WO2012118318A2 - 비천연 아미노산 생산 균주 및 이를 이용한 비천연 아미노산의 제조 방법 - Google Patents

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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Definitions

  • the present invention relates to a non-natural amino acid producing strain, and more specifically to the non-natural amino acid production corynebacterium strain into which a gene encoding a transaminase is introduced, a method for preparing the strain, and non A method for producing natural amino acids and the use of the non-natural amino acid production of the strain.
  • the non-natural amino acid production strain of the present invention by using a strain of the genus Corynebacterium to maintain a low concentration of alpha chitoglutarate that occurs during general bioconversion at no additional cost, and to efficiently produce glutamic acid used for bioconversion It is possible to produce the desired non-natural amino acid efficiently and simply.
  • Amino acids are very important substances in living things, which can be called the basis of living things. Chemically, the amino acid has a chemical formula of NH 2 CH (R) CO 2 H, in which R is attached to the basic framework of an amino acid consisting of an amino group (-NH 2 ) and a carboxyl group (-COOH). This depends on the type of amino acid. Amino acids are largely classified into natural amino acids, which are about 20 amino acids found in living things, and non-natural amino acids that do not exist in nature. Non-natural amino acids have different properties depending on the change in R and their uses. When producing chiral drugs, amino acids are an important ingredient because of their chirality. In particular, non-natural amino acids are used in the manufacture of chiralized compounds, peptides, and the like, and the demand is gradually increasing, but methods for efficiently producing expensive non-natural amino acids are still inadequate.
  • Non-natural amino acids can be prepared by chemical synthesis methods or biological synthesis methods using biocatalysts.
  • chemical methods have low reaction selectivity, so that the yield of the reaction product is not high.
  • the biological method utilizes an enzyme having excellent reaction selectivity or a microorganism that produces the catalyst as a catalyst so that the yield of the reaction product is high and the amount of by-products is low.
  • the present inventors have found that there is no inhibition of alpha chitoglutarate when using a strain of the genus Corynebacterium in which a gene encoding a transaminase is introduced.
  • the present invention has been accomplished by confirming that high efficiency non-natural amino acids can be prepared without the addition of low glutamic acid.
  • the present invention is to develop an economical method that can maintain a low concentration of alpha chitoglutarate produced as a by-product when producing an unnatural amino acid using transaminase and to produce glutamic acid, which is required as an amino group provider, from glucose and ammonia
  • the purpose is to develop and provide a method for providing a biotransformation reaction.
  • One object of the present invention is to provide a recombinant strain of the genus Corynebacterium for the production of non-natural amino acids, into which a gene encoding a transaminase is introduced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the recombinant strain.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an unnatural amino acid using the recombinant strain.
  • Another object of the present invention is to provide a non-natural amino acid production use of the recombinant strain.
  • the recombinant strain of the present invention and the method for producing non-natural amino acids using the same are non-natural amino acids, which are applied in various fields, such as the manufacture of pharmaceuticals, due to the high production yield and the small amount of by-products, and thus, a large amount of non-natural through a simple separation and purification process.
  • Enable to produce amino acids since the transaminases are not inhibited by the accumulation of alpha-chitoglutarate, which is a disadvantage of the conventional methods for producing non-natural amino acids by bioconversion, it is economical because no additional cost is required to prevent them.
  • 1 is a diagram briefly illustrating a process of producing a non-natural amino acid from glutamic acid and alpha chitosan ( ⁇ -keto acid) using a transaminase.
  • Figure 2 shows a conventional method for maintaining a low concentration of by-product alphachitoglutarate when producing non-natural amino acid from glutamic acid and alpha chitosan using transaminase.
  • Alpha chitoglutarate is converted to glutamic acid by aspartate aminotransferase.
  • HAAE (2- (3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S) -amino ethanoic acid), a non-natural amino acid from 2-oxoethanoic acid).
  • Glucose is converted to alpha chitoglutarate via glycolysis, and alpha chitoglutarate and ammonia are converted to glutamic acid by glutamate dehydrogenase.
  • Glutamic acid transfers an amino group to alpha chitosan (KHAO) by transaminase (BcAT) to produce a non-natural amino acid (HAAE) that is a reaction product.
  • Figure 4 shows the growth curve and glucose reduction and production curve of HAAE (2- (3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S) -amino ethanoic acid) of recombinant Corynebacterium glutamicum.
  • KHAO Kerto acid 2- (3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid
  • Figure 5 shows the growth curve and glucose reduction and L-tert-leucine production curve of the recombinant Corynebacterium glutamicum of the present invention.
  • the present invention provides a recombinant strain of the genus Corynebacterium for the production of non-natural amino acids, into which a gene encoding a transaminase is introduced.
  • non-natural amino acid refers to amino acids other than the 20 amino acids present in nature. Non-natural amino acids are very useful as intermediate products. There are currently over 700 non-natural amino acids known. Non-natural amino acids that can be prepared by the strain for producing non-natural amino acids of the present invention is not limited, for example, (S) -homophenylalanine ((S) -homophenylalanine), (2R, 3S) -3-phenyliso Serine ((2R, 3S) -3-phenylisoserin), L-phosphinothricine, HAAE (2- (3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S) -amino ethanoic acid) or L- It may be tert-leucine (L-tert-leucine), preferably may be HAAE or L-tert-leucine.
  • the present inventors use each of KHAO (Keto acid 2- (3-hydroxy-1-) as a substrate using Corynebacterium glutamicum pEKEx2-BcAT prepared as a strain for producing non-natural amino acids. It was confirmed that HAAE and L-tert-leucine were effectively prepared by adding adamantyl) -2-oxoethanoic acid) and trimethyl pyruvate (FIGS. 4 and 5).
  • transaminase refers to an enzyme that catalyzes a reaction for reversibly transferring an amino group between an amino acid and a keto acid
  • the official name is aminotransferase. It is an enzyme that plays an important role in amino acid metabolism, particularly when non-natural amino acids are produced by biological synthesis methods using biocatalysts. A general method for preparing non-natural amino acids using transaminase is briefly shown in FIG.
  • transaminase transfers the amino group of glutamic acid (-NH 2 ) to alpha chitosan ( ⁇ -keto acid) in the production of non-natural amino acids, by-product alpha chito glutarate and the product ratio It will produce natural amino acids.
  • the transaminase includes any kind of transaminase that can be used to prepare the non-natural amino acid of the present invention, for example, aromatic transaminases, aspartate transaminases Or branched chain amino transferase (Branched chain amino transferase), preferably branched chain aminotransferase.
  • sequence information of the transaminase may be obtained using a known database such as GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • corynebacterium sp. Recombinant strain for producing non-natural amino acids means a strain suitable for the preparation of the non-natural amino acids of the present invention as a Gram-positive bacterium.
  • alpha chitoglutarate produced as a by-product strongly inhibits the transaminase, a non-natural amino acid that is a target product It is difficult to manufacture at high concentrations. As shown in FIG.
  • the strain of Corynebacterium genus of the present invention has a biosynthetic cycle capable of metabolizing alpha chitoglutarate, an inhibitor of transaminase, as a carbon source, resulting in alpha produced as a byproduct Chitoglutarate has the ability to be maintained at low concentrations by metabolizing it to a carbon source without the addition of a separate aspartate.
  • the addition of glutamic acid is absolutely necessary, but since the genus Corynebacterium of the present invention biosynthesizes glutamic acid by itself, no additional addition is required.
  • glucose is converted into alpha chitoglutarate through glycolysis, alpha chitoglutarate and ammonia are converted to glutamic acid by glutamate dehydrogenase, and glutamic acid is transaminase.
  • glutamic acid is transaminase.
  • strains of the genus Corynebacterium of the present invention may include a strain having a biosynthesis cycle capable of self-synthesizing glutamic acid and metabolizing alpha chitoglutarate to a carbon source, but for example, Corynebacterium glutami Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium acetoglutamicum , Corynebacterium acetoacidophilum , Corynebacterium thermoaminogenes Corynebacterium ammonia genomebacilli May be Corynebacterium ammoniagenes , preferably Corynebacterium glutamicum .
  • the recombinant strain may be Accession No.
  • KCCM11172P prepared by transforming a vector expressing the aminotransferase, a branched body derived from E. coli.
  • the use of a strain of the genus Corynebacterium as a parent of a recombinant strain for the production of such non-natural amino acids was first developed by the present inventors.
  • According to one embodiment of the present invention by transforming wild strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032 with pEKEX-2 vector inserted with a gene encoding the aminotransferase, a branched chain derived from E. coli A strain for amino acid production was produced.
  • the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum pEKEx2-BcAT, and was deposited on the Korea Microorganism Conservation Center (3F, Yurim Building, 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) on February 10, 2011, with the deposit number KCCM11172P. Was given.
  • the term "introduction” means an increase in the intracellular activity of the transaminase, which can be achieved by overexpression of the gene encoding the transaminase.
  • Overexpression of the gene of interest can enhance protein expression by modifying the promoter region of the gene and / or the nucleotide sequence of the 5'-UTR region, can be enhanced by the introduction of the gene of interest on the chromosome, Can be introduced with a self promoter or enhanced separate promoter on a vector to transform the strain to enhance the expression level of the protein.
  • overexpression of the target gene can be achieved by introducing a mutation into the open reading frame (ORF) region of the target gene.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150% based on activity or concentration in the wild-type protein or the initial microbial strain. , 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%.
  • the introduction of the gene encoding the transaminase introduces a vector containing the gene of the enzyme, increases the copy number of the gene encoding the transaminase on the chromosome, or enhances the promoter sequence of the transaminase gene.
  • the activity of the enzyme can be introduced by substitution or modification, and most preferably, a vector containing a gene encoding a transaminase is introduced.
  • vector refers to a gene construct that is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • Expression vectors associated with the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors (eg, pVWEx2, pXMJ19 or pEKEK-2, etc.), chromosome integration vectors (eg, pTAC-K99, pXK99E, or pXT99A, etc.).
  • a method of introducing a vector containing a transaminase into a strain of Corynebacterium may be used as a transformation method.
  • Transformation refers to a phenomenon in which DNA is introduced into a host so that the DNA can be reproduced as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration, thereby introducing an external DNA into a cell and causing an artificial genetic change.
  • any transformation method may be used, and may be easily performed according to a conventional method in the art.
  • transformation methods include the CaCl 2 precipitation method, the CaCl 2 method, a Hanahan method that improves efficiency by using a reducing agent called DMSO (dimethyl sulfoxide), electroporation, calcium phosphate precipitation, plasma fusion method, silicon carbide Agitation with fibers, agro bacteria mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation.
  • the method for transforming the vector of the present invention is not limited to the above examples, and transformation methods commonly used in the art may be used without limitation.
  • the present inventors transformed Corynebacterium glutamicum into a vector inserted with the branched aminotransferase gene to prepare a strain for producing non-natural amino acids (see Example 1). .
  • the present invention provides a method for producing a recombinant strain for producing a non-natural amino acid comprising the step of introducing a gene encoding a transaminase to a strain of the genus Corynebacterium.
  • Corynebacterium sp. Strains, transaminase, non-natural amino acids and introduction are as described above.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing by adding a non-natural amino acid substrate to the recombinant strains of the genus Corynebacterium for non-natural amino acid production; And (b) producing a non-natural amino acid through a transaminase reaction in the strain.
  • the non-natural amino acid substrate includes, without limitation, a substrate from which the inventors can produce the non-natural amino acid of interest, for example, HAAE (2- (3-hydroxy-1-).
  • HAAE a substrate from which the inventors can produce the non-natural amino acid of interest
  • KHAO Keto acid 2- (3-hydroxy-1-adamantyl) -2-oxoethanoic acid
  • L-tert is an unnatural amino acid.
  • trimethyl pyruvate may be used as a substrate.
  • transaminase reaction In the transaminase reaction of step (b) of the present invention, glutamic acid produced by the strain of Corynebacterium itself is provided as an amino group provider, as shown in FIG. 3, and then introduced into the recombinant strain of the present invention.
  • a transaminase preferably a branched aminotransferase, transfers the amino group of glutamic acid to the substrate to produce an unnatural amino acid.
  • the term "transaminase reaction” may be used interchangeably with "bioconversion".
  • the step (a) may further comprise the step of treating the ethambutol (ethambutol).
  • ethambutol is a synthetic drug mainly used as a synthetic anti-tuberculosis drug, and inhibits arabinosyl transferase to inhibit the synthesis of cell walls and promote the production of glutamic acid. do.
  • Corynebacterium genus of the present invention is a Gram-positive bacterium, the cell wall is thick, so when treated with drugs that can inhibit the synthesis of the cell wall, such as Esmebutol, the substrate can easily enter the strain of the genus Corynebacterium of the present invention And the production of glutamic acid, an amino group donor, in the cell can be high, thus increasing the production of non-natural amino acids.
  • the treatment of the production of 38 mM HAAE when treated with the sample butol See Example 2-3).
  • Esamebutol can be replaced without limitation by a substance capable of functioning similar to the butembutol, for example, by treating the cells with a surfactant (detergent) or an organic solvent to increase the substrate permeability of the cell wall, production of glutamic acid I can promote it.
  • a surfactant detergent
  • an organic solvent to increase the substrate permeability of the cell wall
  • the method for preparing the non-natural amino acid may further include the step of (c) collecting the non-natural amino acid prepared in step (b) from a strain or a medium.
  • the non-natural amino acid can be harvested from the medium by conventional methods.
  • Non-natural amino acids can be harvested, for example, by removing strain cells from the medium and concentrating the non-natural amino acids, or using ion exchange chromatography.
  • the crystallized non-natural amino acids can be collected, for example, by centrifugation or filtration.
  • the non-natural amino acid dissolved in the medium may be collected after the dissolved non-natural amino acid is crystallized.
  • Recombinant strains produced according to the present invention are continuous in a fed-batch process, batch process (batch culture) or fed-batch process or repeated fed-batch process for the purpose of producing unnatural amino acids. Or can be cultured discontinuously.
  • An overview of known culture methods can be found in Chmiel's textbook (Bioreatechnik 1. Einbowung in die Biovonstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction into Bioprocess Technology) (Gustav Fischer publishing house, Stuttgart, 1991)) or Storhas' textbook (Bioreaktoren und periphere bamboo (Bioprocess). reactors and peripheral devices) (Vieweg publishing house, Braunschweig / Wiesbaden, 1994).
  • the culture medium used should meet the requirements of each strain.
  • Possible carbon sources include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch light cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, palmitic acid, stearic acid and Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerin and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources can be organic nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, corn extract, soy flour and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate Can be. Nitrogen sources can be used individually or as a mixture. Possible sources of phosphorus are potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium containing salts.
  • the culture medium may further comprise salts of metals such as magnesium sulfate or ferric sulfate required for growth. Finally, essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to these substances.
  • the materials described above may be added to the culture in the form of a single batch or may be supplied as appropriate during the culture.
  • alkaline compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used.
  • antifoams such as fatty acid polyglycol esters may be used.
  • Agents such as antibiotics may optionally be added to the medium to maintain the stability of the plasmid.
  • an oxygen containing gas mixture such as oxygen or air is introduced into the culture.
  • the temperature of the culture is generally 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. Cultivation continues until maximal unnatural amino acid is formed. This object is typically achieved within 10 to 100 hours.
  • the present invention provides a non-natural amino acid production use of a recombinant strain into which the gene encoding the transaminase is introduced.
  • the inventors of the present invention transformed pEKEK-2 vector into which the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was inserted with a gene encoding aminotransferase, a brand body derived from Escherichia coli, to prepare a recombinant strain for producing an unnatural amino acid.
  • the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum pEKEx2-BcAT, and after spawn cultivation, followed by cultivation by addition of esmebutol, when the cell concentration reached 0.3 g dry cells / L, respectively, IPTG was added thereto. Expression of the brand chain aminotransferase was induced.
  • non-natural amino acids can be obtained without the need for an additional supply of aspartate. Can produce with efficiency.
  • non-natural amino acids can be prepared without the addition of a separate substrate, glutamic acid, and it was confirmed that various non-natural amino acids can be prepared using the recombinant strain of the present invention by changing the substrate according to the desired non-natural amino acid.
  • Recombinant strain for non-natural amino acid production was prepared by the following method.
  • the recombinant plasmid was constructed to produce a branched chain amino transferase, a branched chain from E. coli.
  • Recombinant plasmids were made by inserting the aminotransferase gene (NCBI Accession No. P0AB80, ilvE ), a branched chain derived from E. coli, into pEKEX-2 (Gene (1991) 102: 9398), a Corynebacterium expression vector.
  • a non-natural amino acid strain was produced by transforming the wild strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032 with the pEKEX-2 vector having the gene inserted therein.
  • the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum pEKEx2-BcAT, and was deposited on the Korea Microorganism Conservation Center (3F, Yurim Building, 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) on February 10, 2011, with the deposit number KCCM11172P. Was given.
  • Corynebacterium glutamicum pEKEx2-BcAT prepared in Example 1 was incubated in BHI (Brain heart infusion) medium containing kanamycin (Kanamycin) for a suitable time, and then used as a seed.
  • BHI Brain heart infusion
  • the culture conditions were temperature 30 °C, 200 rpm stirring speed.
  • Example ⁇ 2-1> 0.1 ml of the recombinant Corynebacterium glutamicum spawn culture medium cultured in Example ⁇ 2-1> was inoculated into 10 ml of SiGX2 medium (CGXII medium (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595)). Then, incubated with stirring at 30 ° C at 200 rpm. When the cell concentration reached 0.3 g dry cells / L, IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was added to the culture at a concentration of 0.5 mM to induce the expression of the branched aminotransferase.
  • CGXII medium J. Bacteriol. (1993) 175: 5595
  • KHAO Kerto acid 2- (3-hydroxy-1-adamantyl) -2-oxoethanoic acid
  • non-natural amino acid production strain of the present invention does not need to provide glutamic acid as a provider of amino groups for the production of non-natural amino acids, and the production of by-product alpha-chitoglutarate is a transaminase, a bioconversion enzyme. It supports that it can stably produce non-natural amino acids without inhibition.
  • Example ⁇ 2-1> 0.1 ml of the recombinant Corynebacterium glutamicum spawn culture medium cultured in Example ⁇ 2-1> was inoculated into 10 ml of Siex-extu medium containing 50 mg / l of esambutol, and then 30 Incubation was carried out at 200 ° C. with stirring.
  • IPTG was added to the culture medium at 0.5 mM to induce the expression of the branched aminotransferase.
  • KHAO was added to the culture medium at 50 mM to initiate a bioconversion reaction.
  • Example ⁇ 2-1> 0.1 ml of the recombinant Corynebacterium glutamicum spawn culture medium cultured in Example ⁇ 2-1> was inoculated into 10 ml of Siegextu medium added with 10 mg / l of emusbutol, followed by 200 at 30 ° C. Incubate with stirring at rpm.
  • IPTG was added to the culture medium at 0.5 mM to induce the expression of the branched aminotransferase.
  • trimethyl pyruvate was added to the culture medium at 67 mM to initiate a bioconversion reaction.

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Abstract

본 발명은 비천연 아미노산 생산 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움속 균주, 상기 균주를 제조하는 방법, 상기 균주를 이용하여 비천연 아미노산을 제조하는 방법 및 상기 균주의 비천연 아미노산 생산 용도에 관한 것이다. 본 발명의 비천연 아미노산 생산용 균주는 일반적인 생물전환 중 발생하는 알파키토글루타레이트를 추가 비용 없이 저농도로 유지하고, 생물전환에 사용되는 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 효율적이며 간편하게 원하는 비천연 아미노산을 제조할 수 있다.

Description

비천연 아미노산 생산 균주 및 이를 이용한 비천연 아미노산의 제조 방법
본 발명은 비천연 아미노산 생산 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움속 균주, 상기 균주를 제조하는 방법, 상기 균주를 이용하여 비천연 아미노산을 제조하는 방법 및 상기 균주의 비천연 아미노산 생산 용도에 관한 것이다. 본 발명의 비천연 아미노산 생산용 균주는 일반적인 생물전환 중 발생하는 알파키토글루타레이트를 추가 비용 없이 저농도로 유지하고, 생물전환에 사용되는 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 효율적이며 간편하게 원하는 비천연 아미노산을 제조할 수 있다.
아미노산은 생명체의 근본이라고 할 수 있는, 생명체에서 매우 중요한 물질이다. 화학적으로 아미노산은 NH2CH(R)CO2H의 화학식을 갖고 있는데, 아미노기 (-NH2)와 카르복실기 (-COOH)로 이루어진 아미노산의 기본틀에 R이 곁가지로 붙어 있는 형태를 취하고 있으며, R이 무엇이냐에 따라 아미노산의 종류가 달라진다. 아미노산은 크게 생명체에서 발견되는 20여가지의 아미노산인 천연 아미노산과 천연에 존재하지 않는 비천연 아미노산으로 분류된다. 비천연 아미노산은 R의 변화에 따라 성질이 달라지며 그 용도 또한 달라진다. 키랄성 의약품을 제조할 때 아미노산은 자체의 키랄성 때문에 중요한 원료가 된다. 특히 비천연 아미노산은 키랄화화물, 펩타이드 의약품 등의 제조에 사용되고 있으며 그 수요는 점차 증가하고 있는 추세이나 고가의 비천연 아미노산을 효율적으로 제조하는 방법은 여전히 미비하다.
비천연 아미노산은 화학 합성 방법이나 생물촉매를 사용하는 생물학적인 합성 방법에 의해 제조될 수 있는데, 보통 화학적인 방법은 반응 선택성이 낮아 반응산물의 생산 수율이 높지 않고 부산물이 생성되어 분리 및 정제 공정이 복잡하게 되지만, 생물학적인 방법은 반응 선택성이 우수한 효소나 이를 생산하는 미생물을 촉매로 이용하여 반응산물의 생산 수율이 높고 부산물의 생성량이 적다.
한편, 효소를 이용하여 비천연 아미노산을 제조할 때, 보통 아미노기 제공자 (amino group donor)로 글루탐산이 사용되고, 생산물로 비천연 아미노산과 알파키토글루타레이트가 생성되는데 (도 1), 생성된 알파키토글루타레이트가 생물전환 효소인 트랜스아미나제를 강하게 저해하여 목표산물을 고농도로 생산하기 어렵다. 따라서 생물전환 중 알파키토글루타레이트를 저농도로 유지하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다. 생물전환에 의한 아미노산 생산 중 알파키토글루타레이트를 저농도로 유지하는 방법으로 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제를 이용하는 방안 (도 2)이 보고되었지만, 이 방법은 아스파르테이트를 추가적으로 공급해야 하므로 생산 비용의 증가가 발생 된다. 따라서 생물전환 중 알파키토글루타레이트의 저해 작용을 추가비용 없이 효율적으로 완화시킬 수 있는 방안의 개발이 요구되고 있다. 또한 생물전환에서 아미노기 제공자로 사용되는 글루탐산을 저렴한 유기물로 대체할 수 있다면 생산비용의 절감을 가져올 수 있다.
본 발명자들은 비천연 아미노산의 효율적인 제조 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 트랜스아미나제를 코딩한 유전자를 도입한 코리네박테리움 속 균주를 이용할 경우, 알파키토글루타레이트의 저해가 없으며, 아미노 그룹 제공자로 글루탐산의 추가 없이 고 효율의 비천연 아미노산을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 트랜스아미나제를 이용하여 비천연 아미노산을 제조할 때 부산물로 생성되는 알파키토글루타레이트를 저농도로 유지할 수 있는 경제적인 방법의 개발과 아미노기 제공자로 요구되는 글루탐산을 포도당과 암모니아로부터 생산하여 생물전환 반응에 제공하는 방법을 개발하여 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 하나의 목적은 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된, 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움 속 재조합 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 균주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 균주를 이용하여 비천연 아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 균주의 비천연 아미노산 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 재조합 균주 및 이를 이용한 비천연 아미노산의 생산 방법은 의약품의 제조 등 다양한 분야에서 적용되는 비천연 아미노산을 높은 생산 수율 및 적은 생성량의 부산물로 인하여, 간단한 분리 및 정제 공정을 거쳐 대량의 비천연 아미노산을 생산할 수 있게 한다. 아울러, 기존의 생물전환에 의한 비천연 아미노산 생산 방법의 단점이었던 알파키토글루타레이트의 축적에 의한 트랜스아미나제 저해를 받지 않으므로 이를 막기 위한 추가비용이 필요 없어서 경제적이다.
도 1은 트랜스아미나제를 이용하여 글루탐산과 알파키토산 (α-keto acid)으로부터 비천연아미노산의 생산 과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 트랜스아미나제를 이용하여 글루탐산과 알파키토산으로부터 비천연아미노산을 생산할 때 부산물인 알파키토글루타레이트를 저농도로 유지하는 기존의 방법을 나타낸다. 알파키토글루타레이트가 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제에 의해 글루탐산으로 전환된다.
도 3은 대장균 유래의 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제를 발현하는 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 포도당, 암모니아, 알파키토산인 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)- 2-oxoethanoic acid)로부터 비천연아미노산인 HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid)를 생산하는 과정을 간략히 나타낸 도이다. 포도당이 해당과정을 거처 알파키토글루타레이트로 전환되고, 글루탐산탈수소효소에 의해 알파키토글루타레이트와 암모니아가 글루탐산으로 전환된다. 글루탐산은 트랜스아미나제 (BcAT)에 의해 아미노기를 알파키토산 (KHAO)에 전달하여 반응산물인 비천연 아미노산 (HAAE)이 생성된다.
도 4는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 곡선과 포도당 감소 및 HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid)의 생산 곡선을 나타낸다. 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 에샘뷰톨이 50 ㎎/ℓ로 첨가된 시지엑스투 배지(CGXII medium)에 접종한 후에, 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달했을 때 IPTG를 0.5 mM로 첨가하여 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제 생산을 유도하였으며, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달했을 때 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)- 2-oxoethanoic acid)를 50 mM로 첨가하여 HAAE 생산 반응을 개시하였다. 배양 온도는 30℃, 교반속도는 200 rpm으로 조절되었다.
도 5는 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 곡선과 포도당 감소 및 L-tert-leucine의 생산 곡선을 나타낸다. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 에샘뷰톨이 10 ㎎/ℓ로 첨가된 시지엑스투 배지(CGXII medium)에 접종한 후에, 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, IPTG를 0.5 mM로 첨가하여 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제 생산을 유도하였으며, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, 트리메틸 피루베이트 (trimethyl pyruvate)를 67 mM로 첨가하여 반응산물의 생산을 개시하였다. 배양 온도는 30℃, 교반속도는 200 rpm으로 조절되었다.
하나의 양태로서, 본 발명은 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된, 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움 속 재조합 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어, "비천연 아미노산"이란 천연에 존재하는 20개의 아미노산 이외의 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산은 의약품의 중간 생성물로 매우 유용하게 사용되고 있다. 비천연 아미노산은 현재 700 여 종이 알려져 있다. 본 발명의 비천연 아미노산 생산용 균주에 의해서 제조될 수 있는 비천연 아미노산은 그 제한이 없으나, 그 예로 (S)-호모페닐알라닌 ((S)-homophenylalanine), (2R,3S)-3-페닐이소세린 ((2R,3S)-3-phenylisoserin), L-포스피노쓰리신 (L-phosphinothricine), HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid) 또는 L-tert-루이신 (L-tert-leucine)일 수 있으며, 바람직하게는 HAAE 또는 L-tert-루이신일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명자들은 비천연 아미노산 생산용 균주로 제작한 코리네박테리움 클루타미쿰 pEKEx2-BcAT를 이용하여 기질로 각각 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid) 및 트리메틸 피루베이트 (trimethyl pyruvate)를 첨가하여 HAAE 및 L-tert-루이신을 효과적으로 제조하는 것을 확인하였다 (도 4 및 5).
본 발명에서 용어, "트랜스아미나제 (transaminase)"란 아미노산과 케토산과의 사이에서 아미노기를 가역적으로 전이시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 정식 명칭은 아미노트랜스퍼라제이다. 이는 아미노산 대사에 중요한 역할을 하는 효소로, 특히 비천연 아미노산을 생물 촉매를 사용하여 생물학적 합성 방법에 의해 제조할 때 중요한 역할을 한다. 트랜스아미나제를 이용하여 비천연 아미노산을 제조하는 일반적인 방법은 도 1에 간략히 도시하였다. 도 1에서 보듯이, 일반적으로 트랜스아미나제는 비천연 아미노산의 제조시 글루탐산의 아미노기 (-NH2)를 알파키토산 (α-keto acid)으로 전이시켜서, 부산물로 알파키토글루타레이트 및 생성물인 비천연 아미노산을 제조하게 되는 것이다. 상기 트랜스아미나제는 본 발명의 비천연 아미노산을 제조하는 데 사용될 수 있는 트랜스아미나제의 종류는 제한 없이 포함되나, 그 예로 방향족 트랜스아미나제 (aromatic transaminases), 아스파르테이트 트랜스아미나제 (aspartate transaminases) 또는 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제 (Branched chain amino transferase)일 수 있으며, 바람직하게는 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제이다. 이와 같은 트랜스아미나제의 서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터 베이스를 이용하여 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 재조합 균주"는 그람양성 세균으로 본 발명의 비천연 아미노산의 제조에 적합한 균주를 의미한다. 일반적으로 트랜스아미나제를 이용한 생물전환 방법에 의한 비천연 아미노산의 제조시, 도 1에서 도시한 바와 같이, 부산물로 생성된 알파키토글루타레이트가 트랜스아미나제를 강하게 저해하여 목표 산물인 비천연 아미노산을 고농도로 제조하기 어렵다. 이와 같은 문제점인 트랜스아미나제를 저해하는 알파키토글루타레이트를 저농도로 유지하는 방법으로 도 2에 도시한 바와 같이, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제를 이용하여 글루탐산으로 변형시키는 방법이 제안된 바 있으나, 이 경우 아스파르테이트를 추가적으로 공급해야 하며, 결국 생산 비용의 증가가 발생하는 단점이 있다. 그러나 본 발명의 코리네박테리움 속 균주의 경우, 도 3에 도시한 바와 같이, 트랜스아미나제의 저해제인 알파키토글루타레이트를 탄소원으로 대사할 수 있는 생합성 사이클을 갖고 있어서, 부산물로 생성된 알파키토글루타레이트를 별도의 아스파르테이트의 첨가 없이 탄소원으로 대사하여 저농도로 유지시킬 수 있는 능력이 있다. 또한 트랜스아미나제를 이용하여 비천연 아미노산을 제조할 때는 글루탐산의 추가가 반드시 필요하나 본 발명의 코리네박테리움 속은 글루탐산을 자체적으로 생합성하기 때문에 별도의 추가가 필요 없다. 즉, 본 발명의 코리네박테리움 속 균주는 포도당이 해당과정을 거쳐 알파키토글루타레이트로 전환되고, 글루탐산탈수소효소에 의해 알파키토글루타레이트와 암모니아가 글루탐산으로 전환되며, 글루탐산은 트랜스아미나제에 의해 아미노기를 기질인 알파키토산에 전달하여 비천연 아미노산을 생산하게 된다. 이와 같이 본 발명의 코리네박테리움 속 균주는 글루탐산을 자체 생합성하고, 알파키토글루타레이트를 탄소원으로 대사할 수 있는 생합성 사이클을 갖고 있는 균주는 제한 없이 포함되나, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필럼 (Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)이다. 또한, 상기 재조합 균주는 대장균 유래의 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제를 발현하는 벡터를 형질전환하여 재조한 기탁번호 KCCM11172P 일 수 있다. 이와 같은 비천연 아미노산의 생산용 재조합 균주의 모체로서 코리네박테리움 속 균주를 이용하는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 대장균 유래의 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 삽입된 pEKEX-2 벡터로 야생균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032을 형질전환시켜서 비천연 아미노산 생산용 균주를 제작하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 pEKEx2-BcAT로 명명하고, 2011년 2월 10일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 3층)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11172P를 부여받았다.
본 발명에서, 용어 "도입"은 트랜스아미나제의 세포 내 활성의 증가를 의미하며, 이는 상기 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 부위 및/또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있으며, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다. 또한, 목적 유전자의 ORF (open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 목적 유전자의 과발현을 시킬 수 있다. 과발현의 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것을 알 수 있다. 바람직하게는 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자의 도입은 당해 효소의 유전자를 갖는 벡터를 도입하거나, 염색체상에서 트랜스아미나제를 코딩하고 있는 유전자의 카피수를 증가시키거나, 트랜스아미나제 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시킴으로써 효소의 활성을 도입시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 것이다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 플라스미드 벡터 (예: pVWEx2, pXMJ19 또는 pEKEK-2 등), 크로모좀 인테그레이션 벡터 (예: pTAC-K99, pXK99E 또는 pXT99A 등) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 코리네박테리움 속 균주에 트랜스아미나제를 포함하는 벡터를 도입하는 방법은 형질전환 방법이 이용될 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명자들은 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제 유전자를 삽입한 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환하여 비천연 아미노산 생산용 균주를 제조하였다 (실시예 1 참조).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 속 균주를 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 비천연 아미노산 제조용 재조합 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
코리네박테리움 속 균주, 트랜스아미나제, 비천연 아미노산 및 도입은 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움 속 재조합 균주에 비천연 아미노산 기질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 균주 내에서 트랜스아미나제 반응을 통해 비천연 아미노산을 생산하는 단계를 포함하는, 비천연 아미노산의 제조 방법을 제공한다.
(a) 단계에 있어서, 비천연 아미노산 기질은 본 발명자가 목적고자 하는 비천연 아미노산을 제조할 수 있는 기질은 제한 없이 포함되나, 그 예로 비천연 아미노산인 HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid)를 제조할 경우에는 기질로 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid)를 사용하며, 비천연 아미노산인 L-tert-루이신을 제조할 경우에는 기질로 트리메틸 피루베이트 (trimethyl pyruvate)를 사용할 수 있다.
본 발명의 (b) 단계의 트랜스아미나제 반응은 도 3에 도시된 바와 같이, 코리네박테리움 속 균주가 자체적으로 생산하는 글루탐산이 아미노기 제공자로 제공되며, 그 후 본 발명의 재조합 균주에 도입된 트랜스아미나제, 바람직하게는 브랜치드체인 아미노트랜스퍼라제가 글루탐산의 아미노기를 기질로 전이시켜서 비천연 아미노산을 제조한다. 본 발명에서 용어, "트랜스아미나제 반응"은 "생물전환"과 혼용되어 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 (a) 단계에 에샘뷰톨 (ethambutol)을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "에샘뷰톨 (ethambutol)"은 합성 항결핵약으로 주로 사용되는 합성약제로서, 아라비노실 트랜스퍼라제 (arbinosyl transferase)를 억제하여 세포 벽의 합성을 저해하고 글루탐산의 생산을 촉진하는 작용을 한다. 본 발명의 코리네박테리움 속은 그람 양성 세균으로 세포벽이 두꺼우므로 에샘뷰톨과 같이 세포벽의 합성을 저해할 수 있는 약물을 처리할 경우, 기질이 용이하게 본 발명의 코리네박테리움 속 균주로 들어갈 수 있고 세포 내에서 아미노기 제공자인 글루탐산의 생산이 높아질 수 있어서, 비천연 아미노산의 생산량이 증가된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 에샘뷰톨을 처리하지 않은 경우에 13 mM의 HAAE를 생산한 것에 비해 (실시예 2-2 참조), 에샘뷰톨을 처리할 경우에 38 mM의 HAAE를 생산하는 것을 (실시예 2-3 참조) 확인하였다. 이와 같은 결과는 에샘뷰톨의 처리가 본 발명의 비천연 아미노산을 고 효율로 제조할 수 있도록 도와준다는 것을 뒷받침하는 결과이다. 이와 같은 에샘뷰톨은 에샘뷰톨과 유사한 기능을 할 수 있는 물질로 제한 없이 대체할 수 있으나, 그 예로 계면활성제 (detergent) 또는 유기용매 등으로 균체를 처리하여 세포벽의 기질 투과성을 높여서, 글루탐산의 생산을 촉진할 수 있다.
상기 비천연 아미노산의 제조 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 비천연 아미노산을 균주 또는 배지로부터 수거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
배양 완료 후에 배지로부터 통상적인 방법으로 비천연 아미노산을 수거할 수 있다. 비천연 아미노산은, 예를 들면 배지로부터 균주 세포를 제거하고 비천연 아미노산을 농축시키거나, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수거할 수 있다. 비천연 아미노산이 결정화하고 침전하는 조건하에서 배양하는 경우, 결정화된 비천연 아미노산은, 예를 들면 원심분리 또는 여과에 의해 수거할 수 있다. 이 경우, 배지에 용해된 비천연 아미노산은 용해된 비천연 아미노산이 결정화된 후에 수거할 수도 있다.
본 발명에 따라 생산된 재조합 균주는 비천연 아미노산 제조를 목적으로 유가식 공정, 배치식 공정(배치식 배양) 또는 페드-배치식 (fed-batch) 공정 또는 반복된 페드-배치식 공정으로 연속식으로 또는 불연속식으로 배양될 수 있다. 공지의 배양 방법의 개요는 Chmiel의 교재(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction into Bioprocess Technology) (Gustav Fischer publishing house, Stuttgart, 1991)) 또는 Storhas의 교재(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioprocess reactors and peripheral Devices) (Vieweg publishing house, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기술되어 있다. 사용되는 배양 배지는 각각의 균주의 요건과 들어맞아야 한다. 여러가지 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 핸드북 "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개괄되어 있다. 가능한 탄소원은 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분 빛 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀산과 같은 지방산, 글리세린 및 에탄올과 같은 알콜, 그리고 아세트산과 같은 유기산이다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 추출수, 대두분 및 우레아와 같은 유기의 질소 함유 화합물, 또는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 탄산 암모늄 및 질산 암모늄과 같은 무기 화합물이 될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 가능한 인의 공급원은 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 대응하는 나트륨 함유 염들이다. 배양 배지는 더 나아가서, 성장에 필요한 황산 마그네슘 또는 황산 제이철과 같은 금속의 염들을 포함할 수 있다. 마지막으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 상기 물질들에 더하여 사용될 수 있다. 상기한 물질들은 단일 배치의 형태로 배양물에 첨가될 수 있고 또는 배양 동안에 알맞게 공급될 수도 있다. 배양물의 pH 조절을 위해, 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아와 같은 알칼리성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물이 알맞게 사용된다. 거품 발달을 제어하기 위해, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 사용될 수도 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하도록 항생제와 같은 작용물질을 선택적으로 배지에 첨가할 수도 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 공기와 같은 산소 함유 기체 혼합물이 배양물에 도입된다. 배양물의 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 최대한도의 비천연 아미노산이 형성될 때까지 계속된다. 이 목적은 전형적으로 10 내지 100 시간 내에 달성된다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 균주의 비천연 아미노산 생산 용도를 제공한다.
본 발명자들은 야생균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 대장균 유래의 브랜드체인 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 삽입한 pEKEK-2 벡터를 형질전환하여 비천연 아미노산 생산용 재조합 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 pEKEx2-BcAT로 명명한 후, 종균 배양 후, 에샘뷰톨을 첨가하여 배양 후, 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달하였을 때, 각각 IPTG를 첨가하여 브랜드체인 아미노트랜스퍼라제의 발현을 유도하였다. 이후, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달하였을 때 기질인 KHAO를 첨가하여 생물전환을 시작하여 HAAE가 40 mM로 제조되는 것을 확인하였으며 (도 4), 기질인 트리메틸 피루베이트를 첨가하여 생물전환을 시작하여 L-tert-루이신이 34 mM로 제조되는 것을 확인하였다 (도 5). 또한, 배양 기간에 따라서 비천연 아미노산의 제조 양이 증가하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과는 본 발명의 생물전환에 따라 생성되는 부산물인 알파키토글루타레이트가 본 발명의 재조합 균주 내에서 탄소원으로 사용되어 트랜스아미나제를 저해시키는 작용을 하지 않는 것을 뒷받침하는 것이다. 따라서, 아스파르테이트의 추가 공급의 필요 없이 비천연 아미노산을 고 효율로 생산할 수 있다. 또한 별도의 기질인 글루탐산의 추가 없이 비천연 아미노산을 제조할 수 있으며, 목적하는 비천연 아미노산에 따라 기질을 변경하여 본 발명의 재조합 균주를 이용할 경우 다양한 비천연 아미노산을 제조할 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 비천연 아미노산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 제조
비천연 아미노산 생산용 재조합 균주를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
대장균 유래의 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제(branched chain amino transferase)를 생산하도록 재조합 플라스미드를 구축하였다. 재조합 플라스미드는 코리네박테리움 발현 벡터인 pEKEX-2(Gene (1991) 102:9398)에 대장균 유래의 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제 유전자 (NCBI Accession No. P0AB80, ilvE)를 삽입하여 만들었다.
상기 유전자가 삽입된 pEKEX-2 벡터로 야생균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032을 형질전환시켜서 비천연 아미노산 생산용 균주를 제작하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 pEKEx2-BcAT로 명명하고, 2011년 2월 10일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 3층)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11172P를 부여받았다.
실시예 2: 비천연 아미노산인 HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid) 의 제조
본 실시예 2의 비천연 아미노산인 HAAE를 생산하기 위한 반응은 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid)와 포도당 및 암모니아를 기질로 사용하였다. 기질로부터 HAAE가 생산되는 반응은 도 3과 같다.
<2-1> 종균 배양
상기 실시예 1에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 pEKEx2-BcAT를 카나마이신 (Kanamycin)이 함유된 BHI (Brain heart infusion) 배지에서 적당한 시간 동안 배양한 후, 종균으로 사용하였다. 배양 조건은 온도 30℃, 교반속도 200 rpm 이었다.
<2-2> HAAE 생산
상기 실시예 <2-1>에서 배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 종균 배양액 0.1 ㎖을 10 ㎖의 시지엑스투 배지 (CGXII medium (J. Bacteriol. (1993) 175:5595))에 접종한 후, 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.5 mM 농도로 배양액에 첨가하여, 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제의 발현을 유도하였다. 이 후, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)- 2-oxoethanoic acid)를 배양액에 50 mM로 첨가하여 생물전환 반응을 시작하였다.
그 결과, 생물전환을 개시한 후, 66 시간이 지났을 때, HAAE가 13 mM로 생산되었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 비천연 아미노산 생산용 균주가 비천연 아미노산 생산을 위하여 아미노 그룹의 제공자로 글루탐산의 제공이 필요 없으며, 생산된 부산물인 알파키토글루타레이트가 생물전환 효소인 트랜스아미나제의 저해 없이 안정적으로 비천연 아미노산을 생산할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
<2-3> 에샘뷰톨(ethambutol)을 처리한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 HAAE 생산
상기 실시예 <2-1>에서 배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 종균 배양액 0.1 ㎖을 에샘뷰톨 (ethambutol)이 50 ㎎/ℓ로 첨가된 10 ㎖의 시지엑스투 배지에 접종한 후, 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달했을 때 IPTG를 0.5 mM로 배양액에 첨가하여 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제의 발현을 유도하였다. 이 후, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, KHAO를 배양액에 50 mM로 첨가하여 생물전환 반응을 시작하였다.
그 결과, 생물전환을 개시한 후, 66 시간이 지났을 때, HAAE가 40 mM로 생산되었다 (도 4).
실시예 3: 비천연 아미노산 L-tert-leucine의 제조
상기 실시예 <2-1>에서 배양한 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 종균 배양액 0.1 ㎖을 에샘뷰톨이 10 ㎎/ℓ로 첨가된 10 ㎖의 시지엑스투 배지에 접종한 후, 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 균체 농도가 0.3 g dry cells/ℓ에 도달했을 때 IPTG를 0.5 mM로 배양액에 첨가하여 브렌치드체인 아미노트랜스퍼레라제의 발현을 유도하였다. 이 후, 균체 농도가 0.5 g dry cells/ℓ에 도달했을 때, 트리메틸 피루베이트 (trimethyl pyruvate)를 배양액에 67 mM로 첨가하여 생물전환 반응을 시작하였다.
그 결과, 생물전환을 개시한 후, 35 시간이 지났을 때, L-tert-leucine이 34 mM로 생산되었다 (도 5).
상기와 같은 결과들은 본 발명의 재조합 균주를 이용할 경우 원하는 비천연 아미노산의 기질을 첨가해주는 것에 따라 다양한 비천연 아미노산의 별도의 추가 물질 없이 고효율로 손쉽게 제조할 수 있음을 시사한다.
Figure PCTKR2012001488-appb-I000001

Claims (12)

  1. 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자가 도입된, 비천연 아미노산 생산용 코리네박테리움 속 재조합 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 도입은 상기 유전자를 포함하는 벡터를 도입하거나, 염색체상에서 당해 유전자의 카피수를 증가시키거나, 당해 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시킴으로써 이루어지는 것인 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트랜스아미나제는 방향족 트랜스아미나제 (aromatic transaminase), 아스파르테이트 트랜스아미나제 (aspartate transaminase) 또는 브렌치드체인 아미노트랜스퍼라제 (Branched chain amino transferase)인 것인 재조합 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필럼 (Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)로 이루어진 군에서 선택된 것인 재조합 균주.
  5. 제3항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM11172P인 것인 재조합 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 (S)-호모페닐알라닌 ((S)-homophenylalanine), (2R,3S)-3-페닐이소세린 ((2R,3S)-3-phenylisoserin), L-포스피노쓰리신 (L-phosphinothricine), HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid) 또는 L-tert-루이신 (L-tert-leucine)인 것인 재조합 균주.
  7. 코리네박테리움 속 균주를 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 비천연 아미노산 제조용 재조합 균주를 제조하는 방법.
  8. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 균주에 비천연 아미노산 기질을 첨가하여 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 균주 내에서 트랜스아미나제 반응을 통해 비천연 아미노산을 생산하는 단계를 포함하는, 비천연 아미노산의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비천연 아미노산 기질은 KHAO (Keto acid 2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-2-oxoethanoic acid)이고, 생산된 비천연 아미노산은 HAAE (2-(3-hydroxy-1-adamantyl)-(2S)-amino ethanoic acid)인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 비천연 아미노산 기질은 트리메틸 피루베이트 (trimethyl pyruvate)이고, 생산된 비천연 아미노산은 L-tert-루이신인 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계에 에샘뷰톨 (ethambutol)을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 비천연 아미노산을 균주 또는 배지로부터 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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