BRPI0707454A2

BRPI0707454A2 - processo para a preparação de aminas quirais opticamente ativas

Info

Publication number: BRPI0707454A2
Application number: BRPI0707454-9A
Authority: BR
Inventors: Karen Robins; Uwe Bornscheuer; Mathias Hoehne
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2011-05-03
Also published as: IL192637A; JP2009526531A; CA2637821A1; EP1987152A1; KR101294499B1; AU2007214717A1; EA200870262A1; CN101384723A; ES2767898T3; KR20080093437A; DK1987152T3; EP1818411A1; US9551018B2; US20090246837A1; ES2345734T3; PT1987152E; CN101384723B; EP2202317A1; IL219163A0; EP1987152B1

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAçAO DE AMINAS QUIRAIS OPTICAMENTE ATIVAS. A presente invenção se refere à produção de aminas secundárias opticamente puras, as quais podem ser usadas como produtos intermediários numa síntese de, por exemplo, produtos farmacêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PROCESSOPARA A PREPARAÇÃO DE AMINAS QUIRAIS OPTICAMENTE ATIVAS"

A presente invenção se refere a um processo para apreparação de aminas quirais opticamente ativas.

Aminas quirais desempenham um papel importante naindústria farmacêutica, agroquímica e química. Elas sãofreqüentemente usadas como intermediários ou synthons parao preparo de várias substâncias fisiologicamente, porexemplo, farmaceuticamente ativas, tais como derivados dapirrolidina ou cefalosporina. Num grande número das váriasaplicações das aminas quirais, somente uma formaopticamente ativa particular, ou o enantiômero (R) ou o (S)tem a atividade fisiológica desejada. Dessa forma, existeuma clara necessidade para proporcionar processos para apreparação de aminas quirais numa forma opticamente ativa.

Essas necessidades são parcialmente atendidas pelopreparo de aminas quirais pela cristalização dos saisdiastereoisoméricos através da adição de ácidoscarboxílicos quirais (Breuer et al., Angewandte Chemie(2004) 116, 806 a 843). Outros métodos químicos usam asíntese enantiosseletiva pela redução dos precursoresquirais com ligações duplas C=N.

Além disso, se sabe clivar racematosestereosseletivamente usando várias enzimas, tais comoproteases, amidases ou lipases (Bornscheuer e Kazlauskas,Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCHWeinheim). Também se sabe que transaminases especificas, asaber, α-transaminases, incluindo a-aminoácidoaminotransferases, são adequadas para a preparação deaminoácidos opticamente puros (Bartsch et al., Appl.Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794 a 3799, Cho et al.,Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226 a 234, JP 011 53084 A2(1998), JP 633 04986 A2 (1988), EP 0 248 357 A2 e Ziehr etal., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482 a 487).

Entretanto, esses processos da técnica anterior sofremvárias desvantagens. Embora os processos enzimáticosgeralmente empreguem, ao contrário dos métodos clássicos,condições brandas favoráveis e alcancem umaestereosseletividade razoável, eles regularmente usamenzimas, cuja especificidade de substrato,enantiosseletividade e/ou taxas de conversão não sãosuficientemente altas para processos industrialmenteaplicáveis. Além disso, uma das desvantagens maisproeminentes do uso das transaminases para a preparação deaminas opticamente ativas é representado pelo fenômeno deinibição de substrato e produto freqüentemente observado.

É, conseqüentemente, um dos objetos da presente invençãoproporcionar um processo melhorado para preparar aminasquirais opticamente ativas, particularmente um processo comuma especificidade de substrato melhorada., umaenantiosseletividade melhorada e, particularmente,permitindo uma conversão dos extratos de até 100%.

A presente invenção soluciona o problema técnicosubjacente à presente invenção proporcionando um processopara o preparo de uma amina quiral opticamente ativacompreendendo a) proporcionar um aceptor amino e um doadoramino, b) reagir o aceptor amino e o doador amino com umatransaminase, particularmente com a transaminase (R)- ou(S)-seletiva e c) obter a amina quiral opticamente ativadesejada e um subproduto de α-cetona. De acordo com umamodalidade preferida da presente invenção, numa etapaopcional do processo adicional subseqüente, a amina quiralopticamente ativa na etapa c) é isolada e purificada damistura reacional obtida na etapa c).

A reação da presente invenção segue, a principio, oseguinte esquema:<formula>formula see original document page 5</formula>

Dessa forma, a presente invenção proporciona umprocesso para a síntese assimétrica de aminas quirais pelouso de pelo menos uma transaminase para a transaminação deum grupo amino a partir de um doador amino para um aceptoramino, formando dessa forma o produto desejado. Dependendoda enantiopreferência da transaminase específica usada, umaamina quiral opticamente ativa de configuração ópticadesejada, isto é, ou o enantiômero (R) ou o enantiômero (S)é obtido. Dessa forma o uso numa modalidade da presenteinvenção uma transaminase (S)-seletiva para a sínteseassimétrica gera o enantiômero (S) desejado da amina quiralenquanto ao usar, em outra modalidade da presente invenção,uma transaminase (R)-seletiva gera o enantiômero(R)desejado. Além da amina opticamente ativa desejada, areação resulta num subproduto de cetona, particularmentenum subproduto de α-cetona, a partir do doador amino usadoe, possivelmente, do aceptor amino não convertido e dodoador amino.

No contexto da presente invenção, uma transaminase éuma enzima dependente de piridoxal fosfato catalisando atransferência dos grupos amino. Transaminases sãoclassificadas em E.C. 2.6.I.X. Numa modalidadeparticularmente preferida da presente invenção, atransaminase é uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva,particularmente é, numa modalidade preferida, uma co-transaminase.

No contexto da presente invenção, uma co-transaminaseé uma enzima preferivelmente com o código de classificaçãoE.C. 2.6.1.18. Essas aminotransferases são caracterizadaspelo fato de que elas principalmente usam aminas comosubstratos. Essas enzimas são adicionalmente classificadaspela exibição de uma constante de equilíbrio de reaçõescatalisadas pela ω-transaminase, a qual é maior do que 1.ω-transaminases, as quais podem ser usadas de acordo com apresente invenção, são descritas, por exemplo, em Iwasakiet al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843 a 1846, Shin etal., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348 a 358, Shin e Kim,Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim,Calif., 21 a 25 de março, (1999) 180, Shin e Kim, Biosc.Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782 a 1788 e Shin e Kim,Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534 a 540.

Dessa forma, numa modalidade preferida da presenteinvenção, a transaminase, particularmente a co-transaminaseusada no presente processo é uma transaminase,particularmente uma ω-transaminase obtida a partir deVibrio fIuvialisr particularmente da cepa JS17. Numa outramodalidade preferida, a transaminase é de Alcaligenesdenitrificans, particularmente da cepa Y2k-2. Numa outramodalidade preferida, a transaminase é de Klebsiellapneumoniae, particularmente da cepa YS2F. Numa outramodalidade preferida, a transaminase é do Bacillusthuringiensis, particularmente da cepa JS64. Para asdesignações de cepas ver Shin e Kim, 1998, acima. É claroque a presente invenção também entende, sob o termotransaminase, particularmente ω-transaminase, um extratode um organismo, tal como de um microrganismo ou uma célulacontendo uma transaminase, particularmente uma ω-transaminase, ou uma célula viva ou morta ou o própriomicrorganismo compreendendo uma transaminase,particularmente uma ω-transaminase. Tal microrganismo oucélula ou extrato ou enzima transaminase pode ser usado naforma imobilizada ou não-imobilizada. A transaminase,particularmente a ω-transaminase, também pode ser umatransaminase geneticamente modificada ou de ocorrêncianatural recombinantemente produzida, particularmente umaω-transaminase, a qual é codificada parcialmente oucompletamente por uma seqüência de ácidos nucléicos ou porum derivado seu contido em um ou mais dos organismos acimaidentificados ou sendo equivalente a eles.

No contexto da presente invenção, o termo amina quiralopticamente ativa se refere ao mesmo assunto-matéria que otermo amina quiral enantiomericamente ativa. Esses termos,particularmente, se referem a uma preparação a qual éessencialmente livre, numa modalidade ainda mais preferida,livre do enantiômero indesejado. De acordo com isto, umaamina quiral opticamente ativa compreende essencialmente umexcesso de um enantiômero ou mesmo consiste de somente umenantiômero.

Particularmente, no contexto da presente invenção, umaamina quiral opticamente ativa tem uma pureza óptica depelo menos 70%, particularmente maior do que 90% e, de ummodo melhor, maior do que 99%.

Na presente invenção, a pureza óptica é dada em % deexcesso de um enantiômero em relação ao outro enantiômero.Dessa forma, a pureza óptica em % é o quociente dadiferença entre as concentrações de enantiômero (R) e (S) ea soma das concentrações de ambos os enantiômeros (purezaóptica de A em % = ( [A] - [B] ) : ( [A] + [Β] ) χ 100, em que AeBrepresentam as concentrações dos enantiômeros (R) e (S) ouvice-versa).

Na presente invenção, é preferível que o aceptor aminoseja convertido na amina quiral desejada numa conversão depelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, particularmente de100%. As concentrações para analisar a pureza óptica e aconversão podem ser determinadas, por exemplo, usandocromatografia a gás (CG) ou métodos foto ou fluorimétricos.

No contexto da presente invenção, um aceptor amino éuma molécula capaz de receber um grupo amino transferido deum doador amino por uma transaminase, particularmente poruma ω-transaminase. Numa modalidade particularmentepreferida da presente invenção, o aceptor amino contém umafunção cetona. Numa modalidade particularmente preferida dapresente invenção, o aceptor amino é selecionado do grupoconsistindo de ácido fenilpirúvico, um sal seu, ácidopirúvico, um sal seu, acetofenona, 2-cetoglutarato, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-OP), 3-piridilmetilcetona (3-PMC), éster etílico do ácido 3-oxibutírico (3-OBEE), éster metílico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME), N-l-boc-3-oxipiperidinona, N-l-boc-3-oxopirrolidina (B30P), 3-oxipiperidina, alquil-3-oxibutonoatos, metoxiacetona e 1-oxitetralona.

Numa modalidade particularmente preferida, o aceptoramino é B30P.

No contexto da presente invenção, um doador amino éuma molécula capaz de proporcionar um grupo amino para umaceptor amino usando uma transaminase, particularmente umaω-transaminase. Numa modalidade particularmente preferida,o doador amino é uma amina ou um aminoácido.

Numa modalidade particularmente preferida, o doadoramino é selecionado do grupo consistindo de β-alanina,alanina, particularmente de D,L-alanina, L-alanina ou de D-alanina, α-metilbenzilamina (α-ΜΒΑ), glutamato,fenilalanina, glicina, 3-aminobutirato, isopropilamina, 2-aminobutano, γ-aminobutirato e um sal, por exemplo umcloreto, de qualquer um desses. Numa modalidadeparticularmente preferida, o produto cetona obtido pode sero ácido fenilpirúvico, um sal seu, ácido pirúvico, um salseu, ácido glioxilico, um sal seu, acetofenona, 2-cetoglutarato, acetona, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-0P), 3-piridilmetilcetona (3-PMC), ésteretilico do ácido 3-oxobutírico (3-0BEE), éster metilico doácido 3-oxopentanóico (3-OPME), N-l-boc-3-oxopiperidinona eN-l-boc-3-oxopirrolidina (B30P) ou um sal, por exemplo, umcloreto, de qualquer um deles.

Numa modalidade particularmente preferida, o doadoramino é alanina, particularmente L-alanina.

Numa outra modalidade preferida, a presente invençãose refere a um processo para a preparação de uma aminaquiral opticamente ativa, a qual é selecionada do grupo deaminas com um grupo amino opticamente ativo,particularmente aminas com grupos alquila, grupos alquilaramificados ou grupos arilalquila. Particularmente essasaminas, particularmente aminas mono ou biciclicas, sãoparticularmente aminas de hidrocarbonetos heterociclicos S,O ou N-substituidos ou cíclicas de 5 a 6 membros ou aminasaromáticas, particularmente aminas aromáticas alquil oualcóxi-substituídas. Numa modalidade preferida, as aminasquirais obtidas são selecionadas do grupo consistindo defenilalanina, alanina, 3-aminopiperidina, alquil-3-aminobutanoatos, 3-aminopirrolidina (3-AP), 3-piridil-l-etilamina (3-PEA), N-l-boc-3-aminopirrolidina (B3AP), ésteretílico do ácido 3-aminobutírico (3-ABEE), éster metílicodo ácido 3-aminopentanóico (3-APME), a-metilbenzilamina(α-ΜΒΑ), 1-aminotetralina, a-metil-4-(3-piridil)-butanamina, glutamato, β-aminobutirato, sec-butilamina,metoxiisopropilamina, derivados da 3-aminopirrolidina, I-N-boc-3-aminopiperidina, cefalosporina e derivados dacefalosporina.

Numa modalidade particularmente preferida, a presenteinvenção, dessa forma, prevê a reação de 30P com umatransaminase (S)- ou (R)-seletiva e de um doador amino paraobter (S)- ou (R)-3AP opticamente ativo.

Numa outra modalidade preferida, a presente invençãoprevê a reação de 3-PMC com uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva e com um doador amino para obter (R) ou (S) 3-PEAopticamente ativa.

Numa outra modalidade preferida da presente invenção,a invenção prevê a reação de 3-OBEE com uma transaminase(R)- ou (S)-seletiva e com um doador amino para obter (R)ou (S) 3-ABEE opticamente ativa.

Numa outra modalidade preferida, a presente invençãoprevê a reação de 3-OPME com uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva e com um doador amino para obter (R) ou (S) 3-APMEopticamente ativa.

Numa outra modalidade preferida, a presente invençãoprevê a reação de B30P com uma transaminase (R)- ou (S)-seletiva e com um doador amino, particularmente alanina,para obter (R) ou (S) B3AP opticamente ativa.Numa modalidade particularmente preferida, a invençãose refere a uma reação entre B30P e um doador amino,particularmente alanina, na presença de uma transaminasepara obter B3AP opticamente ativa e piruvato, em que areação é executada num pH de 5,0 até 9,5, preferivelmentede 6,0 até 7,0, particularmente de 6,0 até 6,9, por umtempo de 30 a 70 minutos, particularmente de 40 a 65minutos, particularmente de 50 a 60 minutos.

Numa modalidade particularmente preferida, a referidatransaminase é uma transaminase (R)-seletiva. Numa outramodalidade preferida, a referida transaminase é umatransaminase (S)-seletiva.

Numa modalidade preferida, a referida reação de B30Pcom o doador amino, particularmente alanina, é executada napresença de pelo menos uma piruvato descarboxilase (PDC).

Numa outra modalidade preferida, a referida reação de B30Pcom o doador amino, particularmente alanina, na presença depelo menos uma piruvato descarboxilase, é executadaenquanto se introduz simultaneamente nitrogênio gasoso namistura reacional para a remoção do acetaldeido obtido apartir do piruvato formado pela ação da PDC.

Numa outra modalidade preferida, a referida reação deB30P com o doador amino, particularmente alanina, na'·presença de pelo menos uma piruvato descarboxilase, éexecutada na presença de pelo menos uma álcooldesidrogenase (ADH) para a remoção do acetaldeído obtido apartir do piruvato formado pela ação da PDC.

Numa outra modalidade preferida, a referida reação deB30P com o doador amino, particularmente alanina, napresença de pelo menos uma piruvato descarboxilase, éexecutada enquanto se introduz simultaneamente nitrogêniogasoso na mistura reacional, em que pelo menos uma álcooldesidrogenase está presente no meio reacional para removero acetaldeído obtido a partir do piruvato formado pela açãoda PDC.

Numa outra modalidade preferida da presente invenção,a invenção prevê a reação de acetofenona com umatransaminase (R)- ou (S)-seletiva e com um doador aminopara obter α-MBA (R) ou (S) opticamente ativo.

Numa outra modalidade preferida, a presente invençãoprevê a reação como um aceptor amino, particularmenteciclos de 5 a 6 membros contendo um grupo oxo, mono oubiciclicos, ou hidrocarbonetos ou aromáticos heterociclicosS-, O- ou N-substituídos, particularmente aromáticosalquil- ou alcóxi-substituidos com um doador amino e umatransaminase (R) ou (S)-seletiva para obter aminasopticamente ativas, particularmente aminas mono oubicíclicas, particularmente aminas cíclicas de 5 a 6membros ou hidrocarbonetos heterocíclicos S-, 0- ou N-substituídos ou aminas aromáticas, particularmente aminasaromáticas alquil- ou alcóxi-substituídas, particularmentena forma (S) ou (R).

Numa modalidade particularmente preferida da presenteinvenção, o aceptor amino e o doador amino reagem com atransaminase em meio aquoso, por exemplo, em tampãofisiológico. Numa modalidade particularmente preferida, areação de transaminação é executada num pH na faixa de 5,0até 9,5 ou de 5,0 até 9,0, particularmente de 7 até 8,5. Ainvenção prevê numa modalidade particularmente preferida areação do aceptor amino e do doador amino num valor de pHde 6,0 até 7,0, preferivelmente de 6,0 até 6,9.

Numa modalidade preferida particular, a reação éexecutada numa faixa de temperatura de 10 até 65°C,pref erivelmente de 20 até 50°C, particularmente de 18 até25°C, preferivelmente em temperatura ambiente ou de 34°Caté 39°C, particularmente a 37°C. Numa outra modalidadepreferida da presente invenção, o aceptor amino e o doadoramino são fornecidos numa proporção molar de 1:50 até1:200, particularmente de 1:50 até 1:100, particularmentede 1:100, particularmente de 1:1 até 1:5, particularmentede 1:1 até 1:2. Numa modalidade preferida da presenteinvenção, a atividade enzimática pode ser de 1 até 20.000μπιοΐ/min.

Numa outra modalidade preferida, a reação é executadapor um tempo reacional de 30 até 70, preferivelmente de 40até 65, particularmente de 50 até 60 minutos.

Numa modalidade particularmente preferida, a presenteinvenção se refere a um processo para a preparação de umaamina quiral opticamente ativa de acordo com o acima, quesignifica de acordo com o que, numa primeira etapa doprocesso a), um aceptor amino e um doador amino sãofornecidos, numa segunda etapa de processo b), o aceptoramino e o doador amino reagem com pelo menos uma co-transaminase, numa terceira etapa do processo c) uma aminaquiral opticamente pura e um subproduto de α-cetona sãoobtidos, e em que numa outra etapa do processo d) osubproduto cetona, particularmente o subproduto de a-cetona, obtido na etapa c), é removido da mistura reacionalobtida, particularmente removido pela reação com umaenzima, isso através de clivagem enzimática,particularmente usando uma enzima selecionada do grupoconsistindo de uma descarboxilase, uma sintase ou umadesidrogenase.Numa modalidade particularmente preferida, o produtocetona, particularmente piruvato, obtido na etapa c) , éremovido pela reação com uma piruvato descarboxilase (PDC),por exemplo, de Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilisou Zymobacter palmae, produzindo preferivelmente dessaforma acetaldeido e CO2-

Numa outra modalidade preferida, a invenção se referea um processo, em que o produto cetona obtido,particularmente piruvato, é removido pela ação de uma PDC eem que o acetaldeido formado dessa forma é removido, porexemplo, por um tratamento químico, enzimático ou físico.

Numa outra modalidade preferida, a invenção se referea um processo em que o produto cetona obtido,particularmente piruvato, é removido pela ação de uma PDC eem que o acetaldeido formado dessa forma é removido, porexemplo, pela alimentação de nitrogênio gasoso na misturareacional, preferivelmente pela alimentação do referidonitrogênio gasoso continuamente na mistura reacional pararemover o acetaldeido da mistura reacional.

Numa outra modalidade preferida a invenção se refere aum processo em que o produto cetona obtido, particularmentepiruvato, é removido pela ação de uma PDC e em que oacetaldeido formado dessa forma é removido pela reação doacetaldeido com pelo menos uma álcool desidrogenase (ADH)para remover o acetaldeído da mistura reacional e paraconvertê-lo em etanol.

Numa outra modalidade preferida, a invenção se referea um processo em que o produto cetona obtido,particularmente piruvato, é removido pela ação de uma PDC eem que o acetaldeido formado dessa forma é removido pelaaplicação de uma pressão reduzida na mistura reacional.

Numa outra modalidade preferida a invenção se refere aum processo em que o produto cetona obtido, particularmentepiruvato, é removido pela ação de uma PDC e em que oacetaldeido formado dessa forma é removido por reaçõesquímicas.

Numa outra modalidade preferida a invenção se refere aum processo, em que o produto cetona obtido,particularmente piruvato, é removido pela ação de uma PDC eem que o acetaldeído formado dessa forma é removido pelaalimentação de nitrogênio gasoso na mistura reacional,preferivelmente pela alimentação do referido nitrogêniogasoso continuamente na mistura reacional, e em queadicionalmente o acetaldeído reage com pelo menos umaálcool desidrogenase (ADH) para remover o acetaldeído damistura reacional e convertê-lo em etanol.

Numa outra modalidade preferida, o produto cetona,particularmente piruvato, obtido na etapa c) , é removidopela reação com uma lactato desidrogenase (LDH), porexemplo, da Escherichia coli, preferivelmente por meiodisso produzindo L-lactato.

Numa outra modalidade preferida o produto cetona,particularmente piruvato, obtido na etapa c) , é removidopela reação com uma acetolactato sintase, preferivelmenteproduzindo dessa forma acetolactato.

Numa outra modalidade preferida da presente invenção,o produto cetona, particularmente piruvato, obtido na etapac), é continuamente removido da mistura reacional.

Essas modalidades particularmente preferidasproporcionam a vantagem de obter uma taxa de conversãoparticularmente alta, uma vez que o produto cetona como umsubproduto do presente processo é removido da reação deequilíbrio. A reação é forçada na direção dos produtos,proporcionando dessa forma, com uma altaestereosseletividade, uma conversão muito alta nos produtosdesejados.

A presente invenção também se refere aos processospara a preparação de compostos fisiologicamente ativos oude seus precursores e/ou intermediários na sua produção,particularmente selecionados do grupo de derivados de 3-aminopirrolidina, cefalosporina, derivados decefalosporina, ácidos borônicos heterociclicos, L-diidroxifenilalanina (L-dopa), α-metildopa, D-fenilglicina, β-hidroxifenilglicina. fosfinotricina,derivados pirimido e derivados pirrolidona, em qualquer umdos processos acima identificados da presente invenção sãoempregados. No contexto da presente invenção, um compostofisiologicamente ativo é um composto o qual éfisiologicamente ativo em plantas, animais, humanos,leveduras ou microrganismos, tais como protozoários,bactérias ou virus, isto é, interage com o metabolismo doorganismo.

Outras modalidades preferidas da presente invenção sãoa matéria do tema das reivindicações dependentes.

A presente invenção é ilustrada em maiores detalhesnos seguintes exemplos e nas figuras associadas.

As figuras associadas ilustram a presente invenção.

A Figura 1 mostra um cromatograma em camada fina.

A Figura 2 mostra a atividade relativa de ω-ΤΑ de V.fluvialis em dependência do valor de pH.

A Figura 3 mostra a redução relativa da concentraçãode B3AP para incubações com várias substâncias.

A Figura 4 mostra a redução relativa da conversão deB3AP na presença de piruvato e de acetaldeido.A Figura 5 mostra a conversão de B30P em B3AP duranteo tempo para várias pressões.

A Figura 6 mostra a conversão relativa de B30P em B3APna presença de vários PDC's.

A Figura 7 mostra o efeito de uma concentração dealanina aumentada e de uma concentração de PDC aumentada nasíntese de B3AP assimétrica.

A Figura 8 mostra a conversão de B30P em B3AP emconcentrações de alanina aumentadas.

A Figura 9 mostra a conversão dependente de PLPrelativa de B30P em B3AP.

A Figura 10 mostra a conversão relativa de B30P emB3AP dependente da presença de N2.

A Figura 11 mostra a conversão relativa de B30P emB3AP na presença de uma ADH.

Exemplo 1: Síntese assimétrica de B3AP

A síntese assimétrica de B3AP foi executada em tubosreacionais de 1,5 mL. B30P como aceptor amino foi usadonuma concentração de 5 mM (7,5 μιηοΐ) . A concentração dodoador amino L-alanina foi de 5 mM. Os reagentes e ascondições reacionais usadas são evidentes a partir databela 1 abaixo.Tabela 1: Condições reacionais para a síntese assimétricade (S)-B3AP usando (S)-ω transaminase para transaminar ogrupo amino de alanina para B30P.

<table>table see original document page 22</column></row><table>O tampão usado foi de fosfato de sódio 50 mM, pH 7.TA7 designa a ω-transaminase de Vibrio fluvialis (JülichFine Chemicals, Alemanha). TA8 designa a ω-transaminase deAlcaligenes denitrifícans (Jülich Fine Chemicals,Alemanha). Como lactato desidrogenase um extrato deEscherichia coli foi usado. Além disso, NADH foi adicionadoaté uma concentração final de 10 mM. A concentração depiruvato descarboxilase foi variada. 1,5 unidades (20 μΙΟ eunidades (200 μΐι) da piruvato descarboxilase de10 Saccharomuces eerevisiae (PDCl) foram usadas. 2 unidades(3,4 μΐι) e 20 unidades (34 μΙΟ da piruvato descarboxilasede Zymomonas mobilis (PDC2) foram usadas.

Tabela 2. Conversão e pureza óptica obtida usando TA8 paraa síntese assimétrica de B3AP. Os cálculos foram baseadosna análise de CG (+/- 5%).

<formula>formula see original document page 23</formula><table>table see original document page 24</column></row><table>

Agora se referindo à Tabela 2, acima, é evidente queem cada uma das seis corridas usado a ω-transaminase TA8,um grau muito alto de pureza óptica para a (S)-B3AP obtidapôde ser alcançado. Também foi observado queindependentemente do uso ou de TA7 ou de TA8, o grau deconversão foi somente moderado, se o equilíbrio da reaçãonão foi influenciado (corrida 1). 0 uso de alanina numexcesso de 10 a 50 vezes somente melhorou levemente aconversão. Nas corridas 3, 4, 5 e 6, o produto cetona dareação, que significa piruvato foi, durante a reação detransaminação, removido da reação de equilíbrio. O uso deTA8 juntamente com a lactato desidrogenase de E. coli(corrida 6) levou a um grau extremamente melhorado deconversão, enquanto mantendo e mesmo melhorando aenantiosseletividade. Essencialmente o mesmo permaneceválido para a enantiosseletividade fornecida pela piruvatodescarboxilase de Zymomonas mobills (corridas 3 a 5). PDC1,entretanto, somente aumentou levemente a conversão, PDC2aumentou moderadamente a taxa de conversão (corrida 4) sereagido por 24 h, enquanto que numa reação de 72 h (corrida5), a conversão foi drasticamente melhorada. Todas asreações ocorreram por 24 h, exceto para a corrida 5, a qualocorreu por 72 h.

A figura mostra a cromatografia em camada fina dasreações executadas de acordo com a Tabela 1. "A" designa aω-transaminase de Alcaligenis denitrificans, enquanto que"V" designa a ω-transaminase de Vibrio fluvialis. "K"designa a corrida 1 usando somente TA7 ou TA8 (corrida 1).PDC 1 designa a corrida com a piruvato descarboxilase deSaccharomyses cerevisiae (corrida 3) , LDH a corrida comlactato desidrogenase de Escherichia coli (corrida 6) ePDC2 a corrida com a piruvato descarboxilase de Zymomonasmobilis (depois de 24 e 72 h) (corridas 4 e 5). Dessaforma, os resultados mostram claramente que a produção de(S) -B3AP da cetona pró-quiral B30P poderia ser executadacom uma enantiosseletividade muito elevada. Usando das ω-transaminases como as enzimas individuais no processo depreparação, entretanto, leva a uma conversão moderada. Essataxa de conversão moderada poderia ser muito aumentada pelaremoção de piruvato do equilíbrio, particularmente usandolactato desidrogenase ou piruvato descarboxilase. 0 uso dapiruvato descarboxilase tem entre outras coisas, a vantagemde que não foi necessária nenhuma reciclagem de cofator(NADH). Ela ainda vantajosamente proporcionou a remoçãoenzimática do piruvato com PDC e, dessa forma, proporcionoua vantagem adicional de remoção ou prevenção da inibição deproduto (produto cetona) e empurrando o equilíbrioreacional para a direita, alcançando uma conversão maiselevada (caso ideal de 100%).

Exemplo 2: Dependência do pH na atividade da ω-transaminase na reação de conversão de (S)-aMBA emacetofenonaA síntese foi executada numa cubeta de quartzo usando50 μΐ, de piruvato 100 mM, 4 unidades/mL de co-TA de Vibriofluvialis (a seguir também Vfl) (12 μΐι) e 388 \iL de tampãode fosfato de sódio, 50 mM com variações de pH de pH 6,0até pH 7,4 em 0,2 etapas. A reação foi iniciada com 50 μΙ>de (S)-aMBA 100 mM como doador amino e o aumento naabsorção foi medido em 250 a 260 nm. O aumento na absorçãoé devido à acetofenona formada. Os outros substratossomente contribuíram insignificantemente para a absorção,de forma que a velocidade da reação pôde ser determinadapela medição da absorção da acetofenona. 0 valor alcançadoem pH 7,4 foi ajustado como 100% e a atividade relativapara os outros valores de pH foi calculada conforme éevidente a partir da Figura 2. A Figura 2 mostra aatividade relativa de ω-ΤΑ de V. fluvialis em dependênciado dado valor de pH.

A Figura 2 mostra que em valores de pH mais baixos,tais como 6,0, 6,2 ou 6,4, ainda há uma considerávelatividade presente, por exemplo, de 11% em pH 6,0. Dessaforma, esse resultado demonstra que mesmo num baixo pH épossível obter uma atividade de transaminase significativa,permitindo reagir os substratos num pH mais baixo, o quepor sua vez permite o aumento da conversão pelo uso de PDC,que é sensível aos valores de pH mais altos.Exemplo 3: Sintese assimétrica de B3AP em diferentesvalores de pH

Nesse exemplo, a síntese assimétrica de B3AP a partirde alanina e B30P é mostrada na presença e ausência de umapiruvato descarboxilase (PDC).

Para cada valor de pH 6,0, 6,4 e 7,0, três corridas dêexperimentos foram efetuadas. A corrida 1 usou a PDC deZymomonas mobilis (extrato de células tipo selvagem), acorrida 2 usou a Zymobacter palmae (recombinante na E.coli) e a corrida 3 foi um controle sem PDC, empregandosomente a transaminase. Para obter resultados comparáveis,as atividades de ambas as PDCs foram determinadas em pH 6com um ensaio de álcool desidrogenase e a mesma quantidadede atividade das PDCs foi usada nas corridas identificadasacima.

A Tabela 3 proporciona os volumes da substância usadaem μΐ,. Cada corrida reacional foi executada três vezes emvalores de pH 6,0, 6,4 e 7,0. O valor de pH foi ajustadopelo tampão da solução de substrato B30P. A atividade daPDC foi de cerca de 2,5 unidades/mL em pH 7. Asconcentrações de substrato e de enzima também são evidentesa partir da tabela 3 abaixo. Depois de 10 minutos, 30minutos, 60 minutos e 120 minutos, uma amostra de 100 μΐ,foi tomada e a reação foi interrompida pela adição de 100μΐ; de NaOH 1 Μ. A quantificação da concentração de B3AP foifeita usando EC (eletroforese capilar).

Tabela 3

<table>table see original document page 29</column></row><table>

A Tabela 4 abaixo mostra a conversão em diferentesvalores de pH para as diferentes PDCs. É evidente que o usoda PDC aumenta a conversão. Também é evidente que a PDC deΖ. palmae (Zpa) causa uma conversão um tanto mais elevadado que a PDC de Z. mobilis (Zmo) . Também é evidente que emvalores de pH mais baixos, tais como 6,0 ou 6,4, um notávelaumento de conversão nas corridas empregando PDCs é paraser observado, o qual não é para ser visto no controle semPDC. Em todas as corridas reacionais, poderia ser observadoque depois de 120 minutos a conversão diminuiu.

Tabela 4

<table>table see original document page 30</column></row><table>

n. d. = não-determinado

Exemplo 4: Estabilidade de B3AP na presença de váriosreagentes de uma reação de síntese assimétrica

Para mostrar a estabilidade da B3AP na presença devários reagentes, incubações de B3AP 1 mM foram efetuadasnum tubo reacional por 3 h na presença de váriassubstâncias conforme listado na tabela 5 abaixo.O exemplo foi executado em pH de 6 e 7 (tampão defosfato de sódio). Diretamente depois de reagir assubstâncias, sendo uma primeira amostra To foi tomada, eoutra amostra, Ti, depois de 3 h. Depois da extração, aconcentração de amina foi determinada com um padrão interno(CtMBA) por EC. A partir da diferença das concentraçõesobtidas, o decréscimo em % da concentração de B3AP foicalculado (ver Figura 3).

Tabela 5

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

A partir da Figura 3 fica evidente que os diferentesreagentes não afetam significativamente a concentração deB3AP (corridas de 1 a 9). As corridas reacionais de 11 a 13mostram a influência do acetaldeido. A partir da corrida 11fica evidente que, na ausência de uma transaminase, não háredução na concentração de B3AP, enquanto que na presençade uma transaminase e de acetaldeido, uma forte redução naconcentração de B3AP pode ser observada. Acetaldeidofunciona na reação de transaminase como um aceptor amino,tal como piruvato, e obviamente leva a uma redução naconcentração de B3AP.

Exemplo 5: Reação de B3AP com os aceptores amino piruvato eacetaldeido

Nesse exemplo, a atividade da transaminase de co-TA deVr. fluvialis e de A. denitrificans para os substratos B3APe piruvato e para B3AP e acetaldeido é mostrada.Β3ΑΡ 2 mM reagiu com piruvato 2 mM ou acetaldeido 2 mM(36 μΐ, de Alcaligenes denitrificans (Ade) ou 6 μΐ de Vibriofluvialis (Vfl)-transaminase por 0,5 μΐ de volumereacional, correspondendo a 2 unidades/μΙ, de transaminase,reagiu por 30 minutos). A Figura 4 mostra os resultados. Deacordo com esta, B3AP foi convertido em B30P por ambasenzimas, ambas com piruvato e acetaldeido, sem quaisquerdiferenças significativas.

Exemplo 6: Síntese assimétrica de B3AP sob pressão reduzidaem pH 6

Nesse exemplo, uma pressão reduzida foi aplicada namistura reacional para uma reação de síntese assimétricapara formar B3AP. Como controle, a mesma reação foiexecutada sob pressão normal e sem PDC.

Condições reacionais:

Volume final: 1,5 mL

Tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 6

300 μΐ· de transaminase de Vibrio fluvialis

60 μΙ, de PDC de Zpa (corresponde a 8 unidades/mL em pH 7)

B30P 5 mMD,L-alanina 10 mMTPP, PLP 0,1 mMMgCl2 5 mM

A pressão reduzida foi aplicada usando umrotaevaporador (150 mBar). A medição foi feita usando EC.

A Figura 5 mostra a conversão de B30P em B3AP nodecorrer do tempo para várias pressões. Fica evidente que aconversão é quase que independente da pressão aplicada. Aconversão numa pressão.de. 150 mbar é, considerando a máximaconversão alcançada, semelhante à conversão numa pressão de1000 mbar.

Exemplo 7: Comparação de várias piruvato descarboxilases

Nesse exemplo, três diferentes piruvatodescarboxilases foram usadas para a sintese assimétrica deB3AP. As condições reacionais correspondem àquelas doExemplo 6, exceto que um pH 7 foi usado. PDCs de Z.mobilis, Z. palmae e uma PDC da Biocatalytics (No. decatálogo PDC-101) foram usadas. As atividades das PDCs noensaio de ADH foram idênticas (1,6 unidades/mL).

A Figura 6 mostra que todas as três PDCsessencialmente resultam em conversões comparáveis.

Exemplo 8: Influência das concentrações de enzima e de co-substrato na conversão de B30P em B3AP

Nesse exemplo, a influência da concentração de PDC naconversão de B30P em B3AP usando alanina como um doadoramino é mostrada. Além disso, a influência da concentraçãode alanina na conversão de B30P em B3AP é mostrada.

As condições reacionais são dadas no exemplo 6, excetoque um pH de 7 foi usado e exceto se estabelecido de outraforma. Foi usada TA de Zymobacter palmae.

Conforme é evidente a partir da Figura 7, numa reaçãosem PDC, um aumento de 5 vezes da concentração de alaninade 5 mM até 25 mM resulta numa duplicação da conversão (12%em contraste com 5,3% de conversão depois de 2 h) . Napresença de PDC, a conversão aumenta num excesso de alaninade 5 vezes para a duplicata (30% em contraste com 17%depois de 90 minutos) . No caso, a quantidade de PDC éaumentada na concentração de alanina usual de 1,6unidades/mL até 50 unidades/mL, a conversão também éaumentada, entretanto, somente por um fator < de 2 (29% emcontraste com 17% depois de 40 minutos).

Numa outra corrida de experimentos, a influência de umexcesso de alanina e de um excesso de PDC combinado foimostrada, ambas em pH de 6 e 7. A reação é mais rápida empH 6, enquanto que depois de alcançar uma conversão de 4 9%,a concentração de B3AP também diminui mais rápido. Num pHde 7, a conversão aumentou até 56%.

Exemplo 9: Influência da concentração de alanina na sínteseassimétrica de B3APEm quatro reações, as concentrações de alanina de 5mM, 25 inM, 110 mM, 300 mM e 500 mM foram usadas. Para cadacorrida, um controle sem PDC e uma reação com PDC foramexecutados. O valor de pH foi ajustado até pH 7,0. Asamostras foram tomadas a cada meia hora por um temporeacional de 3 horas. Os tempos reacionais para asconversões dadas na Figura 8 foram de 40 minutos para 5 mM,de 60 minutos para 25 mM e de 90 minutos para 110 até 500mM.

A Figura 8 mostra a conversão da sintese B3APassimétrica em concentrações de alanina aumentadas.

A Figura 8 mostra claramente que a conversão podealcançar de 60 a 70%. É evidente que o aumento daconcentração de alanina de 25 até 110 mM tem um efeitosignificativo na conversão de B30P em B3AP e que um outroaumento de até 500 mM somente influencia levemente aconversão. A influência da PDC na conversão diminui com oaumento da concentração de alanina.

A partir dos dados da reação de controle, a constantede equilíbrio da síntese B3AP foi calculada como se segue:[B3AP] = [Pyr][B30P] = c0/ b3op - [B3APJ e[Ala] = C0, Aia - [B3AP]Dessa forma, usando a concentração de B3AP medida, aconstante de equilíbrio foi calculada como:

<formula>formula see original document page 37</formula>

Tabela 6

<table>table see original document page 37</column></row><table>

A Tabela 6 mostra os valores calculados. Dessa forma,a constante de equilíbrio para a reação com B3AP é de 3,1 χ10ˉ3. Conseqüentemente, o substrato B30P é um substratoadequado para a síntese assimétrica, ao contrário de outrascetonas.

Exemplo 10: Influência de PLP na síntese assimétrica deB3AP

Nesse exemplo, a influência de PLP (piridoxal-5'-fosfato) na conversão de B30P em B3AP é mostrada. Asseguintes três corridas reacionais foram examinadas.

a) Corrida 1 usando PLP 0,1 mM sem adição de mais PLP.b) Na corrida 2, PLP foi adicionado durante a reaçãotão logo a coloração amarela, a qual é devido à presença dePLP no meio reacional, descoloriu. Para esse propósito, de1 a 2 μL de uma solução de PLP saturada é adicionada,ganhando novamente, dessa forma, uma coloração amarelaforte. A influência na concentração de amina através desseleve aumento no volume é considerada como estando abaixo de1% e pode, dessa forma, ser negligenciada.

c) Sem PLP presente e sem PLP adicionado.

Condições reacionais: 1 mL de volume final, 37 μL detransaminase de Vlf, B30P 5 mM, tampão fosfato pH 7,0. Aconcentração de L-alanina foi de 110 mM. As mediçõesocorreram por EC e α-MBA foi usado como padrão interno.

A Figura 9 mostra a conversão no decorrer do tempo.Ali aparenta não haver influência significativa naconversão máxima devido à adição de PLP na corrida b) emcomparação com a corrida a). A reação sem PLP aparenta sermais lenta, embora ela tenha alcançado a mesma conversãoque as outras reações. A adição de PLP na corrida b) causauma redução levemente maior na concentração de amina emcomparação com a corrida de controle.

Exemplo 11: Sintese assimétrica de B3AP com remoção deacetaldeido pela adição de nitrogênioO seguinte exemplo detalha uma forma de melhorar aconversão da síntese assimétrica de B3AP pela remoção deacetaldeido.

Condições reacionais:

Substratos:

B30P 5 mM

L-alanina 500 mM

PDC de Zpa 32 U/mL

Transaminase de Vfl 37 μΐ,/πιΐ.

Tampão de fosfato de sódio, pH 7,0

TPP e PLP 0,1 mM (tiaminodifosfato)

MgCl2 5 mM

Uma vez que a solução reacional continha umaquantidade significativa de proteína, havia uma fortetendência de formação de espuma. Para suprimir a referidaformação de espuma, 0,6 μΐι de concentrado anti-espuma A(Sigma, silicone-polymer) foi adicionado na corridareacional. O concentrado suprimiu a geração de espuma emgrande escala, porém não pôde inibi-la completamente. Paragarantir que o referido concentrado anti-espuma não inibeas enzimas, uma corrida de controle sem a adição denitrogênio foi suplementada com anti-espuma A.Uma vez que a adição de nitrogênio seco levou a umaevaporação de água a partir da solução reacional, onitrogênio foi umidifiçado.

A Figura 10 mostra as conversões de B3AP relativascalculadas. 0 controle com anti-espuma A (controle de N2:Vfl-TA, PDC de Zpa, anti-espuma, sem nitrogênio N2) semadição de nitrogênio corresponde exatamente à corridareacional sem anti-espuma A (Vfl-TA, ZpaPDC). Dessa forma,as enzimas não são influenciadas pela adição de concentradoanti-espuma. A corrida (corrida de N2: Vfl-TA, PDC de Zpa,anti-espuma, N2) tratada com nitrogênio mostrou umaconversão aumentada depois de 60, 90 e 180 minutos.

Exemplo 12: Síntese de B3AP assimétrica sob váriascondições

Condições reacionais:

Volume final: 1 mL

37 μί de Transaminase de Vfl

Zpa-PDC ou PDC Biocatalitico 32 unidades/mL ou Zmo PDC

3,2 unidades/mLB30P 5 mML-alanina 500 mM

Cofatores TPP e PLP 0,1 mM, MgCl2 5 mMpH 7, fosfato de sódioA Figura 10 mostra a conversão de B30P em B3AP para ascorridas reacionais acima identificadas combinando aTransaminase de Vfl com cada PDC.

Na Figura 10, a corrida designada N2 é a corridacontendo Transaminase de Vfl e PDC de Zpa tratada comnitrogênio e anti-espuma A. O controle de N2 é uma amostracontendo Transaminase de Vfl, PDC de Zpa e anti-espuma Asem tratamento com nitrogênio. É evidente que há um aumentosignificativo na conversão a partir do controle de N2 paraa amostra N2 devido à presença de nitrogênio, o qual foialimentado na solução reacional. Dessa forma, a alimentaçãode nitrogênio na forma gasosa dentro do meio reacionalsignificativamente aumentou a conversão de B30P em B3AP.

Exemplo 13: Síntese assimétrica de B3AP na presença daálcool desidrogenase (ADH)

Para remover o acetaldeido produzido pela reação dePDC a partir da mistura reacional, ADH pode ser usado paraconverter o acetaldeido em etanol.

Condições reacionais:

L-alanina 110 mM

B30P 5 mM

Transaminase de Vfl 37 μΐ^ιη!.PDC de Zpa 32 unidades/mLTPP e PLP 0,1 mmMgCl2 5 mM

Tampão de fosfato de sódio, pH 7

As seguintes corridas reacionais estão apresentadas:Corrida reacional 1: reação com PDC e transaminaseCorrida reacional 2: reação com PDC e transaminase cometanol 5 mM (concentração final) e adição de NADHCorrida reacional 3: reação com PDC, ADH e NADHA ADH usada foi a ADH de Saccharomyces cerevisiae comuma atividade entre 50 e 100 unidades/mL. A atividade dePDC foi de 32 unidades/mL.

No inicio da reação, etanol absoluto foi adicionado nacorrida reacional 2 numa concentração final de 5 mM. Noinicio da reação, 5 μιηοΐ de NADH foram adicionados nascorridas reacionais 2 e 3 correspondendo numa concentraçãofinal de NADH de 5 mM. Depois de 10 minutos cada, uma outraadição de 2,4 pmol de NADH (4 μΐ, de uma solução de NADH 0,6M em tampão fosfato 50 mM, pH 8,5) foi adicionado. Asolução de NADH foi estocada em gelo e preparadaimediatamente antes do uso.

Os resultados estão dados na Figura 11 e na Tabela 5.0 efeito da ADH é claramente evidente. A conversão aumentaaté aproximadamente 90%. A corrida de controle 2 sem ADH eetanol 5 mM somente se devia levemente da corrida decontrole 1. Dessa forma, a adição de ADH aumenta muito aconversão na síntese assimétrica de B3AP a partir de B30P.

Claims

1. Processo para a preparação de uma amina quiralopticamente ativa caracterizado pelo fato de:a) proporcionar um aceptor amino e um doador amino,b) reagir o aceptor amino e o doador amino com umatransaminase, ec) obter a amina quiral opticamente ativa desejada eum subproduto de cetona.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a transaminase é uma transaminase (R)-ou (S)-seletiva.

3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o aceptor amino éselecionado do grupo consistindo de ácido fenilpirúvico,um sal seu, ácido pirúvico, um sal seu, acetofenona, 2-cetoglutarato, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-OP), 3-piridilmetilcetona (3-PMC),éster etílico do ácido 3-oxobutírico (3-OBEE), éstermetilico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME), N-l-boc-3-oxopiperidinona, N-l-boc-3-oxopirrolidina (B30P), 3-oxopiperidina, alquil-3-oxobutonoatos, metoxiacetona e-1-oxotetralona.

4.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o doador aminoé selecionado do grupo consistindo de aminas ou deaminoácidos, particularmente de β-alanina, alanina, a-metilbenzilamina (a-MBA), glutamato, fenilalanina e deγ-aminobutirato, glicina, 3-aminobutirato,isopropilamina, 2-aminobutano e um sal, por exemplo, umcloreto, de qualquer um desses.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as aminasobtidas são aminas, particularmente aminas mono oubiciclicas, particularmente aminas cíclicas de 5 a 6membros ou hidrocarbonetos heterocíclicos S-, 0- ou N-substituídos ou aminas aromáticas, particularmenteaminas aromáticas alquil- ou alcóxi-substituidas.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as aminasobtidas são selecionadas do grupo consistindo defenilalanina, alanina, 3-aminopiperidina, alquil-3-aminobutanoatos, 3-aminopirrolidina (3-AP), 3-piridil-l-etilamina (3-PEA), N-l-boc-3-aminopirrolidina (B3AP) ,éster etílico do ácido 3-aminobutírico (3-ABEE), éstermetílico do ácido 3-aminopentanóico (3-APME), a-metilbenzilamina (a-MBA), 1-aminotetralina, a-metil-4-(3-piridil)-butanamina, glutamato, β-aminobutirato, sec-butilamina, metoxiisopropilamina, derivados de 3-aminopirrolidina, l-N-boc-3-aminopiperidina,cefalosporina e derivados de cefalosporina.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a co-transaminase é de Vibrio fluvialis, Alcaligenesdenitrificans, Klebsiella pneumoniae ou Bacillusthuringiensis.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o subprodutocetona obtido na etapa c) é piruvato.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o subprodutocetona obtido na etapa c) é, numa outra etapa doprocesso d) , removido da mistura reacional pela reaçãocom pelo menos uma enzima.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a enzima usada na etapad) é uma descarboxilase.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a enzima usada na etapad) é uma sintetase.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a enzima usada na etapad) é uma desidrogenase.

13. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que aenzima é uma piruvato descarboxilase (PDC).

14. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 ou 12, caracterizado pelo fato de que aenzima é uma lactato desidrogenase (LDH).

15. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que aenzima é uma acetolactato sintase.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o acetaldeído formadopela ação da PDC é removido.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o acetaldeído é removidopela reação com pelo menos uma enzima.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a enzima é uma álcooldesidrogenase.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o acetaldeído é removidopela alimentação de nitrogênio gasoso na misturareacional.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o acetaldeido é removidopela aplicação de uma pressão reduzida na misturareacional.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o acetaldeido é removidopor métodos químicos.

22. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque a amina quiral opticamente ativa obtida na etapa c)ou d) é removida da mistura reacional obtida na etapa c)ou d).

23. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque o processo é executado numa mistura reacional com umpH de 5,0 até 9,5, preferivelmente de 6,0 até 7,0,preferivelmente de 6,0 até 6,9.

24. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque o processo é executado durante um tempo reacional de-40 até 70 minutos.

25. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque o aceptor amino é B30P.

26. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque o doador amino é alanina.

27. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 25 ou 26, caracterizado pelo fato deque o acetaldeido formado pela reação da PDC é removidopela alimentação de nitrogênio gasoso (N2) na misturareacional.

28. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 25 ou 26, caracterizado pelo fato deque a reação é executada na presença de pelo menos umapiruvato descarboxilase e de pelo menos uma álcooldesidrogenase.

29. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 25 ou 26, caracterizado pelo fato deque a reação é executada na presença de pelo menos umapiruvato descarboxilase, de pelo menos uma álcooldesidrogenase e, adicionalmente, na presença denitrogênio gasoso (N2) .

30. Processo para a preparação de um compostofisiologicamente ativo caracterizado pelo fato de queeste composto é selecionado do grupo de derivados de 3-aminopirrolidina, cefalosporina, derivados decefalosporina, ácidos borônicos heterociclicos, L-diidroxifenilalanina (L-dopa), α-metildopa, D-fenilglicina, β-hidroxifenilglicina, fosfinotricina,derivados pirimido e derivados pirrolidona, em que oprocesso de qualquer uma das reivindicações de 1 a 29 éusado.