CN109055452B - 一种制备3-(2-噻吩基)-l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备3‑(2‑噻吩基)‑L‑丙氨酸的方法,包括以下步骤:(1)将海因、2‑噻吩甲醛在惰性气体保护下在催化剂和水的存在下发生缩合反应,得到2‑噻吩亚海因;(2)将所述2‑噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下发生水解反应,得到2‑噻吩丙酮酸反应液;(3)向步骤(2)得到的反应液中加入水、L‑天冬氨酸,在L‑天冬氨酸转氨酶的作用下发生酶转化反应,得到3‑(2‑噻吩基)‑L‑丙氨酸。本发明操作简便、安全、高效,反应条件温和,污染较小,具有较高的反应收率和较好的产品品质,适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成领域,具体涉及一种制备3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的方法。
背景技术
3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸是一种重要的氮、硫杂环化合物,其衍生物具有良好的抗癌、抗疟疾、抗菌、抗氧化及抗病毒等多种生物活性,被广泛用于药物分子的研发和筛选,属于杂环非天然氨基酸,主要用于多肽合成、医药化工等领域,可以作为细菌培养的常用抑制剂,在肿瘤化学治疗的研究方面,研究带有噻吩基氨基酸的抗代谢物是一个新的研究方向。
目前现有技术中,非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的制备方法路线为2类:1、化学合成3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸,2-噻吩甲醛转化为氯甲基衍生物,然后与N-保护的氨基丙二酸二乙酯偶联,形成的二乙基酯碱性水解产生N-保护的氨基丙二酸,其在沸腾的甲苯中脱羧。在最后步骤中,除去保护基团,得到3-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸,然后在解氨酶(PAL)的作用下,分离得到相应的L型丙烯酸酯,L型丙烯酸酯在氨水和PAL的作用下,离子交换树脂分离提取,得到3-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸(Paizs,Csaba;Katona,Adrian;Retey,Janos Chemistry-A European Journal,2006,vol.12,#10p.2739-2744)。2、将2-噻吩甲醇通过羟基酰氯化做成氯甲基噻吩,再经过和金属钠和乙醇和乙酰氨基丙二酸二乙酯混合合成,再加入酰化酶拆分得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。这些方法工艺繁琐,使用溶剂量大,且成本高,不适宜商业化生产。
发明内容
本发明目的在于克服现有工艺中存在的繁琐性、成本高、收率低等技术问题,提供一种非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的制备方法,该方法简单易控制、成本低、使用溶剂少,污染小,适宜于规模化生产。
为了达到上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种制备杂环非天然氨基酸3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的方法,包括以下步骤:
(1)将海因、2-噻吩甲醛在惰性气体保护下在催化剂和水的存在下发生缩合反应,得到2-噻吩亚海因;
(2)将所述2-噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下发生水解反应,得到2-噻吩丙酮酸反应液;
(3)向步骤(2)得到的2-噻吩丙酮酸反应液中加入水、L-天冬氨酸,在L-天冬氨酸转氨酶(AST)的作用下发生酶转化反应,得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
本发明反应式如下:
步骤(1)中,所述催化剂为乙醇胺、正丙醇胺、异丙醇胺或正丁醇胺,优选为乙醇胺。2-噻吩甲醛、海因和催化剂的摩尔比为1∶(1.00~1.50)∶(0.02~0.50),优选1∶(1.05~1.10)∶(0.05~0.20),更优选1∶1.05∶0.08。
步骤(1)包括以下步骤:将海因、催化剂和水混合,得到混合溶液,在惰性气体保护下于10~20℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛,加毕在80~90℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛,然后再在95~105℃反应,得到2-噻吩亚海因。
优选地,在惰性气体保护下于10~15℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛。
步骤(1)中,在80~90℃反应2~4h,在95~105℃反应0.5~2h。优选地,在85℃反应3h,在95~100℃反应1h。
步骤(2)中,所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾,优选为氢氧化钠。2-噻吩亚海因和碱的摩尔比为1∶(1.0~10.0),优选1∶(2.0~4.0),更优选1∶(2.0~3.0)。
步骤(2)包括以下步骤:将所述2-噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下在85~95℃反应直至溶液中不存在2-噻吩亚海因,然后再在100~105℃反应,得到反应液。
步骤(2)中,在85~95℃反应3-6h,在100~105℃反应0.5~2h。优选地,在85~90℃反应4~5h,在100℃反应1h。
步骤(3)中,2-噻吩亚海因和L-天冬氨酸的摩尔比为1∶(1.00~1.50),优选1∶(1.05~1.20),更优选为1∶1.1。酶转化反应的反应温度为30~40℃,优选30~32℃。
步骤(3)包括以下步骤:向步骤(2)得到的反应液中加入水、L-天冬氨酸,调节pH值,再加入含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵菌体,进行酶转化反应,反应结束后用离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
步骤(3)中,所述的发酵菌体为发酵液或冷冻菌泥,产酶的菌为大肠杆菌(Escherichiacolt)。发酵培养温度为35~37℃,时间20~24h,种子液接种量为5~10%,镜检饱满,OD值为0.4~0.6,酶活:0.5-0.6umol/(ml.min)。冷冻菌泥要高速离心或者絮凝,才能保存。
所述的L-天冬氨酸转氨酶的酶活定义为:每ml发酵液每分钟催化底物生成1μmol产物计所需酶量称为一个酶活单位(U),1U=1umol/(ml.min)。
当所述的发酵菌体为发酵液时,反应液(即2-噻吩海因、L-天冬氨酸和水调节pH值之后的溶液)体积与发酵液体积比为1∶(0.5~5),优选1∶1。
步骤(3)中,所述调节pH值为:使用氢氧化钠水溶液调节pH值至7~10,优选8.0~9.0。所述氢氧化钠水溶液优选为10wt%的氢氧化钠水溶液。
步骤(3)中,所述离子交换树脂为强酸或强碱型离子交换树脂,优选JK008强酸型离子交换树脂。
步骤(1)和步骤(2)所述惰性气体优选为氮气。
有益效果:本发明制备方法简单易控制,降低了了工艺繁琐性,降低了成本,缩短了周期,适用于大规模生产,本发明制得3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸收率高,降低副产物的含量,生产成本低,使用溶剂少,污染小,大幅度提高生产过程的安全性,提高产品的品质。
附图说明
图1为本发明产物的HPLC图谱;
图2为本发明产物的核磁图谱。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细的描述,但他们不是对本发明的进一步限制。以下实施例所用JK008强酸型离子交换树脂购自上海华震科技有限公司。
实验所用主要检测仪器:
1、Agilent 1260 Infinity
2、检验条件:色谱柱:4.6*250mm ODS柱
3、检测波长:210nm
4、流动相:
A:0.20%(质量百分浓度)磷酸二氢钾溶液
B:0.05%(质量百分浓度)三氟乙酸乙腈混合溶液
5、流速:1.0ml/min
6、柱温:室温。
实施例1
含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵液的制备:
具体发酵条件为:产酶的菌为大肠杆菌(Escherichiacolt,ATCC11303),1.5%葡萄糖,0.6%蛋白胨,0.1%牛肉膏,2%玉米浆,0.05%氯化钠,0.05%硫酸镁,0.05%硫酸铵。用氢氧化钠溶液调节pH为7.5~7.7,种子液接种量为5~10%(v/v),于160转/min条件下,35~37℃培养20~24h,镜检饱满,OD值为0.4~0.6,酶活:0.5-0.6umol/(ml.min)。该酶为胞内酶,不需破壁,发酵完毕直接使用含有菌体的发酵液,也可以离心保存后使用。
实施例2
(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入100g(1mol)海因和5g(0.08mol)乙醇胺,充分搅拌,通氮气保护,水浴保温10~15℃,滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛,2小时滴加完毕,滴完结束后升温至85℃,保温3小时,检测溶液中无2-噻吩甲醛,继续升温至95℃,保温1小时,降温到室温,抽滤,少量水洗涤,干燥得到175.2g 2-噻吩亚海因(产率95.5%,纯度99.4%);
(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入50g(0.26mol)2-噻吩亚海因和24g(0.6mol)氢氧化钠,充分搅拌,在氮气保护下升温至90℃保温水解反应4-5h,反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失,继续升温到至100℃,保温1小时,迅速降温到室温待用;
(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)L-天冬氨酸,使用10wt%氢氧化钠水溶液调节pH值到8.0~9.0,再加入含有500ml实施例1制备得到的含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵液,在30~32℃进行酶转化反应,反应结束后用JK008型离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到29.8g 3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸(产率67.7%,以2-噻吩亚海因计)。
(4)通过HPLC、旋光、NMR对样品进行分析,HPLC:99.73%(HPLC图谱见图1),旋光:-31.5°(C=1%IN H2O),NMR(核磁图谱见图2)符合要求,即为3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
实施例3
(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入100g(1mol)海因和5.5g(0.073mol)正丙醇胺,充分搅拌,通氮气保护,水浴保温10~15℃,滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛,2小时滴加完毕,滴完结束后升温至85℃,保温3小时,检测溶液中无2-噻吩甲醛,继续升温至95℃,保温1小时,降温到室温,抽滤,少量水洗涤,干燥得到171.2g 2-噻吩亚海因(产率92.7%,纯度99.2%);
(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入50g(0.26mol)2-噻吩亚海因和30g(0.75mol)氢氧化钠,充分搅拌,在氮气保护下升温至90℃保温水解反应,反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失,继续升温到至100℃,保温1小时,迅速降温到室温待用;
(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)L-天冬氨酸,使用10wt%氢氧化钠水溶液调节pH值到8.0~9.0,再加入含有1000ml实施例1制备得到的含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵液,在30~32℃进行酶转化反应,反应结束后用001*7型离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到29.5g 3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸(产率67.0%,以2-噻吩亚海因计)。
(4)通过HPLC、旋光、NMR对样品进行分析,HPLC:99.50%,旋光:-31.3°(C=1%INH2O),NMR符合要求,即为3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
实施例4
(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入100g(1mol)海因和5.9g(0.08mol)正丁醇胺,充分搅拌,通氮气保护,水浴保温10~15℃,滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛,2小时滴加完毕,滴完结束后升温至85℃,保温3小时,检测溶液中无2-噻吩甲醛,继续升温至95℃,保温1小时,降温到室温,抽滤,少量水洗涤,干燥得到170.8g 2-噻吩亚海因(纯度99.3%);
(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入50g2-噻吩亚海因(0.26mol)和24g(0.6mol)氢氧化钠,充分搅拌,在氮气保护下升温至85℃保温水解反应,反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失,继续升温到至100℃,保温1小时,迅速降温到室温待用;
(3)将上步骤反应溶液迅速加入500ml水和39.3g(0.29mol)L-天冬氨酸,使用10wt%氢氧化钠水溶液调节pH值到8.0~9.0,再加入含有500ml实施例1制备得到的含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵液,在30~32℃进行酶转化反应,反应结束后用JK008型离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到29.2g 3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸(产率66.3%,以2-噻吩亚海因计)。
(4)通过HPLC、旋光、NMR对样品进行分析,HPLC:99.61%,旋光:-31.6°(C=1%INH2O),NMR符合要求,即为3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
实施例5
(1)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入100g(1mol)海因和5.5g异丙醇胺,充分搅拌,通氮气保护,水浴保温10~15℃,滴加入106g(0.95mol)2-噻吩甲醛,2小时滴加完毕,滴完结束后升温至85℃,保温3小时,检测溶液中无2-噻吩甲醛,继续升温至95℃,保温1小时,降温到室温,抽滤,少量水洗涤,干燥得到170.8g2-噻吩亚海因(纯度99.2%);
(2)在带有搅拌、通气和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入50g2-噻吩亚海因(0.26mol)和24g(0.6mol)氢氧化钠,充分搅拌,在氮气保护下升温至85℃保温水解反应,反应过程中检测2-噻吩亚海因基本消失,继续升温到至100℃,保温1小时,迅速降温到室温待用;
(3)将上步骤反应溶液迅速加入1000ml水和39.3g(0.29mol)L-天冬氨酸,使用10wt%氢氧化钠水溶液调节pH值到8.0~9.0,再加入含有500ml实施例1制备得到的含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵液,在30~32℃进行酶转化反应,反应结束后用JK008型离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到29.5g 3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸(产率67.0%,以2-噻吩亚海因计)。
(4)通过HPLC、旋光、NMR对样品进行分析,HPLC:99.65%,旋光:-31.2°(C=1%INH2O),NMR符合要求,即为3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
实施例6
与实施例1相同,区别仅在于:
步骤(1)中,2-噻吩甲醛、海因和乙醇胺的摩尔比为1∶1.00∶0.02。在氮气保护下于15~20℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛。加毕在80℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛,然后再在100℃反应2小时。
步骤(2)中,碱为氢氧化钾,2-噻吩亚海因和碱的摩尔比为1∶1.0。在95℃反应直至溶液中不存在2-噻吩亚海因,然后再在105℃反应2小时。
步骤(3)中,2-噻吩亚海因和L-天冬氨酸的摩尔比为1∶1.00,酶转化反应的反应温度为38~40℃。
得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸,其NMR与实施例1终产物一致。
实施例7
与实施例1相同,区别仅在于:
步骤(1)中,2-噻吩甲醛、海因和乙醇胺的摩尔比为1∶1.50∶0.50。加毕在90℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛,然后再在105℃反应0.5小时。
步骤(2)中,2-噻吩亚海因和氢氧化钠的摩尔比为1∶10.0。
步骤(3)中,2-噻吩亚海因和L-天冬氨酸的摩尔比为1∶1.50,酶转化反应的反应温度为33~35℃。
得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸,其NMR与实施例1终产物一致。
对比例1
(1)在带有搅拌和回流装置的1000ml四口烧瓶中加入500ml水,之后加入100g海因和5g乙醇胺,充分搅拌,水浴保温80~85℃,滴加入106g 2-噻吩甲醛,2小时滴加完毕,滴完结束后85℃保温3小时,检测溶液中无2-噻吩甲醛,继续升温至95℃,保温1小时,降温到室温,抽滤,少量水洗涤,干燥,得到101.8g 2-噻吩亚海因(纯度40.2%)。
对比例2
与实施例1相同,区别仅在于:
步骤(2)没有使用氮气保护。
得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸10.8g(产率12.3%,以2-噻吩亚海因计),HPLC:50.20%。
Claims (7)
1.一种制备3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将海因、催化剂和水混合,得到混合溶液,在惰性气体保护下于10~20℃向所述混合溶液中滴加2-噻吩甲醛,加毕在80~90℃反应直至溶液中不存在2-噻吩甲醛,然后再在95~105℃反应,得到2-噻吩亚海因;
(2)将所述2-噻吩亚海因在惰性气体保护下在碱和水的存在下在85~95℃反应3-6h,直至溶液中不存在2-噻吩亚海因,然后再在100~105℃反应0.5~2h,得到反应液;
(3)向步骤(2)得到的2-噻吩丙酮酸反应液中加入水、L-天冬氨酸,在L-天冬氨酸转氨酶的作用下发生酶转化反应,得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述催化剂为乙醇胺、正丙醇胺、异丙醇胺或正丁醇胺,2-噻吩甲醛、海因和催化剂的摩尔比为1:(1.00~1.50):(0.02~0.50)。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,在80~90℃反应2~4h,在95~105℃反应0.5~2h。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾,2-噻吩亚海因和碱的摩尔比为1∶(1.0~10.0)。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,2-噻吩亚海因和L-天冬氨酸的摩尔比为1∶(1.00~1.50),酶转化反应的反应温度为30~40℃。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,步骤(3)包括以下步骤:
向步骤(2)得到的反应液中加入水、L-天冬氨酸,调节pH值,再加入含有L-天冬氨酸转氨酶的发酵菌体,进行酶转化反应,反应结束后用离子交换树脂提取,浓缩、结晶得到3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述调节pH值为:使用氢氧化钠水溶液调节pH值至7~10。
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