CN107686852B - 一种莫西沙星中间体化合物的制备方法 - Google Patents

一种莫西沙星中间体化合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种莫西沙星中间体化合物的制备方法。该方法包括下列步骤：溶剂中，在ω‑转氨酶和/或其固定化形式以及氨供体的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如下所示的转氨反应，制得如式(II)所示的化合物；所述的ω‑转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；其中，X为氯、溴、碘、甲磺酸酯或对甲苯磺酸酯；R为C1‑4烷氧羰基、苄氧羰基或苄基。本发明的制备方法成本低，步骤少，操作简单，产品ee值高达99％以上，更适用于工业化生产。

Description

一种莫西沙星中间体化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种莫西沙星中间体化合物的制备方法。
背景技术
莫西沙星(moxifloxacin)是第三代喹诺酮类光谱抗菌药物，1999年上市至今在临床上广泛应用于治疗呼吸道感染如获得性肺炎、慢性支气管炎急性发作、急性细菌性鼻窦炎等。
Figure BDA0001070013640000011
(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)是莫西沙星的关键手性中间体，分子结构有哌啶和吡咯烷两个骨架结构和两个手性中心，已报道的制备方法主要分为以下几种：
路线1：哌啶路线
Figure BDA0001070013640000012
哌啶路线有较多的合成方法的报道，也是目前工业化生产中采用的工艺，这些工艺都是采用3，4-吡啶二羧酸为起始原料，涉及到吡啶的高压氢化，羧酸羰基的还原等反应，高压氢化对设备要求较高，羧酸羰基的还原要用到昂贵的还原试剂，这条路线的工艺报道还都涉及到手性的拆分，需要解决拆分工艺中废弃的异构体的消旋再利用，拆分剂回收利用等问题，工艺流程复杂，既不经济也不环保。
路线2：吡咯烷路线
Figure BDA0001070013640000021
专利US5703244报道了一种吡咯烷路线的不对称合成方法，该方法采用sharpless不对称环氧化构建手性单元，将顺式1，4-丁烯二醇去对称化、不对称环氧化、烯丙基溴格式试剂开环、去不对称化四步反应得到手性醇，然后两步闭环得到3-羟基吡咯烷，再将3-羟基转化为构型相反的氨基，最后通过五步反应构建哌啶环得到式(I)化合物，该路线工艺流程长达11步，且采用sharpless构建手性骨架的工艺成本较高，所以没有工业化生产的价值。
具体路线如下：
Figure BDA0001070013640000022
上述两种路线无论是采用拆分方法还是不对称合成方法制备式(I)化合物，已有的合成技术都存在工艺成本高、工艺流程复杂的缺点。
路线3：手性胺与羰基化合物的还原胺化反应制备手性氨基化合物
Figure BDA0001070013640000023
专利申请号为CN201280003246.3和专利申请号为CN201110312411.0中均公开了采用上述路线3制备式(I)化合物。虽然路线3相比较路线1和2降低工艺成本，缩短工艺流程，减少废弃物的排放，具有巨大的市场应用价值，适于大规模推广应用，但是仍需要经过还原胺化反应、分子内关环、脱除辅基等步骤，步骤仍然较长。
因此，如何进一步缩短制备式(I)化合物的步骤，降低成本，提高式(I)化合物的ee值，更适用于工业化生产应用，成为本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中莫西沙星的关键手性中间体(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)的制备方法中存在的成本高、工艺复杂和产品ee值较低等的缺陷，而提供了一种莫西沙星中间体化合物的制备方法。本发明的制备方法成本低，步骤少，操作简单，产品ee值高达99％以上，更适用于工业化生产。
本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题的。
本发明提供了一种如式(II)所示的化合物(4aS,7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶的制备方法，其包含下列步骤：溶剂中，在ω-转氨酶和/或其固定化形式以及氨供体的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如下所示的转氨反应，制得如式(II)所示的化合物；所述的ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所不；
Figure BDA0001070013640000031
其中，X为氯、溴、碘、甲磺酸酯或对甲苯磺酸酯；R为C1-4烷氧羰基、苄氧羰基或苄基。
所述的C1-4烷氧羰基优选甲氧羰基
Figure BDA0001070013640000032
乙氧羰基
Figure BDA0001070013640000033
正丙氧羰基
Figure BDA0001070013640000041
异丙氧羰基
Figure BDA0001070013640000042
正丁氧羰基
Figure BDA0001070013640000043
异丁氧羰基
Figure BDA0001070013640000044
或叔丁氧羰基
Figure BDA0001070013640000045
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的溶剂可为有机合成领域此类转氨反应常规的溶剂，只要不影响转氨反应的进行即可，优选水和/或有机溶剂。所述的有机溶剂可为有机合成领域此类转氨反应常规的有机溶剂，只要能够很好的溶解如式(III)所示的化合物，即可。所述的有机溶剂优选亚砜类溶剂和/或醋酸酯类溶剂。所述的亚砜类溶剂优选N，N-二甲基亚砜(DMSO)。所述的醋酸酯类溶剂优选醋酸异丁酯。当所述的溶剂为水和有机溶剂的混合溶剂时，所述的水和有机溶剂的混合溶剂中，水和有机溶剂的用量关系可不作具体限定所述的溶剂的用量可不作具体限定，只要不影响转氨反应的进行即可，所述的溶剂的用量可不作具体限定，只要不影响反应进行即可，所述的溶剂与如式(III)所示的化合物的体积质量比优选15-50mL/g；进一步优选25-35mL/g(例如28-31.5mL/g)。
本发明中，ω-转氨酶的固定化形式通常是指将ω-转氨酶用物理或化学方法(所述的物理或化学方法可为酶固定化领域中常规的方法)处理，但仍具有酶活性的状态。ω-转氨酶的固定化形式的稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
所述的ω-转氨酶的用量可不作具体限定，只要不影响转氨反应的进行即可；一般以ω-转氨酶活性确定其与式(III)所示的化合物用量。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的氨供体可为有机合成领域此类转氨反应常规的氨供体，一般根据转氨酶的种类确定，选择与转氨酶相匹配的氨供体。所述的氨供体优选异丙胺、手性甲基苄胺(例如R-甲基苄胺和/或S-甲基苄胺)和D-丙氨酸中的一种或多种。所述的氨供体的用量可不作具体限定，只要不影响转氨反应的进行即可。所述的氨供体与如式(III)所示的化合物的质量比优选0.1∶1-1∶1，更优选0.3∶1-0.8∶1(例如0.4∶1-0.67∶1)。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应的温度可为有机合成领域此类反应常规的温度，优选20℃-55℃；更优选45℃-55℃。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应的进程可采用本领域常规的检测方法(例如TLC、GC、HNMR或HPLC等)进行监测，一般以如式(III)所示的化合物消失时作为反应的终点。所述的转氨反应的时间优选2-24小时，更优选12-20小时。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应优选在反应体系的pH值为8.0-10.0的条件下进行。所述的反应体系的pH值可通过有机合成领域常规的酸或碱进行调节，例如当反应体系的pH值超过10.0，可通过加入酸将反应体系的pH值调至8.0-10.0之间；当反应体系的pH值低于8.0，可通过加入碱将反应体系的pH值调至8.0-10.0之间。所述的酸优选无机酸，例如盐酸。所述的碱与优选有机碱，例如氨水。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应优选在辅酶的存在下进行。所述的辅酶可为有机合成领域此类转氨反应常规的辅酶，优选磷酸吡哆醛。所述的辅酶的用量可不作具体限定，只要不影响转氨反应的进行即可。所述的辅酶与如式(III)所示的化合物的质量比优选0.001∶1-0.01∶1，更优选0.005∶1-0.006∶1。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法优选包括下列步骤：溶剂中，在pH值为8.0-10.0条件下，在ω-转氨酶和/或其固定化形式、氨供体和辅酶的作用下，将如式(III)所示的化合物进行所述的转氨反应，即可；更优选包括下列步骤：将溶剂和如式(III)所示的化合物的混合液，与氨供体混合，调节反应体系pH值至8.0-10.0之间，再与ω-转氨酶和/或其固定化形式和辅酶混合，进行所述的转氨反应。
所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应结束后，还可包含后处理的操作。所述的后处理的操作可为有机合成领域常规的后处理操作，本发明优选包含下列步骤：将所述的转氨反应结束后的反应液，调节pH值至2-3，固液分离后，用有机溶剂萃取滤液，水相调节pH值至10以上后，用有机溶剂萃取，合并有机相，干燥(例如无水硫酸钠或无水硫酸镁)，过滤，除去有机溶剂(优选减压浓缩)，得如式(II)所示的化合物粗品，将所得粗品进行柱层析纯化，即可；或者将所述的转氨反应结束后的反应液进行固液分离后，滤液浓缩至干，即可。其中，可采用本领域常规的酸，例如盐酸调节反应液的pH值至2-3。所述的固液分离的方法可为本领域常规的方法，优选抽滤。在进行固液分离的操作时，可先在反应液中加入硅藻土，以方便固液分离。在进行固液分离的操作时，优选将所得滤饼用水淋洗。萃取时所用有机溶剂可为有机合成领域常规的萃取用有机溶剂，优选卤代烃类溶剂，例如二氯甲烷。所述的柱层析纯化的操作中，所述的洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚体系。其中乙酸乙酯和石油醚的体积比可根据所得如式(II)所示的化合物TLC进行选择，优选乙酸乙酯∶石油醚(V∶V)＝1∶5-1∶8。
本发明还提供了一种如式(I)所示的化合物(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶的制备方法，其包括下列步骤：
(1)溶剂中，在ω-转氨酶和/或其固定化形式以及氨供体的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如下所示的转氨反应，制得如式(II)所示的化合物；所述的ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；
(2)将如式(II)所示的化合物进行如下所示的脱保护反应，即可；
Figure BDA0001070013640000061
其中，X为氯、溴、碘、甲磺酸酯或对甲苯磺酸酯；R为C1-4烷氧羰基、苄氧羰基或苄基。
步骤(1)中，所述的如式(II)所示的化合物的制备方法中，所述的转氨反应的条件均同前所述。
步骤(2)中，所述的脱保护反应的方法和条件可为有机合成领域此类反应常规的方法和条件。本领域技术人员可根据如式(II)所示的化合物中R的具体情况进行常规选择。本发明优选包括下列任一方法：
方法一包括下列步骤：
(a)水中，在酸的作用下，将如式(II-1)所示的化合物进行如下所示的脱保护成盐反应，制得如式(II-2)所示的化合物；
(b)溶剂中，将如式(II-2)所示的化合物与碱进行酸碱中和反应，制得如式(I)所示的化合物；
Figure BDA0001070013640000071
R1为C1-4烷氧羰基或苄氧羰基；
方法二包括下列步骤：溶剂中，在钯碳的催化下，将如式(II-3)所示的化合物和氢气进行如下所示的脱保护反应，制得如式(I)所示的化合物；
Figure BDA0001070013640000072
R2为苄基。
方法一中，步骤(a)中，所述的酸可为有机合成领域此类反应常规的酸，优选浓盐酸(即质量分数为36％-37％的浓盐酸)。所述的酸与如式(II-1)所示的化合物的质量比优选2∶1-5∶1，进一步优选3∶1-4∶1。所述的水的用量可不作具体限定，只要不影响反应进行即可，所述的水与如式(II-1)所示的化合物的体积质量比优选5mL/g-20mL/g，进一步优选8mL/g-10mL/g。所述的脱保护成盐反应的温度优选水的回流温度，例如95℃-105℃，更优选100℃。所述的脱保护成盐反应的进程可采用本领域常规的检测方法(例如TLC、GC、HNMR或HPLC等)进行监测，一般以如式(II-1)所示的化合物消失时作为反应的终点。所述的脱保护成盐反应的时间优选12-36小时，更优选24小时。
方法一中，步骤(a)中，所述的脱保护成盐反应结束后，还可进一步包含后处理的操作。所述的后处理的操作可为有机合成领域后处理常规的操作。本发明优选包含下列步骤：除去脱保护成盐反应结束后的反应液中的水，加入C1-4的醇类溶剂(例如乙醇)，于10℃-20℃下搅拌析晶，过滤，干燥即可。
方法一中，步骤(b)中，所述的酸碱中和反应的条件可为有机合成领域此类反应常规的条件。所述的溶剂优选C1-4的醇类溶剂，例如甲醇。所述的甲醇的用量可不作具体限定，只要不影响反应的进行即可。所述的溶剂与如式(II-2)所示的化合物的体积质量比优选5mL/g-15mL/g。所述的碱优选无机碱，例如氢氧化钠。所述的氢氧化钠的用量可不作具体限定，只要能够调节反应体系的pH值至6.0-8.0之间即可。所述的氢氧化钠优选以氢氧化钠溶液的形式加入到反应体系中，所述的氢氧化钠溶液中的溶剂优选C1-4的醇类溶剂，例如甲醇。所述的氢氧化钠溶液中的溶剂用量可不作具体限定，只要不影响反应进行即可。所述的酸碱中和反应的温度优选溶剂回流温度。所述的酸碱中和反应的进程可采用本领域常规的检测方法(例如TLC、GC、HNMR或HPLC等)进行监测，一般以如式(II-2)所示的化合物消失时作为反应的终点。所述的酸碱中和反应的时间优选3-10小时，更优选5小时。
方法一中，步骤(b)中，所述的酸碱中和反应结束后，还可进一步包含后处理的操作。所述的后处理的操作可为有机合成领域后处理常规的操作，本法敏优选包含下列步骤：将酸碱中和反应结束后的反应液，进行固液分离(优选过滤)，除去溶剂(优选减压浓缩)，即可。
方法二中，所述的脱保护反应的条件可为有机合成领域此类反应常规的条件。所述的溶剂优选C1-4的醇类溶剂，例如甲醇。所述的溶剂与如式(II-3)所示的化合物的体积质量比优选10mL/g-100mL/g，更优选50mL/g-60mL/g。所述的钯碳优选质量分数为5％-10％的钯碳，所述的百分比是指钯的质量占钯碳总质量的百分比。所述的脱保护反应的压力优选1-10atm，更优选5atm。所述的脱保护反应的温度优选室温(或常温，即环境温度)。所述的脱保护反应的进程可采用本领域常规的检测方法(例如TLC、GC、HNMR或HPLC等)进行监测，一般以如式(11-3)所示的化合物消失时作为反应的终点。所述的脱保护成盐反应的时间优选5-24小时，更优选8-10小时。
方法二中，所述的脱保护反应结束后，还可进一步包含后处理的操作。所述的后处理的操作可为有机合成领域后处理常规的操作。本发明优选包含下列步骤：将脱保护反应结束后的反应液，除去钯碳和溶剂(例如分别采用过滤和减压浓缩的操作)，即可。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的制备方法成本低，步骤少，操作简单，产品ee值高达99％以上，更适用于工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1、转氨反应
Figure BDA0001070013640000091
将15.0g 3-(3-溴丙基)-4-氧代吡咯烷-1-羧酸乙酯(3-1)加入到400mL蒸馏水中，加20mL的DMSO助溶，搅拌状态下加入R-甲基苄胺10.0g和盐酸将反应液pH调至8.0左右，再加入30.0g的ω-转氨酶和0.08g磷酸吡多醛(PLP)，其中，ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；保持温度25-30℃，pH 8.0左右，反应20小时，TLC原料基本反应完全，停止反应。用浓盐酸将体系pH调至2-3，搅拌后加入硅藻土抽滤，滤饼用水淋洗，滤液用二氯甲烷萃取杂质，水相用30％的氢氧化钠水溶液调节pH至10以上，再用二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩二氯甲烷至干，所得的粗品用硅胶拌样，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5的淋洗液柱层析，得到5.4g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)，收率50.4％，ee值99.0％。1H NMR(400MHz，CDCl3)64.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.52-3.22(m，5H)，2.99(dd，J＝12.1，2.7Hz，1H)，2.64(dd，J＝15.9，6.9Hz，1H)，2.33-2.13(m，1H)，1.84-1.54(m，4H)，1.52-1.35(m，1H)，1.25(td，J＝7.1，3.6Hz，3H)；MS(ESI)m/z＝199(M++1).
2、脱保护
Figure BDA0001070013640000101
向上一步得到5.4g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)中加入50g浓盐酸，升温回流反应24小时，TLC或GC跟踪原料反应完全。降温后减压浓缩水，然后加入30g无水乙醇，冷却至15±5℃搅拌析晶，抽滤，烘干得3.8g盐酸盐。
将盐酸盐加入到30mL甲醇中升温至微回流，保持回流状态下滴加含1.5g氢氧化钠的甲醇溶液，加完后保温回流约5小时，降温，抽滤除盐。所得滤液浓缩掉甲醇，得到2.6g(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)，两步收率38.5％，ee值99.5％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.17(m，1H)，3.04-2.90(m，4H)，2.78(d，1H)，2.61(dt，1H)，2.09(m，1H)，1.88(br，2H)，1.70(m，2H)，1.55(m，1H)，1.44(m，1H)；MS(ESI)m/z＝127(M++1).
实施例2
1、转氨反应
Figure BDA0001070013640000111
将10.0g 3-(3-氯丙基)-4-氧代吡咯烷-1-羧酸乙酯(3-2)加入到300mL蒸馏水中，加15mL的DMSO助溶，搅拌状态下加入4.0g异丙胺和盐酸将反应液pH调至9.0左右，再加入20.0g的ω-转氨酶和0.05g磷酸吡多醛(PLP)，其中，ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示；升温至45-50℃，保持pH在9.0左右，保温反应12小时后，TLC原料基本反应完全，停止反应。用浓盐酸将体系pH调至2-3，搅拌后加入硅藻土抽滤，滤饼用水淋洗，滤液用二氯甲烷萃取杂质，水相用30％的氢氧化钠水溶液调节pH至10以上，再用二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩二氯甲烷至干，所得的粗品用硅胶拌样，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5的淋洗液柱层析，得到5.3g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)，收率62.3％，ee值99.3％。
2、脱保护
Figure BDA0001070013640000112
脱保护的操作以及产品的氢谱数据参见实施例1。上述5.3g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)反应得到3.1g(4aS,7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)，两步收率57％，ee值99.8％。
实施例3
1、转氨反应
Figure BDA0001070013640000121
将20.0g 3-(1-苄基-4-氧化吡咯烷-3-基)丙基甲烷磺酸酯(1-3)加入到600mL蒸馏水中，搅拌状态下加入D-丙胺酸10.0g和氨水将反应液pH调至10.0左右，再加入40g的ω-转氨酶和0.10g磷酸吡多醛(PLP)，其中，ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；升温至45-50℃，保持pH在10.0左右，保温反应2小时后，TLC原料基本反应完全，停止反应。用浓盐酸将体系pH调至2-3，搅拌后加入硅藻土抽滤，滤饼用水淋洗，滤液用二氯甲烷萃取杂质，水相用30％的氢氧化钠水溶液调节pH至10以上，再用二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩二氯甲烷至干，所得的粗品用硅胶拌样，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶8的淋洗液柱层析，得到7.7g油状液体(4aS，7aS)-6-苄基八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(2-2)，收率55.3％，ee值99.1％。
2、脱保护
Figure BDA0001070013640000122
将上步得到7.7g液体(4aS，7aS)-6-苄基八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(2-2)溶解于400mL甲醇中，加入5％的钯碳，在5atm的氢化压力下常温反应8小时，TLC跟踪原料反应完全。过滤除去钯碳，滤液浓缩至干，得3.3g(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)，两步收率41％，ee值99.2％。产品的氢谱数据参见实施例1。
实施例4
1、转氨反应
Figure BDA0001070013640000131
将8.0g 3-(3-氯丙基)-4-氧代吡咯烷-1-羧酸乙酯(3-2)溶解于100mL醋酸异丁酯中，搅拌状态再下加入3.0g异丙胺，24.0g的固定化的ω-转氨酶和0.04g磷酸吡多醛(PLP)，其中，固定化的ω-转氨酶中的ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；升温至45-50℃，保温反应20小时后，TLC原料基本反应完全，停止反应。过滤除去固体固定化酶，浓缩滤液至干，得到4.8g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)，收率70.3％，ee值99.5％。
2、脱保护
Figure BDA0001070013640000132
脱保护的操作以及产品的氢谱数据参见实施例1。上述4.8g油状液体(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯(2-1)反应得到2.7g(4aS，7aS)-八氢-1H-吡咯并[3，4-b]吡啶(I)，两步收率62％，ee值99.9％。
实施例5
Figure BDA0001070013640000133
将5.0g3-(3-溴丙基)-4-氧代吡咯烷-1-羧酸乙酯(3-1)加入到100mL蒸馏水中，加8mL的DMSO助溶，搅拌状态下加入D-丙氨酸3.0g和氨水将反应液pH调至8.0左右，再加入10.0g的ω-转氨酶和0.03g磷酸吡多醛(PLP)，ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；保持温度25-30℃，pH 8.0左右，反应20小时，经TLC及LCMS检测，(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-1-羧酸乙酯收率56.4％，ee值99.2％。
按照实施例5相同操作，但是使用下表所示的转氨酶和氨供体，实验结果如下：
序号 转氨酶 氨供体 反应结果
1 AT-ωTA D-丙氨酸 痕量产物
2 HN-ωTA D-丙氨酸 没有产物
3 TAMV D-丙氨酸 没有产物
4 VfTA31 L-丙氨酸 没有产物
5 VfTA31/W57G L-丙氨酸/异丙胺 痕量产物
6 AC-ωTAmutG L-丙氨酸 没有产物
实施例5中涉及的转氨酶的来源信息如下：
AT-ωTA和HN-ωTA参照
Figure BDA0001070013640000141
M，Schatzle S，Jochens H，Robins K，Bornscheuer UT.Rational assignment of key motifs for function guides insilico enzyme identification.Nat Chem Biol，2010，6：807-813。
TAMV参照G Shin，S Mathew，H Yun.Kinetic resolution of amines by(R)-selective omega-transaminase from Mycobacterium vanbaalenii.Joumal ofIndustrial and Engineering Chemistry，2015，23：128-133。
VfTA31参照US2013089898A1。
VfTA31/W57G参照Cassimjee KE，et al.Chromobacterium violaceumω-transaminase variant Trp60Cys shows increased specificity for(S)-1-phenylethylamine and 4′-substituted acetophenones，and followS Swain-Luptonparameterisation.Org Biomol Chem，2012，10(28)：5466-5470。
AC-ωTAmut6参照AR Martin，et al.Improved activity and thermostabilityof(S)-aminotransferase by error-prone polymerase chain reaction for theproduction of a chiral amine.Biochemical Engineering Joumal，2007，37：246-255。
实施例6
1、菌种构建
根据SEQ ID NO.4-6核酸序列进行全基因合成，两端设计限制性内切酶位点NdeI和BamHI，亚克隆到表达载体pET24a(Novagen)的相应位点上，获得的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)进行表达。
全基因合成和克隆均委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
2、菌体发酵和制备
配制培养基：LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2)；TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L，pH 7.0-7.5)。培养基TB分装于500mL三角摇瓶，装液量100mL，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌20min。摇瓶培养条件：将构建好的菌种分别接种到含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm培养16h后，按1％接种量接种到新鲜TB培养基中(含100μg/mL卡那霉素)，37℃220rpm培养至OD600＝5-6，加入终浓度为0.3mM IPTG，28℃诱导16h左右。
发酵液于4℃、4000rpm离心30min后弃上清收集菌体，冻于-20℃备用。
Figure IDA0001070013700000011
Figure IDA0001070013700000021
Figure IDA0001070013700000031
Figure IDA0001070013700000041
Figure IDA0001070013700000051
Figure IDA0001070013700000061
Figure IDA0001070013700000071
Figure IDA0001070013700000081
Figure IDA0001070013700000091
Figure IDA0001070013700000101
Figure IDA0001070013700000111
Figure IDA0001070013700000121

Claims (10)

1.一种如式(II)所示的化合物(4aS,7aS)-八氢-1H-吡咯并[3,4-b]吡啶的制备方法，其特征在于，其包含下列步骤：溶剂中，在ω-转氨酶和氨供体的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如下所示的转氨反应，制得如式(II)所示的化合物；所述的ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
Figure FDA0003708899250000011
其中，X为氯、溴、碘或甲磺酸酯；
R为C1-4烷氧羰基或苄基；
所述的溶剂为水和/或有机溶剂，所述的有机溶剂为亚砜类溶剂和/或醋酸酯类溶剂；
所述的氨供体根据转氨酶的种类确定；
所述的转氨反应在辅酶的存在下进行；所述的辅酶为磷酸吡哆醛。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的ω-转氨酶为ω-转氨酶的固体形式。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的溶剂与如式(III)所示的化合物的体积质量比为15-50mL/g；
所述的氨供体为异丙胺、手性甲基苄胺和D-丙氨酸中的一种或多种；
所述的氨供体与如式(III)所示的化合物的质量比为0.1:1-1:1；
所述的转氨反应的温度为20℃-55℃。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述的溶剂与如式(III)所示的化合物的体积质量比为25-35mL/g；
所述的氨供体与如式(III)所示的化合物的质量比为0.3:1-0.8:1；
所述的转氨反应的温度为45℃-55℃。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的转氨反应在反应体系的pH值为8.0-10.0的条件下进行。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶与如式(III)所示的化合物的质量比为0.001:1-0.01:1。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶与如式(III)所示的化合物的质量比为0.005:1-0.006:1。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的如式(II)所示的化合物的制备方法包括下列步骤：溶剂中，在pH值为8.0-10.0条件下，在ω-转氨酶、氨供体和辅酶的作用下，将如式(III)所示的化合物进行所述的转氨反应，即可。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的如式(II)所示的化合物的制备方法包括下列步骤：将溶剂和如式(III)所示的化合物的混合液，与氨供体混合，调节反应体系pH值至8.0-10.0之间，再与ω-转氨酶和辅酶混合，进行所述的转氨反应。
10.一种如式(I)所示的化合物(4aS,7aS)-八氢-1H-吡咯并[3,4-b]吡啶的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：
(1)溶剂中，ω-转氨酶和氨供体的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如下所示的转氨反应，制得如式(II)所示的化合物；所述的ω-转氨酶的氨基酸序列如序列表Seq IDNO.1或SEQ ID NO.2所示；
(2)将如式(II)所示的化合物进行如下所示的脱保护反应，即可；
Figure FDA0003708899250000021
其中，X为氯、溴、碘或甲磺酸酯；R为C1-4烷氧羰基或苄基；步骤(1)中，所述的转氨反应的条件同权利要求1-9任一项所述。
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