CN103205470B - 一种短链脱氢酶TsrU的功能及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短链脱氢酶TsrU的功能及其应用。具体地,短链脱氢酶TsrU能够催化4-乙酰-2-喹啉酸或其类似物发生羰基的手性单一还原反应,可以在体外高效生产4-(1-羟甲基)-2-喹啉酸或其结构类似物,并且在硫链丝菌素生物合成的侧链反应中,该酶对底物具有很大的容忍性,可广泛应用于其他类似底物的手性还原反应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和工程领域,具体地,涉及一种短链脱氢酶TsrU的功能及其应用。
背景技术
硫肽类抗生素是一类富含硫元素的氨基酸残基被高度修饰的环肽类化合物。硫肽类抗生素具有一个三或四取代的吡啶核心,多个噻唑、噁唑或噻唑啉等氮杂环及脱水氨基酸,有的还带有高度修饰的芳香环侧链。大部分的硫肽类抗生素大都可以抑制革兰氏阳性菌的生长,对多种耐药性的条件致病菌具有较强的杀伤作用。硫肽类抗生素作用机制是通过与核糖体结合,从而抑制蛋白质的合成来实现的。根据结合位点的不同,作用机制可分为两类:(1)与50S核糖体亚单元上的23SrRNA-L11蛋白复合物结合,抑制延长因子的GTPase活性,从而抑制蛋白质的合成;(2)与延长因子Tu蛋白复合物结合,抑制Ef-Tu·GTP·aa-tRNA复合物的形成,从而抑制蛋白质的合成。
硫链丝菌素(Thiostrepton)是硫肽类抗生素家族的成员,虽然首次发现硫链丝菌素是在1954年,但是由于其结构复杂,直到1989年才借助X晶体衍射技术才确定了其分子结构。目前对硫链丝菌素生物合成基因簇已经做了一定的研究,例如通过将基因簇中鉴定出的相应基因的编码蛋白与数据库中的已知蛋白作比较,推测其功能,并在此基础上初步建立了硫链丝菌素的生物合成途径。然而由于硫链丝菌素的侧链生物合成途径十分特异,合成底物经历多个酶的连续反应,才得到特殊的喹啉酸单元。
目前,硫链丝菌素生物合成途径及其次生代谢产物的生物合成过程还是未知的,因此本领域迫切需要解析各类与硫链丝菌素代谢途径有关的过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种短链脱氢酶TsrU的功能。
本发明的另一目的是提供短链脱氢酶TsrU的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种短链脱氢酶TsrU的用途,它用于催化下述还原反应:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
在另一优选例中,R为CF3。
在另一优选例中,R1为甲基。
在另一优选例中,R为F;R1为CH3;n为1。
在另一优选例中,所述反应是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
在另一优选例中,所述反应不是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
在另一优选例中,所述的短链脱氢酶TsrU来自于劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentii)。
在另一优选例中,所述的短链脱氢酶TsrU选自下组:
(1)具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽;
(2)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,具有催化活性的衍生多肽。
在另一优选例中,所述的短链脱氢酶TsrU是由具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列所编码的多肽。
在另一优选例中,所述的短链脱氢酶TsrU为分离的或重组的。
在另一优选例中,所述的短链脱氢酶TsrU是在大肠杆菌中表达的来自劳伦链霉菌Streptomyceslaurentii的重组蛋白。
在本发明的第二方面,提供了一种催化方法,包括步骤:
(i)在辅酶存在的条件下,用短链脱氢酶TsrU催化式I化合物发生还原反应,从而形成式II化合物:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
在另一优选例中,所述的辅酶为NADPH或NADH。
在另一优选例中,在步骤(i)中,将短链脱氢酶TsrU与NADPH、式I化合物混合,从而进行反应。
在另一优选例中,步骤(i)中,在具有以下至少一个或多个特征的反应体系中进行反应:
(a)短链脱氢酶TsrU的浓度为0.001-1mg/ml;
(b)反应pH为4.5-9.0;
(c)反应温度为15-45℃;
(d)辅酶浓度为0.01-50mM。
在另一优选例中,短链脱氢酶TsrU的浓度为约0.01-0.8mg/ml,较佳地为约0.05-0.5mg/ml。
在另一优选例中,反应pH为约7.0。
在另一优选例中,反应温度为约30℃。
在另一优选例中,辅酶浓度为约0.05-10mM,较佳地为约0.1-5mM。
在另一优选例中,式I化合物是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
在另一优选例中,所述式I化合物不是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
在本发明的第三方面,提供了一种短链脱氢酶TsrU的用途,它被用作催化下述还原反应的催化剂:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1表示部分反应底物的结构。
图2显示了纯化后的TsrU蛋白SDS-PAGE鉴定结果,泳道1为标准蛋白分子量泳道,泳道2为TsrU蛋白泳道。
图3表示TsrU催化4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为4-(1-羟乙基)-6-氟-2-喹啉酸标准品,ii为4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸标准品,iii为反应开始第0分钟,iv为反应开始第5分钟,v为反应开始第15分钟。
图4表示TsrU催化4-乙酰-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸标准品,ii为4-乙酰-2-喹啉酸标准品,iii为反应开始第0分钟,iv为反应开始第5分钟,v为反应开始第15分钟。
图5表示TsrU催化4-乙酰-8-氟-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii4-(1-羟乙基)-8-氟-2-喹啉酸标准品。
图6表示TsrU催化4-乙酰-7-氟-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii4-(1-羟乙基)-7-氟-2-喹啉酸标准品。
图7表示TsrU催化4-乙酰-6-氯-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii4-(1-羟乙基)-6-氯-2-喹啉酸标准品。
图8表示TsrU催化4-乙酰-6-溴-2-喹啉酸还原的HPLC分析,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii4-(1-羟乙基)-6-溴-2-喹啉酸标准品。
符号说明
图1中TFA为三氟乙酸。
图2中KD为千道尔顿。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,短链脱氢酶TsrU能够催化下述反应:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
所述反应可以在体外高效生产具有式II所示结构的化合物,并且参与硫链丝菌素生物合成的侧链反应。
TsrU基因及蛋白
如本文所用,术语“本发明蛋白”、“TsrU蛋白”、“TsrU多肽”或“TsrU肽”可互换使用,本发明所指的TsrU蛋白包括:完整的TsrU蛋白、或其突变体、或其活性片段。
在本发明的一个优选例中,具有活性的TsrU蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示,其序列为:
VTAPALPLAGQVALVTGAGRGIGRMVAVALAEAGMTVGLVGRNRRLLDVTARACAAAREAASGDGSGDGSGGGPEAGVAVAVADVRAPAEIREAAEAVRAALGPVDLLVNNAGLVDQGELPFWEADPERWWEVFETNVRGTVNTCRAVLPEMTRRGSGRVVNVNSRLAVQGDPRYSAYCGSKATLLALDAVAAEPLRDRGVHLFDISPGMVRTDMTLSMAVCAGRDDWTDPALFLAAILRVAHGDLDPLAGRFLHVGADDFDALLSERRLAV(SEQIDNO:1)
如本文所用,术语“TsrU基因”或“TsrU多核苷酸”可互换使用,都指编码具有TsrU活性的核苷酸序列。当编码相同的氨基酸时,密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是,由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时,核苷酸的变换也是可被接受的。
在本发明的一个优选例中,编码TsrU蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示,其序列为:
GTGACCGCCCCCGCGCTCCCGCTCGCCGGGCAGGTCGCGCTGGTCACCGGGGCCGGCCGCGGCATCGGGCGGATGGTCGCGGTCGCCCTCGCCGAGGCGGGCATGACCGTCGGACTGGTCGGCCGGAACCGGCGGCTCCTCGACGTCACCGCGCGCGCCTGCGCCGCCGCCCGCGAAGCCGCCTCCGGGGACGGCTCCGGGGACGGCTCCGGAGGCGGTCCGGAAGCCGGTGTCGCCGTGGCGGTGGCGGATGTCCGCGCGCCCGCCGAGATCCGGGAGGCCGCCGAGGCGGTACGGGCCGCACTCGGCCCCGTCGACCTCCTGGTGAACAACGCCGGCCTGGTGGACCAGGGCGAACTCCCCTTCTGGGAAGCCGATCCGGAGCGGTGGTGGGAGGTCTTCGAGACGAACGTCCGCGGCACCGTCAACACCTGCCGGGCCGTCCTGCCGGAGATGACCCGCCGCGGATCGGGCCGCGTCGTCAACGTCAACTCCCGCCTCGCCGTCCAGGGAGACCCCCGCTACTCCGCCTACTGCGGCTCCAAGGCGACGCTGCTCGCCCTGGACGCGGTCGCGGCGGAACCGCTCCGGGACCGCGGGGTCCACCTGTTCGACATCAGTCCGGGCATGGTGCGCACCGACATGACCCTGTCGATGGCCGTCTGCGCGGGCCGCGACGACTGGACGGACCCCGCCCTGTTCCTCGCGGCGATACTCCGCGTGGCCCACGGCGACCTCGACCCCCTCGCCGGCCGCTTCCTCCACGTGGGCGCCGACGACTTCGACGCGTTACTGAGCGAACGGCGGCTCGCCGTCTGA(SEQIDNO:2)
本领域的普通技术人员可以以常规的途径(如NCBI)获得所述DNA序列及编码的蛋白序列。
在得到了TsrU的氨基酸片段的情况下,可根据其构建出编码它的核酸序列,并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的TsrU核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的雯库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的雯库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
如本文所用,术语“引物”指的是在与模板配对,在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸,但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如,在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列,这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合,非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物,从而进行扩增。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的TsrU多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明编码TsrU蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,TsrU多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含TsrU编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;昆虫细胞;动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的一个优选例中,TsrU的制备方法包括步骤:
(1)用PCR的方法从Streptomyceslaurentii基因组中获得编码短链脱氢酶TsrU的0.85kbDNA片段,然后连入到市售的质粒载体上,将构建成功的质粒导入大肠杆菌宿主中,得到重组菌株。诱导宿主TsrU的表达;
(2)将培养完成的菌株离心,收集菌体,将菌体重悬于破菌缓冲液中(50mMTris-Cl,200mMNaCl,pH=8.0),超声破菌。破菌后将悬浮液体离心,取上清与Ni-NTA过夜结合,利用含有不同浓度咪唑的破菌缓冲液冲洗,于咪唑溶液冲洗液中得到蛋白TsrU。TsrU可以长期保存于-80℃。
催化底物
本发明的短链脱氢酶TsrU具有催化具有式1化合物的能力。
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
在本发明的优选例中,反应底物具有附图1所示的结构。
这些催化底物可以通过购买市售产品获得,本领域的技术人员也可以通过常规手段进行人工合成。
在本发明的一个优选例中,以4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸为例,其具体合成步骤如下:
1.合成6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯:将6-氟-喹啉-2-羧酸溶解于甲醇中,在冰水浴下缓慢滴入二氯亚砜,缓慢升温至室温后,加热回流。反应液冷却至室温后小心的倾倒入碳酸氢钠的饱和液中,然后以二氯甲烷多次萃取。萃取液合并后经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后经柱色谱分离得6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯;
2.合成4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯:将七水硫酸亚铁加入到含有6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯和三氟乙酸的乙醛溶液中。在冰水浴条件下,缓慢加入双氧水,30分钟后再次加入双氧水并继续反应90分钟。缓慢升温至室温,以5%的硫代硫酸钠溶液终止反应,再加入饱和碳酸氢钠溶液中和剩余的三氟乙酸。乙酸乙酯多次萃取水相,萃取液经无水硫酸钠干燥,过滤后减压浓缩后经柱色谱分离的产品4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯;
3.合成4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸:室温下,将4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯溶解于四氢呋喃中,然后加入30%的氢氧化钠溶液,该反应伴有沉淀生成,反应进行100分钟后再加入氢氧化钠使沉淀物溶解,水相经过二氯甲烷萃取后以2M稀盐酸酸化至pH为1后再以乙酸乙酯多次萃取。萃取液经无水硫酸钠干燥后过滤,减压浓缩后得白色固体4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸。
催化反应与短链脱氢酶TsrU的活性测试
短链脱氢酶TsrU具有催化下述反应的能力:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
在另一优选例中,所述反应为体外催化的还原反应,且需要辅助因子NADPH。
在另一优选例中,所述反应在具有以下至少一个或多个特征的反应体系中进行反应:
(a)短链脱氢酶TsrU的浓度为0.001-1mg/ml,较佳地为约0.01-0.8mg/ml,更佳地为约0.05-0.5mg/ml;
(b)反应pH为6.0-9.0,较佳地为约7.8;
(c)反应温度为15-45℃,较佳地为约30℃;
(d)辅酶浓度为0.01-50mM,较佳地为约0.05-10mM,更佳地为约0.1-5mM。
在另一优选例中,式I化合物是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
在另一优选例中,所述式I化合物不是4-乙酰-2-喹啉酸生成4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
本领域技术人员可以使用通用的方法如HPLC、NMR、MS的方法对产物和底物进行鉴定。
工业应用
本发明还提供了短链脱氢酶TsrU的工业用途,它被用作催化下述还原反应的催化剂:
其中,
R为H、F、Cl、Br、I、CH3或CF3;
n为0、1、2、3、或4;
R1为C1-C4烷基。
本发明的优点
(1)短链脱氢酶TsrU对底物具有很大的容忍性,能够广泛应用在催化具有式1所示结构的底物还原反应中;
(2)短链脱氢酶TsrU催化效率高,产物很纯,产生的杂质较少。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
大肠杆菌重组菌株SL1121的构建
克隆编码TsrU蛋白基因的引物序列如下:
TsrU-F(SEQIDNO:3)5’-CGAAGCTTCAGGTGGTGCCGTCAGACG-3’;
TsrU-R(SEQIDNO:4)5’-CATATGACCGCCCCCGCGCTCCCGCTC-3’。
以硫链丝菌素产生菌劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentii)ACTCC31255的总DNA为模板,以dNTP,DMSO,无酶水,高保真的PrimestarDNA聚合酶及其缓冲液组成PCR反应体系,对TsrU基因表达的0.85kb片段进行PCR扩增。扩增反应结束后将反应产物进行凝胶电泳分离,切胶回收纯化,纯化后加入限制性内切酶HindIII以及NdeI消化回收片段,将其连入用同样酶处理过的pET28a中,构建重组载体。将该载体转化到E.coliDH5α中,挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素)中培养过夜,至菌液较浓。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。验证正确的质粒转化E.coliBL21中。
实施例2
短链脱氢酶TsrU的异源表达
将大肠杆菌SL1121接种于3mlLB培养基(卡那霉素50μg/ml)37℃培养8小时,然后接种于800mlLB培养基(卡那霉素50μg/ml),37℃培养2.5小时至A600nm为0.5-0.7。然后转移至25℃继续培养0.5小时,加入IPTG至终浓度为0.1mM,25℃培养6小时以上(或过夜)。将菌液离心(5000rpm,20分钟),收集菌体。利用超声波破碎菌体,将破碎的菌体离心(15000rpm,30分钟),取上清溶液与Ni-NTA(QIAGEN)3mL混合过夜。最后,分别用100、150、200、250、300mM的梯度的浓度咪唑溶液冲洗,收取150到200mM的洗出液,浓缩脱盐,即可获得纯化的TsrU蛋白。
图2显示了纯化的TsrU蛋白SDS-PAGE的鉴定结果,表明在本实施例中,TsrU蛋白获得成功的分离和纯化。
实施例3
反应底物4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的合成
1.6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的合成与鉴定
将10.0毫摩尔的6-氟-喹啉-2-羧酸溶解于10毫升甲醇中,在冰水浴下缓慢滴入0.92毫升二氯亚砜后缓慢升温至室温后再加热回流12小时。反应液冷却至室温后小心的倾倒入碳酸氢钠的饱和液中,然后以二氯甲烷多次萃取。萃取液合并后经无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后经柱色谱分离得产品1.25克,产率:61%。
6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的1HNMR鉴定结果:
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(dd,J=9.2,5.6,1H),8.27(d,J=8.8,1H),8.22(d,J=8.8,1H),7.57(dt,J=9.2,2.8,1H),7.50(dd,J=8.8,2.8,1H),4.09(s,3H)。
6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的13C的NMR鉴定结果:
13CNMR(100MHz,CDCl3)δ165.75,161.72(d,J=250.9),147.39(d,J=3.6),144.67,136.70(d,J=5.8),133.43(d,J=9.5),130.27(d,J=10.2),121.80,120.95(d,J=25.6),110.65(d,J=21.9),53.28。
6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的19F的NMR鉴定结果:
19FNMR(282MHz,CDCl3)δ-109.78(dd,J=13.8,7.9,1F)。
2.4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的合成与鉴定
将0.38克七水硫酸亚铁加入到含有10毫摩尔6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯、0.97毫升三氟乙酸的50毫升乙醛溶液中。在冰水浴条件下,缓慢加入30%的双氧水5.5毫升。30分钟后再次加入30%的双氧水5.5毫升并继续反应90分钟。缓慢升温至室温,以5%的硫代硫酸钠溶液终止反应,再加入饱和碳酸氢钠溶液中和剩余的三氟乙酸。乙酸乙酯多次萃取水相,萃取液经无水硫酸钠干燥,过滤后减压浓缩后经柱色谱分离的产品2.05g,产率为83%。
4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的1HNMR结果:
1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.49(s,1H),8.36(t,J=3.0,1H),8.30~8.29(m,1H),7.58(dt,J=8.4,3.0,1H),4.09(s,3H),2.79(s,3H)。
4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的13CNMR结果:
13CNMR(100MHz,CDCl3)δ199.91,165.26,163.34(d,J=251.6),146.94(d,J=2.9),146.03,141.77(d,J=6.6),133.72(d,J=9.4),126.13(d,J=11.6),121.33,121.29(d,J=26.2),109.83(d,J=24.8),53.50,29.61。
4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的13CNMR结果
19FNMR(282MHz,CDCl3)δ-106.03(m,1F)。
4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的HR-MALDI-MS结果:
HR-MALDI-MS(m/z):[M+Na]+270.0537(calcd.ForC13H10FNO3Na+1,270.0542)。
3.4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的合成与鉴定
室温下,将1.0毫摩尔的4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯溶解于3.5毫升四氢呋喃中,然后加入30%的氢氧化钠溶液。溶液很快变成黄色并伴有沉淀生成。反应进行100分钟后再加入0.1M氢氧化钠使沉淀物溶解。水相经过二氯甲烷萃取后以2M稀盐酸酸化至pH为1后再以乙酸乙酯多次萃取。萃取液经无水硫酸钠干燥后过滤,减压浓缩后得白色固体。乙酸乙酯-石油醚重结晶的产品135mg,产率为58%。
4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的1HNMR结果:
1HNMR(300MHz,Acetone-d6)δ8.58(s,1H),8.33~8.25(m,2H),7.77(dt,J=8.7,3,1H),2.87(s,3H)。
4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的13CNMR结果:
13CNMR(100MHz,Acetone-d6)δ200.15,164.61,162.89(d,J=249.1),147.23(d,J=2.8),145.17,133.27(d,J=9.7),126.02(d,J=11.6),124.96(d,J=26.4),120.61,109.63(d,J=25.0),28.97。
4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的19FNMR结果:
19FNMR(282MHz,Acetone-d6)δ-108.99(m,1F)。
4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的HR-MALDI-MS结果:
HR-MALDI-MS(m/z):[M+H]+234.0561(calcd.ForC12H9FNO3 +1,234.0566)。
实施例4
短链脱氢酶TsrU催化4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的活性测试
以实施例3合成的4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸为TsrU的作用底物,建立反应体系,检测TsrU的反应活性。
反应体系为:25mMNADPH2uL,6.5mM底物4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸4μL,2.103mg/mL浓度的TsrU5μL,1MpH=7.8的磷酸二氢钾缓冲液10μL,加去离子水至100μL,将反应体系置于30℃温浴,反应10分钟后,加入利用2倍体积的甲醇,使得反应淬灭,取淬灭后的溶液进行HPLC分析。
HPLC分析条件见下
仪器:Agilent1100HPLC高效液相系统
柱子:AgilentZORBAXSB-C18column(4.6x250mm,生产号880975-902)
检测波长:UV=254nm
流动相条件:V=1ml/min;A=H2O(0.1%甲酸);B=CH3CN(0.1%甲酸)
图3显示了TsrU催化4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸的HPLC鉴定结果,i为4-(1-羟乙基)-6-氟-2-喹啉酸标准品,ii为4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸标准品,iii为反应开始第0分钟,iv为反应开始第5分钟,v为反应开始第15分钟。结果表明,TsrU能够将4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-6-氟-2-喹啉酸。
实施例5
短链脱氢酶TsrU催化的其他反应
按照实施例3的方法分别制备4-乙酰-2-喹啉酸、4-乙酰-8-氟-2-喹啉、4-乙酰-7-氟-2-喹啉酸、4-乙酰-6-氯-2-喹啉酸、4-乙酰-6-溴-2-喹啉酸;按照实施例2-3的方法制备短链脱氢酶TsrU;参照实施例4的方法用短链脱氢酶TsrU对上述化合物进行催化,用HPLC的方法分析,结果如下:
图4显示了TsrU催化4-乙酰-2-喹啉酸的HPLC分析结果,i为4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸标准品,ii为4-乙酰-2-喹啉酸标准品,iii为反应开始第0分钟,iv为反应开始第5分钟,v为反应开始第15分钟。
结果表明,TsrU能够催化4-乙酰-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-2-喹啉酸。
图5显示了TsrU催化4-乙酰-8-氟-2-喹啉酸的HPLC分析结果,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii为4-(1-羟乙基)-8-氟-2-喹啉酸标准品。
结果表明,TsrU能够催化4-乙酰-8-氟-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-8-氟-2-喹啉酸。
图6显示了TsrU催化4-乙酰-7-氟-2-喹啉酸的HPLC分析结果,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii为4-(1-羟乙基)-7-氟-2-喹啉酸标准品。
结果表明,TsrU能够催化4-乙酰-7-氟-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-7-氟-2-喹啉酸。
图7显示了TsrU催化4-乙酰-6-氯-2-喹啉酸的HPLC分析结果,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii为4-(1-羟乙基)-6-氯-2-喹啉酸标准品。
结果表明,TsrU能够催化4-乙酰-6-氯-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-6-氯-2-喹啉酸。
图8显示了TsrU催化4-乙酰-6-溴-2-喹啉酸的HPLC分析结果,i为反应开始第0分钟,ii为反应开始第2分钟,iii为4-(1-羟乙基)-6-溴-2-喹啉酸标准品。
结果表明,TsrU能够催化4-乙酰-6-溴-2-喹啉酸还原为4-(1-羟乙基)-6-溴-2-喹啉酸。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种短链脱氢酶TsrU的用途,其特征在于,它用于催化下述还原反应:
其中,
R为F、Cl、或Br;
n为1;
R1为C1-C4烷基;
其中,所述短链脱氢酶TsrU来自于劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentii),并且所述短链脱氢酶TsrU的序列如SEQIDNO.:1所示。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,R为F。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,R为F;R1为CH3;n为1。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,R1为甲基。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的短链脱氢酶TsrU由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列所编码。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的短链脱氢酶TsrU是在大肠杆菌中表达的来自劳伦链霉菌Streptomyceslaurentii的重组蛋白。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的短链脱氢酶TsrU为分离的或重组的。
8.一种催化方法,其特征在于,包括步骤:
(i)在辅酶存在的条件下,用短链脱氢酶TsrU催化式I化合物发生还原反应,从而形成式II化合物;
其中,
R为F、Cl、或Br;
n为1;
R1为C1-C4烷基;
其中,步骤(i)中,在具有以下特征的反应体系中进行反应:
(a)短链脱氢酶TsrU的浓度为0.001-1mg/ml;
(b)反应pH为6.0-9.0;
(c)反应温度为15-45℃;和
(d)辅酶浓度为0.01-50mM;
其中,所述短链脱氢酶TsrU来自于劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentii),并且所述短链脱氢酶TsrU的序列如SEQIDNO.:1所示。
9.如权利要求8所述的方法,其中,所述辅酶浓度为0.05-10mM,
10.如权利要求8所述的方法,其中,所述辅酶浓度为0.1-5mM。
11.一种短链脱氢酶TsrU的用途,其特征在于,它被用作催化下述还原反应的催化剂:
其中,
R为F、Cl、或Br;
n为1;
R1为C1-C4烷基;
其中,所述短链脱氢酶TsrU来自于劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentii),并且所述短链脱氢酶TsrU的序列如SEQIDNO.:1所示。
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