CN110004162B - 一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用 - Google Patents

一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用，将化学法和酶法技术相结合，开发出一条反应条件温和，生产安全，反应收率高，三废排放少，反应后处理简单，易于实现工业化生产的技术。此外，对生物催化所需的酶通过基因工程技术构建得到串联表达重组菌株，实现一菌双酶表达的效果，大大减少了规模化生产中酶的生产成本。

Description

一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的 应用
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体地说涉及一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用。
背景技术
哮喘是最常见的呼吸道疾病，是由于过敏、循环系统或肺的充血、支气管水肿、肾或心脏的疾患以及中枢神经系统的激动等各种病因引起的疾病。多表现为发作性咳嗽、胸闷及呼吸困难。
盐酸甲氧那明，具有松弛支气管平滑肌解除支气管痉挛的作用。其平喘作用强于麻黄碱，中枢兴奋及心血管方面则较弱。在临床上主要以复方制剂用于支气管哮喘特别是不能耐受麻黄碱者。它的结构式如下：
Figure BDA0002023401880000011
盐酸甲氧那明为β肾上腺素受体激动药，目前盐酸甲氧那明原料药在中国市场上的售价比较昂贵，制备盐酸甲氧那明的传统方法以邻甲氧基苯甲醛为起始原料，在碱性条件下与硝基乙烷缩合，然后用铁与三氯化铁的化合物在盐酸作用下还原成邻甲氧基苯丙酮，最后加入甲胺的盐酸盐，用硼氢化钠还原胺化，得到盐酸甲氧那明。该工艺用到的原料硝基乙烷以及催化剂氧化铂均价格较贵，而三氯化铁和铁的使用将产生大量的废水、废渣，对环境危害较大。
国外目前的报道的合成方法多采用金属催化氢化反应：Heinzelman R.V.报道了一种合成方法(Journal of the American Chemical Society，1953，75：921-5)，2-甲氧基苯基丙酮，用氧化铂作催化剂，甲胺溶于甲醇中(7.7％浓度)，在三个大气压的条件下加压氢化反应1～3小时，产物2-甲氧基苯基异丙醇的收率80％。ZenichiH等报道了另外的一个合成方法(Yakugaku Zasshi，1957，77：256-8.)，2-甲氧基苯基丙酮3g和20g30％的甲胺甲醇溶液，在雷尼镍和二氯化铂的催化氢化下得到1.6g产物2-甲氧基苯基异丙醇，收率为40％。上述用2-甲氧基苯丙酮和甲胺甲醇反应的方法中，要用到氧化铂，二氯化铂，钯碳作为催化剂，价格昂贵，会显著增加生产成本，且加氢过程易燃易爆，危险性较高。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种多克隆位点编码的分离的基因片段，本发明另一个目的是前述基因片段编码的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物，本发明再一个目的是提供包含前述核酸的串联重组表达载体，本发明再一个目的是提供前述串联重组表达载体的转化体；本发明再一个目的是提供前述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用，本发明再一个目的是提供前述转化体的制备方法及通过该方法制备获得的氧化还原酶粗酶液。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种分离的基因片段，该基因片段同时包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，第二核苷酸序列为sEQID NO.4。
所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌Novosphingobium aromaticivorans DSM12444的还原酶SDR(GenBank：CP000677.1)；
所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属Rhodococcus sp.M8的甲醇脱氢酶ADH(GenBank：OLL16747.1)，其兼具羰基还原酶的活性；
所述SEQ ID NO.3来源于类高加索酸奶乳杆菌Lactobacillus parakefiriDSM10551的r-型特异性的甲醇脱氢酶rADH(GenBank：KRL73676.1)，其兼具羰基还原酶的活性；
所述SEQ ID NO.4来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶GDH(GenBank：BAA09024.1)。
所述基因片段编码获得了对应第一核苷酸序列的第一氨基酸序列，以及对应第二核苷酸序列的第二氨基酸序列，形成同时包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物。
因此，本发明涉及的是三组同时含有编码GDH核苷酸序列的基因片段，及其对应的三种羰基还原酶，但不限于这三组基因片段。
本发明提供的一种串联重组表达载体，其包含前述分离的基因片段。优选地，其为含有两个多克隆位点的大肠杆菌，选自包括但不限于pRSFDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCOLADuet-1中的任意一种，优选用pRSFDuet-1作为表达载体，该载体在酶液大规模生产过程中，菌体在卡那霉素抗性下生长较其他的抗性好。
利用上述串联重组表达载体，利用本领域熟知的方法，通过转化感受态宿主细胞制备获得串联重组表达载体的转化体。所述宿主细胞选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等，优选用BL21(DE3)作为宿主细胞。
前述的串联重组表达载体的转化体即用于发酵获得所述重组羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物的工程菌株。利用本领域熟知的方法，通过培养和诱导产酶，收集菌体，破碎获得含有重组羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物的上清液，可直接应用于工业生产，也可通过简单的分离纯化方法适当除杂，再投入工业生产，但考虑到蛋白酶在纯化过程中会导致蛋白含量的损失，且投入的人力、设备成本较高，因此可利用上述氧化还原酶粗酶液直接应用于盐酸甲氧那明关键中间体生物催化反应的生产。
本发明所述串联重组表达载体的转化体优选为基于pRSFDuet-1质粒构建的大肠杆菌串联重组表达菌株，其具体的制备方法包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增获得第一核苷酸序列，其编码对应SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3任意一个氨基酸序列；通过PCR扩增获得编码对应SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列；
(2)将第一核苷酸序列与预先用Ncol和Notl双酶切的pRSFDuet-1质粒进行同源重组，再用Ndel和Xhol双酶切，纯化后与第二核苷酸序列连接，获得串联重组质粒；
(3)将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株。
其中，扩增第一核苷酸序列的引物选自：
SDR-P：5′-taataaggagatataccatggcaCCGCTTGAAATGACGATTGC-3′，
SDR-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTCAGACCTGGCTGAAGCCGC-3′；
ADH-P：5′-taataaggagatataccatggcaAAAGCGGTGCAGTATACGG-3′，
ADH-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTTACGGCACGACAACGCCGCGAC-3′；
rADH-P：5′-taataaggagatataccatggcaACTGATCGTCTGAAGGGCAAAG-3′，
rADH-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTTACTGTGCGGTAAACCCGCCG-3′；
扩增第二核苷酸序列的引物为：
GDH-P：5′-gtataagaaggagatatacatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3′，
GDH-R：5′-ggtttctttaccagactcgagTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3’。
对于上述方法制备获得的大肠杆菌串联重组表达菌株，可通过常规的方法进行耐药性筛选并诱导生产获得含有羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液。对于本发明以pRSFDuet质粒构建的工程菌株，优选的制备方法是：挑取上述大肠杆菌串联重组表达菌株的单菌落，接入含有卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；再将过夜培养物接种于含有卡那霉素的TB培养基中震荡培养，至发酵液OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG诱导培养，发酵后离心收集菌体，PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎后再离心，收集上清液，获得氧化还原酶粗酶液。
利用上述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物，或利用上述含有羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物的氧化还原酶粗酶液，可用于羰基还原为羟基的反应，尤其适合制备盐酸甲氧那明中羰基还原的工艺。其中葡萄糖脱氢酶GDH属于催化反应的供氢酶，分别与还原酶SDR、甲醇脱氢酶ADH、甲醇脱氢酶rADH这三个还原酶联合催化，形成对下式化合物I的生物催化还原反应。
盐酸甲氧那明的工艺路线如下：
Figure BDA0002023401880000041
其中，化合物I(2-甲氧基苯丙酮)制备获得化合物II(2-甲氧基苯基异丙醇)，现有技术用氧化铂作催化剂，甲胺溶于甲醇中，加压氢化反应获得化合物II，收率为80％；也有通过甲胺甲醇溶液在雷尼镍和二氯化铂的催化氢化下获得化合物II，收率为40％。利用本发明生物酶催化的方法获得化合物II的收率不低于86％。
本发明利用上述重组羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的组合物作为生物酶制剂催化化合物I得到2-甲氧基苯基异丙醇，再经羟基保护、甲基氨基化并去保护、通入HCI气体获得盐酸甲氧那明。将化学法和酶法技术有利相结合，开发出一条反应条件温和，生产安全，反应收率高，三废排放少，反应后处理简单，易于实现工业化生产的技术。此外，对生物催化所需的酶通过基因工程技术构建得到串联表达重组菌株，实现一菌双酶表达的效果，大大减少了规模化生产中酶的生产成本。
附图说明
图1是本发明脱氢酶SDR-GDH的质粒图谱；
图2是本发明脱氢酶ADH-GDH的质粒图谱；
图3是本发明脱氢酶rADH-GDH的质粒图谱；
图4是本发明实施例5中2-甲氧基苯基异丙醇的HCLP质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。
实施例1
一种分离的基因片段，该基因片段同时包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，第二核苷酸序列为SEQID NO.4。
因此，该基因片段为包括以下三种方式：
(1)SDR-GDH基因：同时含有SEQ ID NO.1的第一核苷酸序列、以及SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列，SEQ ID NO.1所示序列来源于新鞘脂菌Novosphingobiumaromaticivorans DSM12444的还原酶SDR(GenBank：CP000677.1)，SEQ ID NO.4所示序列来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶GDH(GenBank：BAA09024.1)；
(2)ADH-GDH基因：同时含有SEQ ID NO.2的第一核苷酸序列、以及SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列，SEQ ID NO.2所示序列来源于红球菌属Rhodococcussp.M8的甲醇脱氢酶ADH(GenBank：OLL16747.1)，SEQ ID NO.4所示序列来源于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的葡萄糖脱氢酶GDH(GenBank：BAA09024.1)；
(3)rADH-GDH基因：同时含有SEQ ID NO.3的第一核苷酸序列、以及SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列，SEQ ID NO.3所示序列来源于类高加索酸奶乳杆菌Lactobacillusparakefiri DSM10551的r-型特异性的甲醇脱氢酶rADH(GenBank：KRL73676.1)，SEQ IDNO.4所示序列来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶GDH(GenBank：BAA09024.1)。
上述三种基因片段编码获得了对应的羰基还原酶重组蛋白，其对应地包含第一核苷酸序列编码的第一氨基酸序列，以及第二核苷酸序列编码的第二氨基酸序列。
为此，分别以上述三种微生物的基因组为模板，用以下引物进行PCR扩增，先获得分离的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。
还原酶SDR扩增片段SEQ ID NO.1的引物为：
SDR-P：5′-taataaggagatataccatggcaCCGCTTGAAATGACGATTGC-3′，
SDR-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTCAGACCTGGCTGAAGCCGC-3′；
甲醇脱氢酶ADH扩增片段SEQ ID NO.2的引物为：
ADH-P：5′-taataaggagatataccatggcaAAAGCGGTGCAGTATACGG-3′，
ADH-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTTACGGCACGACAACGCCGCGAC-3′；
r-型特异性的甲醇脱氢酶rADH扩增片段SEQ ID NO.3的引物为：
rADH-P：5′-taataaggagatataccatggcaACTGATCGTCTGAAGGGCAAAG-3′，
rADH-R：5′-cgacttaagcattatgcggccgcTTACTGTGCGGTAAACCCGCCG-3′；
葡萄糖脱氢酶GDH扩增片段SEQ ID NO.4的引物为：
GDH-P：5′-gtataagaaggagatatacatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3′，
GDH-R：5′-ggtttctttaccagactcgagTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3′。
其中，引物SDR-P、ADH-P、rADH-P的下划线部分为Ncol酶切位点；SDR-R、ADH-R、rADH-R的下划线部分为Notl酶切位定。GDH-P下划线部分为Ndel酶切位点，GDH-R下划线部分为Xhol酶切位点。
大写的碱基序列为目标序列的核苷酸，小写的碱基序列为线性化载体酶切位点5′端末端序列。
将第一核苷酸序列与预先用Ncol和Notl双酶切的pRSFDuet-1质粒进行同源重组，再用Ndel和Xhol双酶切，纯化后与第二核苷酸序列连接，获得下述实施例2～4的串联重组质粒。
实施例2串联重组质粒pRSFDuet-SDR-GDH及其转化体
如图1所示，PCR获得SEQ ID NO.1所示的SDR和SEQ ID NO.4所示的GDH片段，通过同源重组先构建pRSFDuet-SDR重组质粒，此重组质粒再与GDH同源重组，获得pRSFDuet-SDR-GDH串联重组质粒。
将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株BL21(DE3)/pRSFDuet-SDR-GDH。
实施例3串联重组质粒pRSFDuet-ADH-GDH及其转化体
如图2所示，PCR获得SEQ ID NO.2所示的ADH和SEQ ID NO.4所示的GDH片段，通过同源重组先构建pRSFDuet-ADH重组质粒，此重组质粒再与GDH同源重组，获得pRSFDuet-ADH-GDH串联重组质粒。
将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株BL21(DE3)/pRSFDuet-ADH-GDH。
实施例4串联重组质粒pRSFDuet-rADH-GDH及其转化体
如图3所示，PCR获得SEQ ID NO.3所示的rADH和SEQ ID NO.4所示的GDH片段，通过同源重组先构建pRSFDuet-rADH重组质粒，此重组质粒再与GDH同源重组，获得pRSFDuet-rADH-GDH串联重组质粒。
将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株BL21(DE3)/pRSFDuet-rADH-GDH。
实施例5盐酸甲氧那明合成路线中SDR-GDH粗酶液催化合成2-甲氧基苯基异丙醇
在圆底烧瓶中加入100g底物2-甲氧基苯丙酮，1700mL水，165g葡萄糖，250mg NAD，用质量分数20％的碳酸钠溶液调节pH在7.0，保持温度在35℃，充分搅拌溶解后加入4％实施例2获得的SDR-GDH粗酶液，反应过程中用质量分数20％的碳酸钠溶液控制pH在7.0。经检测反应12小时底物已耗尽，5000rpm离心15min，取上层清液，弃去酶渣。用DCM萃取清液3次，每次200mL，合并有机相，用无水硫酸钠干燥2小时。随后减压旋干并回收DCM，得到淡黄色油状物86.21g，产率达到86.21％，HPLC检测纯度达到99.49％(如图4所示)。
核磁确证：1H-NMR(CDCl3，ppm)2.122(s，3H，COCH3)，3.663(s，2H，COCH2)，3.903(s，3H，OCH3)，6.865-6.938(m，2H，ArH)，7.11(dd，J＝1.6Hz，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.25(dt，J＝1.6Hz，8Hz，1H，ArH)。
实施例6盐酸甲氧那明合成路线中ADH-GDH粗酶液催化合成2-甲氧基苯基异丙醇
本实施例的方法与实施例5基本相似，其区别在于，选用的粗酶液为实施例3获得的ADH-GDH粗酶液，得到产品2-甲氧基苯基异丙醇(II)，产率达到88.13％，HPLC检测纯度达到99.51％。
实施例7盐酸甲氧那明合成路线中rADH-GDH粗酶液催化合成2-甲氧基苯基异丙醇
本实施例的方法与实施例5基本相似，其区别在于，选用的粗酶液为实施例4获得的rADH-GDH粗酶液，得到产品2-甲氧基苯基异丙醇(II)，产率达到87.35％，HPLC检测纯度达到99.42％。
实施例8盐酸甲氧那明合成工艺
Figure BDA0002023401880000081
(1)化合物vI→化合物I
室温下，1L三口瓶中加入459g(4.5mol)醋酐，300g(1.8mol)邻甲氧基苯乙酸(IV)，搅拌并升温至60℃，滴加29.5g(0.36mol)N-甲基咪唑，滴毕，升温至130℃回流5h，停止反应。减压蒸馏回收过量的醋酐，冷却至室温，加入300mL质量分数30％的NaOH，搅拌30min后，加入二氯甲烷萃取3次(200mL×3)，合并的有机层用100mL2mol/L的HCl洗涤后，常压蒸馏回收二氯甲烷，然后减压蒸馏，收集80～90℃(2kPa)的馏分，得231.5g邻甲氧基苯丙酮(I)。产率79.22％，HPLC检测纯度≥98.86％。核磁确证：1H-NMR(CDCl3，ppm)1.21(s，3H)，2.05(br，1H)，2.721(dd，J＝7.6 Hz，13.6Hz，1H)，2.845(dd，J＝4.6 Hz，13.6Hz，1H)，3.821(s，3H)，4.030-4.076(m，1H)，6.857-6.924(m，2H)，7.128-7.248(m，2H)。
(2)化合物I→化合物II
以实施例5、实施例6、实施例7任意一种羰基还原酶，对底物化合物I进行催化获得化合物II。
(3)化合物II→化合物Iv
取2-甲氧基苯丙醇50g，三乙胺36.5g(1.2eq)，500mL干燥的DCM，0℃氮气保护环境下搅拌15min，滴加TsCl 68g(1.2eq)，继续搅拌30min后恢复常温并搅拌8h。反应完毕后，用饱和碳酸氢钠溶液清洗2次，每次200mL。取有机相，旋干DCM，得到油状中间体(IV)78.2g，收率81.21％。
(4)化合物Iv→化合物III
取上述中间体粗品(IV)50g，100mL DMF，对甲苯磺酸32g(1.2eq)，质量分数33％的甲胺乙醇溶液8g(1.5eq)，60℃回流24h。反应完毕后，加入200mL碳酸钠溶液水洗，随后200mL DCM萃取2次，合并有机相。旋干DCM，残留物进行减压蒸馏，收集110～120℃(2kPa)的馏分，得到32.2g邻甲氧基苯丙甲胺(III)粗品，为淡黄色液体，收率79.32％，HPLC检测纯度达到80.15％。核磁确证：1H-NMR(400MHz，DMSO)d：1.24(d，J＝8.0Hz，3H，CH3)，2.53(dd，J1＝10.0Hz，J2＝6.0Hz，Ha，CH2)2.79(dd，J1＝10.0Hz，J2＝6.0Hz，Hb，CH2)，3.20(m，1H，CH)，3.81(s，3H，CH3)，6.89～7.21(m，4H，Ar-H)；13C-NMR(100MHz，DMSO)d：20.8，33.7，38.5，56.1，59.5，112.4，121.3，127.0，127.7，130.6，158.7。
(5)化合物III→化合物v
方法A：在1L三口瓶中加入90g邻甲氧基苯丙甲胺(III)粗品、500mL无水丙酮，0～5℃下通入HCl气体2h，有白色沉淀产生，抽滤，用丙酮洗涤，滤饼用乙醇甲苯混合溶剂重结晶，得78.9g盐酸甲氧那明(V)，收率72.25％，HPLC检测纯度达到99.53％。
方法B：将得到的盐酸甲氧那明(V)粗品90g，滤饼用乙醇重结晶，得到盐酸甲氧那明(V)纯品58.12g，收率64.32％，HPLC检测纯度达到99.11％。核磁确证：1H-NMR(D2O，ppm)1.16(d，J＝6.8Hz，3H，)，2.597(s，3H)，2.839(dd，J＝6.8Hz，14Hz，1H)，2.932(dd，J＝6.4Hz，14Hz，1H)，3.45(m，1H)，3.765(s，3H)，6.922(t，J＝7.6Hz，1H)，6.985(d，J＝6.8Hz，，1H)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H)，7.281(t，J＝8.0Hz，1H)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 长兴制药股份有限公司
<120> 一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用
<130> 19WS2V0070015
<141> 2019-04-10
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 792
<212> DNA
<213> Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444
<400> 1
atgccgcttg aaatgacgat tgctctcaac aatgtggtcg ccgtcgtcac cggcgcggcg 60
ggaggcatcg gccgcgaact ggtcaaggcg atgaaggccg ccaacgccat cgtcatcgcc 120
accgacatgg cgccctcggc cgatgtcgaa ggcgcggacc attatctcca gcacgacgtg 180
acgagcgagg ccggctggaa ggcggtcgcg gcactggccc aggaaaagta cgggcgcgtc 240
gatgcgctgg tgcacaacgc gggcatctcg atcgtcacga agttcgaaga cactccgctg 300
tccgatttcc accgcgtgaa cacggtcaac gtcgattcca tcatcatcgg tacgcaggtc 360
ctgctgccgc tgctcaagga aggcggcaag gcgcgcgcag ggggcgcctc ggtggtcaac 420
ttctccagcg tcgcgggtct gcgcggcgcg gcgttcaatg cggcctattg caccagcaag 480
gcggcggtga agatgctctc gaagtgcctc ggcgcggaat tcgcggcgct cggctacaac 540
atccgcgtca actccgtgca tccgggcggc atcgataccc cgatgctcgg ctcgctgatg 600
gacaagtacg tcgaactcgg cgctgccccc tcgcgcgagg tggcccaggc cgcgatggaa 660
atgcgccacc cgatcggtcg catgggtcgc cctgccgaaa tgggcggcgg cgtggtctat 720
ctctgctccg acgcagcaag cttcgtcacc tgcacggaat tcgtgatgga cggcggcttc 780
agccaggtct ga 792
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Rhodococcus sp. M8
<400> 2
atgaaagcgg tgcagtatac ggaaattggt tcagaaccgg tggttgtcga tatcccgacc 60
ccgacgccgg gtccgggtga aattctgctg aaagtgaccg cggccggcct gtgtcattcg 120
gacatctttg ttatggatat gccggcagct caatatgcat acggtctgcc gctgacgctg 180
ggtcacgagg gtgtgggtac cgttgcggaa ctgggcgaag gtgtgaccgg cttcggtgtt 240
ggcgatgccg ttgcagtcta tggtccgtgg ggttgcggtg catgtcatgc ttgcgcacgt 300
ggtcgcgaaa actactgcac gcgtgcggcc gatctgggta ttaccccgcc gggtctgggt 360
agcccgggtt ctatggccga atatatgatt gtggacagtg cacgccatct ggttccgatc 420
ggtgacctgg atccggtggc agctgcaccg ctgacggatg ctggtctgac cccgtaccac 480
gcgattagtc gtgttctgcc gctgctgggt ccgggttcca ccgcagtggt tatcggtgtc 540
ggcggtctgg gtcacgtggg cattcagatc ctgcgtgctg tgagtgccgc acgcgtcatt 600
gccgtggatc tggatgacga tcgtctggca ctggcacgtg aagttggtgc agatgctgcg 660
gtcaaatccg gtgctggtgc agcagacgca attcgtgaac tgacgggcgg tcagggtgct 720
<210> 3
<211> 1038
<212> DNA
<213> Lactobacillus parakefiri DSM 10551
<400> 3
atgaaagcgg tgcagtatac ggaaattggt tcagaaccgg tggttgtcga tatcccgacc 60
ccgacgccgg gtccgggtga aattctgctg aaagtgaccg cggccggcct gtgtcattcg 120
gacatctttg ttatggatat gccggcagct caatatgcat acggtctgcc gctgacgctg 180
ggtcacgagg gtgtgggtac cgttgcggaa ctgggcgaag gtgtgaccgg cttcggtgtt 240
ggcgatgccg ttgcagtcta tggtccgtgg ggttgcggtg catgtcatgc ttgcgcacgt 300
ggtcgcgaaa actactgcac gcgtgcggcc gatctgggta ttaccccgcc gggtctgggt 360
agcccgggtt ctatggccga atatatgatt gtggacagtg cacgccatct ggttccgatc 420
ggtgacctgg atccggtggc agctgcaccg ctgacggatg ctggtctgac cccgtaccac 480
gcgattagtc gtgttctgcc gctgctgggt ccgggttcca ccgcagtggt tatcggtgtc 540
ggcggtctgg gtcacgtggg cattcagatc ctgcgtgctg tgagtgccgc acgcgtcatt 600
gccgtggatc tggatgacga tcgtctggca ctggcacgtg aagttggtgc agatgctgcg 660
gtcaaatccg gtgctggtgc agcagacgca attcgtgaac tgacgggcgg tcagggtgct 720
accgcggttt ttgacttcgt cggcgcacaa agcacgatcg ataccgccca gcaagtcgtg 780
gcagtggacg gtcatatttc tgttgtcggt atccatgccg gcgcacacgc taaagttggc 840
tttttcatga tcccgtttgg cgcgtcagtg gttacgccgt attggggtac ccgttcggaa 900
ctgatggaag tcgtggcact ggcacgtgca ggtcgtctgg atattcacac cgaaacgttc 960
accctggacg aaggtccggc tgcataccgt cgtctgcgtg aaggttctat ccgtggtcgc 1020
ggcgttgtcg tgccgtaa 1038
<210> 4
<211> 786
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg ggataaagct gatgacacga acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540
attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600
gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660
ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720
ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acactatatc cttcattcca ggcaggccgc 780
ggttaa 786

Claims (9)

1.一种分离的基因片段，其特征在于：该基因片段同时包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，第二核苷酸序列为SEQ IDNO.4；所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444，所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属（Rhodococcus sp.）M8。
2.如权利要求1所述基因片段编码的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物。
3.一种串联重组表达载体，其包含权利要求1所述的基因片段。
4.包含权利要求3所述串联重组表达载体的转化体。
5.权利要求2所述组合物在制备盐酸甲氧那明关键中间体上的应用。
6.一种大肠杆菌串联重组表达菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）通过PCR扩增获得第一核苷酸序列，选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的任意一个核苷酸序列；通过PCR扩增获得SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列；所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444，所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属（Rhodococcus sp.）M8；
（2）将第一核苷酸序列与预先用NcoI和NotI双酶切的pRSFDuet-1质粒进行同源重组，再用NdeI和XhoI双酶切，纯化后与第二核苷酸序列连接，获得串联重组质粒；
（3）将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
扩增第一核苷酸序列的引物为：
SDR-P：5’-taataaggagatataccatggcaCCGCTTGAAATGACGATTGC-3’，
SDR-R：5’-cgacttaagcattatgcggccgcTCAGACCTGGCTGAAGCCGC-3’；或
ADH-P：5’-taataaggagatataccatggcaAAAGCGGTGCAGTATACGG-3’，
ADH-R：5’-cgacttaagcattatgcggccgcTTACGGCACGACAACGCCGCGAC-3’；
扩增第二核苷酸序列的引物为：
GDH-P：5’-gtataagaaggagatatacatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3’，
GDH-R：5’-ggtttctttaccagactcgagTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3’。
8.一种氧化还原酶粗酶液，其特征在于通过如下方法制备获得：
挑取权利要求7所述方法制备获得的大肠杆菌串联重组表达菌株的单菌落，接入含有卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；再将过夜培养物接种于含有卡那霉素的TB培养基中震荡培养，至发酵液OD600达到0.6~0.8时，加入IPTG诱导培养，发酵后离心收集菌体，PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎后再离心，收集上清液，获得氧化还原酶粗酶液。
9.一种生物催化制备盐酸甲氧那明的方法，其特征在于：以2-甲氧基苯丙酮为底物，投入质量比1%~10%的权利要求8所述的氧化还原酶粗酶液，30~37℃下反应1~24小时，分离纯化获得2-甲氧基苯基异丙醇，再经羟基保护、甲基氨基化并去保护、通入HCl气体获得盐酸甲氧那明。
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