JP2018148906A - テルペンの生体触媒環化のための方法及びその方法で使用され得るシクラーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の意味では、「シクラーゼ」は一般に、特にシトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を示す、酵素又は酵素変異体である。イソメラーゼサブクラスからの分子内トランスフェラーゼが、シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を有する酵素として適切である;即ち、EC番号EC 5.4.(Eur. J. Biochem. 1999、264、610〜650による酵素コード)を有するタンパク質。特に、EC 5.4.99.17がその代表である。シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を有する適切な酵素は、特に、ホモファルネソールからアンブロキサンへの環化又はスクアレンからホペンへの環化もまたもたらし(従って、「SHC」:スクアレンホペンシクラーゼと称することもある)、国際出願PCT/EP2010/057696(本明細書中で明示的に参照される)に詳細に記載されたシクラーゼである。特に、本発明によるシクラーゼは、SHCの変異によって誘導されるシクラーゼである。
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100
式中、XA及びXBは、それぞれ鏡像体A及びBのモル分率を示す。
アルキル及びまたそれから誘導されるラジカル(基)(例えば、ヒドロキシアルキル)中の全てのアルキル部分、例えば:1〜4個、1〜6個、1〜8個又は1〜10個の炭素原子を有する、飽和の、直鎖又は分枝鎖の炭化水素ラジカル、例えば、
・C1〜C6-アルキル:例えば、C1〜C4-アルキルの代表例として、メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル及び1,1-ジメチルエチル;並びにまた、ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル及び1-エチル-2-メチルプロピル。
-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル、1-エチル-2-メチル-1-プロペニル及び1-エチル-2-メチル-2-プロペニルなどのC2〜C6-アルケニルである。
本発明は、以下の特別な実施形態に特に関する。
b)配列番号3〜326から選択される配列における変異であって、変異した位置は、配列番号2の位置F486に対応する(即ち、「F486アナログ」位置である)、変異
を含む、実施形態1に記載の酵素変異体であって、
少なくとも一つのシトロネラール異性体から、少なくとも一つのイソプレゴール異性体への少なくとも環化は、変異によって行うことが可能であるか(即ち、対応する元の又は野生型のタンパク質はこの反応を触媒しない)、又は改変される(即ち、対応する元の又は野生型のタンパク質はこの反応を触媒するが、例えば、より低い生成物収率、ターンオーバー速度及び/又は立体特異性である)。さらに、シクラーゼの部分配列又は短縮形態はまた、配列番号2由来のF486に対応する位置において、このシクラーゼに典型的な(cycrase-typical)変異を有する。例えば、配列番号2によるシクラーゼのN末端短縮版は、この短縮版の一例である。これは、以下のN末端:(M)KIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPN……を特徴とし、式中、N末端のKは、配列番号2の位置16に対応する。
配列番号2又はその短縮版によるF486X、式中、X=N、Q、L、M、E、G、S、V、T、C、I又はA
配列番号2又はその短縮版によるY702X、式中、X=F、A、C又はS
配列番号2又はその短縮版によるY561X、式中、X=A又はS
(この短縮版は、例えば、以下のN末端配列:(M)KIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPN……を含む。)
b)配列番号2による多重変異体F486A/Y702A、F486A/Y561A又はF486A/Y705A
c)配列番号3〜325のうち一つから誘導された、a)又はb)に対応する変異体
から選択される、実施形態1〜8の一つに記載の酵素変異体。
・30〜70重量%の、NiOとして計算したニッケルの酸素含有化合物
・15〜45重量%の、ZrO2として計算したジルコニウムの酸素含有化合物
・5〜30重量%の、CuOとして計算した銅の酸素含有化合物、及び
・0.1〜10重量%の、MoO3として計算したモリブデンの酸素含有化合物
を含む触媒の存在下で生じ、重量%の数字は、乾燥非還元型触媒に基づくものである、請求項19に記載の方法。
「a」、「b」、「c」及び「d」は、各場合において互いに独立して、単結合又は二重結合のC-C結合を示し、但し、累積二重結合が排除されること及び以下を条件とする:
R1は以下の定義を有する:
(1)「a」が二重結合である場合:
R1は、
オキソ(=O)、又は
CH-(CH2)n-Zから選択され、
式中、nは0、1又は2であり、
Zは、OH、CHO、C(O)アルキル、例えば、C(O)C1〜C4-アルキル、特に、C(O)-CH3又はC(O)-CH2CH3;COOH、C(CH2)-CH=CH2;C(OH)(CH3)-CH=CH2;C(CH3)=CH-CH=CH2;又は式C(CH3)=CH-CH2Yのラジカルであり、
式中、Yは、OH、CH2OH、COOH又はCH2C(O)CH3である;又は
(2)「a」が単結合である場合:
R1は、CH3;CHO;CH2CH2OH;CH=CH2;CH2C(O)OH;CH2CHO又はC3H6CH(CH3)CHOから選択され;
「a」が二重結合である場合、この二重結合はE配置又はZ配置を有する;
R2及びR3は、以下の定義を有する:
(1)「a」及び「b」がそれぞれ単結合である場合:
R2及びR3は、互いに独立して、H、アルキル、例えばC1〜C4-アルキル、又はOHであるか、或いはR2及びR3は一緒になって、メチレン(=CH2)又はオキソ(=O)基である;又は
(2)「a」又は「b」が二重結合である場合、ラジカルR2及びR3のうち一方は存在せず、二つのラジカルのうちもう一方はH、C1〜C4-アルキル、特にメチル、又はOHである;
R4はH又はヒドロキシ-C1〜C4-アルキル、特にヒドロキシメチルである;
R5及びR6は、以下の定義を有する:
(1)「c」が単結合である場合:
R5及びR6はそれぞれHであるか、又はR5及びR6は一緒になって、オキソ(=O)基である;又は
(2)「c」が二重結合である場合、ラジカルR5及びR6のうち一方は存在せず、二つのラジカルのうちもう一方はHである;
R7、R8及びR9は、以下の定義を有する:
(1)「d」が単結合である場合:
ラジカルR7、R8及びR9のうち二つは、各場合において互いに独立して、H又はアルキル、例えばC1〜C4-アルキル、特にメチル若しくはエチルであり、残りのラジカルはOHである;又は
(2)「d」が二重結合である場合、ラジカルR7、R8及びR9のうち一つは存在せず、二つのラジカルの残りは、各場合において互いに独立して、H又はアルキル、例えばC1〜C4-アルキル、特にメチル若しくはエチルである;
R10は、H又はヒドロキシ-C1〜C6-アルキル、例えばヒドロキシ-C1〜C4-アルキル又はモノ不飽和若しくはポリ不飽和のC2〜C6-アルケニル、例えば特にH若しくはCH=CH-C(CH3)=CH2であり;
この方法では、立体異性体的に純粋な形態の式IVの化合物又はそれらの立体異性体混合物を、クラスEC 5.4.99、特にクラスEC 5.4.99.17の酵素を使用して、又は実施形態1〜12の一つに記載の酵素変異体を使用して、又はこれらの酵素若しくは酵素変異体を発現する実施形態16に記載の微生物の存在下で反応させる、方法。
(式中、
R1は前記した定義を有し、特にラジカルCH-(CH2)n-Zであり、式中、
n=0かつZ=CHO又はCOOH;又は
n=1かつZ=OH;又は
n=2かつZ=C(O)CH3;COOH、C(CH2)-CH=CH2;C(CH3)=CH-CH=CH2;又は式C(CH3)=CH-CH2Yのラジカルであり、
式中、Yは、OH、CH2OH、COOH又はCH2C(O)CH3である;
かつ「a」はE配置又はZ配置を任意選択で有する);又は
式IVb
(式中、R1は前記した定義を有し、特にCH-CHOであり;ラジカルR7及びR8のうち一方はHであり、もう一方はC1〜C4-アルキルであり、特に、R7はエチルであり、二重結合「a」及び「d」はZ配置を有する)、
から選択される化合物が変換される、実施形態21に記載の方法。
a)配列番号2である、又は
b)アミノ酸残基の最大25%、例えば最大20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2若しくは1%が、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせによって、配列番号2に対して変更されており、配列番号2の酵素活性の少なくとも50%、例えば少なくとも60、65、70、75、80、85、90又は95%をなお有している。
a)シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を有する、遊離の、任意選択で精製又は部分的に精製されたポリペプチド;
b)シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を有する、固定化されたポリペプチド;
c)細胞から単離された、a)又はb)によるポリペプチド;
d)シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼの活性を有するポリペプチドを少なくとも一つ含む、細胞全体、任意選択で休止細胞又は消化された細胞;
e)d)の下に記載された細胞の細胞溶解物又は細胞ホモジネート。
a)配列番号2である、又は
b)アミノ酸残基の最大25%、例えば最大20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2若しくは1%が、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせによって、配列番号2に対して変更されており、配列番号2の酵素活性の少なくとも50%、例えば少なくとも60、65、70、75、80、85、90又は95%をなお有している。
1.特に適切な野生型配列
本発明に従って有用なSHC野生型配列、その配列番号、供給源生物、GenBank参照番号、配列番号2の位置F486に「対応する」アミノ酸残基、即ち、F486アナログ(「Aa」)、及びその配列位置を、以下の表に示す。情報は、以下のように設定した配列アラインメントに基づく:
プログラム:CLUSTALW、
デフォルトパラメータ:
タンパク質ギャップオープンペナルティ(Protein Gap Open Penalty) 10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ(Protein Gap Extension Penalty) 0.2
タンパク質ウェイトマトリクス(Protein weight matrix): Gonnetシリーズ
本発明は、本明細書中に具体的に開示されるシクラーゼ活性を有する変異体に限定されず、その機能的等価物にも拡張される。
3.1核酸
本発明は、上記酵素又はシクラーゼ活性を有する上記その変異体をコードする核酸配列にも関する。
複数のアラインメントパラメータ:
ギャップオープニングペナルティ(Gap opening penalty) 10
ギャップ伸長ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲(Gap separation penalty range) 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅延(alignment delay)のための%同一性 40
残基特異的ギャップ(Residue specific gap) オフ
親水性残基ギャップ(Hydrophilic residue gap) オフ
トランジションウェイティング(Transition weighting) 0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
K-タプル(K-tuple)サイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウインドウサイズ 5
最良のディアゴナルの数(Number of best diagonal) 5。
DNAギャップオープンペナルティ 15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ 6.66
DNAマトリクス 同一性
タンパク質ギャップオープンペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ 0.2
タンパク質マトリクス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4。
さらに、本発明による酵素の機能的変異体を生成するための方法は、当業者に公知である。
・部位特異的変異誘発(この方法では、遺伝子の単一又は数個のヌクレオチドが意図的に交換される)(Trower MK (編) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
・飽和変異誘発(この方法では、任意のアミノ酸のためのコドンが、遺伝子の任意の点で交換又は付加され得る)(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
・エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(エラープローンPCR)(この方法では、ヌクレオチド配列がエラープローンDNAポリメラーゼによって変異導入される)(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);
・SeSaM法(配列飽和法(sequence saturation method))(この方法では、好ましい交換がポリメラーゼによって防止される)(Schenkら、Biospektrum、第3巻、2006、277〜279)
・ミューテーター株における遺伝子の継代(この方法では、例えば、欠陥のあるDNA修復機構に起因して、ヌクレオチド配列の変異率が増加している)(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (編) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、又は
・DNAシャッフリング(この方法では、密接に関連した遺伝子のプールが形成されて消化され、そのフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用され、このとき、鎖が繰り返し分離され再度一緒になることによって、全長の最終的なモザイク遺伝子が生成される)(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
本発明はさらに、特に、調節核酸配列の遺伝的制御下に、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現構築物;及び特に、これらの発現構築物を少なくとも一つ含む組換えベクターに関する。
文脈に依存して、用語「微生物」は、野生型微生物又は遺伝的に変更された組換え微生物或いはそれら両方を意味し得る。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチド又はその機能的な生物学的に活性なフラグメントの組換え産生のための方法に関し、この方法では、ポリペプチド産生微生物が培養され、任意選択でポリペプチドの発現が誘導され、これらが培養物から単離される。ポリペプチドはまた、所望の場合、この方法で工業規模で生成され得る。
本発明による酵素は、本明細書中に記載される方法において、遊離で又は固定化されて使用され得る。固定化された酵素は、不活性担体に固定化された酵素である。適切な担体材料及びそこに固定化された酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183及びDE-OS 100193773並びにこれらの文献中で引用された参考文献から公知である。これに関して、これらの文献の開示全体が参照される。適切な担体材料には、例えば、粘土、粘土鉱物、例えば、カオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換材料、合成ポリマー、例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン及びポリオレフィン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレンが含まれる。担持された酵素を生成するために、担体材料は、通常、微細に分割された粒状形態で使用され、多孔性形態が好ましい。担体材料の粒径は、通常、5mm以下であり、特に2mm以下である(粒径分布曲線)。同様に、細胞全体触媒としてデヒドロゲナーゼを使用する場合、遊離形態又は固定化形態が選択され得る。担体材料は、例えば、Ca-アルギン酸塩、及びカラゲナンである。酵素並びに細胞はまた、グルタルアルデヒドを用いて直接的に架橋され得る(CLEAへの架橋)。対応する及び他の固定化技術は、例えば、J. Lalonde及びA. Margolin「Immobilization of Enzymes」、K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002、第III巻、991〜1032、Wiley-VCH, Weinheim中に記載されている。本発明による方法を実施するための生体内変換及びバイオリアクタに関するさらなる情報は、例えば、Rehmら、(編)Biotechnology、第2版、第3巻、第17章、VCH, Weinheim中にも示されている。
7.1概要
特に、本発明による環化方法は、酵素の存在下で実施され、この酵素は、配列番号1による核酸配列又はその機能的等価物によってコードされ、この核酸配列は、遺伝子構築物又はベクターの構成要素である。この遺伝子構築物又はベクターは、国際出願PCT/EP2010/057696の第16〜20ページ(本明細書中で明示的に参照される)に詳細に記載されている。この機能的等価物、特にシトロネラール-イソプレゴールシクラーゼ活性を有する機能的等価物は、特に、本明細書中に規定されるようなF486又はF486アナログ変異を含む。
本発明による方法は、酵素が、以下の形態のうち少なくとも一つであることを特徴とする:
a)遊離の、任意選択で精製又は部分的に精製されたポリペプチド;
b)固定化されたポリペプチド;
c)a)又はb)に従って細胞から単離されたポリペプチド;
d)少なくとも一つのかかるポリペプチドを含む細胞全体、任意選択で休止状態又は増殖中の細胞;
e)d)による細胞の溶解物又はホモジネート。
b)この微生物を増殖させる工程、
c)任意選択で、この微生物からシクラーゼ活性を有する酵素を単離する工程又はこの酵素を含むタンパク質画分を調製する工程、及び
d)工程b)に記載の微生物又は工程c)に記載の酵素を、基質、例えば一般式(I)のシトロネラールを含む媒体に移す工程。
本発明に従って使用される、シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼ活性を有する酵素によって変換される式(II)のシトロネラールは、式(R-II)の(+)-R-シトロネラール及び式(S-II)の(-)-S-シトロネラールの両方として、並びに式(II)のラセミ体として、市販されている。
a)配列番号2である、又は
b)アミノ酸残基の最大25%が、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせによって、配列番号2に対して変更されており、配列番号2の酵素活性の少なくとも50%をなお有している。
a)配列番号2である、又は
b)アミノ酸残基の最大25%が、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせによって配列番号2に対して変更されており、配列番号2の酵素活性の少なくとも50%をなお有している。
本発明で調製されるイソプレゴールは、従来の方法での触媒的水素付加によってメントールへと変換され得る。従来の水素付加プロセスもまた、WO 2009/013192に記載されるように、特に触媒的方法において、この目的に特に適している。
・45%〜55重量%の、NiOとして計算したニッケルの酸素含有化合物、
・25%〜35重量%の、ZrO2として計算したジルコニウムの酸素含有化合物、
・5%〜20重量%の、CuOとして計算した銅の酸素含有化合物、
・1%〜3重量%の、MoO3として計算したモリブデン酸素含有化合物、及び
・0%〜5重量%のさらなる成分、
重量%の数字は、加算すると最大100重量%になり、乾燥非還元型触媒に関連している。
本明細書中に記載される酵素及び微生物は、上記一般式IVの化合物を変換するために、特に適切である。その非限定的な例を、構造式及び化学名を記載する以下の表Aにまとめる。
以下の実施例において、特別な情報が存在しない場合には、以下の一般的な情報が適用される。
使用する全ての材料及び微生物は、市販の製品である。
全ての実験はE.コリを用いて実施した。SHCタンパク質は、それぞれのshc遺伝子を有するpET16b構築物を含むE.コリBL21(DE3)pLysS又はE.コリRosetta pLysRAR62中で、アンピシリン(100μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml)、及び0.5mMイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシドを補充したLuria-Bertani培地中で0.4のOD600で増殖させ、30℃で4時間さらに増殖させることによって、発現させた。
それぞれのスクアレン-ホペンシクラーゼ遺伝子(例えば、ザイモモナス・モビリスZMO1548[NC_006526.2、領域:1578816..1580993])を、対応するプライマー対(例えば、ZMO1548-fwd(5'-gcgctgtttcatatgggtattgaca-3')(配列番号327)及びZMO1548-rev(5'-gcgcttaccctggatcctcgaaaat-3')(配列番号328))を使用して、染色体DNAからPCR増幅した。制限酵素消化した(例えば、NdeI/BamHIを用いて)PCR産物を、pET16b中にクローニングし(例えば)pET1584(を得た)。構築物を、DNA配列決定によって確認し、E.コリXL1-blue中に形質転換した。
組換えE.コリ細胞を、20mM Tris-HCl pH8.0(湿細胞1g当たり3ml)中に懸濁した。この環化混合物は、250μlの細胞懸濁物、50μlの1Mクエン酸塩緩衝液(pH4.5)、20mM(最終濃度)の基質及び500μlまでの水を含んだ。スクアレンの環化では、1%(v/v)Triton-X100を添加した。ホモファルネソール環化のために、E.コリ細胞(6gの湿細胞)を、可溶化緩衝液(50mMリン酸塩、10mM MgCl2(pH6.5;総容量:25ml))中に懸濁した。細胞を、Manton-Gaulinホモジナイザーを使用して1500バールで溶解させた。不溶性細胞細片を、遠心分離して除いた(4℃及び7150*gで15分間)。この環化混合物は、1.25mlの緩衝液(50mMリン酸カリウム、45mM MgCl2(pH6.5))中、1mlの生細胞抽出物及び20mMのホモファルネソールを含んだ。反応混合物を、マグネチックスターラーを用いて30℃で撹拌した。反応を、ヘプタンでの抽出によって停止させた。有機相を、ガスクロマトグラフィーによって分析した。コントロールは、空ベクターを保有するE.コリ細胞及び熱不活化SHC発現細胞を用いて実施した。環化生成物の形成は、コントロールでは観察されなかった(データ示さず)。
テルペノイドを、DB-5カラム(20m×0.1mm×0.1μm)及びイオン化検出器を備えたAgilent 7890Aガスクロマトグラフを使用するガスクロマトグラフィーによって、定性的及び定量的に分析した。3μlの溶媒抽出物をカラムにアプライした(分割比1:5、ヘリウム流速0.25又は0.5ml/分、インジェクター温度250℃)。
〔実施例1〕クイックチェンジ変異誘発(quick-change mutagenesis)を使用する合理的タンパク質設計による、F486X型のスクアレン-ホペンシクラーゼの変異体の生成
種々のスクアレン-ホペンシクラーゼの変異体を、対応する遺伝子中に「クイックチェンジ」変異誘発によって組み込んだ。製造業者の情報(Agilent Technologies, Waldbronn)に基づいた手順は、大まかには以下の通りであった。最初に、PCRを実施した:
PCR分量: 1.8μl DMSO
2μl dNTP(各2.5mM)
1.5μl フォワードプライマー(10pmol/μl)
1.5μl リバースプライマー(10pmol/μl)
1μl テンプレート(1μg/μL;SHC遺伝子を保有する組換えプラスミド(例えばpETZmSHC_1)
0.2μl Prime-Star Polymerase(Takara、2.5単位/μl)
6μl 5×緩衝液
16μl H2O
PCRプログラム:
(1)95℃ 3分間
(2)95℃ 45秒間
(3)53℃ 1分間
(4)68℃ 17分間
工程(2)、(3)及び(4)を5×反復。
ZmSHC_1 配列番号2;
ZmSHC_2 配列番号6;
Ap 配列番号4;
Bj 配列番号5及び
Sc 配列番号3。
実施例1に従って生成された、F486に対応する配列位置における種々の単一変異の、シクラーゼ活性に対する影響を、種々の基質について決定した。
ザイモモナス・モビリス由来のスクアレン-ホペンシクラーゼ-1(配列番号2)の、シトロネラールに対する僅かな環化活性の一般的な検出後、ターンオーバー速度は、合理的タンパク質設計によって大いに改善された。予備試験(図2を参照)において、フェニルアラニン残基F486をアラニンに交換することによって、シトロネラール(1)から出発するイソプレゴール(2)の生成の大きな増加がもたらされた。
位置F486での変異後の、活性における明確な変化は、基質としてスクアレンを用いても観察される。興味深いことに、この場合、チロシンでのフェニルアラニンの交換は、ほぼ2倍の変換を生じる(図4を参照)。
実施例1に従って生成された、F486に対応する配列位置における種々の単一変異の、種々の他のSHCのシクラーゼ活性に対する影響を、種々のシトロネラール基質について決定した(各場合において、20mMで一晩のインキュベーション):
変異体は以下の通りである:
Ap-SHC:F481C、
Bj-SHC:F447C、
Sc-SHC:F449C、
Zm SHC-2:F438C。
これらの物質を、上記シトロネラールの変換に使用された条件に対応する条件下で変換した。
国際出願PCT/EP2010/057696(参照により本明細書に組み込まれる)は、特異的オリゴヌクレオチドを使用して、ザイモモナス・モビリスのゲノムDNAからZm-SHC遺伝子を如何にして増幅し、エシェリキア・コリ中で発現させるかを記載している。
以下で扱うのは、国際出願PCT/EP2010/057696にはこの形態で述べられていない、材料及び方法だけである。
E.コリ株DH5α、E.コリ株BL21(DE3)pLysS(Novagen)及びE.コリRosetta株を使用した。プラスミドpET16b(Novagen)をクローニングに使用した。さらに、SHCの過剰発現のために、プラスミドpLysRAR62を、コドン使用頻度をE.コリに適合させるために、さらに形質転換した。さらに、E.コリLu15568由来のプラスミドpDHE+ZmSHC-1を使用した(国際出願PCT/EP2010/057696)。これらの株を、30℃でLB培地中で増殖させた。
スクアレン、(+/-)-シトロネラール、(+)-R-シトロネラール及び(-)-S-シトロネラールは、Sigma(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich)から購入した。制限酵素、T4リガーゼ及びDNAポリメラーゼは、New England Biolabs(New England Biolabs GmbH, Frankfurt)のものであった。
プラスミドを、Qiagen(Qiagen, GmbH, Hilden)のQiaprep Spin Miniprep Kitを使用してE.コリから単離した。ゲル抽出又はPCR精製のために、QiagenのQiaquick Gel Extraction Kitを使用した。使用した全てのE.コリ株は、CaCl2法を使用して形質転換した。
ザイモモナス・モビリス亜種モビリス(Zymomonas mobilis subspec. mobilis)CP4由来のDNAは、Sprenger教授(Institute of Microbiology、University of Stuttgart)により提供された。PCRは、Prime Star Polymeraseを使用して実施した。以下のプライマーを、ザイモモナス・モビリス由来のスクアレン-ホペンシクラーゼ遺伝子を合成するために使用した:
SHC_1: SHC-for TATGCATATGGGTATTGACAGAAT(配列番号387)
SHC-rev CCGGATCCTCAATTATTCAAATCAATC(配列番号388)。
対応するE.コリBl21(DE3)pLysS及びE.コリRosetta形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコール(それぞれ100μg/ml及び32μg/ml)を含むLB培地中で、30℃で培養した。スクアレン-ホペンシクラーゼの合成を、0.5〜1mM IPTG又は0.1%ラムノース(pDHE誘導体を使用する場合)の添加により、0.4〜0.6のOD600で誘導した。細胞をさらに4〜6時間増殖させ、その後回収した。これは、細胞を遠心分離して取り、40%グリセロールを含む25mM Tris/HClを1gの湿重量当たり5mlにすることによって、実施した。細胞を直ぐにはさらに使用しない場合、細胞を-20℃で保存した。細胞の消化のために、細胞を、フレンチプレスにそれぞれ2回供し、活性アッセイのために、直接、又は遠心分離による細胞細片の除去後のいずれかに、使用した。或いは、細胞消化は、超音波を使用して実施した。遠心分離後、SHCタンパク質を、引き続いて可溶化緩衝液(50mM Tris/HCl pH8、10mM MgCl2、1% Triton X-100)で溶解して細胞細片を除去し、従って、SHCタンパク質を部分的に富化した。
クアレン-ホペンシクラーゼの活性を決定するための各バッチは、1mlの最終容量を有した。これは、フレンチプレスによって消化した細胞600μl(或いは、細胞膜からの可溶化後800μl)、異なるpHレベル(pH4.0〜pH8.0を試験に使用した)を有する100mMクエン酸Na緩衝液、及び10mM基質溶液[(+/-)シトロネラール、(+)-R-シトロネラール及び(-)-S-シトロネラール]からなった。基質及びH2Oに加えて、基質溶液は、Triton X-100(これは、0.2%の濃度で各活性バッチ中に存在した)もまた含んだ。
ガスクロマトグラフィー測定を、水素炎イオン化検出器を備えたAgilent 7890Aガスクロマトグラフで実施した。使用したカラムは、20mの長さ、0.1mmの直径及び0.25μMのコーティングを有するDB-5(Agilent Technologies)であった。物質を、入手可能な標準溶液を用いた保持時間の比較によって同定した。
ザイモモナス・モビリス由来のスクアレン-ホペンシクラーゼを、E.コリにおいて組換えにより調製した。この酵素は、シトロネラールをイソプレゴールへ変換することができる。
配列番号1〜326 種々のSHC遺伝子の核酸/アミノ酸配列
配列番号327〜388 PCRプライマー。
Claims (26)
- 配列番号2〜326又はその部分配列から選択されるアミノ酸配列を含む、野生型酵素の変異体から選択される、シクラーゼ活性を有する酵素変異体であって、シトロネラール異性体から、少なくとも一つのイソプレゴール異性体への少なくとも環化を触媒する、前記酵素変異体。
- a)配列番号2の位置F486における変異、又は
b)配列番号3〜326から選択される配列における変異であって、変異した位置が、配列番号2の位置F486に対応する、前記変異、
を含む、請求項1に記載の酵素変異体。 - 各場合においてアミノ酸残基の最大25%が、欠失、挿入、置換、付加、逆位又はそれらの組み合わせによって、配列番号2〜326に対して変更されている、請求項1又は2に記載の酵素変異体。
- 配列番号2の位置F486における変異、又は配列番号3〜326による配列のうち一つにおける、該位置に対応する位置における変異が、F486N、F486Q、F486L、F486M、F486E、F486G、F486S、F486V、F486T、F486C、F486I及びF486Aから選択される置換である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- さらに、配列番号2の位置W374、D437、D440、F428、W555、Y561、Y702、Y705の一つに、又は配列番号3〜326による配列のうち一つにおける、該位置から選択される少なくとも一つの対応する位置に少なくとも一つの変異が存在する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- 配列番号2の位置D437及び/又はD439及び/又はD440に変異が存在しないか、或いは配列番号3〜326による配列のうち一つにおけるそれぞれの対応する位置に変異が存在しない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- 配列番号2の位置Y702に変異が存在しないか、若しくは配列番号3〜326による配列のうち一つにおける対応する位置に変異が存在しないか、又は変異が存在する場合には、該変異が置換Y702F又は対応する置換である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- 配列番号2の位置P229、D439、D508、E601、G553、G556、N432、P436、P499、R224、S371、T376、T563、W414若しくはW624のうち少なくとも一つにおいて、又は配列番号3〜326による配列のうち一つにおける、該位置から選択される少なくとも一つの対応する位置において、任意選択でさらに変異している、請求項1〜7のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- a)単一変異体:
配列番号2によるF486X、式中、X=N、Q、L、M、E、G、S、V、T、C、I又はA
配列番号2によるY702X、式中、X=F、A、C又はS
配列番号2によるY561X、式中、X=A又はS、
b)配列番号2による多重変異体F486A/Y702A、F486A/Y561A又はF486A/Y705A、
c)配列番号3〜325のうち一つから誘導された、a)又はb)に対応する変異体、
から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の酵素変異体。 - 配列番号2によるアミノ酸配列を位置1から725まで、2から725まで又は16から725まで含み、任意選択でN末端がメチオニン残基で伸長されている酵素のシトロネラール-イソプレゴールシクラーゼ活性の少なくとも50%を示す、請求項1〜9のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- シトロネラール-イソプレゴールシクラーゼ活性が、標準条件下で参照基質としてシトロネラールを使用して決定される、請求項10に記載の酵素変異体。
- 変異が、配列番号2によるアミノ酸配列を位置1から725まで、2から725まで又は16から725までを含み、任意選択でN末端がメチオニン残基で伸長されている酵素において生じる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の酵素変異体。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の変異体をコードする、核酸配列。
- 請求項13に記載の核酸配列を含む、発現カセット。
- 少なくとも一つの調節エレメントの制御下に、少なくとも一つの請求項13に記載の核酸配列又は少なくとも一つの請求項14に記載の発現カセットを含む、組換えベクター。
- 少なくとも一つの請求項13に記載の核酸配列又は少なくとも一つの請求項14に記載の発現カセット又は少なくとも一つの請求項15に記載のベクターを含む、組換え微生物。
- 水素付加が、水素並びに
30〜70重量%の、NiOとして計算したニッケルの酸素含有化合物、
15〜45重量%の、ZrO2として計算したジルコニウムの酸素含有化合物、
5〜30重量%の、CuOとして計算した銅の酸素含有化合物、及び
0.1〜10重量%の、MoO3として計算したモリブデンの酸素含有化合物、
を含む触媒の存在下で生じ、ここで、重量%の数字は、乾燥非還元型触媒に基づくものである、請求項19に記載の方法。 - 一般式IV:
「a」、「b」、「c」及び「d」は、各場合において互いに独立して、単結合又は二重結合のC-C結合を示し、但し、累積二重結合が排除されること及び以下を条件とする:
R1は以下の定義を有する:
(1)「a」が二重結合である場合:
R1は、
オキソ(=O)、又は
CH-(CH2)n-Zから選択され、
式中、nは0、1又は2であり、
Zは、OH、CHO、C(O)C1〜C4-アルキル;COOH、C(CH2)-CH=CH2;C(OH)(CH3)-CH=CH2;C(CH3)=CH-CH=CH2;又は式C(CH3)=CH-CH2Yのラジカルであり、
式中、Yは、OH、CH2OH、COOH又はCH2C(O)CH3である;又は
(2)「a」が単結合である場合:
R1は、CH3;CHO;CH2CH2OH;CH=CH2;CH2C(O)OH;CH2CHO又はC3H6CH(CH3)CHOから選択され;
「a」が二重結合である場合、該二重結合はE配置又はZ配置を有する;
R2及びR3は、以下の定義を有する:
(1)「a」及び「b」がそれぞれ単結合である場合:
R2及びR3は、互いに独立して、H、C1〜C4-アルキル又はOHであるか、或いはR2及びR3は一緒になって、メチレン(=CH2)又はオキソ(=O)基である;又は
(2)「a」又は「b」が二重結合である場合、ラジカルR2及びR3のうち一方は存在せず、二つのラジカルのうちもう一方はH、C1〜C4-アルキル又はOHである;
R4はH又はヒドロキシ-C1〜C4-アルキルである;
R5及びR6は、以下の定義を有する:
(1)「c」が単結合である場合:
R5及びR6はそれぞれHであるか、又はR5及びR6は一緒になって、オキソ(=O)基である;又は
(2)「c」が二重結合である場合、ラジカルR5及びR6のうち一方は存在せず、二つのラジカルのうちもう一方はHである;
R7、R8及びR9は、以下の定義を有する:
(1)「d」が単結合である場合:
ラジカルR7、R8及びR9のうち二つは、各場合において互いに独立して、H又はC1〜C4-アルキルであり、残りのラジカルはOHである;又は
(2)「d」が二重結合である場合、ラジカルR7、R8及びR9のうち一つは存在せず、二つのラジカルの残りは、各場合において互いに独立して、H又はC1〜C4-アルキルである;
R10は、H又はヒドロキシ-C1〜C6-アルキル又はモノ不飽和若しくはポリ不飽和のC2〜C6-アルケニルであり;
立体異性体的に純粋な形態の式IVの化合物又はそれらの立体異性体混合物を、クラスEC 5.4.99、特にクラスEC 5.4.99.17の酵素を使用して、又は請求項1〜12のいずれか1項に記載の酵素変異体を使用して、又は該酵素若しくは酵素変異体を発現する請求項16に記載の微生物の存在下で反応させる、前記方法。 - 式IVa:
(式中、
R1は前記した定義を有し、特にラジカルCH-(CH2)n-Zであり、式中、
n=0かつZ=CHO又はCOOH;又は
n=1かつZ=OH;又は
n=2かつZ=C(O)CH3;COOH、C(CH2)-CH=CH2;C(CH3)=CH-CH=CH2;又は式C(CH3)=CH-CH2Yのラジカルであり、式中、Yは、OH、CH2OH、COOH又はCH2C(O)CH3である;
かつ「a」はE配置又はZ配置を任意選択で有する);又は
式IVb:
(式中、R1は前記した定義を有し、特にCH2CHOである);又は
式IVc:
(式中、R1は前記した定義を有し、特にCH-CHOであり;ラジカルR7及びR8のうち一方はHであり、もう一方はC1〜C4-アルキルであり、特に、R7はエチルであり、二重結合「a」及び「d」はZ配置を有する)、
から選択される化合物が変換される、請求項21に記載の方法。 - 式IVの化合物が、シトロネラール;シトラール;ファルネソール;ホモファルネソール;ホモファルネシル酸などのホモファルネソール誘導体;ゲラニルアセトン、メロナール;ノナジエナール;及びトリメチルデカテトラエンから選択される、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- テルペンの環化のための、特にシトロネラールからイソプレゴールへの変換のための、及び一般式IVの化合物の変換のための、ECクラスEC 5.4.99、特にECクラスEC 5.4.99.17の酵素の使用。
- テルペン及び/又はテルペノイドの環化のための、及び請求項20〜23のいずれか1項に記載の定義による一般式IVの化合物の変換のための、請求項1〜12のいずれか1項に記載の酵素変異体、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の発現構築物、請求項15に記載の組換えベクター又は請求項1に記載の組換え微生物の、使用。
- シトロネラールからイソプレゴールへの変換のための、又はスクアレンのホペンへの変換のための、請求項25に記載の使用。
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