PT1987152E

PT1987152E - Processo para a preparação de aminas quirais opticamente activas

Info

Publication number: PT1987152E
Application number: PT07711521T
Authority: PT
Inventors: Karen Robins; Uwe Bornscheuer; Matthias Hoehne
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2010-08-18
Also published as: EP1987152B1; JP2009526531A; EP2202318B1; EA200870262A1; AU2007214717B2; KR101294499B1; EP2202318A1; AU2007214717A1; WO2007093372A1; IL192637A0; JP2013188217A; ES2626645T3; JP5430945B2; IL192637A; EP1818411A1; US9074228B2; IL219164A0; CN101384723A; EP2202317A1; CA2637821A1

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE AMINAS QUIRAIS OPTICAMENTE ACTIVAS" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de aminas quirais opticamente activas.

As aminas quirais têm uma função importante na indústria farmacêutica, agroquímica e quimica. São frequentemente utilizadas como intermediários ou sintões para a preparação de várias substâncias fisiológicas, por exemplo, substâncias farmaceuticamente activas, tais como derivados de cefalosporina ou pirrolidina. Em muitas das várias aplicações das aminas quirais, apenas uma forma opticamente activa particular, o enantiómero (R) ou (S), tem a actividade fisiológica desejada. Assim, existe uma necessidade evidente para proporcionar processos para a preparação de aminas quirais numa forma opticamente activa.

Estas necessidades são parcialmente preenchidas por preparação de aminas quirais por cristalização dos sais diastereoméricos através da adição dos ácidos carboxilicos quirais (Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843).

Outros métodos químicos utilizam a síntese enantiosselectiva por redução dos precursores pró-quirais com ligações duplas C=N-.

Além disso, é conhecido como clivar estereosselectivamente racematos utilizando várias enzimas, tais como proteases, 1 amidases ou lipases (Bornscheuer e Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim). Sabe-se também que transaminases específicas, nomeadamente as cx-transaminases, incluindo aminotransferases do ácido α-amino, são adequadas para a preparação de aminoácidos opticamente puros (Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234, documentos JP 01153084 A2 (1998), JP 63304986 A2 (1988), EP 0248357 A2 e Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487).

Shin e Kim (Biotechnology and Bioengineering, 1999, 65 (2), 206-211) divulgam um processo para a síntese assimétrica de aminas quirais com uma ω-transaminase (Vibrio fluvialis JS17).

Hwang e Kim (Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34, 429-436) divulgam um processo para produzir aminas quirais opticamente activas por reacção de um aceitador amino e um doador amino na presença de uma ω-transaminase.

Cho et al. (Biotechnology and Bioengineering, 2003, 81 (7), 783-789) divulgam uma sintese simultânea de um aminoácido (S) e aminas (R) enantiomericamente puros, utilizando reacções de transaminase associada.

No entanto, estes processos da técnica anterior sofrem de várias desvantagens. Embora os processos enzimáticos empreguem normalmente, em contraste com os métodos clássicos, condições moderadas favoráveis e alcancem uma estereosselectividade razoável, utilizam regularmente enzimas, cuja especificidade, enantiosselectividade e/ou taxas de conversão do substrato, não são suficientemente elevadas para processos com aplicação industrial. Além disso, uma das desvantagens mais acentuadas da 2 utilização de transaminases para a preparação de aminas opticamente activas é representada pelo fenómeno de inibição do produto e substrato frequentemente observado. É por isso um dos objectivos da presente invenção proporcionar um processo melhorado para preparar aminas quirais opticamente activas, em particular um processo com uma especificidade melhorada para o substrato, uma enantiosselectividade melhorada e, em particular, permitindo uma conversão dos extractos até 100%. A presente invenção resolve o problema técnico subjacente à presente invenção pelo fornecimento de um processo para a preparação de uma amina quiral opticamente activa e piruvato como um produto secundário α-cetona compreendendo a) proporcionar um aceitador amino e alanina como um dador amino, b) reagir o aceitador amino e o dador amino com uma transaminase selectiva (R)- ou (S)-, c) obter a amina quiral opticamente activa desejada e piruvato como um produto secundário α-cetona e d) remover o piruvato da mistura reaccional com uma descarboxilase. De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, num outro passo do processo opcional subsequente, a amina quiral opticamente activa obtida no passo c) e d) é isolada e purificada a partir da mistura reaccional obtida no passo c) e d). A reacção da presente invenção segue, em principio, o seguinte esquema: 3

aceitador amino dador amino amina quiral produto de cetona m3 RS 'R' aceitador amino

K coo dador amino

O coo produto de cetona

Assim, a presente invenção proporciona um processo para a síntese assimétrica de aminas quirais, utilizando, pelo menos, uma transaminase para a transaminação de um grupo amino da alanina como um dador amino para um aceitador amino, formando deste modo o produto desejado. Dependendo da enantiopreferência da transaminase específica utilizada, é obtida uma amina quiral opticamente activa da configuração óptica desejada, i. e., o enantiómero (R) ou (S) . Assim, utilizando numa forma de realização da presente invenção uma transaminase (S) selectiva para a síntese assimétrica gera o enantiómero (S) desejado da amina quiral enquanto utilizando, noutra forma de realização, da presente invenção uma transaminase (R) selectiva gera o enantiómero (R) desejado. Além da amina opticamente activa desejada, a reacção resulta em piruvato como um produto secundário α-cetona a partir do dador amino utilizado e, possivelmente, aceitador amino não convertido e dador amino. 4

No contexto da presente invenção, uma transaminase é uma enzima dependente de piridoxalfosfato que catalisa a transferência de grupos amino. As transaminases são classificadas em E.C. 2.6.I.X. Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção, a transaminase é uma transaminase selectiva (R) - ou (S)-, particularmente numa forma de realização preferida, uma ω-transaminase.

No contexto da presente invenção, uma ω-transaminase é uma enzima, de um modo preferido, com o código de classificação E.C.2.6.1.18 . Estas amino transaminases são caracterizadas pelo facto de utilizarem principalmente aminas como substratos. Estas enzimas são depois caracterizadas pela exibição de uma constante de equilíbrio de reacções catalisadas pela ω-transaminase que é superior a 1. As ω-transaminases que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção são descritas, por exemplo, em Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843-1846, Shin et al., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348-358, Shin e Kim, Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March 21-25, (1999) 180, Shin e Kim, Biosc. Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782-1788 e Shin e Kim, Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534-540.

Assim, numa forma de realização preferida da presente invenção, a transaminase selectiva (R) ou (S) , em particular, a ω-transaminase selectiva (R) ou (S), utilizada no presente processo é uma transaminase selectiva (R) ou (S), em particular uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S) obtida da Vibrio fluvialis, em particular da estirpe JS17. Numa outra forma de realização preferida, a transaminase selectiva (R) ou (S) é de Alcaligenes denitrificans, em particular da estirpe Y2k-2. Noutra forma de realização preferida, a transaminase selectiva 5 (R) ou (S) é de Klebsiella pneumoniae, em particular da estirpe YS2F. Noutra forma de realização preferida, a transaminase selectiva (R) ou (S) é de Bacillus thuringiensis, em particular da estirpe JS64. Para as designações de estirpes ver Shin e Kim, 1998, acima. Com certeza, a presente invenção engloba também o termo transaminase selectiva (R) ou (S), em particular, ω-transaminase selectiva (R) ou (S), um extracto de um organismo, tal como um microrganismo ou uma célula, contendo uma transaminase selectiva (R) ou (S), em particular, uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S), ou uma célula morta ou viva, ou o próprio microrganismo compreendendo uma transaminase selectiva (R) ou (S), em particular uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S) . Tal microrganismo ou célula ou extracto ou enzima transaminase selectiva (R) ou (S) pode ser utilizado na forma imobilizada ou não imobilizada. A transaminase selectiva (R) ou (S) , em particular a ω-transaminase selectiva (R) ou (S) pode também ser uma transaminase selectiva (R) ou (S) de ocorrência natural, produzida recombinantemente ou geneticamente modificada, em particular uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S), que é codificada parcialmente ou completamente por uma sequência de ácido nucleico ou um seu derivado contido num dos seguintes organismos identificados acima ou sendo equivalente a este.

No contexto da presente invenção, o termo amina quiral opticamente activa, refere-se ao mesmo assunto/tema que o termo amina quiral enantiomericamente activa. Estes termos, em particular, referem-se a uma preparação que é essencialmente livre, numa forma de realização ainda mais preferida, livre do enantiómero indesejado. Consequentemente, uma amina quiral opticamente activa, compreende essencialmente um excesso de um enantiómero ou consiste mesmo em apenas um enantiómero. 6

Em particular, no contexto da presente invenção, uma amina quiral opticamente activa tem uma pureza óptica de, pelo menos, 70%, em particular, mais de 90% e, no máximo, >99%.

Na presente invenção, a pureza óptica é apresentada em % do excesso de um enantiómero relativamente a outro enantiómero. Assim, a pureza óptica em % é o quociente da diferença entre as concentrações do enantiómero (R) e (S) e a soma das concentrações de ambos os enantiómeros (pureza óptica de A em % = ( [A] — [B] ) : ( [A] + [B] ) x 100, em que A e B representam as concentrações dos enantiómeros (R) e (S) ou vice versa).

Na presente invenção é preferido que o aceitador amino seja convertido na amina quiral desejada numa conversão de, pelo menos, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, em particular, 100%. As concentrações para analisar a pureza óptica e a conversão podem ser determinadas, por exemplo, utilizando métodos de cromatografia gasosa (GC) ou foto ou fluorimétricos.

No contexto da presente invenção, um aceitador amino é uma molécula capaz de aceitar um grupo amino transferido de um dador amino através de uma transaminase selectiva (R) ou (S), em particular, uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S). Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o aceitador amino contém uma funcionalidade cetona. Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o aceitador amino é seleccionado do grupo consistindo de ácido f enilpirúvico, um seu sal, ácido pirúvico, um seu sal, acetofenona, 2-cetoglutarato, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-OP), 3-piridilmetilcetona (3-PMK), éster etílico do ácido 3-oxobutírico (3-OBEE), éster metílico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME), N-l-boc-oxopiperidinona, N-l-boc-3- 7 oxopirrolidina (B30P), 3-oxo-piperidina, alquil-3-οχο- butonoatos, metoxiacetona e 1-oxotetralona.

Numa forma de realização particularmente preferida, o aceitador amino é B30P.

No contexto da presente invenção, um dador amino é uma molécula capaz de proporcionar um grupo amino a um aceitador amino, utilizando uma transaminase selectiva (R) ou (S), em particular, uma ω-transaminase selectiva (R) ou (S).

Os dadores amino são β-alanina, alanina, em particular D,L-alanina, L-alanina ou D-alanina. Os produtos de cetona são o ácido f enilpirúvico, um seu sal, ácido pirúvico, um seu sal, ácido glioxilico, um seu sal, acetofenona, 2-cetoglutarato, acetona, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-OP), 3-piridilmetilcetona (3-PMK), éster etílico do ácido 3-oxobutirico (3-OBEE), éster metilico do ácido 3-oxopentanóico (3-ΟΡΜΕ), N-l-boc-3-oxopiperidinona e N-l-boc-3-oxopirrolidina (B30P) ou um sal, por exemplo, um cloreto, de qualquer um deles. 0 produto secundário da α-cetona, de acordo com a presente invenção, é piruvato.

De acordo com a presente invenção, o dador amino é alanina, em particular, L-alanina.

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma amina quiral opticamente activa que é seleccionada do grupo de aminas com um grupo amino opticamente activo, em particular, aminas com grupos alquilo, grupos alquilo ramificados ou grupos arilalquilo. Em particular, estas aminas, em particular aminas mono- ou bicíclicas, são, em particular, aminas cíclicas de 5 a 6 membros ou hidrocarbonetos heterocíclicos substituídos com N, S ou 0, ou aminas aromáticas, em particular, aminas aromáticas substituídas com alquilo ou alcoxilo. Numa forma de realização preferida, as aminas quirais obtidas são seleccionadas do grupo consistindo de fenilalanina, alanina, 3-aminopiperidina, alquil-3-amino-butanoatos, 3-aminopirrolidina (3-AP), 3-piridil-l-etilamina (3-PEA), N-l-boc-3-aminopirrolidina (B3AP), éster etílico do ácido 3-aminobutírico (3-ABEE), éster metálico do ácido 3-aminopentanóico (3-APME), a-metilbenzilamina (α-MBA), 1-aminotetralina, a-metil-4-(3-piridil)-butanamina, glutamato, β-aminobutirato, sec-butilamina, metoxiisopropilamina, derivados de 3-aminopirrolidina, l-N-Boc-3-aminopiperidina, cefalosporina e derivados da cefalosporina.

Numa forma de realização particularmente preferida, a presente invenção prevê fazer reagir 30P com uma transaminase selectiva (S) ou (R) e alanina como um dador amino para obter um 3AP (S) ou (R) opticamente activo.

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção prevê fazer reagir 3-PMK com uma transaminase selectiva (R) ou (S) e alanina como um dador amino, para obter uma 3-PEA (R) ou (S) opticamente activa.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, a invenção prevê fazer reagir 3-OBEE com uma transaminase selectiva (R)- ou (S)- e alanina como um dador amino, para obter uma 3-ABEE (R) ou (S) opticamente activa.

Noutra forma de realização preferida, a invenção prevê fazer reagir 3-OPME com uma transaminase selectiva (R) ou (S) e 9 alanina como um dador amino, para obter uma 3-APME (R) ou (S) opticamente activa.

Noutra forma de realização preferida, a invenção prevê a reacção de B30P com uma transaminase selectiva (R) ou (S) e alanina como um dador amino, para obter um B3AP (R) ou (S) opticamente activo.

Numa forma de realização particularmente preferida, a

invenção refere-se a uma reacção entre ο B30P e o dador amino, alanina, na presença de uma transaminase para obter ο B3AP opticamente activo e piruvato, em que a reacção é efectuada a um pH de 5,0 a 9,5, de um modo preferido, 6,0 a 7,0, em particular 6,0 a 6,9, durante um período de 30 a 70 minutos, em particular, 40 a 65 minutos, em particular 50 a 60 minutos.

Numa forma de realização particularmente preferida, a referida transaminase é uma transaminase selectiva (R) . Noutra forma de realização preferida, a referida transaminase é uma transaminase selectiva (S).

Numa forma de realização preferida, a referida reacção de B30P com o dador amino, a alanina, é efectuada na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase (PDC). Noutra forma de realização preferida, a referida reacção de B30P com o dador amino, a alanina, na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase é efectuada enquanto se introduz, simultaneamente, azoto gasoso na mistura reaccional para a remoção do acetaldeído obtido do piruvato formado pela acção da PDC. 10

Noutra forma de realização preferida, a referida reacção de B30P com o dador amino, alanina, na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase é efectuado na presença de, pelo menos, uma álcool desidrogenase (ADH) para a remoção do acetaldeído obtido do piruvato formado pela acção da PDC.

Noutra forma de realização preferida, a referida reacção de B30P com o dador amino, alanina, na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase, é efectuada enquanto se introduz simultaneamente azoto gasoso na mistura reaccional, em que, pelo menos, uma álcool desidrogenase está presente no meio reaccional para remover o acetaldeído obtido do piruvato formado pela acção da PDC.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, a invenção prevê a reacção da acetofenona com uma transaminase selectiva (R) ou (S) e alanina como um dador amino para obter oí-MBA (R) ou (S) opticamente activo.

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção prevê a reacção de um aceitador amino, em particular, hidrocarbonetos heterocíclicos substituídos com S, 0 ou N ou cíclicos com 5 a 6 membros contendo o grupo oxo, mono ou bicíclicos ou aromáticos, em particular, aromáticos substituídos com alquilo ou alcoxilo com alanina como um dador amino e uma transaminase selectiva (R) ou (S) para obter aminas opticamente activas, em particular, aminas mono- ou bicíclicas, em particular aminas de hidrocarbonetos cíclicos com 5 a 6 membros ou hidrocarbonetos heterocíclicos substituídos com S, 0, ou N ou aminas aromáticas, em particular, aminas aromáticas substituídas com alquilo ou alcoxilo, em particular na forma (S) ou (R). 11

Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o aceitador amino e o dador amino, alanina, são feitos reagir com uma transaminase selectiva (R) ou (S) em meio aquoso, por exemplo, tampão fisiológico. Numa forma de realização particularmente preferida, a reacção de transaminação é efectuada a um pH na gama de 5,0 a 9,5, 5a 9, em particular de 7 a 8,5. A invenção prevê, numa forma de realização particularmente preferida, fazer reagir o aceitador amino e o dador amino a um valor de pH de 6,0 a 7,0, de um modo preferido, de 6,0 a 6,9.

Numa forma de realização particularmente preferida, a reacção é efectuada numa gama de temperatura de 10 a 65 °C, de um modo preferido, 20 a 50 °C, em particular, 18 a 25 °C, de um modo preferido, à temperatura ambiente ou 34 °C a 39 °C, em particular, 37 °C. Noutra forma de realização preferida da presente invenção, o aceitador amino e o dador amino são proporcionados numa proporção molar de 1:50 a 1:200, em particular de 1:50 a 1:100, em particular 1:100, em particular 1:1 a 1:5, em particular de 1:1 a 1:2. Numa forma de realização da presente invenção, a actividade enzimática pode ser de 1 a 20000 ymol/min.

Noutra forma de realização preferida, a reacção é efectuada durante um periodo de tempo de 30 a 70, de um modo preferido, 40 a 65, em particular, 50 a 60 minutos.

Assim, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um processo para a preparação de uma amina quiral opticamente activa de acordo com o anterior, isso significa de acordo com os quais num primeiro passo do processo a) são proporcionados um aceitador amino e como um dador amino alanina, num segundo passo 12 do processo b) o aceitador amino e o dador amino são feitos reagir com, pelo menos, uma transaminase selectiva (R) ou (S), de um modo preferido, uma ω-transaminase, num terceiro passo do processo c) é obtida uma amina quiral opticamente pura e um piruvato como produto secundário da α-cetona e, em que, num outro passo do processo d) o produto secundário de cetona, em particular, o produto secundário de α-cetona, obtido no passo c) é removido da mistura reaccional obtida por reacção com uma enzima, isso significa por clivagem enzimática utilizando uma descarboxilase.

Numa forma de realização particularmente preferida, o produto de cetona, nomeadamente, piruvato, obtido no passo c) é removido por reacção com uma piruvato descarboxilase (PDC), por exemplo, da Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis ou Zymobacter palmae, produzindo, deste modo, de um modo preferido, acetaldeído e CO2.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo, em que o produto de cetona obtido, nomeadamente piruvato, é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeído formado deste modo é removido, por exemplo, por um tratamento químico, enzimático ou físico.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo, em que o produto de cetona, nomeadamente piruvato, obtido é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeído formado deste modo é removido, por exemplo, por alimentação de azoto gasoso na mistura reaccional, de um modo preferido, por alimentação do referido azoto gasoso continuamente na mistura reaccional, para remover o acetaldeído da mistura reaccional. 13

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo, em que o produto de cetona, nomeadamente piruvato obtido é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeido assim formado é removido por reacção do acetaldeido com, pelo menos, uma álcool desidroxigenase (ADH) para remover o acetaldeido da mistura reaccional e converte-lo em etanol.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo, em que o produto de cetona, nomeadamente, o piruvato obtido é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeido assim formado é removido por aplicação de uma pressão reduzida à mistura reaccional.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo em que o produto de cetona, nomeadamente piruvato obtido é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeido formado é removido por reacções químicas.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um processo, em que o produto de cetona, nomeadamente piruvato obtido é removido por acção de uma PDC e em que o acetaldeido assim formado é removido por alimentação de azoto gasoso na mistura reaccional, de um modo preferido, por alimentação do referido azoto gasoso continuamente na mistura reaccional e, em que, adicionalmente, o acetaldeido é feito reagir com, pelo menos, uma álcool desidroxigenase (ADH) para remover o acetaldeido da mistura reaccional e converte-lo em etanol.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, o produto de cetona, nomeadamente piruvato, obtido no passo c) é removido continuamente da mistura reaccional. 14

Estas formas de realização particularmente preferidas proporcionam a vantagem de obter uma taxa de conversão particularmente elevada, uma vez que o produto de cetona como produto secundário, nomeadamente piruvato do presente processo, é removido da reacção de equilíbrio. A reacção é forçada na direcção dos produtos, proporcionando assim, com uma estereosselectividade elevada, uma conversão muito elevada nos produtos desejados. A presente invenção refere-se também a processos para a preparação dos compostos fisiologicamente activos ou seus precursores e/ou intermediários na sua produção, em particular seleccionados do grupo de derivados 3-aminopirrolidina, cefalosporina, derivados da cefalosporina, ácidos borónicos heterocíclicos, L-di-hidroxifenilalanina (L-Dopa), a-metildopa, D-fenilglicina, β-hidroxifenilglicina, fosfinotricina, derivados pirimido e derivados pirrolidona, em que é empregue qualquer um dos processos identificados acima da presente invenção. No contexto da presente invenção, um composto fisiologicamente activo é um composto que é fisiologicamente activo quer em plantas, animais, humanos, leveduras ou microrganismos, tais como protozoários, bactérias ou vírus, i. e., interagem com o metabolismo do organismo.

Outras formas de realização preferidas da presente invenção são o objectivo das reivindicações dependentes. A presente invenção é ilustrada em maior detalhe nos seguintes exemplos e figuras que a acompanham.

As figuras que a acompanham ilustram a presente invenção. 15 A Figura 1 mostra uma cromatografia em camada fina. A Figura 2 mostra a actividade relativa da ω-ΤΑ de V. fluvialis dependendo do valor de pH. A Figura 3 mostra a redução relativa da concentração de B3AP para incubações com várias substâncias. A Figura 4 mostra a redução relativa da conversão de B3AP na presença de piruvato e acetaldeído. A Figura 5 mostra a conversão de B30P em B3AP ao longo do tempo para várias pressões. A Figura 6 mostra a conversão relativa de B30P em B3AP na presença de vários PDC. A Figura 7 mostra o efeito de uma concentração de alanina aumentada e uma concentração de PDC aumentada numa síntese assimétrica de B3AP. A Figura 8 mostra a conversão de B30P em B3AP a concentrações de alanina aumentadas. A Figura 9 mostra a conversão relativa de B30P em

B3AP.dependente de PLP A Figura 10 mostra a conversão relativa de B30P para B3AP dependente da presença de N2. A Figura 11 mostra a conversão relativa de B30P em B3AP na presença de uma ADH. 16

Exemplo 1; Síntese Assimétrica de B3AP A síntese assimétrica de B3AP foi efectuada em tubos reaccionais de 1,5 mL. 0 B30P como um aceitador amino foi utilizado numa concentração de 5 mM ( 7,5 pmol). A concentração do dador amino utilizado, a L-alanina, foi de 5 mM. Os reagentes e as condições reaccionais utilizados são evidentes a partir da tabela 1 abaixo.

Tabela 1: As condições reaccionais para a síntese assimétrica de (S)-B3AP utilizando a (S)-co transaminase para a transaminação do grupo amino da alanina para B30P 1 2 3 4 5 6 B30P, 20 mM [pL] 375 375 375 375 375 375 D,L-Ala, 100 mM [pL] 150 2 6 mg D,L-Ala 150 150 150 150 TA7/TA8 [pL] 18 111 18 111 111 18 111 18 111 18 111 LDH [pL] 500 pL + 60 pL 250 mM NADH PDC1 [pL] 200 (15U) PDC2 [pL] 34 (2 0U) 34 (20U) Tampão [pL] 957 864 1218 1125 6 64 923 830 923 830 397 304 17 0 tampão utilizado foi o fosfato de sódio 50 mM, pH 7. TA7 denomina a ω-transaminase de Vibrio fluvialis (Jiilich Fine Chemicals, Alemanha). TA8 designa a ω-transaminase de Alcaligenes denitrificans (Jiilich Fine Chemicals, Alemanha) . Foi utilizado um extracto de Escherichia coli como a lactato desidrogenase. Além disso, foi adicionada NADH a uma concentração final de 10 mM. A concentração da piruvato descarboxilase foi variada. Foram utilizadas 1,5 unidades (20 pL) e 15 unidades (200 pL) da piruvato descarboxilase de

Saccharomyces cerevisiae (PDC1). Foram utilizadas 2 unidades (3,4 pL) e 20 unidades (34 pL) da piruvato descarboxilase de Zymomonas mobilis (PDC2).

Tabela 2: Conversão e pureza óptica obtidas utilizando TA8 para a síntese assimétrica de B3AP. Os cálculos foram baseados na análise por GC (+/- 5%)

Corrida Enzima Conversão [%] % de ees [%] enantiómero (S) 1 TA7 ou TA8 individuais 1,3 99,4 2 Excesso de Alanina (50-vezes) 10, 1 99,6 3 PDC de Saccharomyces cerevisiae 4, 6 99,5 4 PDC de Zymomonas mobilis 34, 0 99,6 5 PDC de Zymomonas mobilis (72 h) 73, 0 99, 4 6 LDH de Escherichia coli 66,5 99,9 18

Referindo-se agora à tabela 2 acima, é evidente que em cada uma das seis corridas utilizando a ω-transaminase de TAB, pode ser alcançado um grau muito elevado de pureza óptica para o (S)-B3AP obtido. Foi também observado que, independentemente da utilização de TA7 ou TA8, o grau de conversão foi apenas moderado, se o equilíbrio da reacção não foi influenciado (corrida 1). Utilizando alanina num excesso de 10-50 vezes melhorou apenas ligeiramente a conversão. Nas corridas 3, 4, 5 e 6, o produto de cetona da reacção, quer dizer, piruvato, foi, durante a reacção de transaminação, removido da reacção de equilíbrio. A utilização de TA8 em conjunto com a lactato desidrogenase da E. coli (corrida 6) conduziu a um grau extremamente melhorado de conversão enquanto mantendo, e até mesmo melhorando, a enantiosselectividade. Praticamente o mesmo é válido para a enantiosselectividade proporcionada pela piruvato descarboxilase de Zymomonas mobilis (corridas 3 a 5), no entanto, a PDC1, aumenta apenas ligeiramente a conversão, a PDC2 aumenta moderadamente a taxa de conversão (corrida 4) se feita reagir durante 24 h enquanto que numa reacção de 72 h (corrida 5), a conversão foi drasticamente melhorada. Todas as reacções aconteceram durante 24 h, excepto para a corrida 5, que ocorreu durante 72 h. A figura mostra a cromatografia de camada fina das reacções efectuadas de acordo com a tabela 1. "A" indica a ω-transaminase de Alcaligenis denitrificans enquanto "V", a ω-transaminase de Vibrio fluvialis. "K" indica a corrida 1 utilizando TA7 ou TA8 individuais (corrida 1). PDC1 indica a corrida com piruvato descarboxilase de Saccharomyses cerevisiae (corrida 3), LDH a corrida com lactato desidrogenase de Escherichia coli (corrida 6) e PDC2 a corrida com piruvato descarboxilase de Zymomonas mobilis (após 24 e 72 h) (corrida 4 e 5) . Assim, os 19 resultados mostram claramente que a produção de (S)-B3AP a partir da cetona B30P pró-quiral poderá ser efectuada com uma enantiosselectividade muito elevada. Utilizando as ω-transaminases como as únicas enzimas no processo de preparação, no entanto, conduz a uma conversão moderada. Esta taxa de conversão moderada poderá ser muito mais melhorada por remoção de piruvato do equilíbrio, em particular utilizando a lactato desidrogenase ou piruvato descarboxilase. Utilizando a piruvato descarboxilase tem, inter alia, a vantagem de que não foi necessário reciclar o co-factor (NADH). Proporciona também, de um modo vantajoso, a remoção enzimática de piruvato com PDC e, deste modo, proporciona a vantagem adicional de remover ou evitar a inibição do produto (produto de cetona) e deslocando o equilíbrio da reacção para a direita conseguindo assim uma conversão superior (caso ideal de 100%). A corrida 6 não pertence aos ensinamentos presentes.

Exemplo 2: Dependência do pH da actividade da ω-transaminase na reacção de conversão de (S)-otMBA em acetofenona (não pertencente aos presentes ensinamentos) A síntese foi efectuada numa cuvette de quartzo utilizando 50 pL de piruvato 100 mM, 4 unidades/mL da ω-ΤΑ de Vibrio fluvialis (daqui para a frente também Vfl) (12 μL) e 388 μL de tampão de fosfato de sódio, 50 mM com variações de pH 6,0 para pH 7,4 em passos de 0,2. A reacção foi iniciada com 50 pL de (S)-aMBA 100 mM como o dador amino e o aumento na absorção foi determinado de 250 até 260 nm. O aumento na absorção é devido à acetofenona formada. Os outros substratos contribuem apenas de um modo insignificante, para a absorção de modo a que a 20 velocidade da reacção possa ser determinada pela medição da absorção da acetofenona. 0 valor atingido a pH 7,4 foi estabelecido como 100% e a actividade relativa para os outros valores de pH foi calculada como é evidente a partir da figura 2. A figura 2 mostra a actividade relativa da ω-ΤΑ de V. fluvialis dependendo do valor de pH apresentado. A Figura 2 mostra que a valores de pH inferiores, tais como 6,0, 6,2 ou 6,4, existe ainda actividade considerável, por exemplo, 11% a pH 6,0. Assim, este resultado demonstra que mesmo a um pH baixo, é possível obter uma actividade de transaminase significativa, permitindo fazer reagir com os substratos a um pH baixo, que por sua vez, permite aumentar a conversão utilizando uma PDC, que é sensível a valores de pH mais elevados.

Exemplo 3: Síntese assimétrica de B3AP a valores de pH diferentes

Neste exemplo, a síntese assimétrica de B3AP a partir da alanina e B30P é apresentada na presença e ausência de uma piruvato descarboxilase (PDC).

Para casa valor de pH 6,0, 6,4 e 7,0, foram efectuadas três corridas de experiências. A corrida 1 utilizou a PDC de Zymomonas mobilis (extracto de células do tipo selvagem), a corrida 2 utilizou Zymobacter palmae (recombinante em E. coli) e a corrida 3 foi um controlo sem PDC, empregando apenas a transaminase. Para obter resultados passíveis de comparação, as actividades de ambas as PDC foram determinadas a pH 6 com um ensaio de álcool desidrogenase e a mesma quantidade de 21 actividade das PDC foi utilizada nas corridas identificadas acima. A Tabela 3 apresenta os volumes da substância utilizados em pL. Cada corrida reaccional foi efectuada três vezes a valores de pH de 6,0, 6,4 e 7,0. O valor de pH foi ajustado pelo tampão da solução de substrato B30P. A actividade da PDC foi de cerca de 2,5 unidades/mL a pH 7. As concentrações de substrato e enzima foram também evidentes a partir da tabela 3 abaixo. Após 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, foi retirada uma amostra de 100 pL e a reacção interrompida pela adição de 100 pL de NaOH 1 Μ. A quantificação da concentração de B3AP foi efectuada utilizando CE (electroforese capilar).

Tabela 3

Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 B30P 10 mM em tampão 100 mM de valor de pH correspondente 500 500 500 D,L-alanina 400 mM 25 25 25 PDC de Z. mobilis 290 - - PDC de Zb. palmae — 18,32 - V. fluvialis ω-ΤΑ a pH 7,0 21, 4 21, 4 21, 4 V. fluvialis ω-ΤΑ a pH 6,4 72,3 72,3 72,3 1/. fluvialis ω-ΤΑ a pH 6,0 110 110 110 TPP 4 mM 25 25 25 PLP 4 mM 25 25 25 MgCl2 4 0 mM 25 25 25 Água adicionar 1000 pL 22 A Tabela 4 abaixo mostra a conversão a diferentes valores de pH para as diferentes PDC. É evidente que a utilização de PDC aumenta a conversão. É também evidente que o PDC de Z. palmae (Zpa) provoca uma conversão um pouco superior à obtida com PDC de Z. mobilis (Zmo) . É também evidente que a valores de pH inferiores, tal como 6,0 ou 6,4, é observado um aumento considerável na conversão nas corridas utilizando PDC, que não é observado no controlo sem PDC. Em todas as corridas reaccionais pode ser observado que após 120 minutos, a conversão diminuiu.

Tabela 4

Conversão Corrida 1 (Zmo) Corrida 2 (Zpa) Corrida 3 (controlo) Tempo (min) pH 6 pH 6,4 pH 7 pH 6 pH 6,4 pH 7 pH 6 pH 6,4 pH 7 10 7,5 5,5 2,4 12, 1 9,8 4, 9 2,5 2,4 2,0 30 11, 4 14, 2 9,6 16,0 17, 8 15,2 5,1 4,8 4,6 60 8,3 n. d. 12,4 11, 0 n. d. 16,3 7,0 n. d. n. d. n.d.= não determinado 23

Exemplo 4; Estabilidade de B3AP na presença de vários reagentes de uma reacção de síntese assimétrica

Para demonstrar a estabilidade de B3AP na presença de vários reagentes, foram efectuadas incubações de B3AP 1 mM num tubo reaccional durante 3 h na presença de várias substâncias, como listado na tabela 5 abaixo. 0 exemplo foi efectuado a um pH de 6 e 7 (tampão de fosfato de sódio). Directamente após fazer reagir as substâncias, foi retirada uma primeira amostra To, e outra amostra, Ti, após 3 horas. Após a extracção, foi determinada a concentração de amina com um padrão interno (aMBA) por CE. A partir da diferença das concentrações obtidas, foi calculada a diminuição em % da concentração de B3AP (ver figura 3).

Tabela 5 B3AP 1 mM e: Corrida Reagentes 1 tampão Na-P 50 mM 2 B30P 5 mM 3 D,L-alanina 10 mM 4 cofactores (PLP, TPP 0,1 mM, Mg 5 mM) 5 cofactores + B30P + alanina 6 145 pL de extracto celular de Z.mobilis (50% de glicerina) 7 10 pL de extracto celular de E.coli (Zpa PDC recombinante) 8 55 pL/11 pL de Mil-TA (pH 6/7) 2 4 (continuação) B3AP 1 mM e: Corrida Reagentes 9 50 pL de Ade-TA 10 VTI-TA + B30P + cofactores 11 acetaldeido 1 mM 12 Vfl-TA + acetaldeido 13 Ade-TA + acetaldeido

Da figura 3 é evidente que os diferentes reagentes não afectam significativamente a concentração de B3AP (corridas 1 a 9) . As corridas reaccionais 11 a 13 mostram a influência de acetaldeido. Da corrida 11 é evidente que na ausência de uma transaminase não ocorre redução na concentração de B3AP, enquanto que na presença de uma transaminase e acetaldeido pode ser observada uma forte redução na concentração de B3AP. As funções de acetaldeido na reacção da transaminase como um receptor amino, tal como piruvato, conduz obviamente a uma redução na concentração de B3AP.

Exemplo 5: Reacção de B3AP com aceitadores amino, piruvato e acetaldeido (não pertencendo ao presente ensinamento)

Neste exemplo, é apresentada a actividade de transaminase da ω-ΤΑ de V. fluvialis e A. denitrificans para os substratos B3AP e piruvato e para B3AP e acetaldeido. 0 B3AP 2 mM foi feito reagir com piruvato 2 mM ou acetaldeido 2 mM (36 pL de transaminase de Alcaligenes denitrificans (Ade) ou 6 pL de transaminase de Vibrio fluvialis 25 (Vfl) por 0,5 pL de volume reaccional, correspondendo a 2 unidades/pL de transaminase que foram feitas reagir durante 30 minutos). A Figura 4 apresenta os resultados. Consequentemente, ο B3AP foi convertido em B30P por ambas as enzimas, tanto com piruvato como com acetaldeído, sem quaisquer diferenças significativas.

Exemplo 6: Síntese assimétrica de B3AP sob pressão reduzida a pH 6

Neste exemplo, foi aplicada uma pressão reduzida à mistura reaccional para uma síntese assimétrica para formar B3AP. Como um controlo, foi efectuada a mesma reacção a pressão normal e sem PDC.

Condições reaccionais:

Volume final: 1,5 mL

Tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 6 300 pL de transaminase de Vibrio fluvialis 60 pL de Zpa-PDC (corresponde a 8 unidades/mL a pH 7)

B30P 5 mM

D,L-alanina 10 mM

TPP, PLP 0,1 mM 26

MgCl2 5 mM A pressão reduzida foi aplicada utilizado um evaporador rotativo (150 mBar). A determinação foi efectuada utilizando CE. A Figura 5 mostra a conversão de B30P em B3AP ao longo do tempo para várias pressões. É evidente que a conversão é praticamente independente da pressão aplicada. A conversão a uma pressão de 150 mbar é, no que se refere à conversão máxima obtida, semelhante à conversão a uma pressão de 1000 mbar.

Exemplo 7: Comparaçao de várias piruvato descarboxilases

Neste exemplo, foram utilizadas três piruvato descarboxilases diferentes para a síntese assimétrica de B3AP. As condições reaccionais correspondem às do exemplo 6, excepto que foi utilizado um pH de 7. Foram utilizadas PDC de Z. mobilis, Z. palmae e uma PDC de Biocatalytics (catálogo n° PDC-101). As actividades das PDC no ensaio ADH foram idênticas (1,6 unidades/mL). A Figura 6 mostra que todas as três PDC resultam, essencialmente, em conversões comparáveis. 27

Exemplo 8; Influência das concentrações de enzima e co-substrato na conversão de B30P em B3AP

Neste exemplo, é demonstrada a influência da concentração de PDC na conversão de B30P em B3AP, utilizando alanina como dador amino. Além disso, é demonstrada a influência da concentração de alanina na conversão de B30P em B3AP.

As condições reaccionais são apresentadas no exemplo 6, excepto que foi utilizado um pH de 7 e excepto quando indicado em contrário. Foi utilizado Zymobacter palmae TA.

Como é evidente a partir da figura 7, numa reacção sem PDC um aumento de 5 vezes na concentração de alanina de 5 mM para 25 mM resulta numa duplicação da conversão (12% em contraste com 5,3% de conversão após 2 h) . Na presença de PDC, a conversão aumenta para o dobro com um excesso de 5 vezes de alanina (30% em contraste com 17% após 90 minutos) . No caso da quantidade de PDC ser aumentada, numa concentração normal de alanina, de 1,6 unidades/mL para 50 unidades/mL, a conversão é também aumentada, no entanto, apenas por um factor < 2 (29% em contraste com 17% após 40 minutos).

Numa outra corrida de experiências, foi mostrada a influência de um excesso de alanina combinado com um excesso de PDC, a um pH de 6 e 7. A reacção é mais rápida a um pH de 6, enquanto após atingir uma conversão de 49%, a concentração de B3AP também diminuiu mais rapidamente. A um pH de 7, a conversão aumento até 56%. 28

Exemplo 9: Influência da concentração de alanina na síntese assimétrica de B3AP

Em quatro reacções, foram utilizadas concentrações de alanina de 5 mM, 25 mM, 110 mM, 300 mM e 500 mM. Para cada corrida, foi efectuado um controlo sem PDC e uma reacção com PDC. O valor de pH foi ajustado para pH 7,0. As amostras foram retiradas a cada meia hora durante o tempo da reacção de 3 horas. Os tempos de reacção para as conversões dador na figura 8 foram de 40 minutos para 5 mM, 60 minutos para 25 mM e 90 minutos para 110 a 500 mM. A Figura 8 mostra a conversão da síntese assimétrica de B3AP a concentrações elevadas de alanina. A Figura 8 mostra claramente que a conversão pode atingir 60 a 70%. É evidente que aumentando a concentração de alanina de 25 para 110 mM teve um efeito significativo na conversão de B30P em B3AP e que um aumento posterior para 500 mM apenas influencia ligeiramente a conversão. A influência de PDC na conversão diminui com o aumento na concentração de alanina. A partir dos dados da reacção de controlo, foi calculada a constante de equilíbrio da síntese de B3AP como se segue: [B3AP} = [Pyr] [B30P] = colnOP-[B3AP] e [Ala] = c0Ala-[B3AP] 29

Deste modo, utilizando a concentração de B3AP medida, foi calculada a constante de equilíbrio como: [B3AP][Pyr]_[B3AP]2_ [B30P] [Ala] ~ (Wp - [B3AP]) - [q, Ala -[B3AP]

Tabela 6 c0, [Ala] [B3AP] K 10'J 5 5 3,2 25 12 3,1 110 24 3,5 300 35 3,2 500 40 2, 8 Média de K: 3,1 A Tabela 6 mostra os valores calculados. Deste modo, a constante de equilíbrio para a reacção com B3AP é de 3,1 x 1CT3. Deste modo, o substrato B30P é um substrato adequado para a síntese assimétrica em contraste com outras cetonas.

Exemplo 10: Influência de PLP na síntese assimétrica de B3AP

Neste exemplo, é demonstrada a influência de PLP (piridoxal-5'-fosfato) na conversão de B30P em B3AP. Foram examinadas as sequintes três corridas reaccionais. 30 a) Corrida 1 utilizando PLP 0,1 mM sem adiçao de mais PLP. b) Na corrida 2, foi adicionado PLP durante a reacção, logo que desapareceu a cor amarela, que é devida à presença de PLP no meio reaccional. Com este objectivo, foram adicionados 1 a 2 pL de uma solução saturada de PLP, recuperando deste modo uma cor amarela intensa. A influência na concentração de amina através deste pequeno aumento no volume é considerada como sendo inferior a 1% e, por isso, pode ser ignorada. c) Sem PLP presente e sem PLP adicionado.

Condições reaccionais: 1 mL de volume final, 37 pL de VTl-transaminase, B30P 5 mM, tampão de fosfatos pH 7,0. A concentração de L-alanina foi de 110 mM. As medições foram efectuadas por CE e foi utilizado a-MBA como padrão interno. A Figura 9 mostra a conversão ao longo do tempo. Parece não existir influência significativa na conversão máxima devido à adição de PLP à corrida b) em comparação com a corrida a) . A reacção sem PLP parece ser mais lenta, embora tenha atingido a mesma conversão que as outras reacções. A adição de PLP na corrida b) provocou uma redução ligeiramente maior na concentração de amina em comparação com a corrida de controlo. 31

Exemplo 11; Síntese assimétrica de B3AP com remoção de acetaldeído através da adição de azoto 0 seguinte exemplo descreve em detalhe um modo para melhorar a conversão da síntese assimétrica de B3AP pela remoção de acetaldeído.

Condições reaccionais:

Substratos:

B30P 5 mM

L-alanina 500 mM

32 U/mL de Zpa-PDC 37 pL/mL de VTl-transaminase

Tampão de fosfato de sódio pH 7,0

PLP e TPP (difosfato de tiamina) 0,1 mM

MgCl2 5 mM

Uma vez que a solução reaccional continha uma quantidade significativa de proteína, existe uma forte tendência para a formação de espuma. Para suprimir a referida espuma, foi adicionado 0,6 pL de um concentrado de antiespuma A (Sigma, polímero de silicone) à corrida reaccional. O concentrado suprimiu a geração de espuma em grande extensão, mas não 32 conseguiu inibi-la completamente. Para excluir que o referido concentrado antiespuma inibe as enzimas, uma corrida de controlo sem a adição de azoto foi suplementada com antiespuma A.

Uma vez que a adição de azoto seco conduziu a uma evaporação de água da solução reaccional, o azoto foi humidificado. A Figura 10 mostra as conversões relativas calculadas de B3AP. O controlo com antiespuma A (controlo N2: Vfl-TA, Zpa-PDC, antiespuma, sem azoto N2) sem adição de azoto corresponde exactamente à corrida reaccional sem antiespuma A (Vfl-TA, ZpaPOC). Deste modo, as enzimas não são influenciadas pela adição do concentrado de antiespuma. A corrida (corrida N2: Vfl-ΊΑ, Zpa-PDC, antiespuma, N2) tratada com azoto mostrou um aumento na conversão após 60, 90 e 180 minutos.

Exemplo 12: Síntese assimétrica de B3AP sob várias condições Condições Reaccionais:

Volume final: 1 mL 3,7 pL de VTI-transaminase 32 unidades/mL de PDC de Zpa ou PDC de Biocatalytics ou 3,2 unidades/mL de PDC de Zmo

B30P 5 mM

L-alanina 500 mM 33

Cofactores PLP e TPP 0,1 mM, MgCl2 5 mM pH 7, fosfato de sódio A Figura 10 mostra a conversão de B30P em B3AP para as corridas reaccionais acima identificadas, combinando a Míl-transaminase com cada PDC.

Na figura 10, a corrida designada N2 é a corrida contendo VTI-transaminase e Zpa-PDC, tratada com azoto e antiespuma A. O controlo N2 é uma amostra contendo Vfl-transaminase, Zpa-PDC e antiespuma A, sem tratamento de azoto. É evidente que existe um aumento significativo na conversão no controlo N2 relativamente à amostra N2 devido à presença de azoto, que foi introduzido na solução reaccional. Deste modo, a alimentação com azoto na forma gasosa no meio reaccional aumenta significativamente a conversão de B30P em B3AP.

Exemplo 13: Síntese assimétrica de B3AP na presença de álcool desidrogenase (ADH)

Para remover o acetaldeído produzido pela reacção da PDC da mistura reaccional, pode ser utilizado a ADH para converter o acetaldeído em etanol.

Condiçoes Reaccionais: L-alanina 110 mM

B30P 5 mM 34 37 pL/mL de VTI-transaminase

32 unidades/mL de Zpa PDC PLP e TPP 0,1 mM MgCl2 5 mM

Tampão de fosfato de sódio, pH 7 São apresentadas as seguintes corridas de reacção:

Corrida de reacção 1: reacção com PDC e transaminase

Corrida de reacção 2: reacção com PDC e transaminase com etanol 5 mM (concentração final) e adição de NADH

Corrida de reacção 3: reacção com PDC, ADH e NADH A ADH utilizada foi a ADH de Saccharomyces cerevisae com uma actividade entre 50 e 100 unidades/mL. A actividade da PDC foi de 32 unidades/mL.

No inicio da reacção foi adicionado etanol absoluto à corrida de reacção 2 numa concentração final de 5 mM. No inicio da reacção foram adicionados 5 pmol de NADH às corridas de reacção 2 e 3, correspondendo a uma concentração final de 5 mM de NADH. Após 10 minutos, foi efectuada outra adição de 2,4 pmol de NADH (4 pL de uma solução 0,6 M de NADH em tampão de fosfatos 50 mM, pH 8,5) . A solução de NADH foi armazenada em gelo e preparada imediatamente antes da utilização. 35

Os resultados são apresentados na figura 11 e tabela 5. 0 efeito do ADH é claramente evidente. A conversão aumenta até, aproximadamente, 90%. A corrida de controlo 2 sem ADH e etanol 1. na 5 mM apenas se desvia ligeiramente da corrida de controlo Deste modo, a adição de ADH aumenta em muito a conversão síntese assimétrica de B3AP a partir de B30P.

Lisboa, 11 de Agosto de 2010 36

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de uma amina quiral opticamente activa e piruvato como um produto secundário de alfa-cetona compreendendo: a) proporcionar uma aceitador amino e alanina como um dador amino, b) fazer reagir o aceitador amino e o dador amino com uma transaminase selectiva (R) ou (S), c) obter a amina quiral opticamente activa desejada e piruvato como um produto secundário de alfa-cetona e d) remover a piruvato da mistura reaccional com uma descarboxilase.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a descarboxilase é uma piruvato descarboxilase (PDC).
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o acetaldeido formado pela acção de PDC é removido.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, onde o acetaldeido é removido por reacção com, pelo menos, uma enzima.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a enzima é uma álcool desidrogenase. 1
6. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o acetaldeido é removido por alimentação com azoto gasoso na mistura reaccional.
7. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o acetaldeido é removido por aplicação de uma pressão reduzida à mistura reaccional.
8. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o acetaldeido é removido por métodos químicos.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o aceitador amino é seleccionado do grupo consistindo de ácido fenilpirúvico, um seu sal, ácido pirúvico, um seu sal, acetofenona, 2-cetoglutarato, 3-oxobutirato, 2-butanona, 3-oxopirrolidina (3-OP), 3-piridilmetilcetona (3-PMK), éster etílico do ácido 3-oxobutírico (3-OBEE), éster metílico do ácido 3-oxopentanóico (3-OPME), N-l-boc-3-oxopiperidinona, N-l-boc-3-oxopirrolidina (B30P), 3-oxo-piperidina, alquil-3-oxo-butanoatos, metoxiacetona e 1-oxotetralona.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as aminas obtidas são aminas mono- ou bicíclicas, em particular aminas cíclicas com 5 a 6 membros ou hidrocarbonetos heterocíclicos substituídos com S, O, ou N ou aminas aromáticas, em particular, aminas aromáticas substituídas com alquilo ou alcoxilo.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as aminas obtidas são seleccionados do grupo consistindo de fenilalanina, alanina, 2 3-aminopiperidina, alquil-3-amino-butanoatos, 3-aminopirrolidina (3-AP), 3-piridil-l-etilamina (3-PEA), N-l-boc-3-aminopirrolidina (B3AP), éster etílico do ácido 3-aminobutírico (3-ABEE), éster metílico do ácido 3-aminopentanóico (3-APME), a-metilbenzilamina (α-MBA), 1-aminotetralina, a-metil-4-(3-piridil)-butanamina, glutamato, β-aminobutirato, sec-butilamina, metoxiisopropilamina, derivados de 3-aminopirrolidina, l-N-boc-3-aminopiperidina, cefalosporina e derivados de cefalosporina.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a ω-transaminase é de Vibrio fluvialis, Alcaligenes denitrificans, Klebsiella pneumoniae ou Bacillus thuringiensis.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amina quiral opticamente activa obtida no passo c) ou d) é removida da mistura reaccional.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo é efectuado numa mistura reaccional com um pH de 5,0 a 9,5.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo é efectuado durante um tempo reaccional de 40 a 70 minutos.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a reacção é efectuada na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase e, pelo menos, uma álcool desidrogenase. 3
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a reacção é efectuada na presença de, pelo menos, uma piruvato descarboxilase, pelo menos, uma álcool desidrogenase e, adicionalmente, na presença de azoto gasoso (N2) .
18. Processo para a preparaçao de um composto fisiologicamente de derivados derivados de heterocíclicos, oí-metildopa, fosfinotricina, activo seleccionado do grupo 3-aminopirrolidona, cefalosporina, cefalosporina, ácidos borónicos L-di-hidroxifenilalanina (L-Dopa), D-fenilgiicina, β-hidroxifenilglicina, derivados pirimido e derivados pirrolidona, em que é utilizado o processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 17. Lisboa, 11 de Agosto de 2010 4 cetona B30P amina B3AP alanina 2/11 Figura 2 actividade relativa

valor de pH 3/11 Figura 3

Redução relativa de Β3ΆΡ - concentração[%] número da corrida 4/11 Figura 4

5/11

Figura 5 Ο 30 60 90 120 tempo (h) —150 mbar —·— 1000 mbar Controlo sem PDC 6/11 Figura 6 ο V) Μ Ο > c ο υ

tempo (h) ZmoPDC Zpa-PDC 1,7 U/ml —a- Biocat.PDC 7/11 Figura 7 Conversão (%)

φ Zpa-PDC 32 U/mL; 'alanina 25 mM, pH 7 . 'Zpa-PDC 32 U/mL; .alanina 25 mM, pH 6 -TÉt—;Zpa-PDC 1, 6 U/mL; alanina 25 mM —·— iZpa-PDC 50 U/mL —;Zpa-PDC 1, 7 U/mL (controlo analina 2 5 mM controlo alanina 5 mM ( 0 50 100tempo [min] 150 200 8/11 Figura 8

ϋ) jControlo B 32 U/mL PDC 9/11 Figura 9

10/11 Figura 10 <JP i_i O V)n Φ> C O U

0 30 60 90 120 150 180 tempo [min] -Vfl+Zpa - N2-contr Vfl+Zmo Vfl+Biocat. N2 —*c— Vfl-contr. 11/11 Figura 11 àp l__i o !(d W H 0) > c o α

t [min] TA + PDC—·— TA+PDC+Etanol+ + TA + pDC + NADH + ADH NADH