CN106811492A - 一种拉科酰胺的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种拉科酰胺的制备方法，包括以下步骤：(a1)使5‑甲氧甲基海因与D‑海因酶、海因消旋酶及D‑氨甲酰基水解酶接触，制得(R)‑2‑氨基‑3‑甲氧基丙酸；或(a2)使5‑甲氧甲基海因与D‑海因酶、海因消旋酶接触，制得(R)‑2‑氨甲酰基氨基‑3‑甲氧基丙酸，再将(R)‑2‑氨甲酰基氨基‑3‑甲氧基丙酸脱去氨甲酰基，得到(R)‑2‑氨基‑3‑甲氧基丙酸；(b)由步骤(a1)或(a2)制得的(R)‑2‑氨基‑3‑甲氧基丙酸制备拉科酰胺。综上可知，本发明的技术方案，以5‑甲氧甲基海因代替D‑丝氨酸作为起始原料，能够降低拉科酰胺的制备成本。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种拉科酰胺的制备方法。
背景技术
拉科酰胺的化学名为(R)-2-乙酰胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺，结构式如下式Ⅰ所示，临床上用于治疗癫痫和神经性疼痛。
目前拉科酰胺的制备方法一般以D-丝氨酸为起始原料。
例如，美国专利US5773475第一次描述了三种拉科酰胺的制备方法，制备路线如路线1所示，方法一：用D-丝氨酸先做成甲酯，再和苄胺反应生成(2R)-2-氨基-N-苄基-3-羟基丙酰胺(化合物2)，然后乙酰化得到(2R)-2-乙酰氨基-N-苄基-3-羟基丙酰胺(化合物3)，最后和碘甲烷，在氧化银催化，乙腈做溶剂条件下甲基化得到拉科酰胺(化合物1)；方法二：D-丝氨酸用氯甲酸苄酯保护得到化合物4，然后和碘甲烷，在氧化银催化，乙腈做溶剂条件下甲基化得到(2R)-2-苄氧羰基氨基-3-羟基丙酸甲酯(化合物5)，式V经柱层析纯化后水解得到化合物6，再在-78℃条件下，氯甲酸异丁酯反应做成混合酸酐，再与苄胺发生反应得到化合物7，化合物7氢化脱去保护得到化合物8，再乙酰化，经柱层析纯化得到拉科酰胺；方法三：D-丝氨酸先乙酰化得到N-乙酰基-D-丝氨酸，然后冷却到-78℃，和氯甲酸异丁酯做成混合酸酐，再与苄胺发生反应得到(2R)-2-乙酰氨基--N-苄基-3-羟基丙酰胺(化合物3)，柱层析纯化后，与碘甲烷，氧化银在乙腈中反应得到拉科酰胺。
美国专利US2009143472报道了一种制备拉科酰胺的方法，其制备路线如路线2所示，D-丝氨酸用三甲基氯硅烷保护末端羟基，然后用三苯基氯甲烷保护氨基，再脱去三甲基硅保护基得到N-三苯甲基-D-丝氨酸(化合物9)，化合物9用氢化钠做碱，和碘甲烷在-15℃到-5℃温度范围内发生羟甲基化反应得到O-甲基-N-三苯甲基-D-丝氨酸(化合物10)，再与氯甲酸异丁酯和苄胺在-78℃条件下，反应得到(2R)-2-三苯甲氨基--N-苄基-3-羟基丙酰胺(化合物11)，化合物11脱保护，得到化合物8，最后和醋酐发生乙酰化反应得到拉科酰胺(化合物1)。
美国专利US2008027137报道了一种制备拉科酰胺的方法，其制备路线如图3所示，D-丝氨酸先用Boc保护，然后和硫酸二甲酯，在相转移催化剂和NaOH溶液中，或者丁基锂做碱反应得到N-Boc-O-甲基-D-丝氨酸(化合物12)，然后与氯甲酸异丁酯和苄胺在-78℃条件下，反应得到(2R)-2-叔丁氧羰基氨基--N-苄基-3-羟基丙酰胺(化合物13)，再在酸性条件下脱掉保护基，得到化合物8，最后乙酰化得到拉科酰胺(化合物1)。
上述拉科酰胺制备方法具有很多局限性：
1、D-丝氨酸作为起始原料较贵；
2、甲基化用到碘甲烷和氧化银，比较昂贵；
3、用到剧毒的硫酸二甲酯作为甲基化试剂，而且有少量消旋现象；
4、和苄胺反应做酰胺反应用到超低温反应；
5、中间体用到柱层析手段，无法工业化。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种拉科酰胺的制备方法，用于解决以D-丝氨酸作为起始原料较贵问题。具体技术方案如下：
本发明提供了一种式Ⅰ所示的拉科酰胺的制备方法，包括以下步骤：
(a1)使式II所示的5-甲氧甲基海因与D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲酰基水解酶接触，制得式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；
或
(a2)使式II所示的5-甲氧甲基海因与D-海因酶、海因消旋酶接触，制得式Ⅲ所示的(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸，再将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸脱去氨甲酰基，得到式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；
(b)由步骤(a1)或(a2)制得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制备拉科酰胺。
本领域技术人员可知，5-甲氧甲基海因的成本明显低于D-丝氨酸，显而易见，本发明的技术方案，以5-甲氧甲基海因代替D-丝氨酸作为起始原料，能够降低拉科酰胺的制备成本。另外，以，5-甲氧甲基海因作为起始原料，无需进行甲基化，因此，本发明的技术方案可以避免使用昂贵或剧毒的甲基化试剂。进一步地，本发明的技术方案，部分步骤采用酶促反应，更加绿色环保。
本文中，所说的术语“D-海因酶”(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)是一类催化海因、5'取代海因及其衍生物开环生成N-氨甲酰基-D-氨基酸的酰胺水解酶。其可以选自来自放射形土壤杆菌的D-海因酶、来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的D-海因酶、来自根癌土壤杆菌的D-海因酶、来自粪肠球菌的D-海因酶、来自皮氏伯克霍尔德氏菌的D-海因酶、来自恶臭假单胞菌的D-海因酶，来自黄杆菌的D-海因酶等。其中优选来自放射形土壤杆菌D-海因酶。
本文中，所说的术语“海因消旋酶”(hydantoin racemase,EC 5.1.99.5)是一类催化海因发生消旋，生产L-海因和D-海因的酶。其可以选自来自放射形土壤杆菌的海因消旋酶、来自根癌土壤杆菌的海因消旋酶和来自黄杆菌的海因消旋酶等。其中优选放射形土壤杆菌的海因消旋酶。
本文中，所说的术语“D-氨甲酰基水解酶”(D-carbamoylase,EC 3.5.1.77)是能高度专一性的脱氨甲酰化，形成游离氨基酸的水解酶。其可以选自放射形土壤杆菌的D-氨甲酰基水解酶、来自根癌土壤杆菌的D-氨甲酰基水解酶、来自粪肠球菌的D-氨甲酰基水解酶、来自皮氏伯克霍尔德氏菌的D-氨甲酰基水解酶、来自恶臭假单胞菌的D-氨甲酰基水解酶，来自黄杆菌的D-氨甲酰基水解酶等。其中优选来自放射形土壤杆菌的D-氨甲酰基水解酶。
需要说明的是，本发明的技术方案中所用到的5-甲氧甲基海因可以通过市售途径获得，也可以采用现有的合成方法自行合成。其来源本发明在此不进行限定。
另外，本发明中所涉及到的D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲酰基水解酶等，既可以通过市售途径获得相关产品，也可以采用基因工程技术来制备。
可选的，步骤(a1)包括：
获得表达D-海因酶的湿菌体、表达海因消旋酶的湿菌体和表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体；
将各湿菌体进行细胞破碎后，制取粗酶液；
使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
需要说明的是，获得表达各酶的湿菌体，以及对湿菌体进行细胞破碎，从而制得粗酶液，均可以采用现有技术中常规的技术手段来实现，本发明在此不进行限定。
在上述可选的技术方案中，粗酶液的使用量以制备粗酶液所用的各湿菌体计为：0.01-1g，优选为0.1-1g表达D-海因酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，优选为0.1-1g表达海因消旋酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.02-2g，优选为0.2-2g表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸锰的加入量与表达D-海因酶的湿菌体的质量比可以为1：(1-100)，优选为1：(20-60)。采用此限定组成的粗酶液，既可以实现低成本、高效率地制得(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
在具体实施过程中，使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步骤可以在pH值在7-10的缓冲溶液中进行，优选在pH值在7-8的缓冲溶液中进行，更优选在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中进行。
更为具体地，可以将5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的缓冲溶液，优选pH值在7-9的缓冲溶液，更优选0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中；再将所制备的粗酶液与之混合，在合适的温度下，例如30-40℃下反应，在反应过程中，用无机酸，例如盐酸调节反应的pH值，使其维持在6-10，优选在7-9左右。利用薄层层析法检测底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反应结束，一般地，反应20-40小时，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液。在后续的反应步骤(b)中，既可以直接利用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液进行反应，制备拉科酰胺，也可以将(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液，浓缩结晶，提纯(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高纯度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制备拉科酰胺。显然，考虑到成本，优选采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液进行后续反应。对所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸进行旋光度测试，出人意料的发现，(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee(Enantiomericexcess，对映体过量)值不小于99％，优选地，不小于99.7％，更优选地，不小于99.9％。手性纯度极高。使得采用本发明的技术方案，中间体(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱层析等手段进行异构体的拆分，更有利于拉科酰按制备的工业化。
可选地，在步骤(a2)中：制取(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸的步骤包括：
获得表达D-海因酶的湿菌体及表达海因消旋酶的湿菌体；
将各湿菌体进行细胞破碎后，制取粗酶液；
使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。
如前所述，获得表达各酶的湿菌体，以及对湿菌体进行细胞破碎，从而制得粗酶液，均可以采用现有技术中常规的技术手段来实现，本发明在此不进行限定。
在该可选的方案中，粗酶液的使用量以制备粗酶液所用的各湿菌体计为：0.01-1g，优选为0.1-1g表达D-海因酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，优选为0.1-1g表达海因消旋酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸锰的加入量与表达D-海因酶的湿菌体的质量比可以为1：(1-100)，优选为1：(20-60)。采用此限定组成的粗酶液，既可以实现低成本、高效率地制得(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。
在具体实施过程中，使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸的步骤可以在pH值在7-10的缓冲溶液中进行，优选在pH值在7-8的缓冲溶液中进行，更优选在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中进行。
更为具体地，可以将5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的缓冲溶液，优选pH值在7-9的缓冲溶液，更优选0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中；再将所制备的粗酶液与之混合，在合适的温度下，例如30-45℃下反应，在反应过程中，用碱，例如氢氧化钠调节反应的pH值，使其维持在7-10，优选在7-8左右。利用薄层层析法检测底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反应结束，一般地反应20-40小时，得到(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液。在后续的生成(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步骤中，既可以直接利用(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液进行反应制备(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，也可以将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液，浓缩结晶，提纯(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸，利用高纯度的(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸制备(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
在通过上述的酶促反应制得(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸后，可以继续采用D-氨甲酰基水解酶进行酶促反应，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。也可以在步骤(a2)中：将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸与亚硝酸盐，优选为亚硝酸钠反应，脱去氨甲酰基，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。对所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸进行旋光度测试，(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，优选地，不小于99.7％，更优选地，不小于99.9％。使得采用本发明的技术方案，中间体(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱层析等手段进行异构体的拆分，更有利于拉科酰按制备的工业化。
在具体实施过程中，可以将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸分散于水中，加入浓盐酸后，再加入亚硝酸盐水溶液，优选加入亚硝酸钠水溶液，更优选滴加亚硝酸钠水溶液进行反应，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。在后续的反应步骤(b)中，既可以直接利用上述用亚硝酸盐制得的含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反应液进行反应，制备拉科酰胺，也可以将(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反应液浓缩结晶，提纯(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高纯度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制备拉科酰胺。显然，考虑到成本，优选采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反应液进行后续反应。
在本发明的技术方案中，可选地，步骤(a1)和/或(a2)所用到的D-海因酶、海因消旋酶和/或D-氨甲酰基水解酶为经过纯化处理的酶。也就是说，再得到表达本发明的技术方案所用的酶的菌体后，可以采用本领域常规技术对其进行破碎及提纯处理，从而获得高纯度，例如纯度为95％以上的D-海因酶、海因消旋酶和D-氨甲酰基水解酶；进而再与5-甲氧甲基海因进行酶促反应。
在本发明的技术方案中，可选地，步骤(b)包括：
(b1)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸与乙酰化试剂反应，生成式Ⅴ所示的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；优选地，所述乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴；
具体实施过程中，可以将含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液或提纯后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用碱调节pH值到8～9，加入乙酰化试剂，室温反应8-24小时，反应结束后，将反应体系调至酸性，并用有机溶剂萃取，将有机萃取相浓缩后，用石油醚打浆，过滤得到(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸。
(b2)使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸与苄胺反应生成拉科酰胺。
优选地，步骤(b2)包括：
使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在碱和苄胺存在条件下与卤甲酸烷基酯反应生成拉科酰胺；
具体地，可以将(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸溶于有机溶剂中，在低温的条件下，例如0到-20℃，加入卤甲酸烷基酯、氮甲基吗啡啉及苄胺溶液，自然升温到室温反应2-8小时，反应结束，采用常规的后处理方法，对制备的拉科酰胺进行提纯处理。
或
可替代地，使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在缩合剂的存在下，和苄胺反应生成拉科酰胺；优选地，所述缩合剂选自碳二亚胺类缩合剂，更优选地，选自N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。可以理解的是，使用缩合剂进行缩合反应，其反应条件对于本领域技术人员来是容易实现的，本发明在此不进行赘述。
在本发明的技术方案中，可选地，步骤(b)包括：
(b3)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸与氨基保护试剂反应生成式Ⅵ所示的化合物，其中，PG代表氨基保护基团，优选地，PG代表叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、苄氧羰基或三苯甲基；
具体实施过程中，可以将含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液或提纯后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用碱调节pH值到8～9，加入氨基保护试剂，室温反应8-24小时，反应结束后，采用常规手段进行提纯处理，得到式Ⅵ所示的化合物。
(b4)使式Ⅵ所示的化合物与苄胺反应，得到式Ⅶ所示的化合物；
优选地，步骤(b4)包括：
使式Ⅵ所示的化合物在碱和苄胺存在条件下与卤甲酸烷基酯反应生成式Ⅶ所示的化合物；
具体地，可以将Ⅵ所示的化合物溶于有机溶剂中，在低温的条件下，例如0到-20℃，加入卤甲酸烷基酯、氮甲基吗啡啉及苄胺溶液，自然升温到室温反应2-8小时，反应结束，采用常规的后处理方法，对制备的式Ⅶ所示的化合物进行提纯处理。
或
使式Ⅵ所示的化合物在缩合剂的存在下，和苄胺反应生成式Ⅶ所示的化合物。优选地，所述缩合剂选自碳二亚胺类缩合剂，更优选地，选自N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
(b5)使式Ⅶ所示的化合物脱保护基生成式Ⅷ所示的化合物，(R)-2-胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺；
具体实施过程中，可以将Ⅶ所示的化合物溶于有机溶剂中，并向其中加入浓盐酸，室温反应1-5小时，反应完毕，采用常规的后处理方法，对式Ⅷ所示的化合物进行提纯处理。
(b6)式Ⅷ所示的化合物与乙酰化试剂反应生成拉科酰胺，优选地，所述乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴。
具体实施过程中，将式Ⅷ所示的化合物溶于有机溶剂中，加入碱，例如三乙胺，在低温条件下，例如0～5℃下加乙酰化试剂，室温，例如25度反应1-5个小时，反应完毕，采用常规的后处理方法，对合成出的拉科酰胺进行提纯处理。
综上可知，本发明的技术方案，以5-甲氧甲基海因代替D-丝氨酸作为起始原料，能够降低拉科酰胺的制备成本。
不仅如此，以5-甲氧甲基海因作为起始原料，无需进行甲基化，可以避免使用昂贵或剧毒的甲基化试剂。进一步地，本发明的技术方案，部分步骤采用酶促反应，更加绿色环保。而且，与苄胺的反应温度相对现有技术也更加温和。
更为重要的是，本发明的技术方案所制备的中间体(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，优选地，不小于99.9％，手性纯度极高。因此，其不需要采用柱层析等手段进行异构体的拆分，进而使整个拉科酰按的制备过程无需进行异构体的拆分，工业化前景好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋体的高效液相谱图；
图2为实施例2制备的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相谱图；
图3为实施例5制备的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相谱图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
首先对表达D-海因酶的湿菌体、表达海因消旋酶的湿菌体和表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体的制备过程进行说明。
(1)D-海因酶原始基因的合成：根据放射形土壤杆菌的D-海因酶的原始基因序列进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-AA-hyd。放射形土壤杆菌D-海因酶氨基酸序列参见GenBank Accession:Q44184。
(2)海因消旋酶原始基因的合成：根据放射形土壤杆菌的海因消旋酶的原始基因序列进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-AA-RA。放射形土壤杆菌的海因消旋酶的氨基酸序列参见GenBank Accession:WP_012650408。
(3)D-氨甲酰基水解酶原始基因的合成：根据放射形土壤杆菌D-氨甲酰基水解酶的原始基因序列进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-AA-Car。放射形土壤杆菌D-氨甲酰基水解酶氨基酸序列参见GenBank Accession:Q44185。
(4)湿菌体的制备：将上述重组表达载体分别通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中。分别挑取单菌落，将单菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃，振荡培养过夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mL TB培养基中，37℃下振荡培养至OD600至3.0，然后添加IPTG至终浓度为0.1mM，25℃下诱导培养过夜。5000g离心10min后收集菌体，即得到表达D-海因酶的湿菌体、表达海因消旋酶的湿菌体和表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体。
拉科酰胺的制备路线一
实施例1
5-甲氧甲基海因(式II化合物)的制备
溴乙醛缩二乙醇(39.4g，0.2mol)溶于甲醇钠(10.8g，0.2mol溶于100mL甲醇)溶液中，置于高压釜内，加热到105～110℃，反应1小时，然后冷却，倒入500mL冰水中，乙醚萃取(200mL×3)，无水硫酸钠干燥，蒸去乙醚，残余物减压蒸馏，收集48～50℃/19mmHg产品，得到甲氧基乙醛缩二乙醇23g，收率78％。1H NMR(CHCl3):δ1.182(t,J＝6.8Hz,6H,(CH2CH3)2),δ3.350(s,3H,OCH3),δ3.402(d,J＝5.2Hz,2H,OCH2),δ3.533(dd,J＝7.2,9.2Hz,2H,CH2CH3),δ3.661(dd,J＝7.2,9.6Hz,2H,CH2CH3),δ4.587(t,J＝5.2Hz,1H,CH)。
甲氧基乙醛缩二乙醇(14.8g，0.1mol)加入20mL 5N的盐酸，室温搅拌24小时，然后冷却，加入Na2SO3(12.6g，0.1mol)，加入KCN(6.5g，0.1mol溶于50mL水)水溶液，室温搅拌2小时，加入50mL乙醇和碳酸铵(19.2g，0.2mol)，混合物55℃加热2小时，活性炭脱色，浓缩掉大部分溶剂，加入3倍体积乙醇，降温缓慢析晶，固体过滤得5-甲氧甲基海因7.5g，收率52.1％，熔点167～170℃(升华)。1H NMR(DMSO):δ3.262(s,3H,OCH3),δ3.496(dd,J＝2.1,10.4Hz,1H,CHH’O),δ3.571(dd,J＝4,10.4Hz,1H,CHH’O),δ4.147(t,J＝3.2Hz,1H,CH),δ7.926(br,1H,NH),δ10.585(br,1H,NH)。
实施例2
(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制备
将按前述方法获得的表达D-海因酶的湿菌体2g、表达海因消旋酶的湿菌体2g和表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体4g重悬于20mL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，超声破碎后得到粗酶液。
将按照实施例1的方法制备的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，随后，将所制的粗酶液溶解0.05g硫酸锰后，加入底物的缓冲液中。在40℃下磁力搅拌反应25小时，并用4M盐酸调节反应的pH值，使其维持在7.5左右。利用薄层层析法(TLC)检测底物完全消耗，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液。
将(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液浓缩结晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，1H NMR(D2O):δ3.182(s,3H,OCH3),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH2O)。手性ee值100％。
其中，薄层层析法：薄层板：硅胶G；展开剂：正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，Rf＝0.5，茚三酮显色。
手性ee值采用高效液相色谱法测定：色谱条件：仪器：Aglient(安捷伦)1260高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱:CROWNPAK CR+,4.0*150mm,5um；流速:0.2mL/min；柱温:5℃；检测波长:200nm；流动相：称取16.3g 70％高氯酸溶液至1L水中；进样量:10μL；该高效液相色谱谱图如图2所示(图1为2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋体的测定谱图，用于确定两个异构体的出峰位置)，根据图2中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其异构体的峰面积之比可以确定手性ee值100％。
实施例3
(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制备
将按照实施例2的方法制备的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液(约含20g化合物Ⅳ，0.12mol)用NaOH溶液调节pH8～9，20℃滴加乙酸酐(19g，0.18mol)，室温反应16小时，反应结束后，浓盐酸调节pH4左右，乙酸乙酯萃取(60mL×3)三次，有机相合并，浓缩得到浅黄色油状物，石油醚打浆得黄色固体粉末，收率74％。1H NMR(CDCl3):δ2.142(s,3H,C(O)CH3),δ3.462(s,3H,OCH3),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH).
实施例4
(R)-2-乙酰胺基--N-苄基-3-甲氧基丙酰胺(拉科酰胺)的制备将按照实施例3的方法制备的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(48.3g，0.3mol)溶于二氯甲烷溶液中，降温至-10℃，加入氯甲酸异丁酯(37g，0.3mol)，-5℃以下滴加氮甲基吗啡啉(30g，0.3mol)，放热，滴毕，-5℃下搅拌反应半个小时，然后在-5℃以下滴加苄胺(25g，0.3mol溶于25g二氯甲烷)溶液，滴毕，自然升温到室温反应5小时，反应结束，依次用120mL水，120mL 4％盐酸，120mL8％NaHCO3溶液和120ml水洗，有机相浓缩，用375mL乙酸乙酯/正己烷(1:3)重结晶，得到产品61g，收率81％。1H NMR(CDCl3):δ2.042(s,3H,C(O)CH3),δ3.372(s,3H,OCH3),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH2),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).
拉科酰胺的制备路线二
实施例5
(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制备
将按前述方法获得的表达D-海因酶的湿菌体2g和表达海因消旋酶的湿菌体2g重悬于20mL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，超声破碎后得到粗酶液。
将按照实施例1的方法制备的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，随后将所制的粗酶液溶解0.05g硫酸锰后，加入底物的缓冲液中。在40℃下磁力搅拌反应25小时，并用4M氢氧化钠调节反应的pH值，使其维持在7.5左右。利用薄层层析法检测底物完全消耗(薄层层析法参照实施例2)，用4M盐酸调ph至2.5析出固体，得到(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。
将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸(14g，0.086mol)悬浮于250mL水中，加热到10℃，加入34.7g浓盐酸，滴加亚硝酸钠水溶液(31.3g，含有6.26g亚硝酸钠)，滴毕，10℃搅拌8小时，反应完毕，得到含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反应液。
将(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶反应液浓缩结晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，1H NMR(D2O):δ3.182(s,3H,OCH3),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH2O)。手性ee值99.72％。
检测手性ee值的高效液相色谱谱图如图3所示(手性ee值的检测方法同实施例2)，根据图3中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其异构体的峰面积之比可以确定手性ee值99.72％。
实施例6
(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制备
将按照实施例5的方法制备的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反应液用30％NaOH水溶液调节pH10.5，滴加醋酐(17.6g，0.172mol)，加热到40度反应5小时，TLC(正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，茚三酮显色)显示原料消耗完毕，弄4M的盐酸调pH1～2，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次60mL，合并有机相，浓缩至干，石油醚打浆得到10.5g白色固体，收率76％。1H NMR(CDCl3):δ2.142(s,3H,C(O)CH3),δ3.462(s,3H,OCH3),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH)。
实施例7
拉科酰胺的制备
将按照实施例6的方法制备的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸按照实施例4的方法制得拉科酰胺。
拉科酰胺的制备路线三
实施例8
N-Boc-O-甲基-D-丝氨酸(化合物Ⅵ)的制备
将按照实施例2的方法制备的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶转化液(约含35.7g化合物Ⅳ，0.3mol)用NaOH溶液调节pH10～11，20℃滴加Boc酸酐(二碳酸二叔丁酯)(78.5g，0.36mol)，室温反应16小时，反应结束后，用100mL甲基叔丁基醚萃取过量的Boc酸酐，水相用2N盐酸调节pH5左右，二氯甲烷萃取(100mL×3)三次，有机相合并，无水硫酸钠干燥，浓缩至干，石油醚打浆，过滤得白色固体粉末56.5g，收率86％。1H NMR(CDCl3):δ1.472(s,9H,(CH3)3O),δ3.393(s,3H,OCH3),δ3.653(m,1H,NH),δ3.885(m,1H,CHH’O),δ4.294,4.461(t,J＝1.5Hz,1H,CH),δ452,5.927(m,1H,CHH’O),δ9.282(br,1H,COOH)。
实施例9
(R)-2-Boc胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅶ)的制备
将按照实施例8的方法制备的N-Boc-O-甲基-D-丝氨酸(50g，0.23mol)溶于二氯甲烷溶液中，降温至-10℃，加入氯甲酸异丁酯(28.4g，0.23mol)，-5℃以下滴加氮甲基吗啡啉(23g，0.23mol)，放热，滴毕，-5℃下搅拌反应半个小时，然后在-5℃以下滴加苄胺(19.2g，0.23mol溶于20g二氯甲烷)溶液，滴毕，自然升温到室温反应5小时，反应结束，依次用90mL水，90mL 4％盐酸，90mL8％NaHCO3溶液和90ml水洗，有机相浓缩的黄色油状物，用350mL乙酸乙酯/正己烷(1:5)重结晶，得到产品45.5g，收率64％。1H NMR(CDCl3):δ1.424(s,9H,(CH3)3O),δ3.344(s,3H,OCH3),δ3.505(dd,J＝6,9.2Hz,1H,CHH’O),δ3.806(dd,J＝4,9.2Hz,1H,CHH’O),δ4.290(m,1H,CH),δ4.464(m,2H,CH2Ph),δ5.504(br,1H,BocNH),δ6.892(br,1H,BnNH),δ7.289(m,5H,PhH)。
实施例10
(R)-2-胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅷ)的制备
将按照实施例9的方法制备的(R)-2-Boc胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺(40g，0.13mol)溶于125mL二氯甲烷，反应液中加入75mL浓盐酸，室温搅拌反应2.5小时，反应完毕，有机相用35ml×2水洗，水相合并，用甲叔醚50mL提取杂质，水层用30％NaOH调pH到10～12，二氯甲烷(50mL×2)提取，有机相合并，用30mL饱和食盐水洗一次，有机相浓缩得浅黄色油状物25g，收率92％，放置会固化。1H NMR(CDCl3):δ3.232(s,3H,OCH3),δ3.431(m,1H,CH),δ3.498(m,2H,CH2O),δ4.325(m,2H,CH2Ph),δ7.199(m,5H,PhH),δ7.841(br,1H,NH)。
实施例11
拉科酰胺的制备
将按照实施例10的方法制备的(R)-2-胺基-N-苄基-3-甲氧基丙酰胺(21g，0.1mol)溶于100mL二氯甲烷溶液，加入三乙胺(14g，0.14mol)，在0～5℃滴加乙酸酐(12.2g，0.12mol)，滴毕，室温25℃反应3个小时，反应完毕，用40mL水洗，二氯甲烷浓缩干，加200mL乙酸乙酯/正己烷1:1溶剂70℃溶解，然后缓慢降温至室温，大量固体析出，过滤，少量乙酸乙酯/正己烷1:1溶剂淋洗，干燥的拉科酰胺21.3g，收率85％。1H NMR(CDCl3):δ2.042(s,3H,C(O)CH3),δ3.372(s,3H,OCH3),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH2),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).
以上对本发明所提供的拉科酰胺的制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
Claims (13)
1.一种式Ⅰ所示的拉科酰胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a1)使式II所示的5-甲氧甲基海因与D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲酰基水解酶接触，制得式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；
或
(a2)使式II所示的5-甲氧甲基海因与D-海因酶、海因消旋酶接触，制得式Ⅲ所示的(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸，再将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸脱去氨甲酰基，得到式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；
(b)由步骤(a1)或(a2)制得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制备拉科酰胺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a1)包括：
获得表达D-海因酶的湿菌体、表达海因消旋酶的湿菌体和表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体；
将各湿菌体进行细胞破碎后，制备粗酶液；
使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，粗酶液的使用量以制备粗酶液所用的各湿菌体计为：0.01-1g，优选为0.1-1g表达D-海因酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，优选为0.1-1g表达海因消旋酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.02-2g，优选为0.2-2g表达D-氨甲酰基水解酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a2)中：制取(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸的步骤包括：
获得表达D-海因酶的湿菌体及表达海因消旋酶的湿菌体；
将各湿菌体进行细胞破碎后，制取粗酶液；
使用粗酶液，优选在硫酸锰的存在下，将5-甲氧甲基海因转化为(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，粗酶液的使用量以制备粗酶液所用的各湿菌体计为：0.01-1g，优选为0.1-1g表达D-海因酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，优选为0.1-1g表达海因消旋酶的湿菌体/1g 5-甲氧甲基海因。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a2)中：将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸与亚硝酸盐，优选为亚硝酸钠反应，脱去氨甲酰基，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸分散于水中，加入浓盐酸后，再加入亚硝酸盐水溶液，优选加入亚硝酸钠水溶液进行反应，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a1)和/或(a2)所用到的D-海因酶、海因消旋酶和/或D-氨甲酰基水解酶为经过纯化处理的酶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括：
(b1)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸与乙酰化试剂反应，生成式Ⅴ所示的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；优选地，所述乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴；
(b2)使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸与苄胺反应生成拉科酰胺。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(b2)包括：
使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在碱和苄胺存在条件下与卤甲酸烷基酯反应生成拉科酰胺；
或
使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在缩合剂的存在下，和苄胺反应生成拉科酰胺；优选地，所述缩合剂选自碳二亚胺类缩合剂，更优选地，选自N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括：
(b3)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸与氨基保护试剂反应生成式Ⅵ所示的化合物，其中，PG代表氨基保护基团，优选地，PG代表叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、苄氧羰基或三苯甲基；
(b4)使式Ⅵ所示的化合物与苄胺反应，得到式Ⅶ所示的化合物；
(b5)使式Ⅶ所示的化合物脱保护基生成式Ⅷ所示的化合物；
(b6)使式Ⅷ所示的化合物与乙酰化试剂反应生成拉科酰胺，优选地，所述乙酰化试剂选自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(b4)包括：
使式Ⅵ所示的化合物在碱和苄胺存在条件下与卤甲酸烷基酯反应生成式Ⅶ所示的化合物；
或
使式Ⅵ所示的化合物在缩合剂的存在下，和苄胺反应生成式Ⅶ所示的化合物，优选地，所述缩合剂选自碳二亚胺类缩合剂，更优选地，选自N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a1)或(a2)中所制得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的手性ee值不小于99％，优选地，不小于99.7％，更优选地，不小于99.9％。
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