JPH06165687A - ２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸から鏡像体として純粋な形態でｌ−チエニルアラニンを生物工学的に製造する方法およびその使用 - Google Patents

２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸から鏡像体として純粋な形態でｌ−チエニルアラニンを生物工学的に製造する方法およびその使用

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JPH06165687A
JPH06165687A JP5190159A JP19015993A JPH06165687A JP H06165687 A JPH06165687 A JP H06165687A JP 5190159 A JP5190159 A JP 5190159A JP 19015993 A JP19015993 A JP 19015993A JP H06165687 A JPH06165687 A JP H06165687A
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hydroxy
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ゲールハルト・クレツチユマル
Johannes Dr Meiwes
ヨハネス・マイヴエス
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マンフレート・シユドク
Peter Hammann
ペーター・ハマン
Ulrich Lerch
ウルリツヒ・レルヒ
Susanne Grabley
ズザネ・グラープライ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸か
ら鏡像体として純粋な形態でＬ−チエニルアラニンを工
学的に製造する方法の提供。 【構成】 Ｌ−チエニルアラニンをヒダントインまたは
アズラクトン経路により製造するもので、出発物質を２
−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸として、生物変
換の助けにより、２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリ
ル酸のエノール形態をアミノ基転移してＬ−チエニルア
ラニンとすることを特徴とする。アミノ基転移はアミノ
供与体としてのＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミ
ン酸の存在下で実施される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】Ｌ−チエニルアラニンはヒダント
インまたはアズラクトンルートを経由して製造される。
２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸が生物変換の
ための出発物質として用いられる。発明性のある工程
は、生物変換により２−ヒドロキシ−３−チエニルアク
リル酸のエノール形態をアミノ基転移してＬ−チエニル
アラニンとすることにある。アミノ基転移はアミノ供与
体としてのＬ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸
の存在下で実施される。
【０００２】光学活性、非蛋白質系アミノ酸例えばＬ−
チエニルアラニンは医薬品、作物防護剤または合成単位
として極めて重要である。例えば、Ｌ−dopaはパーキン
ソン氏病に対するものであり、α−メチルdopaは高血圧
症に対するものであり、またはＬ−ホスフィノスリシン
は除草活性物質の生物学的活性成分としてである。
【０００３】更に、光学活性アミノ酸は合成前駆物質、
特に医薬品合成前駆物質であり、例えばＤ−フェニルグ
リシンまたはＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンは半
合成ペニシリンの製造での前駆物質である。更に、これ
らのものは他のキラルファインケミカルのためのまた修
飾生物活性ペプチドに組み入れるためのキラル合成ユニ
ットとして使用される。〔R.A. Sheldon, H.J.M. Zeege
rs, J.P.M. HoubiersおよびL.A. Hulshof, Chimicaogg
i, 5, p.35（1991）〕。
【０００４】
【従来の技術】非蛋白質系光学活性アミノ酸は醗酵によ
りまたは天然源から得ることができないので、これらの
ものはこれまで通常の合成、次いでラセミ分割により、
キラル補助剤を用いる不斉合成により、またはキラルも
しくはプロキラル前駆物質の生物変換により製造されて
いた。
【０００５】非蛋白質系アミノ酸の商業上の合成に使用
される方法の例としては次のものがある： １． Ｌ−特異性アミノペプチダーゼを用いる加水分解
によってラセミアミノ酸アミドを分割するアミダーゼ法
〔H.W.J. Boesten、 米国特許第3,971,700号（197
6）〕。 ２． Ｎ−アセチル−Ｄ,Ｌ−アミノ酸のアシラーゼ接
触鏡像体選択性加水分解〔I．Chibata およびT. Tosa、
Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10, p.197 (1981)〕。
【０００６】両方法の欠点は、光学活性反応生成物の収
率が５０％以下であるところにある。更に進歩した生物
工学的方法、すなわちＤ,Ｌ−モノ置換ヒダントインの
微生物的加水分解では、アミノ酸のキラル前駆物質をラ
セマーゼの存在により５０％を超える収率で鏡像体とし
て純粋なＬ−アミノ酸に変換することができる〔Ch.Syl
datk, A. Laeufer, R. MuellerおよびH. Hoeke, Advanc
es Biochem. Engin.in Biotechnol. vol. 41，A. Fiech
ter (Ed.), p. 29〜75, Springer Verlag, Berlin, New
York, London (1990)〕。一方では、この方法の欠点
は、飽和（水添）ヒダントイン前駆物質の合成が難しい
ことであり、特に前駆物質が硫黄含有部分構造を含有し
ているときは、貴金属水添触媒の不活化を生じ、かつ前
駆物質とするのに更に複雑な電気化学的還元方法を必要
とする（H. Hoeke, Conference Paper, Chiral '92, Ma
nchester, UK, 1992）。他方では、この方法は少なくと
も３種の酵素を使用する多段階プロセスであるため技術
的見地からみて非常に複雑である。これらの関連酵素は
一定のpH値および一定の温度で異なった活性を有し、こ
れはプロセスコントロールが複雑であることを意味して
いる〔A. Moeller,C. Syldatk, M. Schulze, F. Wagne
r, Enzyme Microbiol. Technol., 10, p.618(1988)〕。
【０００７】アミノ酸の鏡像体特異性合成を実施するそ
の他の可能性は、プロキラルα−ケト酸前駆物質のアミ
ノ基転移である。この方法は主として天然アミノ酸の合
成について、また非蛋白質系アミノ酸の合成について開
示されている〔コリネバクテリウムグルタミクム（Cory
nebacterium glutamicum）菌株を用いるα−ケトイソカ
プロン酸のＬ−ロイシンの合成（R. Wichmann, C. Wand
reyおよびI. Groβe-Weismann, H. Appl. Microbiol. B
iotechnol., 32, p. 373（1990）〕。
【０００８】欧州特許出願第０,１５２,２７５号には、
アミノトランスフェラーゼの過生産を特徴とする遺伝子
修飾微生物を用いる蛋白質系アミノ酸フェニルアラニン
の製造方法が開示されている。相当するα−ケト酸の微
生物または酵素生物変換により得られるその他のアミノ
酸は非蛋白質系（non-proteinogenic）アミノ酸であ
る。例として、遺伝子修飾Ｅ．コリ菌株を用いるＬ−ｔ
−ロイシンおよびＬ−ホスフィノスリシンの製法（欧州
特許第０,２４８,３５７号）およびＥ．コリからの単離
アスパルテートアミノトランスフェラーゼおよびアミノ
供与体としてのグルタミン酸を用いる一連のα−ケト酸
のアミノ基転移〔J.E. BaldwinおよびS.C. Ng, Bull. S
ing. N.I.Chem., 18, p. 127（1990）〕。
【０００９】Ｌ−３−（２−チエニル）アラニン基体構
造タイプに限定されている次の各方法は、光学活性を有
する非蛋白質系チエニルアラニンの合成についてこれま
でに記載されている。 ａ） ジアステレオマー塩の晶出による伝統的なラセミ
体分割〔A.W. LipkowskiおよびG. Flouret, Pol. J. Ch
em., 54, p. 2225（1980）〕； ｂ） α−キモトリプシンによる低級アルキルエステル
の鏡像体選択性加水分解〔M. Pugniere, L.G. Barryお
よびA. Previero, Biotechnol. Techniques, 3,p. 339
（1989）〕； ｃ） R.A. Sheldonの方法によるアミノペプチダーゼに
よる相当するアミノ酸アミドのラセミ体分割（“Chiral
Synthesis", Proceedings of the Chiral Synthesis W
orkshop, Manchester, UK, 18th April 1989, Conferen
ce Paper, p. 25）； ｄ） Ch. シルダット（Syldatk）等によるヒダントイ
ナーゼ方法〔Ch. Syldatk, A. Laeufer, R. Mueller an
d H. Hoeke, Advances Biochem. Engin. in Biotechno
l. Vol. 41, A. Fiechter (Ed.) p. 29〜75, Springer
Verlag, Berlin,New York, London (1990）〕および ｅ） トランス−３−（２−チエニル）アクリル酸への
アンモニアの酵素添加（ＰＣＴ出願ＷＯ ８９１２−６
８８）。
【００１０】上記ａ）〜ｃ）に述べられている方法は、
すべてのラセミ方法のように、収率に関して上述した欠
点を有している。チエニルアラニン合成のためのヒダン
トイナーゼ方法の欠点は主として必要とされる５−チエ
ニルメチルヒダントインの入手可能性の問題にあるが、
最後に述べた方法での基質の濃度は僅か約３ｇ／リット
ルでの低さであり、そしてこの方法は１００mgスケール
で４７.９mg（４３％）の収量で所望のアミノ酸Ｌ−３
−（２−チエニル）アラニンを提供する。この方法は工
業的スケールでの合成に適していない。
【００１１】
【発明の構成】意外にも、２−ヒドロキシ−３−チエニ
ルアクリル酸から鏡像体として純粋な形態でＬ−チエニ
ルアラニンを製造する方法が見い出され、この方法では
２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸のエノール形
態がアミノ供与体としてのＬ−アスパラギン酸またはＬ
−グルタミン酸の存在下でそれぞれの非蛋白質系アミノ
基転換される。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のとおりの
製法および使用に関する。 １．式（Ｉ）
【化７】 （式中Ｒ1は水素、ハロゲン基、ニトロ基または直鎖も
しくは有枝鎖アルキル基であり、そして２−ヒドロキシ
アクリル酸基はチオフェン環の２−または３−位にあ
る）を有するＬ−チエニルアラニンまたはこれらの化合
物の塩の製法において、式（II）
【化８】 （式中Ｒ1は前述のとおりである）を有する化合物をア
ミノ酸、アスパラギン、グルタミン、Ｌ−アスパラギン
酸および／またはＬ−グルタミン酸の存在下かつ微生物
および／またはトランスアミナーゼ活性を有する酵素の
存在下に生物変換に付すことを特徴とする上記製法。
【００１３】２．式（Ｉ）の化合物のペプチド合成の単
位（ユニット）としての使用 以下に本発明を詳しく説明する。「チエニルアラニン」
なる用語は、２′−または３′−位でアラニン側鎖に連
結している置換または非置換チオフェン基本構造からな
る非蛋白質系アミノ酸について用いられる。Ｌ−チエニ
ルアラニンの合成法はベンチスケール（＜１００ｇの量
の製造）でそしてまた工業的スケールで実施することが
できる。
【００１４】更に、この方法は連続式またはバッチ式で
実施することができる。当業者は、化学装置での連続方
法なる用語は反応剤の一定の供給および反応生成物の一
定の排出意味するものと理解する。当業者は、バッチ式
または非連続方法なる用語は反応に関与する材料を段階
的に添加または取出し得る反応を実施する方法を意味す
るものと理解する。
【００１５】工業的スケールとは１００ｇ以上の量でＬ
−チエニルアラニンを含有することと定義される。出発
物質として使用される式（Ｉ）のチエニルアルデヒド、
例えば４−ブロモ−、５−ブロモ−、３−メチル−、５
−メチル−または５−ニトロ−チオフェンアルデヒドは
商業上入手可能であるか、あるいは周知の合成法により
当業者によって市販の前駆物質から製造し得る。Ｌ−チ
エニルアラニンは次の反応工程を経由して製造すること
ができる。これらの工程の全ては先行技術に属する。但
し、該エノール形態の生物変換はこの限りではない。
【００１６】ａ） ヒダントインルート（ダイアグラム
１）または ｂ） アズラクトンルート（ダイアグラム２）。 ダイアグラム１に示す合成ルートは、Ｌ−３−（２−チ
エニル）アラニン合成（２Ａ）の助けによりダイアグラ
ム３に更に詳しく説明されている。
【００１７】
【化９】
【００１８】
【化１０】
【００１９】
【化１１】
【００２０】ダイアグラムに示した如く、２−ヒドロキ
シ−３−チエニルアクリル酸（３）は相当する複素環前
駆物質（６）または（７）の加水分解開環により得られ
る。ヒダントイン誘導体（６）は、文献既知の方法、例
えば非置換ヒダントイン（５）を用いるアルドール縮合
により、金属シアネートを用いるアミノ酸から、あるい
はブヒャラー・ベルグ合成で金属シアナイドおよび尿素
を用いる３−チエニル−置換プロパノールから得ること
ができる（E. Ware, “The Chemistry of Hydantoins",
Chem. Rev., R.L. Shriner (Ed.), Vol. 46, 403〜47
0, The, Williams & Wilkins Comp., Baltimore (195
0)。ヒダントイン誘導体（６）からのエノールカルボン
酸（３）の合成は文献には未報告であり、そして意外に
も水性塩基中ヒダントインを単に水溶液の沸点まで加熱
することにより高収率で進行する。
【００２１】アズラクトン誘導体（７）からのエノール
カルボン酸の合成（３：ダイアグラム２）を参照）は、
原則として物質を水性酸または塩基中で加熱することに
より文献既知の方法と非常に類似した方法で実施するこ
とができる（J.P. Greenstein and M. Winitz, “Chemi
stry of the Amino Acids", Wiley, New York 1961）。
アズラクトン（７）の加水分解は、また中間体として２
−ベンゾイルアミドアクリレートまたは２−アセチルア
ミドアクリレートを経由して２工程（ダイアグラム２）
で実施することができる。（B.F. Corowe and F.F. Nor
d, J. Org. Chem. 15, 1177 (1950)）。
【００２２】式（３）の中間体の製造にも原則として使
用し得るα−ケトカルボン酸の他の一連の合成法はA.J.
L. Cooper, J.Z. Ginos, A. Meister, Chem. Rev. 83,
321（1983）の綜説中にみることができる。しかし、ダ
イアグラム１〜３に示した合成ルートは、収率および必
要な化学薬品の良好な入手可能性について工業的規模で
の実施化にまた経済上の理由から好ましいものである。
【００２３】種種の合成ルートで製造されたエノール形
態（３）の前駆物質は、アミノ酸（２）を生じるアミノ
基転移反応の意味で本発明による方法によって反応させ
ることができる。分光による知見（赤外分光法、核共鳴
分光法）により、これらの分析技術の検知範囲内で、ダ
イアグラム１〜３に示すエノール構造を有する互変異性
化合物（３）が有機および水性溶媒中で、また広いpH領
域（pH１〜１４）中で専有的に存在し、特に生物変換の
pH条件下で存在することが明らかとなる。この知見は、
例えば相当するケト酸構造式（４Ａ）により文献に開示
されている化合物３Ａ（２−チエニル基およびＲ1＝
Ｈ）について、文献にみられる情報とは著しく異ってい
る（L. Horner and E.-O. Renth, Liebigs Ann. Chem.,
703, 37(1967)）。対照的に相当する２−ヒドロキシ−
３−チエニルアクリル酸のエステルおよび相当する２−
メルカプト化合物の相当するエノール構造は安定な互変
異性形態として文献に記載されている〔２−チエニルチ
オピルビン酸：B.F. CroweおよびF.F. Nord, J. Org. C
hem. 15, 81（1950）; Esters: A.M. Stock, W.E. Dona
hueおよびE.D. Amsturz, J. Org. Chem. 23, 1840 (195
8)〕。一般に、一般式アリール−ＣＨ(２)−Ｃ(＝Ｏ)Ｃ
Ｄ(２)Ｈのアリール置換β−ピルビン酸の実質的な量は
塩基性そのものの媒質中でのみ互変異性エノール形態で
存在する。生理学的pH条件下、エノール含量は非常に少
量となる。〔A.J.L. Cooper, J.Z. GinosおよびA. Meis
ter, Chem. Rev. 83, 321 (1983)〕例えば、フェニルピ
ルビン酸のナトリウム塩は、ＮＭＲスペクトルによる
と、ケト酸形態でほぼ独占的に存在する（The Aldrich
Library of NMR-Spectra, 2nd Edition, Vol. 2, 143C,
p.2）。
【００２４】エノールカルボン酸（３）をアミノ酸
（２）に生物変換するのに本発明によって使用し得る物
質は、動物、植物、微生物または動物器官、例えば豚心
臓由来であって、α−ケト酸をアミノ基変換により天然
Ｌ−アミノ酸に変換し得る酵素のすべてである。
【００２５】しかしながら、本発明の方法は好ましくは
トランスアミナーゼを有する微生物、例えばパラコッカ
ス（Paracoccus）、 アルカリゲネス（Alcaligenes）、
リゾビウム（Rhizobium）、シュードモナス（Pseudomon
as）、 セラチア（Serratia）、 アグロバクテリウム（Ag
robacterium）、 ストレプトマイセス（Streptomyces）
またはエンテロバクテリウム（Enterobacterium）属か
らの微生物を用いて実施される。
【００２６】使用し得るこれらの好ましい属の種として
は、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligens f
aecalis）DSM 4115、 アルカリゲネス・デニトリフィカ
ンス（Alcaligens denitrificans）DSM 4114、シュード
モナス・パウシモビリス（Pseudomonas paucimobilis）
DSM 4120、シュードモナス・スペク（Pseudomonas spe
c.） DSM 4119、 セラチア・プリムチカ（Serratia plym
uthica）DSM 4116、 アグロバクテリウム・ツメファシェ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）、 エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）DH 1、エンテロバクター・ア
グロメランス（Enterobacter agglomerans）DSM 4122、
エンテロバクター・スペク（Enterobacter spec.）DSM
4121、 ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Strept
omyces hygroscopicus）、 ストレプトマイセス・ビリド
クロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）ある
いは土壌単離株DSM 4113、 DSM 4117およびDSM 4118があ
げられる。
【００２７】エシェリキア・コリATCC 11303およびパラ
コッカス・デニトリフィカンスDSM65が特に好ましい。
微生物は純粋なまたは混合培養物の形態で使用し得る。
【００２８】これらの微生物は、〔the Deutsche Samml
ung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen〔German
Collection of Microorganisms and Tissue Cultures〕
(DSM), Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Germ
any, あるいはthe AmericanType Culture Collection
(ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland20
852; USA）で入手可能である。
【００２９】微生物の酵素活性は、本発明による生物変
換生成物、３−（２−チエニル）アラニン（２Ａ）に対
して抵抗性を有するかあるいはこの化合物を単独の窒素
源として利用する菌株を選択することにより増大させる
ことができる。これはアミノ酸Ｌ−フェニルアラニンの
良好な生産体を選択するための一般的な常法であり、例
えば特願９０−７１６９８号に記載されている。
【００３０】生物変換をより高い収率で実施する微生物
を選択するため更に作業するべく培地中に増加する量の
２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸またはその塩
の存在下にそれ自体既知の方法で選択および突然変異を
使用することも可能である。その理由はこれらが基質に
適合させられるからである。
【００３１】特に、遺伝子工学で処理された微生物の突
然変異株を使用すると高い収率が得られる。特に好まし
く使用される微生物は菌株Ｅ.コリATCC 11303であり、
この菌株は更にtyrＢ遺伝子または更にaspＡ遺伝子を含
有するプラスミドで形質転換されたものであり、Ｅ.コ
リATCC 11303においてtyrＢ遺伝子は芳香族トランスア
ミナーゼをコードし、またはaspＡ遺伝子はアスパルタ
ーゼをコードしている。この菌株は例えばドイツ特許願
第Ｐ３６３１８２９.９号および同第Ｐ３７１３７５５.
２号ならびに欧州特許第２４８,３５７号に記載された
方法により生産され、形質転換されている。
【００３２】微生物は、培養液の約４〜６０ｇ／リット
ルの乾燥重量に達するまで生育するのに適した培地中で
好ましい温度および通気条件下に有利に生育する。当面
の培養微生物に最も好ましい条件は当業者に既知である
かまたは簡便な準備試行で定めることができる。そし
て、細胞は液体培地中または液体培地から分離して２−
ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸の生物変換のため
に使用される。生物変換は全細胞または別に消化された
細胞を用いて実施することができ、通常の処理方法が使
用される。
【００３３】生物変換は細胞抽出物、単離完全蛋白質お
よび精製トランスアミナーゼを用いて実施することがで
きる。しかし、操作を容易にするために、細胞そのまま
を用いて実施するのが好ましい。しかし、トランスアミ
ナーゼを単離するのも有利なことがある。その理由は酵
素はより長く生存し、そしてより良いプロセスコントロ
ールが可能だからである。これらの例は例えばS.C. Ng
およびJ. Baldwen, Bull. Sing. N.I. Chem., 18, 127
（1990）にみられ、そこではＥ.コリからのアスパルテ
ートトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）が開示され、またα
−ケト酸からの一連のＬ−α−アミノ酸の合成について
は〔I.G. Fotheringham, S.A. Dacey, P.P. Taylor, T.
G. Smith, M.G. Hunter, M.G. Finlay, S.B. Primrose,
D.M. ParkerおよびR.M. Edwards, Biochem. J., 234,
593(1986)〕に開示されている。更に、固定化された形
態での微生物または酵素を使用することも可能である。
固定化に適した方法は既知の方法であり、有利にはドイ
ツ特許出願公開第３,２３７,３４１号およ同第３,２４
３,５９１号に開示されている方法があげられる。
【００３４】オイペルギット（Eupergit）Ｃ、 ＶＡエポ
キシ、シリカゲル例えばGrace ＸＷＰ２５０ＵＭＰ、 Ｘ
ＷＰ３００ＭＰ、 ＸＷＰ３５０ＭＰ、ＸＷＰ１０００Ｍ
Ｐ、ＸＷＰ１５００ＵＭＰ、ＸＷＰ３５０ＬＰまたはＸ
ＷＰ３５０ＨＰが固定化酵素の支持体として好ましく使
用され、ＸＷＰ５００ＭＰが特に好ましい。固定化酵素
または非固定化酵素はいずれの場合も連続式方法または
バッチ式方法に使用し得る。固定化酵素はバッチ式方法
に好ましく使用される。
【００３５】好ましい態様において、微生物あるいは単
離もしくは固定化酵素を、２−ヒドロキシ−３−チエニ
ルアクリル酸（３）およびアミノ基供与体を加えて、生
理学的緩衝剤に懸濁する。微生物の量に基づいて、バッ
チに加えられる酵素活性は広い限度内で調節することが
できる。１０〜３０,０００μモル／分リットルが有利
である。バッチは好ましくは酵素活性１０,０００〜２
０,０００μモル／分リットルを有する細胞の量を含有
する。
【００３６】使用し得るアミノ基供与体はアスパラギ
ン、グルタミン、アスパラギン酸および／またはグルタ
ミン酸（いずれもＬ−体）、あるいはアンモニウムイオ
ンもしくは尿素と組み合さったフマレートもしくはフマ
ル酸であるが、方法はＬ−アスパラギン酸およびＬ−グ
ルタミン酸を用いて好ましく実施され、Ｌ−アスパラギ
ン酸が特に好ましい。これらの前駆物質はそれらの遊離
酸または適当な塩（媒質に左右される）の形態で基質
（３）に対して少なくとも等モル量または過剰量で使用
される。１：１〜５：１、有利には１：１〜２：１の比
がそれ自体で実証された。
【００３７】塩を使用するとき、酵素活性に対して無視
し得る効果を有する天然イオンを選択する。これらの塩
は好ましくはナトリウム、カリウムおよびアンモニウム
塩である。
【００３８】反応剤は水の溶液の形態でバッチに加える
ことができ、また水混和性溶媒好ましくは純粋なメタノ
ールまたは所望の任意の比で水で希釈したメタノールの
溶液の形態でもよく、あるいは固体物質を同時に加える
ことによりバッチに加えることができる。しかしなが
ら、いずれの場合も０.５〜２４時間、好ましくは８〜
１６時間かけてのバッチ重量を基にして０.５〜１０
％、特に２〜５％の量でのバッチ式または連続式添加が
好ましい。方法は有利には５〜９、特に７〜８.５のpH
で実施される。更に、生物変換を１０〜６５℃、特に３
０〜４５℃の温度で実施するのが得策である。より低い
温度では、生物変換がより遅く漸次進行し、またより高
い温度では酵素の漸進的な不活化をもたらす。
【００３９】生物変換前または過程で微生物を透過性向
上させる必要はない。特にバッチを大気酸素を排除して
微生物または酵素で培養するときに、高い反応比および
収率が得られる。不活性ガス例えば窒素、そしてまたは
希ガス例えばアルゴンが適当である。
【００４０】固定化酵素を用いてアミノ基転換を実施す
る場合、反応溶液を触媒とバッチ式でまたは連続式で反
応させる。反応溶液中の２−ヒドロキシ−３−（２−チ
エニル）アクリル酸の濃度は０.５〜５％、好ましくは
１〜２％である。供与体アミノ酸の濃度はバッチに完全
に対応する。反応溶液（４℃に冷却して導入）は１０〜
６５℃、好ましくは３０〜４５℃で反応させる。固体化
酵素は撹拌反応器またカラム反応器で、好ましくは固定
床プロセスで、使用し得る。後者のプロセスでは、反応
溶液を０.１〜２０ml／分、特に０.１〜０.５ml／分の
速度でカラム中に圧送し、酵素を固定化する。
【００４１】非蛋白系Ｌ−チエニルアラニンはペプチド
合成、好ましくはブラジキニンまたはブラジキニン関連
ペプチドの合成のためのユニットとして使用し得る。
【００４２】ブラジキニンはアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇを有し、そしてキニン類、血漿ホルモンの一群
に属する。ブラジキニン関連ペプチドは、ブラジキニン
の如く降圧作用を有し、特定の筋肉の収縮を促進しかつ
疼痛増進作用を有するリシルブラジキニンである(Conci
se Encyclopedia Biochemistry, 2nd Edition, Thomas
ScottおよびMary Eagleson, Walter de Gruyter, Berli
n, New York 1988, p. 75)。
【００４３】式 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ−Ｋ−(Ｄ)−Ｔｉ
ｃ−Ｇ−Ｍ−Ｆ′−Ｉ （式中、Ａは水素、アルキル、アルカノイル、アルコキ
シカルボニル、アルキルスルホニル、シクロアルキル、
アリール、アリールスルホニル、ヘテロアリールあるい
はアミノ酸であり、これらの各々は任意に置換されてい
てもよく、Ｂは塩基性アミノ酸であり、Ｃはジ−または
トリペプチドであり、Ｅは芳香族アミノ酸残基であり、
Ｆは相互に独立して側鎖に任意に置換分を有していても
よいアミノ酸であり、Ｆ′はＦと同意義であるかまたは
−ＮＨ−（ＣＨ2)2-8であるか、または適宜直接結合で
あり、Ｉは−ＯＨ、−ＮＨ2または−ＮＨＣ2Ｈ5であ
り、そしてＫは式−ＮＨ−（ＣＨ2)1-4−ＣＯ−を有す
る基または直接結合である）を有するペプチドはブラジ
キニン拮抗物質である。これらのものは、ブラジキニン
およびブラジキニン関連ペプチドにより仲介、開始もし
くは増進されるすべての病源状態の治療に使用し得る。
【００４４】ペプチドはペプチド化学の周知の方法で製
造される。例えば、Houben-Weyl, Methoden der organi
schen Chemie〔Methods in Organic Chemistry〕, Volu
me 15/2を参照：好ましくは固相合成例えばB. Merrifie
ld, J. Am. Chem. Soc. 85,2149(1963)あるいはR. C. S
heppard, Int. J. Peptide Protein Res. 21, 118(198
3)により記載されている合成あるいは同等な既知の方法
により合成される。α−アミノ保護基として使用される
基は、ウレタン保護基、例えばフルオレニルメチルオキ
シカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基またはｔ−ブチルオキ
シカルボニル（Ｂｏｃ）保護基である。二次反応を防止
するためまたは合成のために特定の基が必要なときは、
アミノ酸の側鎖の官能基を更に適当な保護基により保護
する〔例えば、B. T. W. Greene, (Protective Groups
in Organic Synthesis）を参照〕。
【００４５】
【実施例】以下の実施例は本発明を更に詳しく説明する
ためのものである。 実施例１ ２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）アクリル酸（３
Ａ）の合成アズラクトン経路による合成 ２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）アクリル酸（３
Ａ）を得るためのアズラクトン合成および加水分解 無水酢酸ナトリウム４２０ｇ（４.９モル）およびアセ
チルグリシン５００ｇを無水酢酸１３００ｇに溶解また
は懸濁し、そしてチオフェン−２−アルデヒド７１９ｇ
を加える。このバッチを不活性ガス下で加熱沸騰させ、
そして１.５時間還流させる。次にバッチを氷浴中で冷
却し、そして沈殿した生成物を吸引濾取する。これを氷
水３００mlを用いて４回洗滌し、そして残渣を真空シェ
ルフ・ドライヤー中５０℃で乾燥する。合した濾液から
沈殿した生成物を同様に処理する。 総アズラクトン（７Ａ）収量：７３０ｇ、８８％ 融点：１３７〜１４０℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6)： ８.２〜６.８(数個ｍ, ４Ｈ, 芳香族Ｈ, ＝ＣＨ）； ４.６０（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3）
【００４６】得られたアズラクトン（７Ａ）１９３ｇ
（１モル）を沸騰塩酸１.５リットルに導入する。３０
分還流後、大部分が溶解する。混合物を熱時濾過し、少
量の水で洗う。赤味がかった褐色の残渣はアミノ酢酸８
Ａ（５５ｇ、２６％）からなる。濾液を撹拌しながら０
℃に冷却する。２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）
アクリル酸（３Ａ）および更にアミノ酢酸２−アセトア
ミドアクリル酸８Ａが沈殿する。混合物を再び吸引濾過
し、そして少量の冷水で洗う。フリットに残っている残
渣を数回エーテルで蒸解し、そして吸引濾取する。フリ
ットに残っているものはアミノアセチルアクリル酸（８
Ａ；５０ｇ、２５％）である。２−ヒドロキシ−３−
（２−チエニル）アクリル酸（３Ａ）を、回転蒸発器で
蒸発させ、乾燥させた後、エーテル相から単離する（４
６ｇ、２７％）。 融点：１６６〜１６８℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.５２；７.２５；７.０２（３ｄｄ, ３Ｈ, 芳香族
Ｈ） ６.７５（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ）
【００４７】別途ルート：２−アミノアセチルアクリル
酸（８Ａ）の単離後２−ヒドロキシ−３−(２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ａ）とするアズラクトン(７Ａ）との
反応 ジオキサン５００mlおよび水１１mlにアズラクトン（７
Ａ）９６.５ｇを溶解する。次にＨＣｌガスを通す。ア
ミノアセチルアクリル酸が晶出し始め、そして反応が４
０分後に終了したとき濃厚な懸濁液の形態である。ジエ
チルエーテル１リットルを撹拌しながら加え、溶解して
いる塩化水素を窒素を通して排除する。生成物を吸引濾
過し、エーテルで十分に洗滌し、そして真空で残りの溶
媒を除去した。アミノアセチルアクリル酸の収量：９
９.５ｇ、理論値の９４％。 融点：２３２〜２３５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.２５（ｓ, １Ｈ, ＮＨ） ７.７５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.７０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.５０（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.１０（ｄｄ, １Ｈ）
【００４８】次に実施される塩酸による加水分解は上述
の如く行われる。２−ヒドロキシ−３−（２−チエニ
ル）アクリル酸の収率７０〜７５％。
【００４９】ヒダントインルートによる合成 ５−（２−チエニリデン）ヒダントイン（６Ａ）と水酸
化ナトリウム溶液との反応による２−ヒドロキシ−３−
（２−チエニル）アクリル酸（３Ａ）の合成 ５Ｎ ＮａＯＨ １.２リットルを撹拌しながらかつ不活
性ガスを通しながら加熱沸騰させる。ヒダントイン（６
Ａ）７７.７ｇ（０.４モル）を導入し、そして混合物を
６０分間還流させる。混合物を次に氷浴で冷却し、そし
て濃塩酸５００mlで徐々に処理する。生成物（３Ａ）の
若干が直接析出し、残りはエーテルを用いて水性濾液か
ら抽出することができる。乾燥生成物（３Ａ）の総収
率：理論値の６６.９％。 ヒダントイン（６Ａ）の分析データ： 融点：２６３〜２６４℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.７０；７.６０；７.１８（３ｄｄ, ３Ｈ, 芳香族
Ｈ） ６.５９（ｓ, １Ｈ, ＝Ｃ−Ｈ）
【００５０】実施例２ ２−ヒドロキシ−３−(３−チエニル)アクリル酸（３
Ｂ）の合成 合成は実施例１に記載のとおりである。 分析データ： ａ） ５−（３−チエニリデン）−２−メチル−３−オ
キサゾリン−４−オン（７Ｂ）： 融点：１１２〜１１６℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ８.３４；７.９０；７.６８（３ｄｄ, ３Ｈ, 芳香族
Ｈ） ７.２８（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.３７（ｓ, １Ｈ, −ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−（３−チエニル）アク
リル酸（８Ｂ）： 融点：２０５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.９３；７.６０；７.４１（３ｄｄ, ３Ｈ, 芳香族
Ｈ） ７.３３（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.００（ｓ, １Ｈ, ＣＨ3, Ｎ−Ａｃ）
【００５１】ｃ） ５−（３−チエニリデン）ヒダント
イン（６Ｂ）： 融点：２７０℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.９５（ｍ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.６８〜７.４２（４ｄｄ, ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.５０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ｄ） ヒドロキシ−３−（３−チエニル）アクリル酸
（３Ｂ）： 融点：１７８〜１８０℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.１０（ｓ, １Ｈ, ＣＯＯＨ） ７.７５；７.４５（２ｍ, ３Ｈ，芳香族Ｈ） ６.５０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ）
【００５２】実施例３ ２−ヒドロキシ−３−(４−ブロモ−３−チエニル）ア
クリル酸(３Ｃ）の合成 合成は実施例１に記載のとおりである。 分析データ： ａ） ５−（４−ブロモ−２−チエニリデン）−２−メ
チル−３−オキサゾリン−４−オン（７Ｃ）： 融点：１４２〜１４５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, Ｄ
ＭＳＯ−ｄ6）： ８.０５；７.７５；７.５４（per ｓ, per １Ｈ, 芳香
族Ｈ, ＝ＣＨ） ２.３７（ｓ, ３Ｈ， ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−(４−ブロモ−２−チ
エニル)アクリル酸（８Ｃ）： 融点：２１３〜２１５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.３０（ｓ, br, １Ｈ, ＮＨ） ７.８０；７.６５；７.５（per ｓ, per １Ｈ, 芳香族
Ｈ, ＝ＣＨ） ２.００（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3Ｎ−Ａｃ）
【００５３】ｃ） ５−（４−ブロモ−２−チエニル）
ヒダントイン（６Ｃ）： 融点：２２０〜２２１℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： １１.３５；１０.５２（２ｓ, ２Ｈ, ＮＨ） ７.７７；７.６５（２ “ｓ", ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.４８（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ｄ） ２−ヒドロキシ−３−(４−ブロモ−２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ｃ）： 融点：１９４〜１９５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.３０（ｓ, br, １Ｈ, ＣＯＯＨ） ７.６３；７.２５（per ｓ〔br〕, per １Ｈ, 芳香族
Ｈ） ６.７５（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ）
【００５４】実施例４ ２−ヒドロキシ−３−(５−ブロモ−２−チエニル）ア
クリル酸(３Ｄ）の合成 合成は実施例１に記載のとおりである。 分析データ： ａ） ５−（５−ブロモ−２−チエニリデン）−２−メ
チル−３−オキサゾリン−４−オン（７Ｄ）： 融点：１９２℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.５５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.５０（ｓ, １Ｈ, ＣＨ） ７.３５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.３５（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−(５−ブロモ−２−チ
エニル)アクリル酸（８Ｄ）： 融点：２２１〜２２２℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.３０（ｓ, １Ｈ, ＮＨ） ７.７５（ｓ〔br〕, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.３５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.２５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.０３（ｓ, ３Ｈ, Ｎ−Ａｃ）
【００５５】ｃ） ５−（５−ブロモ−２−チエニリデ
ン）ヒダントイン（６Ｄ）： 融点：２３５〜２３６℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： １１.３；１０.４（２ｓ, ２Ｈ, ＮＨ） ７.４２；７.３０（２ｄ, ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.５２（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ｄ） ２−ヒドロキシ−３−(５−ブロモ−２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ｄ）： 融点：５６〜５８℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.４０（ｓ〔br〕, １Ｈ, ＣＯＯＨ） ７.０５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.７５（ｄ〔split〕, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.７０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ）
【００５６】実施例５ ２−ヒドロキシ−３−(３−メチル−２−チエニル）ア
クリル酸(３Ｅ）の合成 合成は実施例１に記載のとおりである。 ａ） ５−（３−メチル−２−チエニリデン）−３−メ
チル−３−オキサゾリン−４−オン（７Ｅ）： 融点：１４５〜１４６℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.９０（ｄ，１Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.３５（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.０３（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.４０；２.２５（２ｓ, ６Ｈ, ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−（３−メチル−２−チ
エニル）アクリル酸（８Ｅ）： 融点：２３１〜２３２℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.２５（ｓ, br, １Ｈ, ＮＨ） ７.６５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.６０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.００（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ）
【００５７】ｃ） ５−（３−メチル−２−チエニリデ
ン）ヒダントイン（６Ｅ）： 融点：２１２〜２１４℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： １１.２３；１０.０２（２ｓ, ２Ｈ, ＮＨ） ７.６５；７.００（２ｄ, ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.６０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.２９（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3） ｄ） ２−ヒドロキシ−３−(３−メチル−２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ｅ）： 融点：１８４〜１８５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.４５（ｓ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.９０（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.７０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.２３（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3）
【００５８】実施例６ ２−ヒドロキシ−３−(５−メチル−２−チエニル）ア
クリル酸(３Ｆ）の合成 合成は実施例１に記載のとおりである。 分析データ： ａ） ５−（５−メチル−２−チエニリデン）−２−メ
チル−３−オキサゾリン−４−オン（７Ｆ）： 融点：２８０℃（分解）1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ７.５７（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.４８（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ６.９３（ｄ, split, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.５０；２.３２（２ｓ, per ３Ｈ, ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−(５−メチル−２−チ
エニル)アクリル酸（８Ｆ）： 融点：２５７℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.２０（ｓ, br, １Ｈ, ＮＨ） ７.６０（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.３０（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.８０（ｄ split, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.００（ｓ, ３Ｈ, Ｎ−Ａｃ）
【００５９】ｃ） ５−（５−メチル−２−チエニリデ
ン）ヒダントイン（６Ｆ）： 融点：２６３〜２６４℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： １１.２；１０.２２（２ｓ, ２Ｈ, ＮＨ） ７.４０；６.８５（２ｄ, ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.４５（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.４５（ｓ, ３Ｈ, −ＣＨ） ｄ） ２−ヒドロキシ−３−(５−メチル−２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ｆ）： 融点：１８４〜１８５℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ９.３（ｓ, br, １Ｈ, ＣＯＯＨ） ７.０５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.７（ｄ. split, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.６８（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ２.４３（ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3）
【００６０】実施例７ ２−ヒドロキシ−３−(５−ニトロ−２−チエニル）ア
クリル酸(３Ｇ）の合成 合成は実施例１に如くである。 ａ） ５−（５−ニトロ−２−チエニリデン）−２−メ
チル−３−オキサゾリン−４−オン（７Ｇ）： 融点：＞３００℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ８.０５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.６８（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.４８（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.１６；２.０５（２ｓ, ３Ｈ, ＣＨ3） ｂ） ２−アミノアセチル−３−(５−ニトロ−２−チ
エニル)アクリル酸（８Ｇ）： 融点：２２０℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ８.１５（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.７５（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ７.６０（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ２.０６（ｓ, １Ｈ, ＣＨ3, Ｎ−Ａｃ）
【００６１】ｃ） ５−（５−ニトロ−２−チエニリデ
ン）ヒダントイン（６Ｇ）： 融点：測定せず1 Ｈ ＮＭＲ(１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6)：測定せず ｄ） ２−ヒドロキシ−３−(５−ニトロ−２−チエニ
ル)アクリル酸(３Ｇ）： 融点：１９２〜１９３℃1 Ｈ ＮＭＲ（１００ ＭＨｚ, ケミカルシフトppm, ＤＭ
ＳＯ−ｄ6）： ８.０６（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ７.３４（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.８７（ｓ, １Ｈ, ＝ＣＨ）
【００６２】実施例８ Ｌ−３−（２−チエニル）アラニン（２Ａ）の合成 ２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）アクリル酸３０
ｇ、Ｌ−アスパルテート２９ｇおよびりん酸ピリドキサ
ル４０mgを蒸留水７００mlに溶解し、そしてＮａＯＨを
用いてpHを８とした（溶液１）。得られた溶液を４℃に
冷却した。１リットル反応器に、E. コリ(E. coli)Ｚ
１１９６／６の懸濁液１００ml（乾燥物約６ｇまたは３
０００Ｕトランスアミナーゼ活性に相当）を蒸留水２０
０mlと共に導入した（溶液２）。この懸濁液のpHを８と
し、混合物を４０℃とした。Ｎ2を０.１vvmの割合で通
過させた。溶液１を１６時間の間撹拌しながらこの懸濁
液に計量して入れた。pHをＮａＯＨ／Ｈ2ＳＯ4を用いて
一定に保持した。２４時間後、Ｌ−３−（２−チエニ
ル）アラニンの濃度は２４.６ｇ／リットル（収率８２
％）であった。反応混合物を遠心分離し（１５分、８０
００ｇ）、上澄液をpH１.５とし、活性炭５ｇを加え、
そして懸濁液を７０℃で３０分間撹拌した。次にこれを
４℃に冷却し、そして沈殿を濾去した。濾液をＮａＯＨ
を用いてpH １２とした。溶液をダウエックス(Dowex)１
×２（Ｃｌ）１リットルを充填したカラムに供給した。
このものを水２リットル（アンモニアを用いてpH９とし
た）で洗いすすぎした。Ｌ−３−（２−チエニル）アラ
ニンを０.１０５％酢酸４リットルを用いて溶離した。
溶離液を真空で３００mlに濃縮し、そして得られた濃縮
物を凍結乾燥した。
【００６３】Ｌ−３−（２−チエニル）アラニンの収
量：１７.８ｇ ＨＰＬＣ：純度＞９８％、Ｄ鏡像体＜０.２％ 旋光度：−３０.１°（ｃ＝１，Ｈ2Ｏ）1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.２６（ｄ, １Ｈ, 芳香族Ｈ） ６.８８（ｍ, ２Ｈ, 芳香族Ｈ） ３.８７（“ｔ", １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.３５（ｍ, ２Ｈ, ＣＨ2）13 Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： １７４（ＣＯＯＨ） １３６, １２８, １２８, １２６（芳香族） ５６（＝ＣＨ） ３０（ＣＨ2）
【００６４】実施例９ Ｌ−３−（３−チエニル）アラニン（２Ｂ）の合成 操作は主として実施例８の如くであった。但し、溶液１
はヒドロキシ−３−（３−チエニル）アクリル酸２０ｇ
およびＬ−アスパルテート１９ｇのみを含有していた。
生成物濃度は反応後１１.５ｇ／リットル（５８％）で
あった。イオン交換クロマトグラフィー後、Ｌ−３−
（３−チエニル）アラニン（２Ｂ）７.９ｇ（４０％）
が得られた。 ＨＰＬＣ：純度＞９０％、Ｄ鏡像体＜０.２％ 旋光度：−３８.９°（ｃ＝１，Ｈ2Ｏ）1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.３８；７.１８；６.９７（３ｓ, br, ３Ｈ, 芳香族
Ｈ） ３.８８（“ｔ", １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.１６（ｍ, ２Ｈ, ＣＨ2）
【００６５】実施例１０ Ｌ−３−（４−ブロモ−２−チエニル）アラニン(２Ｃ)
の合成 反応は実施例８と同様に実施した。但し、本例ではより
小さいスケールで行い、単離工程を変更した。 溶液１：（３Ｃ）７５０mg、Ｌ−アスパルテート７２０
mg、ピリドキサルりん酸４mgおよび蒸留水で３５mlとし
た。 溶液２：細胞懸濁液５ml＋蒸留水１０ml ６時間の反応後に、Ｌ−３−（４−ブロモ−２−チエニ
ル）アラニン６０mgが形成された。細胞を分離し、そし
て混合物を活性炭を用いて脱色した後、溶液を中性と
し、そして容量を真空で１０mlとした。
【００６６】混合物を調製用ＨＰＬＣで精製した。ＨＰ
ＬＣの条件：ヌクレオシル(Nucleosil)Ｃ18カラム（１
０cm×４０×２５０mm）；流速２０ml／min-1；溶離液
Ａ：Ｈ 2Ｏ、溶離液Ｂ：アセトニトリル；２５４nmで検
出。８０分でＢの０％〜Ｂの２０％の勾配、次いで６０
分でＢの５０％に至る勾配。（２Ｃ）を含有するフラク
ションを合し、真空濃縮すると水性残渣１０mgが得られ
た。この溶液を凍結乾燥した。（２Ｃ）の収量７０mg
（１０％）。 ＨＰＬＣ：純度＞９５％、Ｄ鏡像体＜０.２％ 旋光度：−２９.３°（ｃ＝１，Ｈ2Ｏ）1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.４０；７.００（２ｓ，２Ｈ, 芳香族Ｈ） ４.００（“ｔ", １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.４２（ｍ, ２Ｈ, ＣＨ2）13 Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： １７３（ＣＯＯＨ） １３８；１３０；１２４；１０９（芳香族） ５６（＝ＣＨ） ３０（ＣＨ2）
【００６７】実施例１１ Ｌ−３−（５−ブロモ−２−チエニル）アラニン(２Ｄ)
の合成 反応は実施例１０と同様に実施した。但し、溶液１は次
のとおり構成されていた： 溶液１：２−ヒドロキシ−３−（５−ブロモ−２−チエ
ニル）アクリル酸１ｇ、Ｌ−アスパルテート０.９７
ｇ、ピリドキサルりん酸４mgおよびＨ2Ｏで３５mlとし
た。 溶液２：細胞懸濁液５ml＋蒸留水１０ml。６時間反応
後、生成物４３mg（４.３％）を検出した。調製用ＨＰ
ＬＣ（実施例１０）によりＬ−３−（５−ブロモ−２−
チエニル）アラニン２７mg（２.７％）が得られた。 ＨＰＬＣ：純度＞８５％、Ｄ鏡像体＜０.２％1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.５０−６.９５（２ｍ，２Ｈ, 芳香族Ｈ） ３.８５（ｍ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.３８（ｍ, ２Ｈ, ＣＨ2）13 Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： １３３；１３２；１３０；１２８（芳香族） ６０（＝ＣＨ） ２３（ＣＨ2）
【００６８】実施例１２ Ｌ−３−（３−メチル−２−チエニル）アラニン(２Ｅ)
の合成 反応は実施例１０と同様に実施した。但し、溶液１は次
のとおり構成されていた： 溶液１：２−ヒドロキシ−３−（５−メチル−２−チエ
ニル）アクリル酸３００mg、Ｌ−アスパルテート２９０
mg、ピリドキサルりん酸４mgおよびＨ2Ｏで３５mlとし
た。 溶液２：細胞懸濁液５ml＋蒸留水１０ml。６時間の反応
後、生成物２１０mg（７０％）を検出した。調製用ＨＰ
ＬＣ（実施例１０）によりＬ−３−（３−メチル−２−
チエニル）アラニン１８４mg（６１％）が得られた。 ＨＰＬＣ：純度＞９５％、Ｄ鏡像体＜０.２％ 旋光度：−８.８°（ｃ＝１.１，１Ｎ ＮａＯＨ）1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.１８；６.８２（２ｄ，２Ｈ, 芳香族Ｈ） ３.７８（ｄｄ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.２３（２ｄｄ, ２Ｈ, ＣＨ） ２.１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）13 Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： １７５（ＣＯＯＨ） １３７；１３１；１３０；１２４（芳香族） ５６（＝ＣＨ） ２９（ＣＨ2） １３（ＣＨ3）
【００６９】実施例１３ Ｌ−３−（５−メチル−２−チエニル）アラニン(２Ｆ)
の合成 反応は実施例１０と同様に実施した。 溶液１：２−ヒドロキシ−３−（５−メチル−２−チエ
ニル）アクリル酸３００mg、Ｌ−アスパルテート２９０
mg、ピリドキサルりん酸４mgおよびＨ2Ｏで３５mlとし
た。 溶液２：細胞懸濁液５ml＋蒸留水１０ml。６時間反応
後、生成物２１０mg（７０％）を検出した。調製用ＨＰ
ＬＣ（実施例１０）によりＬ−３−（５−メチル−２−
チエニル）アラニン１５０mg（５０％）が得られた。 ＨＰＬＣ：純度＞９５％、Ｄ鏡像体＜０.２％ 旋光度：−１９.６°（ｃ＝１，Ｈ2Ｏ）1 Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ７.３０；６.９２（２ｄ，２Ｈ, 芳香族Ｈ） ３.９４（ｍ, １Ｈ, ＝ＣＨ） ３.４０（ｍ, ２Ｈ, ＣＨ2） ２.２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）13 Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ, Ｄ2Ｏ, ケミカルシフトpp
m）： ２１２（ＣＯＯＨ） １４０；１３５；１３４；１２８（芳香族） ５９（＝ＣＨ） ３２（ＣＨ2） １７（ＣＨ3）
【００７０】実施例１４ ＨＰＬＣによる鏡像体純度の測定 溶離液：Ａ） １２.５ｍＭりん酸緩衝液pH７.２ Ｂ） ＡＣＮ 反応剤：１） 分析等級ＥｔＯＨ中ＯＰＡ ５０mg／ml ２） 分析等級ＥｔＯＨ中Ｂｏｃ−Ｌ−システイン１０
０mg／ml ３） １Ｍほう酸カリウム緩衝液pH １０.４ 使用直前、１）および２）各１０μｌを３）９８０μｌ
に加えた。溶液は４℃で約４８時間安定である。 誘導体化：適当な希釈試料１０μｌを反応剤９０μｌと
混和した。１２０秒後、試料を注入することができる。 カラム：同一プレカラム（２０×４.６mm）を伴うグロ
ム(Grom)アミノ−ＯＰＡ（１５０×４.６mm）；流速：
１.５ml min-1；３４０nm検出；勾配：１３分で１０％
〜５０％Ｂ。
【００７１】実施例１５ E. コリ Ａ １１９６／９からの芳香族アミノ酸アミノ
トランスフェラーゼの単離および固定化 酵素の単離：細胞（E. コリ Ｚ １１９６／９）２０ｇ
を緩衝剤（２０mM ＫＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１０μＭピ
リドキサルりん酸、５mM ２−メルカプトエタノール、
１０mMＥＤＴＡおよびリゾチーム１２mg）６０mlに懸濁
し、そして懸濁液を３０℃で１０分間低速で撹拌した。
得られた懸濁液を４℃で１５分間遠心分離し、そして透
明な上澄液を次の処理に使用した。まず、３０％硫酸ア
ンモニウムを用いて４℃で１時間沈降を行い、そして次
に混合物を１５分間１０,０００ｇ／４℃で遠心分離し
た。沈殿を廃棄し、そして上澄液を７０％硫酸アンモニ
ウム（１時間／４℃）での沈降にかけ、そして懸濁液を
上述の如く遠心分離した。沈殿はトランスアミナーゼの
大部分を含有し、そして共役緩衝剤（以下参照）にとっ
た。
【００７２】シリカゲルの活性化：支持体（シリカゲル
ＸＷＰ ５０ＭＰ、グレース(Grace)製）１０ｇを蒸留水
１００mlに懸濁させ、そしてアミノプロピルトリエトキ
シシラン２３００mgを加えた。混合物をＨＣｌを用いて
pH２.５とし、そして６５℃で２時間加熱した。次に混
合物を濾過し、そして中性となるまで水洗し、そしてシ
リカゲルを９０℃で２５時間乾燥した。乾燥支持体をグ
ルタルジアルデヒド２％を含有する０.２５Ｍ ＫＰＰ緩
衝剤pH８の１６０mlにとり、混合物をおだやかに撹拌し
ながら水流ポンプ真空で２時間培養した。次に混合物を
再濾過し、そして水で十分に洗滌した。
【００７３】酵素の共役：活性化された支持体を１０μ
Ｍピリドキサルりん酸および１３０mg／１０,０００Ｕ
酵素を伴う１Ｍ ＫＰＰ緩衝剤（共役緩衝剤）２００ml
にとり、そして４℃で一夜培養した。共役収率は約８０
％であった。このものを実施例１６に記載のとおりのア
ミノ基転移に使用した。
【００７４】実施例１６ 固定化酵素を用いるＬ−３−（２−チエニル）アラニン
の連続合成 ２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）アクリル酸１０
ｇ、Ｌ−アスパラギン酸９.３ｇ、ピリドキサルりん酸
２０mgおよびメルカプトエタノール１mlを蒸留水１００
０mlに溶解し、そして混合物をＮａＯＨを用いてpH８と
した。溶液を４℃に冷却し、反応に用いた。使用する触
媒は蓄積酵素（E. コリ Ｚ １１９６／９からの芳香族
アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）であり、シリカゲ
ル支持体（グレースＸＷＰ ５００ ＭＰ、０.５〜１m
m）で固定化した。乾燥支持体ｇ当り５００〜８００Ｕ
の比活性を有していた。固定化物１０mlをカラム（４０
×１８mm内径）に導入し、これを加熱ジャケットを用い
て４０℃に加熱した。反応溶液を１.５ml ｈ-1の流速で
カラム中を圧送し、そして４℃に再冷却した。得られた
空間−時収率は変換率５０〜６０％で８００mg１-1 ｈ
-1であった。これらの値は８００時間にわたって連続し
て達成された。Ｌ−３−（２−チエニル）アラニンは実
施例８と同様にして単離した。
【００７５】以上、本発明を詳細に説明したが、本発明
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １） 式（Ｉ）
【化１２】 （式中Ｒ1は水素、ハロゲン基、ニトロ基または直鎖も
しくは有枝鎖アルキル基であり、そして２−ヒドロキシ
アクリル酸基はチオフェン環の２−または３−位にあ
る）を有するＬ−チエニルアラニンまたはその塩の製法
において、式（II)
【化１３】 （式中Ｒ1は先の定義のとおりである）を有する化合物
をアミノ酸、アスパラギン、グルタミン、Ｌ−アスパラ
ギン酸および／またはＬ−グルタミン酸の存在下かつ微
生物および／またはトランスアミナーゼ活性を有する酵
素の１種またはそれ以上の存在下に生物変換に付すこと
を特徴とする上記製法。 ２） 微生物および／または酵素が支持体上に固定化さ
れている請求項１の方法。 ３） Ｅ．コリ（E. coli）ATCC 11303および／または
パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denit
rificans）DSM 65を使用する前項１の方法。 ４） 生物変換がＥ．コリATCC 11303により実施され、
Ｅ．コリATCC 11303から単離されたtyrＢ遺伝子を含む
染色体外因子により変換される前項２の方法。 ５） 生物変換が細胞抽出物、単離完全蛋白質または精
製酵素を用いて実施される前項１の方法。
【００７６】６） ヒダントイン誘導体またはアズラク
トン誘導体から得られる２−ヒドロキシ−３−チエニル
アクリル酸を生物変換に使用する前項１の方法。 ７） アミノ基供与体および２−ヒドロキシ−３−チエ
ニルアクリル酸を１：１〜５：１の比で使用する前項１
の方法。 ８） 生物変換をpH５〜９で実施する前項１および３〜
７の方法。 ９） 生物変換を不活性ガス下に実施する前項１および
３〜８の方法。 １０） 反応が連続式またはバッチ式である前項１の方
法。 １１） 前項１〜１０で製造された式（Ｉ）の化合物の
ペプチド合成の単位としての使用。 １２） 前項１〜１０で製造された式（Ｉ）の化合物の
ブラジキニンまたはブラジキニン関連ペプチドの単位と
しての使用。 １３） 式（III）
【化１４】 （式中、Ｒ2は４−ブロモ、５−ブロモ、３−メチル、
５−メチルまたは５−ニトロであり、そしてＲ3が次の
定義の１つを有する）を有する化合物。
【化１５】
【００７７】１４） 式（IV）
【化１６】 （式中Ｒ3は次の定義の１つを有する）を有する化合
物。
【化１７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 マンフレート・シユドク ドイツ連邦共和国デー−6234ハツテルスハ イム／マイン．ホーホハイマーシユトラー セ６ベー (72)発明者 ペーター・ハマン ドイツ連邦共和国デー−6223バーベンハウ ゼン．ビユルガーマイスター−リユール− シユトラーセ20 (72)発明者 ウルリツヒ・レルヒ ドイツ連邦共和国デー−6238ホフハイム・ アム・タウヌス．フオルダーヴアルト24 (72)発明者 ズザネ・グラープライ ドイツ連邦共和国デー−6240ケーニヒシユ タイン／タウヌス．ヘルダーリーンシユト ラーセ７

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ1は水素、ハロゲン基、ニトロ基または直鎖も
    しくは有枝鎖アルキル基であり、そして２−ヒドロキシ
    アクリル酸基はチオフェン環の２−または３−位にあ
    る）を有するＬ−チエニルアラニンまたはその塩の製法
    において、式(II) 【化２】 （式中Ｒ1は先の定義のとおりである）を有する化合物
    をアミノ酸、アスパラギン、グルタミン、Ｌ−アスパラ
    ギン酸および／またはＬ−グルタミン酸の存在下かつ微
    生物および／またはトランスアミナーゼ活性を有する酵
    素の１種またはそれ以上の存在下に生物変換に付すこと
    を特徴とする上記製法。
  2. 【請求項２】 微生物および／または酵素が支持体上に
    固定化されている請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 アミノ基供与体および２−ヒドロキシ−
    ３−チエニルアクリル酸を１：１〜５：１の比で使用す
    る請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 式（III） 【化３】 （式中、Ｒ2は４−ブロモ、５−ブロモ、３−メチル、
    ５−メチルまたは５−ニトロであり、そしてＲ3が次の
    定義の１つを有する）を有する化合物。 【化４】
  5. 【請求項５】 式（IV） 【化５】 （式中Ｒ3は次の定義の１つを有する）を有する化合
    物。 【化６】
JP5190159A 1992-07-31 1993-07-30 ２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸から鏡像体として純粋な形態でｌ−チエニルアラニンを生物工学的に製造する方法およびその使用 Pending JPH06165687A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998048030A1 (fr) 1997-04-23 1998-10-29 Kaneka Corporation Procede d'elaboration de composes amino optiquement actifs

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3786707D1 (de) * 1986-06-04 1993-09-02 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch transaminierung.
WO1995007275A1 (de) * 1993-09-10 1995-03-16 Ciba-Geigy Ag Photochrome verbindungen, verfahren und zwischenprodukte zu deren hestellung und deren verwendung
ATE504572T1 (de) * 1999-09-02 2011-04-15 Shionogi & Co Derivate von aromatische heterocyclen enthaltende integraseinhibitoren
WO2008108998A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Richmond Chemical Corporation Method to increase the yield and improve purification of products from transaminase reactions
KR20170037240A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 주식회사 아미노로직스 광학활성을 가진 티에닐알라닌의 제조 방법
CN109055452B (zh) * 2018-09-25 2021-01-26 南京工业大学 一种制备3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的方法
CN109609478B (zh) * 2019-01-14 2020-06-16 浙江工业大学 α-转氨酶及突变体以及在不对称合成L-草铵膦中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL181508C (nl) * 1974-06-14 1987-09-01 Stamicarbon Werkwijze voor de bereiding van een d-aminozuuramide en een l-aminozuur en werkwijze voor de bereiding van d-fenylglycine.
FR2376860A1 (fr) * 1977-01-07 1978-08-04 Parcor Tetrahydro-4,5,6,7 thieno (2,3-c) et (3,2-c) pyridines, leur procede de preparation et leur application therapeutique
GB8403244D0 (en) * 1984-02-07 1984-03-14 Searle & Co Aminoacids via bioconversion
JPS61181392A (ja) * 1985-02-01 1986-08-14 ジー．デイ．サール　アンド　コンパニー Ｌ‐ドーパの製造方法
DE3786707D1 (de) * 1986-06-04 1993-09-02 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch transaminierung.
FI874212A (fi) * 1986-09-29 1988-03-30 Bristol Myers Co Foerfarande foer framstaellning av 5-aryliden- och 5-alkylidensubstituerade hydantoiner.
FR2632969B1 (fr) * 1988-06-16 1990-11-02 Ecole Nale Superieure Chimie Procede de synthese par voie enzymatique d'acides l-alpha-amines ou l-alpha-amino-n-hydroxyles

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998048030A1 (fr) 1997-04-23 1998-10-29 Kaneka Corporation Procede d'elaboration de composes amino optiquement actifs
US7169592B2 (en) 1997-04-23 2007-01-30 Kaneka Corporation Producing optically active amino compounds

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Publication number Publication date
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DE59309402D1 (de) 1999-04-08

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