EP2379714A1 - Verbesserte biokatalysatoren zur herstellung von duloxetinalkohol - Google Patents

Verbesserte biokatalysatoren zur herstellung von duloxetinalkohol

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Publication number
EP2379714A1
EP2379714A1 EP09784086A EP09784086A EP2379714A1 EP 2379714 A1 EP2379714 A1 EP 2379714A1 EP 09784086 A EP09784086 A EP 09784086A EP 09784086 A EP09784086 A EP 09784086A EP 2379714 A1 EP2379714 A1 EP 2379714A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mutant
nucleic acid
mutants
substituted
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09784086A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nina Schneider
Hans Wolfgang Höffken
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP09784086A priority Critical patent/EP2379714A1/de
Publication of EP2379714A1 publication Critical patent/EP2379714A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the present invention relates to novel phenylethanol dehydrogenase mutants, processes for their preparation; nucleic acid sequences, expression cassettes, vectors and recombinant microorganisms which contain these sequences; Process for the biocatalytic synthesis of substituted, optically active alcohols using these mutants; and in particular a process for the preparation of duloxetine alcohol or duloxetine comprising a biocatalytic synthesis step catalyzed by these mutants.
  • Duloxetine alcohol (3) is an important precursor in the production of duloxetine (4) (see Scheme 1), which is marketed under the trade name Cymbalta®, inter alia, as an antidepressant.
  • TACA duloxetine over duloxetine alcohol
  • the resulting intermediate (TACA) (2) can be prepared by means of a dehydrogenase (see WO2005 / 033094).
  • phenylethanol dehydrogenase reduces EbN1 from Azoarcus sp. (newer name Aromatoleum aromatic cum) (see Höffken et al., Biochemistry, Vol.
  • the object of the invention was to increase the activity of biocatalysts which can be used for duloxetine production.
  • biocatalysts should be provided which improve the enzymatic reduction of TAC (1) to TACA (2).
  • the improvement to be achieved can consist of: Higher reaction rate
  • the solution of the above object surprisingly succeeded in two different ways.
  • the sequence of the biocatalyst-encoding gene was randomly mutated by error-polymerase chain reaction ("error-prone PCR") to generate a variety of variants from which to select improved mutants, which in turn were reused for further improvement mutated (Directed Evolution).
  • Another approach was to selectively perform saturation mutagenesis at selected sequence positions.
  • target positions for appropriate mutations were determined from the crystal structure of dehydrogenase (Höffken et al., Biochemistry, Vol. 45, No.1, 2006) by "rational design.” At these positions, saturation mutagenesis was then performed.
  • FIG. 1 shows the coding nucleic acid sequence (A) or the amino acid sequence (B) of the phenylethanol dehydrogenase EbN1.
  • Figure 2 shows the band model of a monomer of EbNL
  • Figure 3 shows schematically the cloning strategy for different mutants.
  • FIG. 4 shows the result of experiments for the inhibition of phenylethanol dehydrogenase EbN 1 in the presence of in each case 10 mM TA, TAA or TACA as well as the result of a control batch without inhibiting substance.
  • the experiments were carried out with whole cells; 25 or 50 ⁇ l of cell suspension were tested in each case.
  • Figure 5A illustrates the ability to regenerate the cofactor with 2-butanol in the presence and absence of TACA by various mutants of the Y151X type.
  • Figure 5B illustrates the ability to regenerate the cofactor with 2-butanol in the presence and absence of TACA by various T192X mutants.
  • Figure 6A shows the activity of various mutants of the T192X type in a TAC test without cofactor regeneration compared to the reference (LU11558).
  • Figure 6B shows the activity of different T192X mutants in a TAC assay with cofactor regeneration compared to the reference (LU11558).
  • Figure 6C shows the activity of various mutants of the T192X type in a TACA test compared to the reference (LU1 1558).
  • Figure 7A shows the enzymatic activity of various mutants of the Y151X type in a TAC test without cofactor regeneration compared to the reference (LU 1 1558).
  • Figure 7B shows the enzymatic activity of various mutants of the Y151X type in a TAC assay with cofactor regeneration compared to the reference (LU1 1558).
  • FIG. 7B shows the activity of different mutants of the Y151X type in a TAC test in comparison to the reference (LU 1 1558).
  • Figure 8A illustrates the regeneration of the cofactor with 2-butanol in the presence and absence of TAC by mutants of the Y151A-T192X type.
  • Figure 8B illustrates the activity of mutants of the type Y151A-T192X in a TAC assay with cofactor regeneration compared to the control (Y151A).
  • FIG. 9 illustrates the yields of TACA obtained with the aid of the mutant Y151A in various reaction mixtures, in each case in comparison to the reference and in FIG. dependence of different TAC concentrations (400 mM in Figure 9A and 600 mM in Figure 9B).
  • FIG. 10 illustrates in a computer-animated model the substrate binding (TA) in wild-type enzyme EbN 1 (representation A) or in mutant Y151A (representation B).
  • the respectively associated lower image represents an enlarged section of the substrate binding pocket.
  • FIG. 11 shows a computer-simulated representation of a section from the active center of EbN1, highlighted by the arrangement of the amphiphilic HeNx, the loop 2, the substrate and the cofactor (NADH).
  • Figure 12 illustrates the cloning strategy for site-directed mutagenesis.
  • FIGS 13A and 13B illustrate the results of activity tests with various point mutations of the invention.
  • Phenylethanol dehydrogenases (EC No. 1.1.1) are generally enzymes which catalyze the NAD-dependent, stereospecific reduction of acetophenone to S-1-phenylethanol, a "phenylethanol dehydrogenase” or an “enzyme with phenylethanol dehydrogenase Activity "in the context of the invention catalyzes in particular the enzymatic synthesis of optically active alcohols of the general formula II, starting from the ketone of the formula I, and in particular the stereospecific equilibrium reaction between 3-chloro-1- (thienyl-2-yl) -propan-1 on and (1S) -3-chloro-1- (thienyl-2-yl) -propan-1-ol.
  • the present invention relates to the enzymatic reactions described herein in both directions of conversion (ie, the formation of reduction equivalents).
  • "Functional mutants" of a "phenylethanol dehydrogenase” include the “functional equivalents” of such enzymes as defined below.
  • biocatalytic process refers to any process carried out in the presence of catalytic activity of a "phenylethanol dehydrogenase” of the invention or an enzyme having "phenylethanol dehydrogenase activity", ie processes in the presence of crude, or purified, dissolved, dispersed or immobilized enzyme, or In the presence of whole microbial cells which exhibit or express such enzyme activity, biocatalytic processes thus comprise enzymatic as well as microbial processes.
  • stereospecific means that one of several possible stereoisomers of a compound according to the invention with at least one asymmetry center by the action of an enzyme according to the invention in high “Enati- omerenüberschuß” or high “enantiomeric purity", such as at least 90% ee, in particular at least 95% ee, or at least 98% ee, or at least 99% ee is produced.
  • TAC 3-chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-one
  • TACA 3-chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-ol
  • TA 1-thiophene 2-yl-propenones
  • TAA 1-thiophen-2-yl-prop-2-en-1-ol
  • a "lower alcohol” is in particular a mono-ol and in the present invention comprises a lower alkyl
  • This is in particular Ci-C ⁇ -alkyl radicals, in particular -C 6 -.
  • Alkyl groups are branched or especially linear and 1 to 8, in particular 1, 2, 3, 4, 5, or Examples are C 1 -C 4 -alkyl radicals, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, 2-butyl, isobutyl or tert-butyl, and additionally radicals with more than 4 C-atoms, such as pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, n-hexyl,
  • Cyclic rings include a mononuclear or polynuclear, saturated or unsaturated, carbocyclic or heterocyclic, aromatic or nonaromatic, optionally mono- or polysubstituted ring,
  • Cyc are in particular mono- or binuclear, preferably mononuclear, groups of up to 4, such as e.g. 0, 1 or 2 identical or different ring heteroatoms selected from O, N and S are mentioned.
  • carbo- or heterocyclic rings comprise in particular 3 to 12, preferably 4, 5 or 6 ring carbon atoms.
  • Examples which may be mentioned are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, the mono- or polyunsaturated analogs thereof, such as cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclopentadienyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl, cyclohexadienyl, cycloheptadienyl, and phenyl; and 5- to 7-membered saturated or mono- or polyunsaturated heterocyclic radicals having 1 to 4 heteroatoms, which are selected from O, N and S.
  • binuclear groups in which one of the above-mentioned carbo-or heterocycles is condensed with another heterocycle or carbocycle such as e.g. Residues derived from coumarone, indole, quinoline and naphthalene.
  • Cyc radicals are aryl radicals.
  • “Aryl” is a mononuclear or polynuclear, preferably mono- or binuclear, optionally substituted aromatic radical, in particular phenyl or a naphthyl bound via any ring position, such as 1- or 2-naphthyl.
  • the radicals Cyc can be bonded via any desired ring position, preferably via a ring carbon atom.
  • Cyc radicals are phenyl, naphthyl, 2-thienyl, 3-thienyl; 2-furanyl, 3-furanyl; 2-pyridyl, 3-pyridyl or 4-pyridyl; 2-thiazolyl, 4-thiazolyl or 5-thiazolyl; 4-methyl-2-thienyl, 3-ethyl-2-thienyl, 2-methyl-3-thienyl, 4-propyl-3-thienyl, 5-n-butyl-2-thienyl, 4-methyl-3-thienyl, 3-methyl-2-thienyl; 3-chloro-2-thienyl, 4-bromo-3-thienyl, 2-iodo-3-thienyl, 5-iodo-3-thienyl, 4-fluoro-2-thienyl, 2-bromo-3-thienyl, and 4 - Chloro-2-thienyl.
  • the radicals Cyc can furthermore be monosubstituted or polysubstituted, for example monosubstituted or disubstituted.
  • the substituents are on a ring carbon atom.
  • suitable substituents are halogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkoxy, -OH, -SH, -NO 2 or NR 2 R 3 , wherein R 2 and R 3 are independently H, methyl or ethyl.
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine or iodine, in particular fluorine or chlorine.
  • “Lower alkyl” preferably denotes straight-chain or branched alkyl radicals having 2 to 8, in particular 2 to 6, C atoms, such as ethyl, isopropyl or n-propyl, n-, i-, sec- or tert-butyl, n-pentyl or 2-methyl-butyl, n-hexyl, 2-methyl-pentyl, 3-methyl-pentyl, 2-ethyl-butyl.
  • “Lower alkoxy” preferably represents the corresponding oxygen-terminated analogs of the above lower alkyl groups.
  • “Lower alkenyl” is the mono- or polysubstituted, preferably monounsaturated, analogs of the abovementioned alkyl radicals having 2 to 8, in particular 2 to 6, carbon atoms, where the double bond may be in any position of the carbon chain.
  • a first subject of the invention relates to functional phenylethanol dehydrogenase mutants derived from the phenylethanol dehydrogenase EbN 1 from Azoarcus sp. with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • the invention relates to functional phenylethanol dehydrogenase mutants derived from the phenylethanol dehydrogenase EbN1 from Azoarcus sp. having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, wherein the mutant least one mutation in at least one sequence region, selected from
  • Sequence area 142 to 153 also referred to as Loop 2
  • Sequence area 142 to 153 also referred to as Loop 2
  • the invention relates to functional phenylethanol dehydrogenase mutants which additionally comprise at least one further mutation in a further sequence region, chosen from
  • Sequence region 138 to 141 hydrophilic region binding pocket, also referred to as Loop 2
  • the invention relates to functional phenylethanol dehydrogenase mutants derived from the phenylethanol dehydrogenase EbN 1 from Azoarcus sp. having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2, wherein the mutant is selected from among the mutants listed in Table 1.
  • mutants where at least one of the following residues is mutated:
  • mutants of the invention are selected from mutants containing at least one of the following mutations:
  • X 1 to X 8 are independently any amino acid residues, wherein at least one of X 1 to X 3 and X 4 to X 8 is not a natural amino acid residue of the native enzyme according to SEQ ID NO: 2, in particular
  • X 1 is L or substituted by I, V, A, M, F or H.
  • X 2 is I or substituted by L, V, A, M, F or H.
  • X 3 is Y or is substituted by A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T or V; or in which
  • X 4 is T or is substituted by A, E, G, I, P, S, W, V or LX 5 is L or is substituted by I, V, A, M, F or H.
  • X 6 is M or substituted by Y, W, E, V, S, R, Q, K, I, H, G, F, E or
  • X 7 is F or substituted by G, K, T, Y, M, W or R
  • X 8 is L or substituted by I, V, A, M, F or H.
  • the invention also relates in particular to those mutants which still have at least about 50% of the enzymatic activity of the dehydrogenase with SEQ ID NO: 2, such. For example, those with 50 to 100% or more than 100%, such as> 100 to 1000%, each determined under standard conditions using a reference substrate, such as TAC or TACA (see below, information to determine the phenylethanol dehydrogenase activity)
  • the subject matter of the invention is also those mutants which have a percentage sequence identity to SEQ ID NO: 2 of at least about 70%, such as e.g. 70 to 99.9%, 75 to 99.9%, 80 to 99.9%, 85 to 99.9%, 90 to 99.9% or 95 to 99.9%.
  • the invention also relates, in particular, to those mutants in which, in addition to at least one mutation in the above-defined regions (1) to (6), up to 25% of the amino acid residues outside these regions are protected from SEQ ID NO: 2 by addition, deletion, Insertion, substitution, inversion or a combination thereof.
  • the invention particularly relates to those mutants which have the stereospecific equilibrium reaction between 3-chloro-1- (thienyl-2-yl) -propan-1-one (1) and (1S) -3-chloro-1 - (thienyl- 2-yl) -propane-1-ol (2)
  • Another object of the invention relates to nucleic acid sequences encoding a mutant defined herein.
  • a further subject of the invention relates to expression cassettes comprising at least one nucleic acid sequence defined herein, functionally linked to at least one regulatory nucleic acid sequence.
  • Another object of the invention relates to vectors comprising at least one expression cassette defined herein.
  • Another object of the invention relates to recombinant microorganisms comprising at least one nucleic acid defined herein, an expression cassette as defined herein or a vector defined herein.
  • Another object of the invention relates to processes for the preparation of a phenylethanol dehydrogenase mutant defined herein, wherein culturing a recombinant microorganism defined herein, expressing the nucleic acid sequence coding for the mutant and optionally isolating the expression product.
  • Another object of the invention relates to a method for mikrobiel- len / enzymatic synthesis of substituted, optically active alcohols of the formula
  • Cyc is a mononuclear or polynuclear, saturated or unsaturated, carbocyclic or heterocyclic, optionally mono- or polysubstituted ring, each in stereoisomerically pure form or as a mixture of stereoisomers,
  • the subject matter is in particular also such processes, the reaction taking place under conditions of reduction equivalent regeneration, the alcohol used being a lower alcohol, in particular a C 1 to C 6 monoalcohol.
  • mutants are immobilized in isolated form and optionally on a solid support; or expressed in microbial cells which are optionally immobilized on a solid support.
  • Suitable solid carriers e.g. polymeric carrier materials, such as beads or membranes, are familiar to the skilled worker in the field of biotransformation and enzyme reactor technology.
  • the subject matter in particular also relates to processes for the preparation of duloxetine
  • the invention relates to a process for the microbial / enzymatic synthesis of substituted ketones of the formula (I) wherein
  • Cyc is a mononuclear or polynuclear, saturated or unsaturated, carbocyclic see or heterocyclic, aromatic or non-aromatic, optionally mono- or polysubstituted ring, comprising the microbial / enzymatic oxidation of an alcohol of the formula (II)
  • reaction is carried out under conditions of oxidation equivalent regeneration, using as sacrificial ketone a Ci to C 6 monoalkanone.
  • the enzyme mutant used can be isolated in isolation, e.g. optionally immobilized on a solid support, or expressed in microbial cells optionally immobilized on a solid support.
  • the invention relates to the use of an enzyme mutant defined herein in the manufacture of duloxetine alcohol and / or duloxetine.
  • the present invention is not limited to the specifically disclosed proteins or enzymes having phenylethanol dehydrogenase activity, but rather extends to functional equivalents thereof.
  • “Functional equivalents” or analogues of the specifically disclosed enzymes are within the scope of the present invention various polypeptides which furthermore possess the desired biological activity, such as phenylethanol dehydrogenase activity.
  • “functional equivalents” are understood to mean enzymes in the test used for "phenylethanol dehydrogenase activity" in the sense of the invention of at least 1%, in particular at least about 5 to 10% such as at least 10% or at least 20%, such as at least 50% or 75% or 90% higher or lower activity of an enzyme comprising an amino acid sequence as defined herein.
  • Functional equivalents are also preferably stable between pH 4 to 1 and advantageously have a pH optimum in a range of pH 5 to 10, in particular 6.5 to 9.5 or 7 to 8 or about 7.5, and a Temperature optimum in the range of 15 ° C to 80 0 C or 20 0 C to 70 ° C, such as about 30 to 60 0 C or about 35 to 45 ° C, such as at 40 ° C.
  • phenylethanol dehydrogenase activity in the sense of the invention can be detected by means of various known tests, without being limited to a test using a reference substrate such as TAC or TACA under standard conditions as in the experimental section (see Description of Tests 1), 2) or 3)), or to call a biotransformation (complete reaction TAC-> TACA with cofactor regeneration by means of i-propanol or 2-butanol) in the 4-I reactor.
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, “mutants” which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus include the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions, and / or inversions, wherein the mentioned changes in any sequence position can occur, as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention.
  • Functional equivalence is given in particular even if the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, the same substrates are reacted at different rates. Examples of suitable amino acid substitutions are summarized in the following table:
  • Polypeptides and "functional derivatives” and “salts” of the polypeptides are polypeptides and “functional derivatives” and “salts” of the polypeptides.
  • Salts are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, egg salts and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts for example salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtained by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably single domains or sequence motifs, of the polypeptides of the invention having, for example, the desired biological function.
  • Fusion proteins are also fusion proteins which have one of the above-mentioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally distinct heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial substantial functional impairment of the fusion protein moieties)
  • Non-limiting examples Ie for such heterologous sequences are, for example, signal peptides, histidine anchors or enzymes.
  • Homologs to the specifically disclosed proteins according to the invention include homologs of at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98 or 99%, homology (or identity) to one of the specifically disclosed amino acid sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.
  • a percentage homology or identity of a homologous polypeptide according to the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of the amino acid sequences specifically described herein.
  • the percent identity values can also be determined using BLAST alignments, algorithm blastp (protein-protein BLAST), or by applying the Clustal settings below.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation, extension or shortening of the protein.
  • Homologs of the proteins of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the invention also nucleic acid sequences that code for an enzyme with phenylethanol dehydrogenase activity.
  • the present invention also relates to nucleic acids having a specific degree of identity to the specific sequences described herein.
  • Identity between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleotides over the entire nucleic acid length, in particular the identity which is determined by comparison with the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp Computing Appl. Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151-1) is calculated by setting the following parameters:
  • the identity may also be after Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Kojke, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie
  • nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) encoding one of the above polypeptides and their functional equivalents, e.g. accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active portions thereof according to the invention, as well as nucleic acid fragments which are e.g. for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids of the invention.
  • the nucleic acid molecules of the invention may also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which under "stringent” conditions (see below) is at least about 12, preferably at least about 25, such as about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or a corresponding antisense strand hybridizes.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free from chemical precursors or other chemicals if it is synthesized chemically.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences, or a portion thereof, as a hybridization probe and standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers prepared on the basis of this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention can furthermore be prepared by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • Nucleic acid sequences according to the invention or derivatives thereof, homologs or parts of these sequences can be isolated from other bacteria, eg via genomic or cDNA libraries, for example by conventional hybridization methods or the PCR technique. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention.
  • hybridizing is meant the ability of a poly or oligonucleotide to bind to a nearly complementary sequence under standard conditions, while under these conditions, non-specific binding between non-complementary partners is avoided.
  • the sequences may be 90-100% complementary.
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southern Blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR advantage.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides of the conserved regions. However, it is also possible to use longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences for the hybridization. Depending on the nucleic acid used (oligonucleotide, longer fragment or complete sequence) or which nucleic acid type DNA or RNA are used for the hybridization, these standard conditions vary. Thus, for example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are about 10 ° C. lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • the hybridization conditions for DNA DNA hybrids at 0.1 x SSC and temperatures between about 20 0 C to 45 0 C, preferably between about 30 0 C to 45 0 C.
  • the hybridization conditions are advantageous 0.1 x SSC and temperatures between about 30 0 C to 55 0 C, preferably between about 45 0 C to 55 0 C.
  • temperatures for the hybridization are exemplary calculated melting temperature values for a nucleic acid having a length of about 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks of genetics, such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be determined by formulas known to those skilled in the art, for example, depending on the length of the nucleic acids that calculate type of hybrid or G + C content. Further information on hybridization can be found in the following textbooks by the person skilled in the art: Ausubel et al.
  • hybridization can in particular take place under stringent conditions
  • stringent conditions are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • stringent hybridization conditions are meant in particular: The incubation at 42 ° C overnight in a solution consisting of 50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate ( pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 g / ml denatured salmon sperm DNA, followed by a filter wash with 0.1 x SSC at 65 ° C.
  • the invention also relates to derivatives of the specifically disclosed or derivable nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequences of the invention may be used e.g. be derived from SEQ ID NO: 1 or 3 and differ therefrom by addition, substitution, insertion or DeIe- tion of single or multiple nucleotides, but continue to encode polypeptides having the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or, according to the codon usage, a special one Source or host organism are changed in comparison to a specific sequence mentioned, as well as naturally occurring variants, such as splice variants or allelic variants thereof.
  • Articles are also provided by conservative nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived from sequence polymorphisms of the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms may exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • Derivatives of the nucleic acid sequence according to the invention having the sequence SEQ ID NO: 1 or 3 are, for example, allelic variants which have at least 60% homology at the derived amino acid level, preferably at least 80% homology, very particularly preferably at least 90% homology over the entire sequence region (for homology at the amino acid level, reference is made to the above comments on the polypeptides). About partial regions of the sequences, the homologies may be advantageous higher.
  • derivatives are also to be understood as meaning homologs of the nucleic acid sequences according to the invention, in particular of SEQ ID NO: 1 and 3, for example fungal or bacterial homologs, truncated sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • the promoters which are upstream of the specified nucleotide sequences, can be modified by at least one nucleotide exchange, at least one insertion, inversion and / or deletion, without, however, impairing the functionality or effectiveness of the promoters.
  • the promoters can be increased by changing their sequence in their effectiveness or completely replaced by more effective promoters of alien organisms. 3.2.2 Generation of functional mutants
  • the person skilled in the art can introduce completely random or even more targeted mutations into genes or non-coding nucleic acid regions (which are important, for example, for the regulation of expression) and then generate gene banks.
  • the molecular biological methods required for this purpose are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press 2001.
  • error-prone PCR error-prone polymerase chain reaction
  • Nucleotide sequences are mutated by defective DNA polymerases
  • SeSaM method SeSaM method (Sequence Saturation Method), which prevents preferential exchanges by the polymerase.
  • first gene libraries of the respective proteins are generated, whereby, for example, the above-mentioned methods can be used.
  • the gene banks are appropriately expressed, for example by bacteria or by phage display systems.
  • the respective genes of host organisms expressing functional mutants with properties which largely correspond to the desired properties can be subjected to another round of mutation.
  • the steps of mutation and selection or screening can be repeated iteratively until the functional mutants present have the desired properties to a sufficient extent.
  • a limited number of mutations such as e.g. 1 to 5 mutations are made and evaluated on their influence on the relevant enzyme property and selected.
  • the selected mutant can then be subjected in the same way to a further mutation step. This significantly reduces the number of single mutants to be studied.
  • Non-limiting examples of mutants of the invention which have been made available by error-prone mutagenesis of an enzyme according to SEQ ID NO: 2 are summarized in Table 1 below
  • results according to the invention also provide important information regarding the structure and sequence of the enzymes in question, which are required in order to selectively generate further enzymes with desired modified properties.
  • so-called "hot spots” can be defined, i.e., sequence segments that are potentially useful for modifying an enzyme property through the introduction of targeted mutations.
  • the invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • an "expression unit” is understood as meaning a nucleic acid with expression activity which comprises a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulating the expression, ie the transcription and the translation, of this nucleic acid or gene
  • a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulating the expression, ie the transcription and the translation, of this nucleic acid or gene
  • regulatory elements e.g. Enhancers
  • an expression cassette or "expression construct” is understood according to the invention to mean an expression unit which interacts with the nucleic acid to be expressed is functionally linked to the gene to be expressed.
  • an expression cassette comprises not only nucleic acid sequences that regulate transcription and translation, but also the nucleic acid sequences that are to be expressed as a protein as a result of transcription and translation.
  • expression or “overexpression” in the context of the invention describe the production or increase of the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by introducing a gene into an organism replace existing gene with another gene, increase the copy number of the gene (s), use a strong promoter or use a gene coding for a corresponding enzyme with a high activity, and optionally combine these measures.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • a “promoter”, a “nucleic acid with promoter activity” or a “promoter sequence” is understood according to the invention to mean a nucleic acid which, in functional linkage with a nucleic acid to be transcribed, regulates the transcription of this nucleic acid.
  • a “functional” or “operative” linkage in this context means, for example, the sequential arrangement of one of the nucleic acids with promoter activity and a nucleic acid sequence to be transcribed and optionally further regulatory elements, for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, may also function from more distant locations. NEN or even from other DNA molecules on the target sequence exercise.
  • nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind (ie at the 3 'end) of the promoter sequence, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the transgenic nucleic acid sequence to be expressed may be less than 200 base pairs, or less than 100 base pairs or less than 50 base pairs.
  • regulatory elements include targeting sequences, enhancers, polyadenylation signals, selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are e.g. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • Nucleic acid constructs according to the invention comprise, in particular, sequence SEQ ID NO: 1 or 3 or derivatives and homologs thereof, as well as the nucleic acid sequences derivable therefrom, which are advantageously used to control one or more regulatory signals, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is eliminated and expression of genes increased.
  • the nucleic acid construct can also be simpler, ie no additional regulatory signals have been inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the abovementioned "enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids of the invention may be contained in one or more copies in the construct. in the Construct may be further markers, such as antibiotic resistance or auxotrophy complementing genes, optionally included for selection on the construct.
  • suitable regulatory sequences are in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp tet, Ipp, lac, Ipp-lac, lacl q " 17, 15, 13, gal, trc, ara, rhaP (rhaP BAD ) SP6, lambda P R - or contained in the Iambda P ⁇ _ promoter, which are advantageously used in Gram-negative bacteria application
  • promoters are, for example, in the gram-positive promoters amy and SPO2 , in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, artificial regulators may also be used for the regulation.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, e.g. To understand viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention.
  • Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pN-IN 113 -B1, ⁇ gtI 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL1 or pBB1 16, in yeasts 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYe23 or in plants pLGV23, pGHIac +
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ).
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can be used also advantageously be introduced in the form of a linear DNA in the microorganisms and integrated via heterologous or homologous recombination in the genome of the host organism.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and in TJ. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, CoId Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • microorganism may be understood to mean the wild type microorganism or a genetically modified, recombinant microorganism or both.
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium or Rhodococcus used.
  • Very particularly preferred is the genus and species Escherichia coli.
  • Further beneficial bacteria are also found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria
  • the host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the nucleic acid sequences described in this invention, nucleic acid constructs or vectors which code for an enzyme with phenylethanol dehydrogenase activity as defined above.
  • the organisms used in the method according to the invention are grown or grown, depending on the host organism, in a manner known to those skilled in the art.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium that is a carbon source usually in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally contains vitamins, at temperatures between 0 0 C and 100 0 C, preferably between 10 0 C up to 60 0 C attracted with oxygen fumigation.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of polypeptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, which comprises cultivating a polypeptide-producing microorganism, optionally inducing the expression of the polypeptides and isolating them from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or batchwise in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • batch cultivation or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • Storhas bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society of Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981). These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good sources of carbon are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds, such as molasses, or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soybean protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur source inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic see sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach" (ed. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media may also be obtained from commercial suppliers such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or batchwise, as desired.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably at 25 ° C to 40 0 C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid. To control the development of foam anti-foaming agents, such as. As fatty acid polyglycol, are used.
  • the medium can be selected selectively acting substances such.
  • B. Antibiotics to be added. In order to maintain aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such. B. ambient air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is usually from 20 0 C to 45 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broth is then further processed.
  • the biomass can be wholly or partly by separation methods, such. Centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods from the fermentation broth or left completely in it.
  • the cells may also, if the polypeptides are not secreted into the culture medium, be disrupted and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells may optionally be treated by high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods.
  • Purification of the polypeptides can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and by other conventional methods, such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, T.G., Biochemische Harvey
  • vector systems or oligonucleotides for the isolation of the recombinant protein, which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for altered polypeptides or fusion proteins, for example, serve a simpler purification.
  • suitable modifications are, for example, so-called “tags” acting as anchors, such as, for example, the hexa-histidine Anchor known modification or epitopes that can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor (NY) Press).
  • These anchors may serve to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix, which may be filled, for example, in a chromatography column, or used on a microtiter plate or other support.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers which upon reaction with a substrate form a detectable reaction product, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to identify the proteins for the derivation of the proteins.
  • mutants For the expression of mutants according to the invention, reference can be made to the description of the expression of the wild-type enzyme EbN 1 and the expression systems useful therefor in WO2005 / 108590 and WO2006 / 094945, to which reference is hereby expressly made.
  • the enzymes according to the invention can be used freely or immobilized in the methods described herein.
  • An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier.
  • Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powders, anion exchange materials, synthetic polymers such as polystyrene, acrylic resins, phenolformaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins such as polyethylene and polypropylene.
  • the support materials are usually used to prepare the supported enzymes in a finely divided, particulate form, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (sieve). never).
  • Carrier materials are, for example, calcium alginate, and carrageenan.
  • Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs).
  • the selection of the mutants was based on the crystal structure of the enzyme phenylethanol dehydrogenase EbN1 (FIG. 2).
  • the substrate specificity of the enzyme is determined by two loop regions and one HeNx (loop 1 and 2 and HeNx ⁇ FG1 in FIG. 2).
  • the HeNx ⁇ FG1 is flexible and seals the active site after binding of the substrate.
  • Tyr 93 on Loop 1 closes the substrate binding pocket forwards and is responsible for stereoselectivity.
  • Tyr151 belongs to Loop 2 and points into the binding pocket.
  • Thr192 is part of the flexible HeNx ⁇ FG1 and points towards the substrate binding site.
  • the PCR for amplifying the ebn1 H gene segment was carried out as follows: 100 ⁇ l of reaction mixture contained: 1 ⁇ l of template (about 50 ng vector pDHE-ebn1 H), 1 ⁇ l oligonucleotide (20 ng), 2 ⁇ l dNTP mix (10 mM final concentration from Roche), 1 ⁇ l of Pfu Ultra DNA polymerase (1 U / ⁇ l of Stratagene), 10 ⁇ L of 10X Pfu-Ultra buffer (Stratagene) and 80 ⁇ L of sterile water.
  • thermocycler Biometra
  • the amplified DNA was cleaved with the restriction enzymes Ndel and I-111 (Fermentas), ligated into the multiple cloning site (MCS) of the vector pDHE (also cleaved with Ndel-HindIII) and transformed into XL10 ultracompetent cells (Stratagene). By a mini-preparation of these cells, the plasmid DNA of the mutants was recovered.
  • Vector pDHE is described as pDHE19.2 vector in DE 19848129 or WO2005 / 108590.
  • the vector pDHE-ebn1 H-Y151X or pDHE-ebn1 H-T192X (and later pDHE-ebn1 H-Y151A-T192X) was first in the strain LU12037 (E. coli derivative TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: a RhaA " derivative E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; M; M; Masahashi, W; T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol.
  • the cells were manually in the LB main culture with antibiotics (see above) and the corresponding inducers (rhamnose 0.5 g / l and IPTG 0.1 mM) are over-stamped After 16-18 h growth, the cells are used in the test.
  • the aim was therefore to find a mutant that tolerates not necessarily more active, but above all, higher amounts of product or minor component in order to achieve the fullest possible conversion and thus a high space-time yield.
  • FIG. 4 illustrates the inhibition of the phenylethanol dehydrogenase EbN 1 by indicating the respective V max values (amount of NADH formed per time).
  • the control (without inhibitor) is labeled with ButOH.
  • TACA shows the strongest inhibition. Since TA absorbs very strongly in this wavelength range, the formation of NADH can not be detected here.
  • TACA was added as an inhibitor in the further assays.
  • TACA was added as an inhibitor to the regeneration test carried out to date with 2-butanol and NAD.
  • concentration range 0 to 30 mM, followed by a between 0 and 10 mM was set. Based on the results obtained (not shown), a TACA concentration of 10 mM with 25 ⁇ l cells was used in the further test.
  • microtiter plates For each amino acid position, two microtiter plates (96-well) were cloned full of clones. The microtiter plates were completely sequenced and the values assigned to the individual mutations.
  • the cells were grown as described above, then disrupted and finally resuspended in 100 ⁇ l of water. 25 ⁇ l of this cell suspension were added to a new microtiter plate and made up to a volume of 100 ⁇ l with water. Thereafter, the substrate solution (final concentrations: 100 mM 2-butOH, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCl pH 8.0, (10 mM TACA)) was added and the formation of NADH was measured at 340 nm in a photometer. The results from the test are shown in FIGS. 5A and 5B. The V max values are displayed.
  • FIGS. 5A and B show that most of the mutants can no longer or only very slowly regenerate the cofactor (butanol test, dark bars). However, by adding TACA to the butanol test (light bars), these mutants can regenerate the cofactor, better than the control (wild-type). Presumably here instead of 2-butanol to 2-butanone TACA is oxidized to TAC. These mutants tolerate higher levels of TACA compared to the wild type.
  • the missing mutants (for position T192 N 1 D 1 Q 1 H 1 K 1 M 1 F 1 and Y position for Y151 C, F, S) have been tightened, but these were not active or worse than the control.
  • the following mutants were selected from the experiments: Y151A, E, G, H and T192A, G, L, I, respectively, in order to test them on a larger scale.
  • Test 2 Complete reaction: reduction of TAC to TACA with cofactor regeneration using iso-propanol
  • test conditions for the individual tests are:
  • test temperature was in each case at 30 0 C, the enzyme concentration was between 0.1-10 mg / ml.
  • Figure 6A shows that the T192L and T192G mutants reduce TAC more rapidly than the LU1 1558 control.
  • Figure 6B considering the complete reaction ( Figure 6B), the wild type is most active because the other mutants can regenerate the cofactor more poorly.
  • Figure 6C it can be seen that the mutant T192A is able to oxidise TACA better than the wild-type, with the levels of TAC that arise being very low and therefore the results vary in the test.
  • the mutant Y151 A was fermented on a 21-l scale and used in 4-l reactors with 2-butanol as both regeneration and solvent to compare with the wild-type.
  • mutant Y151A is better than the wild type, a second saturation mutagenesis was performed at position T192X based on this mutant.
  • mutants T192I and S show better than the control (Y151A-T192T). These were therefore examined on a larger scale (culture in a 100 ml shake flask). Furthermore, the mutants T192A, L and V were examined on a larger scale as they show about the same activity as the control. However, considering the complete reaction of these five mutants, the control is most active (see Figure 8B, with the formation of TACA with i-propOH as the sacrificial alcohol by HPLC is measured), so that the simple mutant Y151A was used in the further experiments.
  • Figure 9A shows that the mutant is on average 15-20% better than the wild-type. As you can see, the values vary from trial to trial (this also depends on the individual fermentations), but the difference is significant. The average yield in the wild type is 67% ⁇ 8% and in the mutant 86% ⁇ 7%, where each is a different fermentation. Also, the ratio TACA / (TAC + TA) (light bars) is significantly better for the mutant (4.8) than for the control (3.0), which subsequently has a positive effect in the methylamination.
  • the decrease of the reduced cofactor NADH at 340 nm can be measured since the extinction coefficient at this wavelength is S NAD ⁇ : S NADH .
  • the optimal NADH concentration was 0.02 mM.
  • the substrate TAC could be used between 1 and 2 mM.
  • As buffer 50 mM NaH 2 PO 4 pH 5.0 was used, since the reduction of TAC to TACA preferably proceeds in the slightly acidic state.
  • the cells expressing the mutants were grown directly in a microtiter plate (MTP).
  • the clones were picked from the agar plate with a picking robot (Qpix) and inoculated into an LB preculture with antibiotics (100 ⁇ M ampicillin, 20 ⁇ M chloramphenicol and 100 ⁇ M spectinomycin). After a growth time of 24 h at 37 ° C. and 200 rpm, the cells were transferred by hand into the LB main culture with antibiotics and inducers (rhamnose 0.5 g / l and IPTG 0.1 mM). After 16-18 h of growth, the cells were used in the test.
  • antibiotics 100 ⁇ M ampicillin, 20 ⁇ M chloramphenicol and 100 ⁇ M spectinomycin.
  • the cells were grown as described above and then blotted open.
  • the MTPs were provided with lids and placed in the incubator at 15 0 C in the robot system.
  • 100 ⁇ l / well of water was added to subsequently re-suspend the cells in the pack.
  • the Substrate solution (final concentrations: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH 2 PO 4 pH 5.0) was added and the NADH decrease at 340 nm in the photometer determined.
  • Test B Regeneration of NAD to NADH with 2-butanol as a regenerating agent (80 mM TrisHCl pH 8.0, 100 mM 2-butanol, 1.75 mM NAD) in the photometer
  • the cells were grown and then disrupted.
  • the MTPs were provided with lids and placed in the incubator at 15 0 C in the robot system.
  • 100 ⁇ l / well of water was added to subsequently resuspend the cells. From this, two daughter plates were prepared with 20 ⁇ l / well (for assay: regeneration of the cofactor) or 70 ⁇ l / well (for assay: reduction of TAC) cell suspension.
  • the substrate solutions (final concentrations: reduction: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH 2 PO 4 pH 5.0, regeneration: 100 mM 2-butanol, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCl pH 8.0) were added and the formation of NADH was added 340 nm determined in the photometer.
  • TACA was added in the assay.
  • 10 mM TACA is added to the regeneration test carried out to date with 2-butanol and NAD.
  • the evaluation was adapted accordingly to the measurement of TACA inhibition.
  • an error-prone PCR reaction (error polymerase chain reaction) was performed with the addition of MnCb.
  • MnCl 2 the specificity of the Taq DNA polymerase used was reduced, whereby more false nucleotides are incorporated with increasing MnCl 2 concentration and therefore more mutations are generated.
  • the following oligonucleotides with cloning sites (Ndel-Hind III) were selected for the PCR, covering the shortest possible area of the DNA so that mutations could also be formed in the beginning and end regions:
  • the actual PCR was started with the following temperature program: 4 cycles: 95 ° C. for 45 sec, 54 ° C. for 45 sec, 72 ° C. for 45 sec; then 26 cycles: 95 0 C for 45 sec, 58 0 C for 45 sec, 72 0 C for 45 sec; 10 0 C break.
  • the PCR products were purified on an agarose gel (Gfx kit), followed by restriction cleavage with the enzymes Ndel and Hindi 11 (both from NEB).
  • Ndel and Hindi 11 both from NEB.
  • the transformation into XL10 ultrakompetente cells of the company Stratagene was determined by sequencing some clones (16 clones per concentration). The work continued with the MnCl 2 concentration, which provided 1-3 base-pair exchanges.
  • the ligation mixture was first transformed into XL10 competent cells, the clones were counted and then all clones were washed off the agar plate with LB medium.
  • the plasmid DNA was isolated without further incubation of the cells (Promega Kit) and the thus isolated DNA transformed into the production strain TG10, which also co-expresses the chaperones pAgro pHSG, and plated on Q-Tray plates. This procedure was necessary because the transformation rate of the production strain TG10 + (LU12037) in ligation was very low and one wanted to have as many mutants as possible.
  • the error analysis of the individual steps shows that the biggest error in the growth of the individual clones lies in the microtiter plate. This is not surprising since the growth conditions (temperature, oxygen input, etc.) in the microtiter plate can not be controlled as accurately as in a fermenter. Even different fermentations of the same strain vary by about 10% - 15%. The total error in this robot screening is around 35%. Ie. in this screening, only mutants showing an increase of more than 35% are meaningful.
  • the substrate binding pocket of the enzyme is formed by loop 1, 2 and the HeNx ⁇ FG1 (see Figure 2). Most of the mutations were selected from this range, since these amino acids can be expected to have an immediate effect on substrate binding and / or activity of the enzyme.
  • the HeNx is very flexible without a substrate (no electron density is visible in the crystal) and is only fixed at substrate binding.
  • the active center with the substrate binding ta- see can be divided into a hydrophobic and hydrophilic area.
  • the hydrophobic part is predominantly formed by the amphiphilic HeNx ⁇ FG1, which after substrate binding sits like a lid on the substrate binding pocket.
  • the amino acids 192 to 204 are in this range.
  • the side chains of the amino acids Thr192, Leu197, Met200 and Leu204 point into the binding pocket, while amino acid Phe201 serves to stabilize the loop.
  • Threonine 192 with its OH group forms the boundary between the hydrophobic and hydrophilic areas of the active site.
  • Leu 186 sits at the beginning of the flexible HeNx and serves as a hinge for the open and closed states of the active center.
  • Methionine 246 sits at the end of the substrate binding pocket.
  • the opposite side of the substrate binding pocket forms the loop ßE ⁇ F with the amino acids 146 to 151.
  • the terminal OH group of tyrosine 151 is part of the hydrogen bond network of the hydrophilic part of the active site, while the remainder of the side chain belongs to the hydrophobic part.
  • the predominantly hydrophilic underside of the active site forms a strand of amino acids 138-142, here the amino acids Leu139, Thr140 and ThM 42 were mutated.
  • the two cysteines 62 and 83 were chosen for a mutation, since cysteines are generally sensitive to oxidation and can therefore adversely affect the structure.
  • FIG. 11 shows a section from the active center.
  • the cofactor is marked in purple
  • the substrate here TA
  • the mutated amino acids are highlighted.
  • the upper part shows the amphiphilic HeNx ⁇ FG1 and the lower part of the loop ßE ⁇ F. (Loop 2)
  • the PCR product was cleaved with the restriction enzymes Ndel and HindIII and then ligated into pDHE vector. Following successful transformation into the competent cells XL10 Gold (Stratagene) and subsequent plasmid isolation, the plasmids were sequenced to confirm the successful mutation. To determine the activity, the plasmids were transformed into TG10 + competent cells containing the chaperone plasmids pAgro and pHSG (LU12037).
  • FIG. 13A shows the results from the activity tests, in which both the reduction of TAC to TACA with the addition of NADH and the overall reaction with regeneration (dark bars) were tested as described in point 2.2.
  • Figure 13B only the overall reaction with regeneration has been tested.
  • mutant L197I shows a three times higher activity compared to the wild type.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Phenylethanol-Dehydrogenase-Mutanten, Verfahren zu deren Herstellung; dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen, welche diese Sequenzen enthalten; Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen unter Verwendung dieser Mutanten; sowie insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Duloxetinalkohol bzw. Duloxetin, umfassend einen von diesen Mutanten katalysierten biokatalytischen Syntheseschritt.

Description

Verbesserte Biokatalysatoren zur Herstellung von Duloxetinalkohol
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Phenylethanol-Dehydrogenase-Mutanten, Verfahren zu deren Herstellung; dafür kodierende Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Mikroorganismen, welche diese Sequenzen enthalten; Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen unter Verwendung dieser Mutanten; sowie insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Duloxetinalkohol bzw. Duloxetin, umfassend einen von diesen Mutanten katalysierten biokatalytischen Syntheseschritt.
Hintergrund der Erfindung:
Duloxetinalkohol (3) ist eine wichtige Vorstufe bei der Herstellung von Duloxetin (4) (vgl. Schema 1 ), welches unter dem Handelsname Cymbalta® unter anderem als Anti- depressivum vertrieben wird.
TAC TACA, nicht isoliert Duloxetinalkohol 1 2 3
Duloxetin 4
Schema 1 : Herstellung von Duloxetin über Duloxetinalkohol Die dabei auftretende Zwischenstufe (TACA) (2) kann mit Hilfe einer Dehydrogenase hergestellt werden (vgl. WO2005/033094). Beispielsweise reduziert die Phenylethanol- Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. (neuere Bezeichnung Aromatoleum aromati- cum) (vgl. Höffken et al., Biochemistry, Vol. 45, No.1 , 2006) das Chlorketon 3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) zum korrespondierenden Chloralkohol (1 S)-3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-ol (2), analog zu einer Meerwein-Ponndorf-Reduktion. Die Dehydrogenase benötigt dazu den Kofaktor Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), der die notwendigen Reduktionsäquivalente liefert. Dieser teure Kofaktor kann mit Hilfe eines sekundären „Opferalkohols" (z.B. 2-Propanol oder 2-Butanol) regeneriert werden, wobei das entsprechende Keton (z.B. Aceton bzw. 2-Butanon) entsteht. Längerkettige Alkohole werden dabei vom Enzym bevorzugt, sind jedoch auch deutlich teurer. Aus diesem Grund wird 2-Butanol als Opferalkohol eingesetzt (vgl. Schema 2) (vgl. auch WO2006/072465).
NAD NADH
2-Butanol 2-Butanon
Schema 2: Regenerierung des Kofaktors NADH mit Hilfe eines „Opferalkohols"
Das Wildtypenzym EbN 1 und für dessen Expression brauchbare Expressionssysteme sind in der WO2005/108590 und der WO2006/094945 beschrieben.
Kurzfassung der Erfindung:
Aufgabe der Erfindung war es, die Aktivität von Biokatalysatoren zu erhöhen, welche zur Duloxetinherstellung verwendet werden können.
Insbesondere sollten Biokatalysatoren bereitgestellt werden, welche die enzymatische Reduktion von TAC (1 ) zu TACA (2) verbessern. Die zu erzielende Verbesserung kann dabei bestehen in: - Höhere Reaktionsgeschwindigkeit
Höhere Produktausbeute geringere Anfälligkeit gegen Produktinhibition Verbesserung der Kofaktorregeneration Kombinationen davon
Gelöst wurde diese Aufgabe überraschenderweise durch Bereitstellung spezieller Mut- anten der oben bezeichneten Phenylalkohol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp.
Insbesondere gelang die Lösung obiger Aufgabe überraschenderweise auf zwei verschiedenen Wegen. Nach dem ersten Lösungsweg wurde die Sequenz des für den Biokatalysator kodierenden Gens durch Fehler-Polymerasekettenreaktion („error-prone PCR") zufällig mutiert und so eine Vielzahl an Varianten generiert, aus denen verbesserte Mutanten selektioniert werden konnten. Diese wiederum wurden zur weiteren Verbesserung erneut mutiert (Directed Evolution).
Ein anderer Lösungsweg bestand darin, an ausgewählten Sequenzpositionen gezielt Sättigungsmutagenesen durchzuführen. Zunächst wurden aus der Kristallstruktur der Dehydrogenase (Höffken et al., Biochemistry, Vol. 45, No.1 , 2006) Ziel-Positionen für geeignete Mutationen durch „Rationales Design" bestimmt. An diesen Positionen wurden dann Sättigungsmutagenesen durchgeführt.
Figurenbeschreibunq:
Figur 1 zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz (A) bzw. die Aminosäuresequenz (B) der Phenylethanol-Dehydrogenase EbN1.
Figur 2 zeige das Bändermodell eines Monomers von EbNL
Figur 3 zeigt schematisch die Klonierungsstrategie für verschiedene Mutanten.
Figur 4 zeigt das Ergebnis von Versuchen zur Hemmung der Phenylethanol- Dehydrogenase EbN 1 in Gegenwart von jeweils 10 mM TA, TAA bzw. TACA sowie das Ergebnis eines Kontrollansatzes ohne inhibierende Substanz. Die Versuche wurden mit ganzen Zellen durchgeführt; es wurde jeweils 25 bzw. 50 μl Zellsuspension getestet. Figur 5A veranschaulicht die Fähigkeit zur Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TACA durch verschiedene Mutanten des Typs Y151X.
Figur 5B veranschaulicht die Fähigkeit zur Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TACA durch verschiedene Mutanten des Typs T192X.
Figur 6A zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TAC- Test ohne Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU11558).
Figur 6B zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TAC- Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU11558).
Figur 6C zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs T192X in einem TACA- Test im Vergleich zur Referenz (LU1 1558).
Figur 7A zeigt die enzymatische Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC-Test ohne Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU 1 1558).
Figur 7B zeigt die enzymatische Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC-Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Referenz (LU1 1558).
Figur 7B zeigt die Aktivität verschiedener Mutanten des Typs Y151X in einem TAC- Test im Vergleich zur Referenz (LU 1 1558).
Figur 8A veranschaulicht die Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol in Anwesenheit und Abwesenheit von TAC durch Mutanten des Typs Y151A-T192X.
Figur 8B veranschaulicht die Aktivität von Mutanten des Typs Y151A-T192X in einem TAC-Test mit Kofaktor-Regeneration im Vergleich zur Kontrolle (Y151A).
Figur 9 veranschaulicht die mit Hilfe der Mutante Y151A erzielten Ausbeuten an TACA in verschiedenen Reaktionsansätzen jeweils im Vergleich zur Referenz sowie in Ab- hängigkeit von verschiedenen TAC-Konzentrationen (400 mM in Figur 9A bzw. 600 mM in Figur 9B).
Figur 10 veranschaulicht in einem computeranimierten Modell die Substratbindung (TA) in Wildtyp-Enzym EbN 1 (Darstellung A) bzw. in Mutante Y151A (Darstellung B). Das jeweils zugeordnete untere Bild stellt einen vergrößerten Ausschnitt aus der Substratbindungstasche dar.
Figur 1 1 zeigt eine computersimulierte Darstellung eines Ausschnitts aus dem aktiven Zentrum von EbN1 , hervorgehoben sind dabei die Anordnung der amphiphilen HeNx, des Loops 2, des Substrats sowie des Kofaktors (NADH).
Figur 12 veranschaulicht die Klonierungsstrategie für eine site-directed Mutagenese.
Figur 13A und Figur 13B veranschaulichen die Ergebnisse von Aktivitätstests mit verschiedenen erfindungsgemäßen Punkt-Mutationen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
1. Definition allgemeiner Begriffe
„Phenylethanol Dehydrogenasen" (EC Nr.1.1.1 ) sind allgemein Enzyme, welche die NAD H a bh ängige, stereospezifische Reduktion von Acetophenon zu S-1- Phenylethanol katalysieren. . Eine „Phenylethanol Dehydrogenase" bzw. ein „Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität" im Sinne der Erfindung katalysiert insbesondere die enzymatische Synthese optisch aktiver Alkohole der allgemeine Formel II, ausgehend vom Keton der Formel I, und insbesondere die stereospezifische Gleichgewichtsreaktion zwischen 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on und (1 S)-3-Chlor-1- (thienyl-2-yl)-propan-1-ol.
Aufgrund der Reversibilität enzymatischer Reaktionen betrifft die vorliegende Erfindung die hierin beschriebenen enzymatischen Umsetzungen in beiden Umsetzungsrichtungen (d.h. unter Bildung bzw. Verbrauch von reduktionsäquivalenten). „Funktionale Mutanten" einer „Phenylethanol Dehydrogenase" umfassen die unten definierten „funktionalen Äquivalente" solcher Enzyme.
Der Begriff „biokatalytisches Verfahren" betrifft jegliches in Gegenwart von katalytischer Aktivität einer erfindungsgemäßen „Phenylethanol Dehydrogenase" bzw. eines Enzyms mit „Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität" durchgeführtes Verfahren, d.h. Verfahren in Gegenwart von rohem, oder gereinigtem, gelöstem, dispergiertem oder immobilisiertem Enzym, oder in Gegenwart ganzer mikrobieller Zellen, welche derartige Enzymak- tivität aufweisen oder exprimieren. Biokatalytische Verfahren umfassen somit enzyma- tische als auch mikrobielle Verfahren.
Der Begriff „stereospezifisch" bedeutet, dass eines von mehreren möglichen Stereoisomeren einer erfindungsgemäß hergestellten Verbindung mit wenigstens eine Asym- metriezentrum durch die Wirkung eines erfindungsgemäßen Enzyms in hohem „Enati- omerenüberschuß" oder hoher "Enantiomerenreinheit", wie z.B. wenigstens 90%ee, insbesondere wenigstens 95 %ee, oder wenigstens 98 %ee, oder wenigstens 99 %ee produziert wird. Der ee% Wert wird nach folgender Formel berechnet: ee% = [XA-XB]/[ XA+XB]*100, worin XA und X6 für den Molenbruch der Enantiomere A bzw B stehen.
Weiterhin werden hierin folgende Abkürzungen verwendet TAC = 3-Chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-one TACA = 3-Chloro-1-thiophen-2-yl-propan-1-ol TA = 1-Thiophen-2-yl-propenone
TAA = 1-Thiophen-2-yl-prop-2-en-1-ol
Ein „Niedrigalkohol" ist insbesondere ein Monool und umfasst erfindungsgemäß einen Niedrigalkylrest. Dieser stehtinsbesondere für Ci-Cβ-Alkylreste insbesondere CrC6- Alkylreste, die verzweigt oder insbesondere linear sind und 1 bis 8, insbesondere 1 , 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atome aufweisen. Beispiele sind Ci-C4-Alkylreste, wie Methyl, Ethyl, n- Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, 2-Butyl, iso-Butyl oder te/f-Butyl; und zusätzlich Reste mit mehr als 4 C-Atomen, wie Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2- Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, 1 ,1-Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, n-Hexyl, 1 ,1-Dimethylbutyl, 1 ,2- Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl und 3,3- Dimethylbutyl.
„Cyclische Ringe" (Cyc) umfassen einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen, aromatischen oder nichtaromatischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring,
Als Beispiele für carbo- und heterocyclische Gruppen Cyc sind insbesondere ein- oder zweikernigen, vorzugsweise einkernige, Gruppen mit bis zu 4, wie z.B. 0, 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Ring-Heteroatomen, ausgewählt unter O, N und S sind zu nennen.
Diese carbo- oder heterocyclischen Ringe umfassen insbesondere 3 bis 12, vorzugs- weise 4, 5 oder 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden Cyc- lopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, die ein- oder mehrfach ungesättigten Analoga davon, wie Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclopentadienyl, Cyclo- hexenyl, Cycloheptenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptadienyl, und Phenyl; sowie 5- bis 7-gliedrige gesättigte oder ein- oder mehrfach ungesättigte heterocyclische Reste mit 1 bis 4 Heteroatomen, die ausgewählt sind unter O, N und S. Insbesondere sind zu nennen heterocyclische Reste, abgeleitet von Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Piperidin, Morpholin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyridin, Pyran, Pyrimidin, Pyridazin und Pyrazin.
Weiterhin sind zu nennen zweikernige Rests, bei welchen einer der oben erwähnten Carbo- oder Heterocyclen mit einem weiteren Heterocyclus oder Carbocyclus kondensiert ist, wie z.B. Reste abgeleitet von Cumaron, Indol, Chinolin und Naphthalin.
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Cyc-Resten sind Aryl-Reste. „Aryl" steht für einen ein- oder mehrkernigen, vorzugsweise ein- oder zweikernigen, gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest, insbesondere für Phenyl oder für ein über eine beliebige Ringposition gebundenes Naphthyl, wie 1- oder 2-Naphthyl. Die Reste Cyc können dabei über eine beliebige Ringposition, vorzugsweise über ein Ring-Kohlenstoffatom, gebunden sein.
Beispiele für geeignet Cyc-Reste sind Phenyl, Naphthyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl; 2- Furanyl, 3-Furanyl; 2-Pyridyl, 3-Pyridyl oder 4-Pyridyl; 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5- Thiazolyl; 4-Methyl-2-thienyl, 3-Ethyl-2-thienyl, 2-Methyl-3-thienyl, 4-Propyl-3-thienyl, 5- n-Butyl-2-thienyl, 4-Methyl-3-thienyl, 3-Methyl-2-thienyl; 3-Chlor-2-thienyl, 4-Brom-3- thienyl, 2-lod-3-thienyl, 5-lod-3-thienyl, 4-Fluor-2-thienyl, 2-Brom-3-thienyl, und 4- Chlor-2-thienyl.
Die Reste Cyc können weiterhin ein- oder mehrfach, wie z.B. ein- oder zweifach, substituiert sein. Vorzugsweise sitzen die Substituenten an einem Ring-Kohlenstoffatom. Beispiele für geeignete Substituenten sind Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, Niedrigalkoxy, -OH, -SH, -NO2 oder NR2R3, wobei R2 und R3 unabhängig voneinander für H, Methyl oder Ethyl stehen.
„Halogen" steht für Fluor, Chlor, Brom oder Jod, insbesondere Fluor oder Chlor.
„Niedrigalkyl" steht bevorzugt für geradkettige oder verzweigte Alkylreste mit 2 bis 8, insbesondere 2 bis 6 C-Atomen, wie Ethyl, i- oder n-Propyl, n-, i-, sec- oder tert.-Butyl, n-Pentyl oder 2-Methyl-Butyl, n-Hexyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methyl-pentyl, 2-Ethyl-butyl.
„Niedrigalkoxy" steht bevorzugt für die korrespondierenden Sauerstoff-terminierten Analoga der obigen Niedrigalkylreste.
„Niedrigalkenyl" steht für die ein- oder mehrfach, vorzugsweise einfach ungesättigten Analoga oben genannter Alkylreste mit 2 bis 8, insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Doppelbindung in beliebiger Position der Kohlenstoffkette liegen kann.
2. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2. Insbesondere betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase- Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante wenigsten eine Mutation in wenigstens einem Sequenzbereich, ausgewählt unter
(1 ) Sequenzbereich 142 bis 153 (auch bezeichnet als Loop 2) und
(2) Sequenzbereich 190 bis 21 1 (auch bezeichnet als HeNx alpha FG1 )
aufweisen.
Insbesondere betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase- Mutanten, welche zusätzlich wenigstens eine weitere Mutation in einem weiteren Sequenzbereich, ausgewählt unter
(3) Sequenzbereich 93 bis 96 (auch bezeichnet als Loop 1 )
(4) Sequenzbereich 241 bis 249 (C-Terminus)
(5) Sequenzbereich 138 bis 141 (hydrophiler Bereich Bindungstasche, auch bezeichnet als Loop 2) und (6) Cys61 und / oder Cys 83
aufweisen.
Weiterhin betrifft die Erfindung funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutanten, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN 1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante ausgewählt ist unter den in Tabelle 1 aufgelisteten Mutanten.
Insbesondere sind zu nennen Mutante, wobei wenigstens einer der folgenden Reste mutiert ist:
T192, L197, M200, F201 , L204, M246, L139, T140, T142, L146, 1148, Y151 , C61 , C83, L186, wobei die jeweilige Aminosäure durch eine beliebige andere natürliche Aminosäure ersetzt ist Insbesondere sind erfindungsgemäße Mutanten ausgewählt unter Mutanten enthaltend wenigstens eine der folgenden Mutationen:
(a) Einzelmutationen:
Y151XA, wobei XA = A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V ist; T192XB, wobei XB = A, E, G, I, P, S, W, V oder L ist;
(b) Mehrfachmutationen:
Y151XA T192XB, wobei XA und X6 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Mutanten, welche durch wenigstens eine der folgenden modifizierten Teilsequenzen charakterisiert sind:
(Teilsequenz 1 ) 142-TTYWX1 KX2EAX3T-I SS (modifizierter Loop 2) und (Teilsequenz 2) 190-ATX4EASAX5 SAX6X7DVX8P N M LQAI-21 1 (modifizierte HeNx alpha FG1 )
worin X1 bis X8 unabhängig voneinander für beliebige Aminosäurereste stehen, wobei wenigstens einer der Reste X1 bis X3 und X4 bis X8 kein natürlicher Aminosäurerest des nativen Enzyms gemäß SEQ ID NO:2 ist, wobei insbesondere
X1 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.
X2 für I steht oder substituiert ist durch L, V, A, M, F oder H.
X3 für Y steht oder substituiert ist durch A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V; oder worin
X4 für T steht oder substituiert ist durch A, E, G, I, P, S, W, V oder L X5 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.
X6 für M steht oder substituiert ist durch Y, W, E, V, S, R, Q, K, I, H, G, F, E oder
D
X7 für F steht oder substituiert ist durch G, K, T, Y, M, W oder R
X8 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, die noch mindestens etwa 50% der enzymatischen Aktivität der Dehydrogenase mit SEQ ID NO:2 aufweisen, wie z. B. solche mit 50 bis 100% oder mehr als 100% wie z.B. >100 bis 1000%, jeweils bestimmt unter Standardbedingungen unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie TAC oder TACA (vergleiche unten, Angaben zur Bestimmung der Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität)
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, wobei diese eine prozentuale Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 von wenigstens etwa 70%, wie z.B. 70 bis 99,9%, 75 bis 99,9%, 80 bis 99,9%, 85 bis 99,9%, 90 bis 99,9% oder 95 bis 99,9%, aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche Mutanten, bei welcher zu- sätzlich zu wenigstens einer Mutation in den oben definierten Bereichen (1 ) bis (6) bis zu 25% der Aminosäurereste außerhalb dieser Bereiche gegenüber SEQ ID NO: 2 durch Addition, Deletion, Insertion, Substitution, Inversion oder einer Kombination davon verändert sind.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere solche Mutanten, welche die stereospezifische Gleichgewichtsreaktion zwischen 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) und (1 S)-3-Chlor-1 -(thienyl-2-yl)-propan-1 -ol (2)
1 2 in Gegenwart des Cofaktors NAD+ bzw. NADH katalysieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, kodierend für eine hierin definierte Mutante. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Expressionskassetten, umfassend wenigstens eine hierin definierte Nukleinsäuresequenz, funktional verknüpft mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Vektoren, umfassend wenigsten eine hierin definierte Expressionskassette.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, umfassend wenigstens eine hierin definierte Nukleinsäure, eine hierin definierte Expressions- kassette oder einen hierin definierten Vektor.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, wobei man einen hierin definierten rekombinanten Mikroorganismus kultiviert, die für die Mutante kodierende Nukleinsäu- resequenz exprimiert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiel- len/enzymatischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen der Formel
(II)
worin
Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocycli- schen oder heterocyclischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring steht, jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren,
umfassend die biokataytische (mikrobielle/enzymatische) Reduktion eines Ketons der Formel (I) in Gegenwart einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, gegebenenfalls unter Zugabe von Reduktionsequivalenten, wie insbesondere NADH.
Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei die Reaktion unter Bedingungen der Reduktionsäquivalent-Regenerierung erfolgt, wobei man als Opferalkohol einen Niedrigalkohol, wie insbesondere einen Ci bis C6-Monoalkohol verwendet.
Mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden insbesondere solche Ver- bindungen der Formel (I) umgesetzt, wobei Cyc für einen Heterocyclischen Rest, insbesondere einen Thienylrest steht.
Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei man einen im wesentlichen enantiomerenreinen Alkohol der Formel (II), insbesondere das (S)-Enantiomer, erhält.
Gegenstand sind insbesondere auch solche Verfahren, wobei die Mutante in isolierter Form und dabei gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert; oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger, immobilisiert sind, eingesetzt wird. Geeignete feste Träger, wie z.B. polymere Trägermaterialen, wie Beads oder Membranen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Biotransformation und Enzymreaktortechnik geläufig.
Gegenstand sind insbesondere auch Verfahren zur Herstellung von Duloxetin, umfas- send
a) die mikrobielle/enzymatische Reduktion von 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) zu (1 S)-3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-ol (2)
1 2 unter Anwendung eines biokatalytischen Verfahrens wie hierin definiert;
b) die chemische Umsetzung des Alkohols (2) durch Methylaminierung zum Duloxeti- nalkohol (3)
und schließlich
c) die chemische Umsetzung von des Duloxetinalkohols (3) durch Einführung einer Naphthylgruppe zu Duloxetin (4).
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur mikrobiellen/enzymatischen Synthese von substituierten Ketonen der Formel (I) worin
Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocycli- sehen oder heterocyclischen, aromatischen oder nicht-aromatischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring steht, umfassend die mikrobielle/enzymatische Oxidation eines Alkohols der Formel (II)
jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren, in Gegenwart einer hierin definierten Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, gegebenenfalls unter Zugabe von Oxidationssequivalenten, wie insbesondere NAD+.
Insbesondere erfolgt die Reaktion unter Bedingungen der Oxidationsäquivalent- Regenerierung, wobei man als Opferketon einen Ci bis C6-Monoalkanon verwendet.
Die verwendete Enzym-Mutante kann dabei in isolierter Form, wie z.B. gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert, oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert sind, eingesetzt werden.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer hierin definierten Enzymmutan- te bei der Herstellung von Duloxetinalkohol und/ oder Duloxetin.
3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung
3.1 Proteine Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die konkret offenbarten Proteine bzw. Enzyme mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Phenylethanol Dehydrogenase Aktivität, besitzen.
So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die im verwendeten Test auf „Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität" im Sinne der Erfindung eine um mindestens 1 %, insbesondere um mindestens etwa 5 bis 10 % wie z.B. mindestens 10% oder mindestens 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Enzyms, umfassend eine hierin definierte Ami- nosäuresequenz aufweisen. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 5 bis 10, wie insbesondere 6,5 bis 9,5 oder 7 bis 8 oder etwa bei 7,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 800C oder 200C bis 70°C, wie z.B. etwa 30 bis 600C oder etwa 35 bis 45°C, wie etwa bei 40°C
Die „Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität" im Sinne der Erfindung kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. TAC oder TACA, unter Standardbedingungen, wie im experimentellen Teil definiert (vgl. Be- Schreibung Tests 1 ), 2) oder 3)), oder eine Biotransformation (Komplettreaktion- TAC->TACA mit Kofaktorregenerierung mittels i-Propanol oder 2-Butanol) im 4-I- Reaktor zu nennen.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zu- sammengefasst:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
Ne Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; Ne
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Ne; Leu
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen
Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhält- lieh durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispie- Ie für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den kon- kret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfin- dungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algo- rithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).
3.2 Nukleinsäuren und Konstrukte
3.2.1 Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Ideti- tätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen. Unter „Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameters: Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 10
Gap Separation penalty ränge 8
Gap Separation penalty off
% identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0
Pairwise alignment parameter: FAST algorithm on
K-tuple size 1
Gap penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Ko- ike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie
D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic
A c i d s R e s 3 1 ( 1 3 ) : 34 9 7-500, gemäß I nternetadresse: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.htmW und mit den folgenden Parametern bestimmt werden:
DNA Gap Open Penalty 15.0
DNA Gap Extension Penalty 6.66 DNA Matrix Identity
Protein Gap Open Penalty 10.0
Protein Gap Extension Penalty 0.2
Protein matrix Gönnet
Protein/DNA ENDGAP -1
Protein/DNA GAPDIST 4
Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- un d d oppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten. Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer er- findungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense- Stranges hybridisiert.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Stan- dard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nuklein- säu re ka n n i n ei n en geeig neten Vektor klon iert werd en u n d d u rch D NA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden. Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA- Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.
Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.
Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybri- disierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 0C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 0C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 0C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 0C bis 45 0C, bevorzugt zwischen etwa 30 0C bis 45 0C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 0C bis 55 0C, bevorzugt zwischen etwa 45 0C bis 55 0C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridi- zation: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Die „Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.
Unter „stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Denhardt Lösung, 1 0% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschschritt der Filter mit 0,1 x SSC bei 65°C.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.
So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:1 oder 3 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder DeIe- tion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.
Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den kon- kret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen, insbesondere der SEQ ID NO: 1 und 3, beispielsweise pilzliche oder bak- terielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen.
Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, kön- nen durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertion, Inversion und/oder Deletion verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. 3.2.2 Generierung funktionaler Mutanten
Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten erfindungsgemäßer Enzyme bekannt.
Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press 2001.
Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise
- die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis pro- tocols. Humana Press, New Jersey),
- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler-
Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Fei- genbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ),
- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotid- Sequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA,
Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);
- die SeSaM-Methode (Sequence Saturation Method), bei der bevorzugte Austausche durch die Polymerase verhindert werden. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279 - das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidse- quenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder - das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).
Unter Anwendung der so genannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing in- dustrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwen- düng kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display-Systeme.
Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen, wie z.B. 1 bis 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.
Nicht limitierende Beispiele erfindungsgemäßer Mutanten, welche durch error prone Mutagenese eines Enzyms gemäß SEQ ID NO:2 zugänglich gemacht wurden sind in folgender Tabelle 1 zusammengefasst
Tabelle 1 : Mutanten erzeugt durch error prone Mutagenese
Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern auch wichtige Informationen in Bezug auf Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere können sogenannte „hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eignen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren.
Nicht limitierende Beispiele solcher hot spot-Regionen der erfindungsgemäßen Enzyme sind, bezogen auf SEQ ID NO:2, im Folgenden zusammengefasst:
(1 ) 142 bis 153 (Loop 2) und
(2) 190 bis 21 1 (Helix alpha FG1 ) (3) 93 bis 96 (Loop 1 )
(4) 241 bis 249 (C-Terminus)
(5) 138 bis 141 (hydrophiler Bereich Bindungstasche) und
(6) Cys61 und / oder Cys 83
Ebenfalls sind Informationen ableitbar bezüglich Aminosäure-Sequenzpositionen, in deren Bereich Mutationen durchgeführt werden können, die voraussichtlich wenig Einfuß auf die Enzymaktivität haben sollten, und als potentielle „silent mutations bezeich- net werden können. Derartige Mutationspositionen sind für SEQ ID NO:2 in folgender Tabelle 2 zusammengefasst:
Tabelle 2 :
3.2.3 Konstrukte
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Unter einer „Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer „regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.
Unter einer „Expressionskassette" oder „Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.
Die Begriffe "Expression" oder „Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einem „Promotor", einer „Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer „Promotorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.
Unter einer „funktionellen" oder „operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio- nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotor- sequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.
Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nuk- leinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder meh- rere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet- , trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq" 17-, 15-, 13-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-PR- oder im Iambda-Pι_-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gramnegativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inse- riert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.
Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IN113-B1 , λgtl 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacte- rium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsge- mäßen Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Codonnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computer- auswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- wels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
3.3 Mikroorganismen
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff „Mikroorganismus" der Wildtyp- Mikroorganismus oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemä- ßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und expri- miert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungsund Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Clon- ing: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 0C und 100 0C, bevorzugt zwischen 10 0C bis 60 0C unter Sauer- stoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden.
3.4 Rekombinante Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik- roorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten. Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder CeI- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vor- teilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organi- sehe Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyri- doxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Me- dienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 400C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zu- gäbe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentri- fugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.
Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen werden. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarb- Stoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Für die Expression erfindungsgemäßer Mutanten kann auf die Beschreibung der Ex- pression des Wildtypenzyms EbN 1 und der dafür brauchbaren Expressionssysteme in der WO2005/108590 und der WO2006/094945, zurückgegriffen werden, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
3.5 Enzymimmobilisierung
Die erfindungsgemäßen Enzyme können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1149849, EP-A- 1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Siebli- nie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-linking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfah- ren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991- 1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. Weitere Informationen zu Biotransformationen und Bioreaktoren zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren findet man z.B. auch in Rehm et al (Ed) Biotechology, 2nd Edn, VoI 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf folgende, nichtlimitierende Beispiele näher beschrieben.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 : Sättigungsmutagenese
1.1 Molecular Modelling
Die Auswahl der Mutanten erfolgte anhand der Kristallstruktur des Enzyms Pheny- lethanol-Dehydrogenase EbN1 (Figur 2).
Die Substratspezifität des Enzyms wird durch zwei Loop-Bereiche und eine HeNx (Loop 1 und 2 und HeNx αFG1 in Figur 2) bestimmt. Die HeNx αFG1 ist flexibel und verschließt das aktive Zentrum nach Bindung des Substrats. Tyr 93 auf dem Loop 1 schließt die Substratbindetasche nach vorne hin ab und ist dadurch für die Stereoselektivität verantwortlich. Tyr151 gehört zum Loop 2 und zeigt in die Bindetasche. Thr192 ist ein Teil der flexiblen HeNx αFG1 und weist in Richtung der Substratbindestelle. Diese beiden Positionen wurden ausgewählt, da sie die Substratbindung beeinflussen ohne jedoch die Aminosäuren des katalytischen Zentrums und den Kofaktor NAD, d.h. den katalytischen Mechanismus, zu stören. 1.2 Sättigungsmutagenese
Zunächst wurden Sättigungsmutagenesen an den Positionen Y151X bzw. T192X (d.h. Austausch der Position Y151 und T192 gegen alle anderen 19 Aminosäuren, auch Permutation genannt) separat durchgeführt, anschließend wurde eine Doppelmutante (Y 151 A-T192X) generiert.
Dies erfolgte mittels „Site-directed mutagenesis" in jeweils 3 Polymeraseketten- reaktionen (siehe Klonierungsstrategie, Figur 3). Dabei wurden folgende Oligonukleoti- de zur Amplifikation der DNA eingesetzt:
1 ) Mke123 Upper: δ'-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-S' (SEQ ID NO:5)
2) Mke124 Lower: δ'-GCTACGGCGTTTCACTTC-S' (SEQ ID NO:6)
3) Mke798 Y151X Lower: δ'-GTAATGGGTNNNCGCCTCGA-S' (SEQ ID NO:7)
4) Mke793 Y151 X Upper: δ'-TCGAGGCGNNNACCCATTAC-S' (SEQ ID NO:8) 5) Mke796 T192X Upper: 5'-CGGCAACANNNGAAGCGTC-3' (SEQ ID NO:9)
6) Mke797 T192 X Lower: δ'-GACGCTTCNNNTGTTGCCGT-S' (SEQ ID NO:10)
7) Mke951 Y151AT192X: δ'-GGCAACANNNGAAGCGTC-S' (SEQ ID NO:11 )
8) Mke952 Y151AT192X: δ'-GACGCTTCNNNTGTTGCC-S' (SEQ ID NO:12)
Die PCR zum Amplifizieren des ebn1 H-Genabschnitts wurde wie folgt durchgeführt: 100 μl Reaktionsansatz enthielten: 1 μl Template (ca. 50 ng Vektor pDHE-ebn1 H), je 1 μl Oligonukleotid (20ng), 2 μl dNTPMix (ä 10 mM Endkonzentration von Roche), 1 μl Pfu-Ultra-DNA-Polymerase ( 1 U/μl von Stratagene), 1 0 μ l 1 0X Pfu-Ultra-Puffer (Stratagene) und 80 μl steriles Wasser.
Folgendes Temperaturprogramm wurde am Thermocycler (Biometra) eingestellt: 95°C
- 5 min; 30 Zyklen: 95°C - 45 sec, 500C - 45 sec, 72°C - 45 sec ; 72°C - 10 min;
100C
1 a) PCR Oligonukleotide 1 und 3 (6 für T192X) 1 b) PCR Oligonukleotide 2 und 4 (5 für T192X)
2) PCR Oligonukleotide 1 und 2 mit Produkt aus PCR 1 a und b als Template (overlap extension) Das daraus erhaltene amplifizierte ebn1-Gen wurde über ein 1 .2 %iges Agarose-Gel mit Hilfe eines GFX-Kits (GE Healthcare) aufgereinigt.
Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Ndel und I— lind 111 (Fermen- tas) gespalten, in die Multiple Cloning Site (MCS) des Vektors pDHE (ebenfalls mit Ndel-Hindlll gespalten) ligiert und in XL10 ultrakompetenten Zellen (Stratagene) transformiert. Durch eine Mini-Präparation dieser Zellen wurde die Plasmid-DNA der Mutanten gewonnen. Vektor pDHE ist beschrieben als pDHE19.2-Vektor in DE 19848129 oder WO2005/108590.
1.3 Anzucht der Zellen
Der Vektor pDHE-ebn1 H-Y151X bzw. pDHE-ebn1 H-T192X (und später pDHE-ebn1 H- Y151A-T192X) wurde zunächst in den Stamm LU12037 (E. coli Derivat TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: ein RhaA"-Derivat von E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; M; M; Masahashi, W; T (1987) Gene 61 , 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001 ), Mol. Microbiol. 40 (2)) transformiert, der die Chaperone GroEL/S und den laclq Repressor co-exprimiert, und auf Q-Tray-Platten ausplattiert. Die gewachsenen Kolonien wurden mit einem Pickroboter (Qpix) gepickt und in eine CG-Vorkultur (Circular Growth, Gibco) mit Antibiotika (100 μM Ampicillin, 20 μM Chloramphenicol und 100 μM Spectinomycin) in Mikrotiterplatten (MTP) beiimpft. Nach einer Wachstumszeit von 5 h bei 37 0C und 200 Upm, wurden die Zellen per Hand in die LB-Hauptkultur mit Antibiotika (siehe oben) und den entsprechenden Induktoren (Rhamnose 0.5 g/l und IPTG 0.1 mM) überstempelt. Nach 16-18 h Wachstum werden die Zellen im Test eingesetzt.
Zum Aufschluss der Zellen wurden diese zunächst zentrifugiert, der Überstand abge- schüttet und die MTP mit einer Klebefolie versehen. Die MTP wurde für ca. 3 Sekunden komplett in flüssigem Stickstoff getaucht und dann wieder auf die Laborbank zum Auftauen gestellt. Die gleichmäßigsten Ergebnisse erhielt man bei 3-maligem Schockgefrieren mit zwischenzeitlichem Auftauen bei Raumtemperatur.
1.4 Enzymhemmung Es zeigte sich, dass das TAC-Umsetzungsprodukt TACA oder eine Nebenkomponente, welche bei der Umsetzung entsteht, die Reaktion hemmt. Das Substrat wurde nicht vollständig umgesetzt. Es handelte sich hier zwar um eine Gleichgewichtsreaktion, gab man jedoch beispielsweise nach 4 Stunden erneut Zellen bzw. Substrat hinzu, so erfolgte keine weitere Umsetzung. Des Weiteren entfernte man das entstehende 2-Butanon destillativ, um das Gleichgewicht möglichst auf die Seite der Produkte zu verschieben. Trotz dieser Maßnahmen erreichte man keinen vollständigen Umsatz.
Ziel war es also, eine Mutante zu finden, die nicht unbedingt aktiver, sondern vor allen Dingen höhere Mengen an Produkt bzw. Nebenkomponente toleriert, um einen möglichst vollständigen Umsatz und damit eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute zu erzielen.
Im nachfolgenden Test wurden sowohl TACA, als auch TA bzw. TAA als Inhibitoren getestet. Dazu wurden in einem 0.2 ml Ansatz (MTP) 50 μl Zellen (LU1 1558; ein Escherichia coli TG10+ Stamm mit einem durch Rhamnose induzierbaren pDHE1650- Derivat als Überexpressionsplasmid. Die Chaperone GroEL/S und der laclq-Repressor werden co-exprimiert; das Wildtyp-Enzym EbN 1 wird überexprimiert) aus einer Anzucht im 100 ml-Schüttelkolben, 1.75 mM NAD und 100 mM 2-Butanol in einen 80 mM TrisHCI Puffer pH 8.0 gegeben. Dazu wurden jeweils 10 mM TA, TAA bzw. TACA gegeben. Im Photometer wurde dann bei 340 nm die Entstehung von NADH gemessen. In Figur 4 wird die Hemmung der Phenylethanol-Dehydrogenase EbN 1 veranschau- licht, indem die jeweiligen Vmax-Werte (entstandene NADH-Menge pro Zeit) angegeben werden. Die Kontrolle (ohne Inhibitor) ist mit ButOH gekennzeichnet.
Wie in Figur 4 zu sehen ist, zeigt TACA die stärkste Hemmung. Da TA sehr stark in diesem Wellenlängenbereich absorbiert, kann hier die Entstehung von NADH nicht nachgewiesen werden.
Aus diesem Grund wurde in den weiteren Assays TACA als Inhibitor zugesetzt. Hierzu wurde zu dem bisher durchgeführten Regenerationstest mit 2-Butanol und NAD noch TACA als Inhibitor zugegeben. Um die geeignete TACA-Konzentration zu bestimmen, wurden verschiedene Konzentrationen an Zellen und TACA getestet. Zunächst wurde eine Konzentrationsreihe von 0 bis 30 mM, anschließend eine zwischen 0 und 10 mM angesetzt. Aufgrund der ermittelten Ergebnisse (nicht gezeigt) wurde in den weiteren Test eine TACA-Konzentration von 10 mM mit jeweils 25 μl Zellen eingesetzt. 1.5 Ablauf des 2-Butanoltests mit und ohne Zugabe von TACA (Regeneration des Kofaktors)
Dabei wurden je Aminosäureposition zwei Mikrotiterplatten (96-well) voll Klone gepickt. Die Mikrotiterplatten wurden komplett sequenziert und die Werte den einzelnen Mutati- onen zugeordnet.
Die Zellen wurden wie oben beschrieben angezogen, anschließend aufgeschlossen und schließlich in 100 μl Wasser resuspendiert. 25 μl dieser Zellsuspension wurden in eine neue Mikrotiterplatte gegeben und auf ein Volumen von 100 μl mit Wasser aufge- füllt. Danach wurde die Substratlösung (Endkonzentrationen: 100 mM 2-ButOH, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCI pH 8.0, (10 mM TACA)) zugegeben und die Entstehung von NADH bei 340 nm im Photometer gemessen. Die Ergebnisse aus dem Test sind in den Figuren 5A und 5B dargestellt. Es werden die Vmax-Werte angezeigt.
Figur 5A und B zeigt, dass die meisten Mutanten den Kofaktor nicht mehr oder nur sehr langsam regenerieren können (Butanoltest, dunkle Balken). Durch Zugabe von TACA zum Butanoltest (helle Balken) können diese Mutanten jedoch den Kofaktor regenerieren, und zwar besser als die Kontrolle (Wildtyp). Vermutlich wird hier statt 2-Butanol zu 2-Butanon TACA zu TAC oxidiert. Diese Mutanten tolerieren höhere Mengen an TACA im Vergleich zum Wildtyp.
Die fehlenden Mutanten (für Position T192 N1D1Q1H1K1M1F1Y und für Position Y151 C, F, S) wurden nachgezogen, doch diese waren nicht aktiv oder schlechter als die Kontrolle. Aus den Versuchen wurden folgende Mutante ausgewählt: Y151A, E, G, H bzw. T192A, G, L, I, um sie im größeren Maßstab zu testen.
1.6 Verifizierung der positiven Mutanten
Die aus diesem Test hervorgehenden positiven Klone wurden anschließend im größeren Maßstab (Anzucht im 100 ml-Schüttelkolben) untersucht. Dabei wurden drei verschiedene Assays durchgeführt:
Test 1 ) Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH + NADH TAC - TACA
Test 2) Komplettreaktion: Reduktion von TAC zu TACA mit Kofaktor- Regenerierung mittels iso-Propanol
i-Prop anon i-Propanol
Test 3) Oxidation von TACA zu TAC
+ NAD + TACA *- TAC
Die Testbedingungen für die einzelnen Tests lauten:
Test 1 ) Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH
798,6 μL VE-Wasser
50 μL 1 M NaH2PO4 pH5
50 μL NADH (100 mM Stammlösung in Wasser)
1 ,4 μL TAC
100 μj 10x Rnhf;xtraktknn7fintrat der Anzucht aus dem Rnhiittelknlhen
1000 μL Endvolumen
Test 2) Komplettreaktion
730 μL VE-Wasser
50 μL 1 M NaH2PO4 pH5
20 μL NAD 10 mM in Wasser
100 μL 100 mM TAC (14 μL in 1 mL Isopropanol) 100 μL 10x Rohextraktkonzentrat der Anzucht aus dem Schüttelkolben
1000 μL Endvolumen
Test 3) Oxidation TACA zu TAC
798,6 μL VE-Wasser
50 μL 1 M NaH2PO4 pH5
50 μL NAD (10 mM Stammlösung)
1 ,4 μL TACA-
100 μL 10x Rohextraktkonzentrat der Anzucht aus dem Schüttelkolben
1000 μL Endvolumen
In obigen Tests lag die Versuchstemperatur jeweils bei 30 0C, die Enzymkonzentration betrug zwischen 0.1-10 mg/ml.
Die Proben wurden mit konzentrierter HCl abgestoppt und mittels HPLC gemessen.
HPLC-Bedingungen:
Retentionszeiten: TACA 1 ,283 min. (230nm)
TAA 0,910 min. (230 nm)
TA 1 ,168 min. (260nm)
TAC = 1 ,540 min. (260nm)
Die Versuchsergebnisse sind im folgenden Abschnitt zusammengefasst:
1.6.1 Mutanten T192X
Figur 6A zeigt, dass die Mutanten T192L und T192G TAC schneller reduzieren als die Kontrolle LU1 1558. Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion (Figur 6B) so ist der Wildtyp am aktivsten, da die anderen Mutanten den Kofaktor schlechter regenerieren können. In Figur 6C ist zu sehen, dass die Mutante T192A TACA besser oxidieren kann als der Wildtyp, wobei die Konzentrationen an TAC, die entstehen, sehr gering sind und deshalb die Ergebnisse bei dem Test schwanken.
1.6.2 Mutanten Y151 A
In Figur 7A ist zu sehen, dass die Mutanten Y151A und Y151 H TAC etwa 4-5mal schneller den Kofaktor reduzieren als der Wildtyp (LU1 1558). Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion, die Reduktion von TAC zu TACA mit Regeneration des Kofaktors mittels eines Opferalkohols (hier 2-Propanol), so ist nur noch die Mutante Y151A aktiv (Figur 7B). Die Gesamtaktivität ist etwas geringer als bei der Kontrolle. Durch die Vergrößerung der Bindungstasche wird möglicherweise das „kleine" Isopropanol schlechter oxidiert als 2-Butanol, welches bei Reaktoren eingesetzt wird. Die Mutanten Y151A und Y151 H können TACA besser oxidieren als der Wildtyp (Figur 7C).
Die Mutante Y151 A wurde im 21-l-Maßstab fermentiert und in 4-l-Reaktoren mit 2- Butanol sowohl als Regenerations- als auch Lösungsmittel eingesetzt, um sie mit dem Wildtyp zu vergleichen.
1.6.3 Zweite Generation: Mutanten Y151A-T192X
Da die Mutante Y151 A besser als der Wildtyp ist, wurde aufbauend auf dieser Mutante, eine zweite Sättigungsmutagenese durchgeführt an der Position T192X.
Das Ergebnis des Regenerationstests mit 2-Butanol (wobei die Regeneration des Op- feralkohols mit und ohne Zugabe von TACA bestimmt, d.h. die Entstehung von NADH im Photometer gemessen wird) ist in Figur 8A dargestellt.
Die Mutanten T192I und S zeigen besser als die Kontrolle (Y151A-T192T). Diese wurden deshalb im größeren Maßstab (Anzucht im 100-ml-Schüttelkolben) untersucht. Des Weiteren wurden noch die Mutanten T192A, L und V im größeren Maßstab untersucht, da diese etwa die gleiche Aktivität wie die Kontrolle zeigen. Betrachtet man jedoch die Komplettreaktion dieser fünf Mutanten, so ist die Kontrolle am aktivsten (siehe Figur 8B, wobei die Entstehung von TACA mit i-PropOH als Opferalkohol durch HPLC gemessen wird), so dass die einfache Mutante Y151A in den weiteren Versuchen eingesetzt wurde.
1.7 4-l-Reaktoren
Die aus diesem Screening hervorgehende aktivere Mutante Y151A wurde im 21-1- Maßstab mehrmals fermentiert. Eine Reihe von Standardreaktor-Ansätze wurde gefahren, um sie im größeren Maßstab mit der Kontrolle LU11558 zu vergleichen.
1.7.1 Ansatz:
In einem beheizbaren 4-l-Reaktor mit Rührer und Kondensator wurden 2 I 2-Butanol in einem 20 mM KH2PO4-Puffer pH 5.0 vorgelegt. 0.2 mM NAD (0.5 g) und 400 mM TAC
(275 g) bzw. 600 mM (420 g) wurden zugegeben. Durch Zugabe des Biokatalysators
(450 ml, 7.0 g/l BTM) in Form von ganzen Zellen (unbehandelter Fermenteraustrag) wurde die Reaktion gestartet. Bei der Zugabe der Zellen in Fermentationsmedium stieg der pH-Wert auf 6. Das zweiphasige Reaktionsgemisch wurde bei 40 0C und vermin- derten Druck (1 10 mbar) gerührt. Dabei wurde einstufig ein Gemisch aus 2-ButOH,
2-Butanon und Wasser abdestilliert. Gleichzeitig wurde die äquivalente Menge einer
Lösung bestehend aus 69 % 2-Butanol und 31 % H2O (entspricht bis auf 2-Butanon der Zusammensetzung des Destillats) als Feed zugegeben. Der pH-Wert wurde mittels eines pH-Titrators überprüft und zwischen pH~5.5-6.0 konstant gehalten. Jede Stunde wurde eine Probe gezogen, mit konz. HCl abgestoppt und mittels HPLC (LJ31366) analysiert. Nach 8 h wurde die Reaktionsmischung abgelassen.
1.7.2 Vergleich Wildtyp (LU1 1558) mit der Mutante Y151A (LU14759)
Es wurden mehrere 4-l-Reaktoren der Mutante gefahren, zunächst mit 400 mM (-70 g/l) TAC, anschließend mit 600 mM (105 g/l), um zu sehen, ob die Mutante größere Mengen an Produkt/Nebenkomponente toleriert.
Figur 9A zeigt, dass die Mutante im Schnitt 15-20 % besser ist als der Wildtyp. Wie man sieht schwanken die Werte von Versuch zu Versuch (das hängt auch von den einzelnen Fermentationen ab), der Unterschied ist jedoch signifikant. Die durchschnittliche Ausbeute beträgt beim Wildtyp 67 % ± 8 % und bei der Mutante 86 % ± 7 %, wo- bei es sich jeweils um unterschiedliche Fermentationen handelt. Auch das Verhältnis TACA/(TAC+TA) (helle Balken) ist deutlich besser bei der Mutante (4.8) als bei der Kontrolle (3.0), was sich hinterher in der Methylaminierung positiv bemerkbar macht.
Betrachtet man die Läufe mit 600 mM TAC (Figur 9B), so liefert auch hier die Mutante bessere Ergebnisse als die Kontrolle. Das TACA/(TAC+TA)-Verhältnis ist jedoch deutlich schlechter als bei den 400 mM Läufen.
1.8 Ergebnis Durch rationales Design ist es gelungen, eine Mutante Y151A (LU14759) zu finden, die 15 % - 20 % aktiver als der Wildtyp (LU11558) ist und höhere Mengen an TACA bzw. TA toleriert bei der Herstellung der Zwischenstufe des Duloxetinalkohols.
Dieses Ergebnis hat sich in einer Reihe an 4-l-Standardreaktoren, die das Produkti- onsverfahren im kleinen Maßstab widerspiegeln, bestätigt.
Da die Kristallstruktur des Enzyms mit dem Inhibitor TA gelöst wurde, konnte ein zuverlässiges Modell des Enzym-Substrat-Komplexes erstellt werden. Aus dem Modell geht hervor, dass die OH-Gru ppe d es Tyros i n s 1 51 i n e n g em Ko nta kt zu m ß-Kohlenstoffatom der Propanon-Seitenkette des Substrates (in diesem Fall TA) steht und so eine schwache CH-O-Wasserstoffbrücke ausbildet (Figur 10A). Durch die Mutation von Tyrosin 151 zu Alanin wird diese Wechselwirkung aufgehoben und die Bindung abgeschwächt (Figur 10B). Alle anderen Wechselwirkungen bleiben bestehen, so dass die hervorragende Selektivität des Enzyms trotz der Vergrößerung der Bindungs- tasche nicht geändert wird. Der ee-Wert des Produkts liegt weiterhin bei über >99,5%.
Beispiel 2: Random-Mutaqenese
2.1 Testentwicklung für die Roboteranlage
Um die große Probenzahl, die durch eine Random Mutagenese entsteht, zu bewälti- gen, war es notwendig, statt der bisherigen HPLC-Analytik im Labor (bei der direkt das Produkt detektiert wird) eine photometrische Methode für die Roboterstrasse zu entwickeln.
Hierzu kann die Abnahme des reduzierten Kofaktors NADH bei 340 nm gemessen werden, da der Extinktionskoeffizient bei dieser Wellenlänge SNAD <<:SNADH ist. Die optimale NADH-Konzentration lag bei 0.02 mM. Das Substrat TAC konnte zwischen 1 und 2 mM eingesetzt werden. Als Puffer wurde 50 mM NaH2PO4 pH 5.0 verwendet, da die Reduktion von TAC zu TACA im leicht sauren bevorzugt abläuft. Die Zellen, welche die Mutanten exprimieren, wurden direkt in einer Mikrotiterplatte (MTP) angezogen. Hierfür wurden die Klone von der Agarplatte mit einem Pickroboter (Qpix) gepickt und in eine LB-Vorkultur mit Antibiotika (100 μM Ampicillin, 20 μM Choramphenicol und 100 μM Spectinomycin) beiimpft. Nach einer Wachstumszeit von 24 h bei 37 0C und 200 rpm, wurden die Zellen per Hand in die LB-Hauptkultur mit Antibiotika und Induktoren (Rhamnose 0.5 g/l und IPTG 0.1 mM) überstempelt. Nach 16-18 h Wachstum wurden die Zellen im Test eingesetzt.
Vorversuche haben gezeigt, dass die Zellen aus der Kultur vor dem Assay aufgeschlossen werden müssen, da die Aktivität ansonsten zu gering ist. Zum Aufschluss der Zellen wurden verschiedene Methoden getestet, wie z.B. die Lagerung der Zellen über Nacht bei 4 0C, die Zugabe von 1-Butanol und 1 ,4-Butandiol und das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff. Nur die Lagerung bei 4 0C und das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff zeigten Erfolg, wobei die Stickstoffbehandlung aufgrund des Zeitgewinns vorgezogen wurde. Hierzu wurden die gewachsenen Zellen zunächst zentrifu- giert, der Überstand wurde abgeschüttet und die MTP mit einer Klebefolie verschlos- sen. Die MTP wurde für ca. 3 Sekunden komplett in flüssigen Stickstoff getaucht und dann wieder zum Auftauen abgestellt. Die gleichmäßigsten Ergebnisse erhielt man bei 4-maligem Schockgefrieren mit zwischenzeitlichem Auftauen bei Raumtemperatur.
2.2 Ablauf des Robotertests
Die Zellen wurden wie oben beschrieben angezogen und anschließend aufgeschlos- sen. Die MTP wurden mit Deckeln versehen und in den Inkubator bei 15 0C in die Roboteranlage gestellt. Im Multidrop wurden 100 μl/Well Wasser zugegeben, um anschließend die Zellen im Packard zu re-suspendieren. Danach wurde im Multidrop die Substratlösung (Endkonzentrationen: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH2PO4 pH 5.0) zugegeben und die NADH-Abnahme bei 340 nm im Photometer bestimmt.
Die aus diesem Test hervorgehenden positiven Klone werden anschließend im größe- ren Maßstab umfassender untersucht. Dabei wurden drei verschiedene Assays durchgeführt
Test A Komplettreaktion: Reduktion von TAC zu TACA und NADH-Regenerierung mit Isopropanol (50 mM NaH2PO4 pH 5.0, 0.2 mM NAD, 10 mM TAC, 10 % Isopropanol), Messung HPLC LJ31366
2-Butanon 2-Butanol
Test B Regeneration von NAD zu NADH mit 2-Butanol als Regenerierungsmittel (80 mM TrisHCI pH 8.0, 100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD ) im Photometer
NAD NADH
Test C Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH (50 mM NaH2PO4 pH 5.0, 0.2 mM NADH, 1.4 μl TAC pur (10 mM)) im Photometer
TAC TACA 1 2 Beim Vergleich der Ergebnisse aus den drei Assays fiel auf, dass die Regeneration von NAD (d.h. Test B) die Ergebnisse der Komplettreaktion wesentlich besser widerspiegeln, als die im Robotertest zuerst verwendete Reduktion von TAC zu TACA.
Vorversuche zeigten ebenso, dass die Regeneration des Kofaktors mit 2-Butanol (also die Bildung von NADH), nur bei Zellen, welche den Biokatalysator exprimieren, erfolgt. Deshalb wurde der Robotertest auf den Nachweis der NADH-Regeneration mit 2- Butanol umgestellt. Parallel dazu wurde jedoch weiterhin die Reduktion von TAC zu TACA, also die Abnahme von NADH, gemessen.
2.3 Ablauf des modifizierten Robotertests
Die Zellen wurden angezüchtet und anschließend aufgeschlossen. Die MTP wurden mit Deckeln versehen und in den Inkubator bei 15 0C in die Roboteranlage gestellt. Im Multidrop wurden 100 μl/Well Wasser zugegeben, um anschließend die Zellen zu resuspendieren. Daraus wurden zwei Tochterplatten mit 20 μl/Well (für Assay: Regenera- tion des Kofaktors) bzw. 70 μl/Well (für Assay: Reduktion von TAC) Zellsuspension erstellt. Die Substratlösungen (Endkonzentrationen: Reduktion: 2 mM TAC, 0.2 mM NADH, 50 mM NaH2PO4 pH 5.0; Regeneration: 100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD, 80 mM TrisHCI pH 8.0) wurden zugegeben und die Bildung von NADH bei 340 nm im Photometer bestimmt.
2.4 Auswertung der Robotertest-Ergebnisse
Im Roboterscreening wurde die Bildung/Abnahme (Reduktion/Oxidation) von NADH photometrisch bestimmt. Dazu wurden während 10 min jeweils 10 Messwerte ermittelt. Durch Berechnung der Steigung aus diesen Werten wurde die Anfangsaktivität der Dehydrogenase bestimmt.
2.5 Hemmung der Enzymreaktion
Vorversuche hatten gezeigt, dass das Produkt TACA oder eine Nebenkomponente, welche bei der Umsetzung entsteht, die Reaktion hemmen. Das Substrat wurde nicht vollständig umgesetzt. Ziel war es also, eine Mutante zu finden, die nicht nur aktiver, sondern auch höhere Mengen an Produkt bzw. Nebenkomponente toleriert, um einen möglichst vollständigen Umsatz und damit eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute zu erzielen.
Aus diesem Grund wurde im Assay TACA zugesetzt. Hierzu wird zu dem bisher durchgeführten Regenerationstest mit 2-Butanol und NAD noch 10 mM TACA zugegeben.
Aufgrund der begrenzten Biomasse war es nicht möglich, im Roboter-Screening alle drei Tests parallel durchzuführen. Deshalb wurde auf die Reduktionsreaktion von TAC zu TACA verzichtet. Die Regenerationsreaktion von NADH mit 2-Butanol blieb unverändert. Die TAC-Lösung wurde durch eine Substratlösung für die TACA-Hemmung (100 mM 2-Butanol, 1.75 mM NAD, 10 mM TACA, 80 mM TrisHCI pH 8.0) ersetzt. Der Ablauf des Robotertests blieb unverändert.
Die Auswertung wurde entsprechend an die Messung der TACA-Hemmung angepasst.
2.6 Herstellung der Mutantentenbank: Random-Mutagenese an EbN1 -Gen
Um Mutationen in der für die Dehydrogenase kodierenden Sequenz zu erzeugen, wurde eine error-prone-PCR-Reaktion (Fehler-Polymerasekettenreaktion) unter Zugabe von MnCb durchgeführt. Mit MnCI2 wurde die Spezifität der verwendeten Taq-DNA- Polymerase verringert, wodurch mit steigender MnCI2-Konzentration mehr falsche Nukleotide eingebaut werden und demnach mehr Mutationen erzeugt werden. Für die PCR wurden folgende Oligonukleotide mit Klonierungsschnittstellen (Ndel - Hind III) ausgewählt, die einen möglichst kurzen Bereich der DNA abdecken, damit auch in den Anfangs- und Endbereichen Mutationen entstehen konnten:
Mke123 δ'-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-S' (SEQ ID NO:13)
Mke124 δ'-GCTACGGCGTTTCACTTC-S' (SEQ ID NO:14)
Ansatz: In 50 μl PCR-Ansatz: 50 ng Plasmid-DNA (pDHE-ebn1 H) mit Dehydrogenase-Gen, je 120 ng Oligonukleotid, GCRich-Reaction buffer 1fach (Roche), 1/5 vol GCRich resolu- tion (Roche), je 0.2 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1 U Taq DNA Polymerase. Dieser Ansatz wurde 5 min auf 95 0C erhitzt (Anfangs-Denaturierung der DNA) und dann auf 85 0C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde MnCI2 in verschiedenen Konzentrationen (von 0-1 mM in 0.02 mM-Sch ritten) zugegeben. Dies war notwendig, damit sich das MnCI2 komplett löst. Anschließend wurde die eigentliche PCR mit folgen- dem Temperaturprogramm gestartet: 4 Zyklen: 95 0C für 45 sec, 54 0C für 45 sec, 72 0C für 45 sec; dann 26 Zyklen: 95 0C für 45 sec, 58 0C für 45 sec, 72 0C für 45 sec; 10 0C Pause.
Die PCR-Produkte wurden über ein Agarosegel aufgereinigt (Gfx-Kit) und anschlie- ßend eine Restriktionsspaltung mit den Enzymen Ndel und Hindi 11 (beide von NEB) durchgeführt. Nach Ligation in den Vektor pDHE (ebenfalls Ndel / I— lind 111 geschnitten) erfolgte die Transformation in XL10 ultrakompetente Zellen der Firma Stratagene. Anschließend wurde die beste MnCI2-Konzentration durch Sequenzierung einiger Klone (16 Klone pro Konzentration) bestimmt. Dabei wurde mit der MnCI2-Konzentration wei- tergearbeitet, die zwischen 1-3 Basenpaar-Austausche lieferte. Dazu wurde der Ligati- onsansatz zunächst in XL10 kompetente Zellen transformiert, die Klone gezählt und anschließend alle Klone von der Agarplatte mit LB-Medium abgeschwemmt. Die Plas- mid-DNA wurde ohne weitere Inkubation der Zellen isoliert (Promega Kit) und die so isolierte DNA in den Produktionsstamm TG10, welcher auch die Chaperone pAgro pHSG co-exprimiert, transformiert, und auf Q-Tray-Platten ausplattiert. Dieses Vorgehen war notwendig, weil die Transformationsrate des Produktionsstammes TG10+ (LU12037) bei Ligationen sehr gering war, und man möglichst viele Mutanten haben wollte.
2.7 Selektionierte Mutanten Tabelle 1 , oben gibt eine Übersicht der aus dem Robotertest selektionierten Klone. Diese Klone stammen aus den Verifizierungsplatten, welche komplett sequenziert wurden. Diese wurden im größeren Maßstab angezogen und zunächst im Eppendorf getestet. Dabei war die Aktivität der meisten Mutanten jedoch vergleichbar mit dem Wildtyp. Die aktiveren Mutanten, beispielsweise K114T und M200V F201 L, wurden im 21-1- Maßstab fermentiert und in einem 0.5-l-Reaktor getestet.
In einem beheizbaren 0.5-l-Reaktor mit Rührer und Kondensator wurden 250 ml 2-Butanol in einem 20 mM KH2PO4-Puffer pH 5.0 vorgelegt. 0.2 mM NAD (0.1 g) und 400 mM TAC (35 g) wurden zugegeben. Durch Zugabe des Biokatalysators (45 ml, 5.5 g/l BTM) in Form von ganzen Zellen (unbehandelter Fermenteraustrag) wurde die Reaktion gestartet. Bei der Zugabe der Zellen in Fermentationsmedium stieg der pH-Wert auf 6. Das zweiphasige Reaktionsgemisch wurde bei 40 0C und verminderten Druck (1 10 mbar) gerührt. Dabei wurde einstufig ein Gemisch aus 2-ButOH, 2-Butanon und Wasser abdestilliert. Gleichzeitig wurde die äquivalente Menge einer Lösung bestehend aus 69 % 2-Butanol und 31 % H2O (entspricht bis auf 2-Butanon der Zusammensetzung des Destillats) als Feed zugegeben. Der pH-Wert wurde mittels eines pH- Titrators überprüft und zwischen pH~5.5-6.0 konstant gehalten. Jede Stunde wurde eine Probe gezogen, mit konz. HCl abgestoppt und mittels HPLC (LJ31366) analysiert. Nach 8 h wurde die Reaktionsmischung abgelassen.
Die Fehlerbetrachtung der einzelnen Schritte zeigt, dass der größte Fehler im Wachstum der einzelnen Klone in der Mikrotiterplatte liegt. Dies ist nicht erstaunlich, da man die Wachstumsbedingungen (Temperatur, Sauerstoffeintrag, usw.) in der Mikrotiterplatte nicht so exakt wie in einem Fermenter steuern kann. Selbst verschiedene Fermentationen desselben Stammes schwanken um ca. 10 % - 15 %. Der Gesamtfehler bei diesem Roboterscreening liegt etwa bei 35 %. D. h. in diesem Screening sind nur Mutanten, welche eine Erhöhung um mehr als 35 % zeigen, aussagekräftig.
Beispiel 3: Site-directed Mutaqenesis und weitere Sättiqunqsmutaqenesen
Es wurden an weiteren gezielt ausgewählten Positionen einzelne Mutationen („site directed mutagenesis") bzw. Sättigungsmutagenesen durchgeführt, welche getestet wurden.
3.1 Auswahl der Positionen für eine Mutation
Die Substratbindetasche des Enzyms wird vom Loop 1 , 2 und der HeNx αFG1 gebildet (vgl. Figur 2). Die meisten Mutationen wurden aus diesem Bereich ausgewählt, da von diesen Aminosäuren eine unmittelbare Wirkung auf die Substratbindung und/oder Akti- vität des Enzyms erwartet werden kann.
Die HeNx ist ohne Substrat sehr flexibel (im Kristall ist keine Elektronendichte sichtbar) und wird erst bei Substratbindung fixiert. Das aktive Zentrum mit der Substratbindeta- sehe lässt sich in einen hydrophoben und hydrophilen Bereich einteilen. Der hydrophobe Teil wird vorwiegend durch die amphiphile HeNx αFG1 gebildet, die nach Substratbindung wie ein Deckel auf der Substratbindetasche sitzt. Die Aminosäuren 192 bis 204 liegen in diesem Bereich. Die Seitenketten der Aminosäuren Thr192, Leu197, Met200 und Leu204 zeigen in die Bindetasche, während Aminosäure Phe201 der Stabilisierung des Loops dient. Threonin 192 mit seiner OH-Gruppe bildet die Grenze zwischen dem hydrophoben und hydrophilen Bereich des aktiven Zentrums. Leu 186 sitzt am Anfang der flexiblen HeNx und dient als Scharnier für den geöffneten und den geschlossenen Zustand der aktiven Zentrums. Methionin 246 sitzt am Ende der Sub- stratbindetasche. Die Gegenseite der Substratbindetasche bildet der Loop ßEαF mit den Aminosäuren 146 bis 151. Auch hier zeigen die Seitenketten der ausgewählten Aminosäuren Leu146, Ile148 und Tyr151 in die Bindetasche. Die endständige OH- Gruppe des Tyrosins 151 ist Teil des Wasserstoffbrücken-Netzwerks des hydrophilen Teils des aktiven Zentrums, während der Rest der Seitenkette zum hydrophoben Teil gehört. Die vorwiegend hydrophile Unterseite des aktiven Zentrums bildet ein Strang aus den Aminosäuren 138-142, hier wurden die Aminosäuren Leu139, Thr140 und ThM 42 mutiert. Die zwei Cysteine 62 und 83 wurden für eine Mutation ausgewählt, da Cysteine generell oxidationsempfindlich sind und dadurch die Struktur negativ beeinflussen können.
In Figur 1 1 ist ein Ausschnitt aus dem aktiven Zentrum dargestellt. Der Kofaktor ist in violett markiert, das Substrat (hier TA) in grün, die mutierten Aminosäuren sind hervorgehoben. Im oberen Bereich ist die amphiphilen HeNx αFG1 zu sehen und im unteren Bereich der Loop ßEαF. (Loop 2)
3.2 Herstellung der gezielten Mutanten
Zunächst wurden für die jeweilige Position der DNA-Mutation zwei komplementäre ON- gonukleotide (siehe Tabelle 2) ausgewählt, welche der gewünschten DNA-Sequenz entsprachen. Zusätzlich wurden noch zwei weitere Oligonukleotide (Mke123 und Mke124, SEQ ID NO:5 und 6), die das gesamte Gen flankieren, ausgewählt. Die KIo- nierungsstrategie für die Site-directed Mutagenesis ist in Figur 12 dargestellt.
Anschließend wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, jeweils mit einem das Gen flankierenden Oligonukleotid und einem, welches die gewünschte Mutation trägt. Dar- aus erhielt man zwei PCR-Produkte, die an der Stelle der Mutation einen kurzen komplementären Bereich aufwiesen. Mit diesen beiden PCR-Produkten als Template wurde eine zweite PCR durchgeführt, wobei die vorher verwendeten, das Gen flankierenden, Oligonukleotide erneut eingesetzt wurden. Aus dieser Reaktion erhielt man das komplette Gen mit der gewünschten Mutation.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Ndel und Hindlll gespalten und anschließend in pDHE Vektor ligiert. Nach erfolgreicher Transformation in die kompetenten Zellen XL10 Gold (Fa. Stratagene) und anschließender Plasmid-isolation wurden die Plasmide sequenziert, um die erfolgreiche Mutation zu bestätigen. Zur Aktivitätsbestimmung wurden die Plasmide in TG10+ kompetente Zellen, die die Chaperone- Plasmide pAgro und pHSG enthalten, transformiert (LU12037).
Tabelle 2: Oligonukleotid-Sequenzen für die Herstellung der einzelnen Mutanten
Einfache Mutationen
Sättigungsmutagenesen:
3.3 Aktivitätstests der gezielten Mutanten
Figur 13A zeigt die Ergebnisse aus den Aktivitätstests, bei denen sowohl die Reduktion von TAC zu TACA unter Zugabe von NADH als auch die Gesamtreaktion mit Regeneration (dunkle Balken) wie in Punkt 2.2 beschrieben getestet wurde. In Figur 13B ist nur die Gesamtreaktion mit Regeneration getestet worden.
Insbesondere die Mutante L197I zeigt eine dreimal so hohe Aktivität im Vergleich zum Wildtyp. Auf die Offenbarung der hierin zitierten Literaturstellen wird ausdrücklich Bezug genommen.

Claims

Patentansprüche:
1. Funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, abgeleitet von der Pheny- lethanol Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
2. Funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante ausgewählt ist unter den in Tabelle 1 der Beschreibung aufgelisteten Mutanten.
3. Funktionale Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante, abgeleitet von der Phenylethanol Dehydrogenase EbN1 aus Azoarcus sp. mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Mutante wenigsten eine Mutation in wenigstens einem Sequenzbereich, ausgewählt unter
(1 ) 142 bis 153 (Loop 2) und
(2) 190 bis 211 (Helix alpha FG1 )
aufweist.
4. Mutante nach Anspruch 2, welche zusätzlich wenigstens eine weitere Mutation in einem weiteren Sequenzbereich, ausgewählt unter
(3) 93 bis 96 (Loop 1 )
(4) 241 bis 249 (C-Terminus)
(5) 138 bis 141 (hydrophiler Bereich Bindungstasche) und
(6) Cys61 und / oder Cys 83
aufweist.
5. Mutante nach einem der Ansprüche 3 und 4, wobei wenigstens einer der folgenden Reste mutiert ist: T192, L197, M200, F201 , L204, M246, L139, T140, T142, L146, 1148, Y151 ,
C61 , C83, L186, wobei die jeweilige Aminosäure durch eine beliebige andere natürliche Aminosäure ersetzt ist
6. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ausgewählt unter Mutanten enthaltend wenigstens eine der folgenden Mutationen:
a) Einzelmutationen:
Y151XA, wobei XA = A! R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V ist;
T192XB, wobei XB = A, E, G, I, P, S, W, V oder L ist;
b) Mehrfachmutationen:
Y151 XA T192XB, wobei XA und XB die oben angegebenen Bedeutungen besitzen
7. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche durch wenigstens eine der folgenden modifizierten Teilsequenzen charakterisiert ist:
(1 ) 142-TTYWX1 KX2EAX3T-I SS (modifizierter Loop 2) und
(2) 190-ATX4EASAX5 SAX6X7DVX8P N M LQAI-211 (modifizierte HeNx alpha FG1 ) worin X1 bis X8 unabhängig voneinander für beliebige Aminosäurereste stehen, wobei wenigstens einer der Reste X1 bis X3 und X4 bis X8 kein natürlicher Aminosäurerest des nativen Enzyms gemäß SEQ ID NO:2 ist .
8. Mutante nach Anspruch 1 1 , worin
X1 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.
X2 für I steht oder substituiert ist durch. L, V, A, M, F oder H.
X3 für Y steht oder substituiert ist durch A, R, N, E, Q, G, H, I, L, M, T oder V; oder worin X4 für T steht oder substituiert ist durch A, E, G, I, P, S, W, V oder L
X5 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.
X6 für M steht oder substituiert ist durch Y, W, E, V, S, R, Q, K, I, H, G, F, E oder
D
X7 für F steht oder substituiert ist durch G, K, T, Y, M, W oder R X8 für L steht oder substituiert ist durch I, V, A, M, F oder H.
9. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die noch mindestens etwa 50% der enzymatischen Aktivität der Dehydrogenase mit SEQ ID NO:2 aufweist.
10. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei diese eine prozentuale Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 von wenigstens etwa 70% aufweist.
1 1. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher zusätzlich zu wenigstens einer Mutation in den oben definierten Bereichen (1 ) bis (6) bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO: 2 durch Addition, Deletion, Insertion, Substitution, Inversion oder einer Kombination davon verändert sind.
12. Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche die stereospezifische Gleichgewichtsreaktion zwischen 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) und (1 S)-3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-ol (2)
in Gegenwart des Cofaktors NAD+ bzw. NADH katalysiert.
13. Nukleinsäuresequenz, kodierend für eine Mutante nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
14. Expressionskassette, umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13, funktional verknüpft mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäu- resequenz.
15. Vektor, umfassend wenigsten eine Expressionskassette nach Anspruch 14.
16. Rekombinanter Mikroorganismus, umfassend wenigstens eine Nukleinsäure nach Anspruch 13, eine Expressionskassette nach Anspruch 14 oder einen Vektor nach Anspruch 15.
17. Verfahren zur Herstellung einer Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei man einen rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 16 kultiviert, die für die Mutante kodierende Nukleinsäuresequenz exprimiert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert.
18. Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten, optisch aktiven Alkoholen der Formel (II) worin
Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyc- lischen oder heterocyclischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten
Ring steht, jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren,
umfassend die mikrobielle/enzymatische Reduktion eines Ketons der Formel (I)
in Gegenwart einer Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gegebenenfalls unter Zugabe Reduktionsequivalenten, wie insbesondere NADH.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Reaktion unter Bedingungen der Reduktionsäquivalent-Regenerierung erfolgt, wobei man als Opferalkohol einen Ci bis Cβ-Monoalkohol verwendet.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 und 19, wobei Cyc für einen Heterocyclischen Rest, insbesondere einen Thienylrest steht.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei man einen im wesentlichen enantiomerenreinen Alkohol der Formel (II), insbesondere das (S)- Enantiomer, erhält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , wobei die Mutante in isolierter Form und dabei gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert; oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert sind, eingesetzt wird.
23. Verfahren zur Herstellung von Duloxetin, umfassend
a) die biokatalytische Reduktion von 3-Chlor-1-(thienyl-2-yl)-propan-1-on (1 ) zu (1 S)-3-Chlor-1 -(thienyl-2-yl)-propan-1 -ol (2)
1 2 unter Anwendung eines Verfahrens gemäß der Defintion in einem der Ansprüche 18 bis 22;
b) die chemische Umsetzung des Alkohols (2) durch Methylaminierung zum Du- loxetinalkohol (3)
und schließlich
c) die chemische Umsetzung von des Duloxetinalkohols (3) durch Einführung einer Naphthylgruppe zu Duloxetin (4)
24. Verfahren zur mikrobiellen/enzymatischen Synthese von substituierten Ketonen der Formel (I)
worin
Cyc für einen ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyc- lischen oder heterocyclischen, gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten Ring steht, umfassend die mikrobielle/enzymatische Oxidation eines Alkohols der Formel (II)
jeweils in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren, in Gegenwart einer Phenylethanol Dehydrogenase-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gegebenenfalls unter Zugabe Oxidationssequivalenten, wie insbesondere NAD+.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Reaktion unter Bedingungen der Oxida- tionsäquivalent-Regenerierung erfolgt, wobei man als Opferketon einen Ci bis
C6-Monoalkanon verwendet.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 und 25, wobei die Mutante in isolierter Form und dabei gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert; oder exprimiert in mikrobiellen Zellen, welche gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert sind, eingesetzt wird.
27. Verwendung einer Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung von Duloxetinalkohol und/ oder Duloxetin.
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