phe Ala Ser Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser 145 150 155 160 tac gcc gcc gcc aaa gag ggc atc cgc ggc ctc tcc cgc gtc gcg gcc 528 Tyr Ala Ala Ala Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala 165 170 175 acc gag tgg ggc aag gac aac atc aac gtc aac gtg gtc tgc ccc ctg 576 Thr Glu Trp Gly Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu 180 185 190 gcc atg acc gcc cag ctg gag aac ttc aag ctc tcc tac cct gag gcc 624 Ala Met Thr Ala Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala 195 200 205 tac gag aaa aac ctc aga ggg gtg ccc atg ggc cgc ttc ggt gac ccc 672 Tyr Glu Lys Asn Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro 210 215 220 gag ctg gac atc ggc cgg gtc tgc gtg cag ctc ggc tcg ccc gac ttc 720 Glu Leu Asp Ile Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe 225 230 235 240 aag tac atg tcc ggc gag acc ctc acc ctg gaa ggc ggc atg ggt cag 768 Lys Tyr Met Ser Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln 245 250 255 cgc ccc tag 777 Arg Pro <210> 22 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Met Ile Phe Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Gly Lys Ala 1 5 10 15 Lys Ser Ile Gly Tyr Gly Ile Ala Val Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Ala 20 25 30 Asn Leu Val Leu Thr Gly Arg Asn Glu Gln Lys Leu Leu Asp Ala Lys 35 40 45 Glu Glu Leu Glu Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Val Leu Pro Leu Ala Val 50 55 60 Asp Val Thr Pro Ser Asp Glu Ser Glu Asp Arg Val Lys Glu Ala Val 65 70 75 80 Gln Lys Val Ile Ala Glu Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn 85 90 95 Ala His Ala Ser Ala Ser Gly Ile Pro Leu Ser Met Gln Thr Lys Asp 100 105 110 His Phe Asp Leu Gly Ile Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Thr Phe Tyr Tyr 115 120 125 Met Arg Glu Cys Tyr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Gln Gly Ser Val Ile 130 135 140 Asn Phe Ala Ser Gly Ala Gly Leu Phe Gly Asn Val Gly Gln Cys Ser 145 150 155 160 Tyr Ala Ala Ala Lys Glu Gly Ile Arg Gly Leu Ser Arg Val Ala Ala 165 170 175 Thr Glu Trp Gly Lys Asp Asn Ile Asn Val Asn Val Val Cys Pro Leu 180 185 190 Ala Met Thr Ala Gln Leu Glu Asn Phe Lys Leu Ser Tyr Pro Glu Ala 195 200 205 Tyr Glu Lys Asn Leu Arg Gly Val Pro Met Gly Arg Phe Gly Asp Pro 210 215 220 Glu Leu Asp Ile Gly Arg Val Cys Val Gln Leu Gly Ser Pro Asp Phe 225 230 235 240 Lys Tyr Met Ser Gly Glu Thr Leu Thr Leu Glu Gly Gly Met Gly Gln 245 250 255 Arg Pro

Claims (33)

1. 대략 27 내지 30 kD 범위의 분자량을 가진 클로스트리듐 종으로부터 수득가능한 정제된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 (12α-HSDH).
2. 제1항에 있어서, 클로스트리듐 종 군 P 균주 48-50 (DSM4029)로부터 수득가능한 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대략 10 U/mg를 초과하는 범위의 비활성을 가진 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
4. 하기 서열 모티프 중 적어도 하나를 포함하는 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소:
   a)

   

   
   b)

   

   
   c)
   

   

   
   으로부터 선택된 N-말단 서열
   d)

   
5. a) 위치 +1 또는 +2에서 시작하는 각각의 경우에, 서열 2 또는 4에 따른 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나; 또는
   b) 적어도 60%의 서열 동일성 백분율을 갖는, a)에 따른 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
   c) a) 및 b)에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되거나; 또는
   d) 서열 1 또는 3에 따른 코딩 핵산 서열에 의해 코딩되거나; 또는
   e) 적어도 60%의 서열 동일성 백분율을 갖는, 서열 1 또는 3에 따른 핵산 서열로부터 유래된 코딩 서열에 의해 코딩되는,
   12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
6. 변형된 공-기질 이용 및/또는 감소된 생성물 억제를 가진 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 변이체.
7. 제6항에 있어서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 청구된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소로부터 유래되고,
   a) 서열 모티프 VLTGRNE (서열 12)에서 공-기질 이용을 변형시키는 적어도 하나의 돌연변이; 및/또는
   b) 효소의 기질 결합 포켓을 형성하는 아미노산 잔기 영역에서 생성물 억제를 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 가진 변이체.
8. 제7항에 있어서,
   a) 서열 12에서 하기 아미노산 치환: G → D; R → A 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는
   b) 적어도, 서열 4의 위치 97에 상응하는 아미노산 Q의 돌연변이를 포함하고; 특히 서열 4에서 Q97H에 상응하는 돌연변이를 포함하는 변이체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제5항의 c), d) 또는 e)에 기재된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소-코딩 핵산 서열의 이종 발현에 의해 수득가능한, 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
10. 제9항에 있어서, 비병원성 미생물에서 발현되는 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
11. 제10항에 있어서, 에스케리키아 속의 세균, 특히 이.콜리 종에서 발현되는 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소.
12. 제5항의 c), d) 또는 e)에서의 정의에 따른 핵산 서열.
13. 적어도 하나의 조절 핵산 서열의 유전적 조절 하에서 제12항에 청구된 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
14. 제13항에 청구된 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
15. 제12항에 청구된 적어도 하나의 핵산 서열 또는 제13항에 청구된 적어도 하나의 발현 카세트를 보유하거나, 제14항에 청구된 적어도 하나의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
16. 제15항에 청구된 미생물을 배양하고, 발현된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 배양액으로부터 단리하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 제조 방법.
17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서의 정의에 따른 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 존재 하에서 히드록시스테로이드를 반응시키고, 형성된 적어도 하나의 산화 생성물을 반응 배치로부터 임의로 단리하는, 12α-히드록시스테로이드의 효소적 산화 방법.
18. 제17항에 있어서, 히드록시스테로이드가 콜린산(CA) 또는 콜린산 유도체, 예를 들면 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르인 방법.
19. 제18항에 있어서, CA 또는 그의 유도체를 반응시켜 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)를 수득하거나 또는 상응하는 유도체를 수득하는 방법.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, NAD(P)⁺의 존재 하에서 반응이 일어나는 방법.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서의 정의에 따른 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 존재 하에서 케토스테로이드를 반응시키고, 형성된 환원 생성물을 반응 배치로부터 임의로 단리하는, 12-케토스테로이드의 효소적 환원 방법.
22. 제21항에 있어서, 케토스테로이드가 12-케토-CDCA 또는 그의 유도체, 예를 들면 특히 염, 아미드 또는 알킬 에스테르인 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 케토스테로이드 또는 그의 유도체를 상응하는 12α-히드록시스테로이드 또는 그의 유도체로 환원시키는 방법.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, NAD(P)H의 존재 하에서 반응이 일어나는 방법.
25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 소비된 산화환원 균등물이 전기화학적 또는 효소적으로 재생되는 방법.
26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소와의 반응이 고정화 형태로 일어나는 방법.
27. 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 고정화 형태로 포함하는 바이오반응기.
28. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소에 의해 촉매화된 산화환원 반응의 스테로이드를 산화환원 균등물의 존재 하에서 수행하고, 산화환원 균등물의 농도 변화를 결정하고, 그로부터 12-케토스테로이드 또는 12α-히드록시스테로이드의 함량을 정성적 또는 정량적으로 결정하는, 12-케토스테로이드 또는 12α-히드록시스테로이드의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
29. a) 하기 화학식 2의 콜린산(CA)을 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 존재 하에 하기 화학식 3의 상응하는 12-케토케노데옥시콜린산 (12-케토-CDCA)으로 산화시키고;
    b) 하기 화학식 3의 12-케토-CDCA를 탈산소화에 의해 반응시켜 하기 화학식 4의 케노데옥시콜린산(CDCA)을 수득하고;
    c) 하기 화학식 4의 CDCA를 위치 7에서 하기 화학식 5의 7-케토리소콜린산(KLCA)으로 화학적 산화시키고;
    d) 하기 화학식 5의 KLCA를 환원시키고;
    e) 반응 생성물을 임의로 더 정제하는
    것을 포함하는, 하기 화학식 1의 우르소데옥시콜린산(UDCA)의 제조 방법.
    <화학식 1>
    

    

    
    (상기 식에서,
    R은 알킬, NR¹R², H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺를 나타내고, 여기에서 라디칼 R³은 동일하거나 상이하며 H 또는 알킬을 나타낸다)
    <화학식 2>
    

    

    
    (상기 식에서, R은 상기 나타낸 의미를 갖고, 라디칼 R_a은 동일하거나 상이하고 H 또는 아실을 나타낸다)
    <화학식 3>
    

    

    
    (상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다)
    <화학식 4>
    

    

    
    (상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다)
    <화학식 5>
    

    

    
    (상기 식에서, R 및 R_a는 상기 나타낸 의미를 갖는다).
30. 제29항에 있어서, R_a가 아실을 나타낸다면, 이러한 아실 기가 반응 단계 b) 또는 d)를 수행한 후에 임의로 제거되는 방법.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 단계 a)가 NAD(P)⁺의 존재 하에서 일어나는 방법.
32. 제31항에 있어서, 소모된 NAD(P)⁺를 전기화학적 또는 효소적으로 재생하는 방법.
33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가 고정화 형태로 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 이용하여 일어나는 방법.

Images