JPS61195696A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニンの製造方法Info
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- JPS61195696A JPS61195696A JP3447485A JP3447485A JPS61195696A JP S61195696 A JPS61195696 A JP S61195696A JP 3447485 A JP3447485 A JP 3447485A JP 3447485 A JP3447485 A JP 3447485A JP S61195696 A JPS61195696 A JP S61195696A
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- acid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、フェニルピルビン酸を原料としたＬ−フェニ
ルアラニンの製造方法に関するものであり、さらに詳し
くは、培養した微生物の培養液、菌体または菌体処理物
の触媒作用を利用し、フェニルピルビン酸とα、ω−ジ
アミン、またはフェニルピルビン酸とω−アミノ酸から
Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法に関する。
ルアラニンの製造方法に関するものであり、さらに詳し
くは、培養した微生物の培養液、菌体または菌体処理物
の触媒作用を利用し、フェニルピルビン酸とα、ω−ジ
アミン、またはフェニルピルビン酸とω−アミノ酸から
Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法に関する。
Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一種であり、輸
液の成分として重要であるばかりでなく、近年注目を集
めている新しい甘味剤であるアスノくルテーム（α−Ｌ
−７スバルチールーＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ル）の原料としての需要も太きい。
液の成分として重要であるばかりでなく、近年注目を集
めている新しい甘味剤であるアスノくルテーム（α−Ｌ
−７スバルチールーＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ル）の原料としての需要も太きい。
従来からＬ−フェニルアラニンの製造法として知られて
いる方法は、３種に大別することができる。
いる方法は、３種に大別することができる。
第一の方法は現在工業的に行なわれている合成法である
。比較的安価にＤＬ一体を製造することができるが、Ｌ
一体のみを得るためには、その後にラセミ分割を行なわ
なければならない欠点を有する。
。比較的安価にＤＬ一体を製造することができるが、Ｌ
一体のみを得るためには、その後にラセミ分割を行なわ
なければならない欠点を有する。
第二の方法は発酵法である。安価な発酵原料からＬ一体
のみを製造できる長所を有するものの、微生物の芳香族
アミノ酸の生合成経路には強固かつ複雑な制御機構が存
在するため、発酵法によるＬ−フェニルアラニンの蓄積
量は必ずしも十分なものになり得ていない。
のみを製造できる長所を有するものの、微生物の芳香族
アミノ酸の生合成経路には強固かつ複雑な制御機構が存
在するため、発酵法によるＬ−フェニルアラニンの蓄積
量は必ずしも十分なものになり得ていない。
第三の方法は、酵素法として知られ、フェニルアラニン
アンモニア−リアーゼ反応の逆反応を利用した桂皮酸か
らの製造法である。しかしながら、この酵素反応の平衡
は本来、大きくＬ−フェニルアラニンの分解方向に片寄
っているため、高濃度のアンモニアの存在下においても
なお桂皮酸からのＬ−フェニルアラニンへの転換率は、
実用にならない低いレベルにとどまっている。
アンモニア−リアーゼ反応の逆反応を利用した桂皮酸か
らの製造法である。しかしながら、この酵素反応の平衡
は本来、大きくＬ−フェニルアラニンの分解方向に片寄
っているため、高濃度のアンモニアの存在下においても
なお桂皮酸からのＬ−フェニルアラニンへの転換率は、
実用にならない低いレベルにとどまっている。
本発明者らはこうした欠点のないＬ−フェニルアラニン
の製造方法を種々検討した結果、ある種の微生物の培養
液、培養菌体あるいは菌体処理物の作用によシ、フェニ
ルピルビン酸トα、ω−ジアミン、またはフェニルピル
ビン酸とω−アミノ酸からＬ−フェニルアラニンが合成
されることを見出し、その発見に基づいて本発明を完成
させた。
の製造方法を種々検討した結果、ある種の微生物の培養
液、培養菌体あるいは菌体処理物の作用によシ、フェニ
ルピルビン酸トα、ω−ジアミン、またはフェニルピル
ビン酸とω−アミノ酸からＬ−フェニルアラニンが合成
されることを見出し、その発見に基づいて本発明を完成
させた。
本発明は、酵素法としてＬ−フェニルアラニンの生産効
率が良いばかシでなく、原料のフェニルピルビン酸、α
、ω−ジアミンおよびω−アミノ酸はいずれもＤ−１Ｌ
一体の存在しない化合物であるため、これらの化合物が
工業的に比較的安価に供給できる利点を有している。
率が良いばかシでなく、原料のフェニルピルビン酸、α
、ω−ジアミンおよびω−アミノ酸はいずれもＤ−１Ｌ
一体の存在しない化合物であるため、これらの化合物が
工業的に比較的安価に供給できる利点を有している。
本発明には、フェニルピルビン酸に対シてα、ω−ジア
ミン、又はω−アミノ酸からアミン基を転移させる能力
を有する微生物が用いられるが、これらにはエツシエリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒ １ｃｈｉａ）、アエロバクタ−（
Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ、ｉ
ａ）、アクロモノ（フタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等多
くの種類がある。
ミン、又はω−アミノ酸からアミン基を転移させる能力
を有する微生物が用いられるが、これらにはエツシエリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒ １ｃｈｉａ）、アエロバクタ−（
Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ、ｉ
ａ）、アクロモノ（フタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等多
くの種類がある。
これらの菌株の培養は、通常、振盪培養あるいは通気攪
拌深部培養などの好気的条件下で行なう。
拌深部培養などの好気的条件下で行なう。
培養温度は２０〜５０℃であり、培養中の培地のｐＨは
中性または微アルカリ性付近に維持することが望ましい
。培養期間は通常、１〜３日間である。
中性または微アルカリ性付近に維持することが望ましい
。培養期間は通常、１〜３日間である。
培地に使用する炭素源および窒素源は、使用菌が利用可
能々ものならばいずれの種類を用いても良い。
能々ものならばいずれの種類を用いても良い。
高いフェニルアラニン合成活性を有する菌体を得るため
には、前述のα、ω−ジアミン捷たはω−アミノ酸のい
ずれか一種を、０．０５〜１多、好ましくは０４％程度
添加するとよい。
には、前述のα、ω−ジアミン捷たはω−アミノ酸のい
ずれか一種を、０．０５〜１多、好ましくは０４％程度
添加するとよい。
炭素源を具体的に述べると、グルコース、グリセロール
、フラクトース、シュクロース、澱粉加水分解液、糖量
などの種々の炭水化物が使用できる。
、フラクトース、シュクロース、澱粉加水分解液、糖量
などの種々の炭水化物が使用できる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種の無機および有機アンモニウム塩類、または肉
エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼ
イン加水分解物、フイソシーミールあるいはその消化物
などの天然有機窒素源が使用可能である。
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種の無機および有機アンモニウム塩類、または肉
エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼ
イン加水分解物、フイソシーミールあるいはその消化物
などの天然有機窒素源が使用可能である。
天然有機窒素源の多くの場合は、窒素源であるとともに
炭素源にもなり得る。また、窒素源として、前述のα、
ω−ジアミンまたはω−アミノ酸のいずれか一種を用い
ることもできる。
炭素源にもなり得る。また、窒素源として、前述のα、
ω−ジアミンまたはω−アミノ酸のいずれか一種を用い
ることもできる。
更に、無機物としてリン酸−カリウム、リン酸二カリウ
ム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム
、リン酸第−鉄なども必要に応じて使用すると好都合で
ある。
ム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム
、リン酸第−鉄なども必要に応じて使用すると好都合で
ある。
本発明に酵素源として使用されるものは、菌株の培養物
をそのまま、または培養液から遠心分離などの方法によ
り採集した生菌体、その乾燥菌体、あるいは菌体を破砕
、自己消化、超音波処理などの処理により得られた菌体
処理物、更にはこれらの菌体よりの抽出物などいづれも
が利用可能である。もちろん、これらの酵素源を固定し
たものであってもよい。
をそのまま、または培養液から遠心分離などの方法によ
り採集した生菌体、その乾燥菌体、あるいは菌体を破砕
、自己消化、超音波処理などの処理により得られた菌体
処理物、更にはこれらの菌体よりの抽出物などいづれも
が利用可能である。もちろん、これらの酵素源を固定し
たものであってもよい。
本発明の実施におけるＬ−フェニルアラニンの合成反応
は、中性付近から弱アルカリ性にかけてのｐＨの水溶液
中で行なわれる。すなわち、反応液のｐＨは６〜１１の
範囲であり、望ましくは８〜１０である。反応温度は２
０〜５０℃、好ましくは６０〜４０℃である。
は、中性付近から弱アルカリ性にかけてのｐＨの水溶液
中で行なわれる。すなわち、反応液のｐＨは６〜１１の
範囲であり、望ましくは８〜１０である。反応温度は２
０〜５０℃、好ましくは６０〜４０℃である。
反応液中で有効なアミン基供与体となり得るα。
ω−ジアミン、またはω−アミノ酸にはメチレン鎖の長
さの異なるいくつかのものがあるが、中でもプトレッシ
ン（１，４−ブタンジアミン）およびカダベリン（１，
５−ペンタンジアミン）は極めて良好なアミノ基供与体
となる。
さの異なるいくつかのものがあるが、中でもプトレッシ
ン（１，４−ブタンジアミン）およびカダベリン（１，
５−ペンタンジアミン）は極めて良好なアミノ基供与体
となる。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ） 、アエロバ
クタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｅｌｅｒ
ｒａｔｉａ）、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）に属する第３表に示した菌株を、５１１Ｌｌの培地を
入れた大型試験管に一白金耳接種し、３７℃で２２時間
振盪培養した。用いた培地の組成を表１、表２に示した
。
クタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｅｌｅｒ
ｒａｔｉａ）、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）に属する第３表に示した菌株を、５１１Ｌｌの培地を
入れた大型試験管に一白金耳接種し、３７℃で２２時間
振盪培養した。用いた培地の組成を表１、表２に示した
。
表１
表２
生育した菌体を遠心分離により集め、０．５ｖｔｌの反
応液の濁度（６６０ｎｍで測定）が１５になるように菌
体量を調節し、試験管中でろ７℃、２時間反応を行なっ
た。反応液（ｐＨ９，０）は、２０ｍＭフ。
応液の濁度（６６０ｎｍで測定）が１５になるように菌
体量を調節し、試験管中でろ７℃、２時間反応を行なっ
た。反応液（ｐＨ９，０）は、２０ｍＭフ。
トレツシン、２０ｍＭフェニルピルビンｌＬＤ、ＩＭピ
リドキサール燐酸、８０ｍＭトリス緩衝液を含有する。
リドキサール燐酸、８０ｍＭトリス緩衝液を含有する。
対照区としては反応液中にプトレッシンを含まないもの
を設定した。２時間後に反応液中に生じていたフェニル
アラニンの量をアミノ酸分析計によシ定量した。得られ
た結果を表３に示した。
を設定した。２時間後に反応液中に生じていたフェニル
アラニンの量をアミノ酸分析計によシ定量した。得られ
た結果を表３に示した。
以上のように、Ａ−Ｄの培地で生育させた菌体を用いた
場合（実施区）は対照区に比較して顕著なフェニルアラ
ニンの生成を認めた。
場合（実施区）は対照区に比較して顕著なフェニルアラ
ニンの生成を認めた。
実施例２
エシェリヒア・コリに−１２（工ＦＯ３３０１）を、プ
トレッシンを唯一の窒素源とする次の培地１２０ｒ／１
１を入れた坂ロフラスコに一白金耳接種し、６０℃で３
２時間振盪培養した。
トレッシンを唯一の窒素源とする次の培地１２０ｒ／１
１を入れた坂ロフラスコに一白金耳接種し、６０℃で３
２時間振盪培養した。
リン酸−カリウム １５２
リン酸二ナトリウム １．５７
硫酸マクネシウム・７水塩 ０．５２
初期 ｐＨ７，０
遠心分離によシ集めた菌体の０４２を、全量５ｍｌの反
応液に添加し、３７℃でフェニルアラニン合成反応を行
なった。反応液（ｐＨ９ｏ）は、２５ｍＭのプトレッシ
ンまたはカダベリン、２０ｍＭフェニルピルビン酸、０
１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭトリス緩衝液を含
有する。
応液に添加し、３７℃でフェニルアラニン合成反応を行
なった。反応液（ｐＨ９ｏ）は、２５ｍＭのプトレッシ
ンまたはカダベリン、２０ｍＭフェニルピルビン酸、０
１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭトリス緩衝液を含
有する。
５時間後、プトレッシンを添加した反応液中には１５．
７ｍＭ、 カダベリンを添加した反応液中には１１．６
ｍＭのフェニルアラニンが生成していた。いずれのアミ
ン基供与体も添加しない対照区では、フェニルアラニン
の生成量は５．７ｍＭであった。
７ｍＭ、 カダベリンを添加した反応液中には１１．６
ｍＭのフェニルアラニンが生成していた。いずれのアミ
ン基供与体も添加しない対照区では、フェニルアラニン
の生成量は５．７ｍＭであった。
銅イオンとＬ−プロリンを含む移動相を用いた逆相カラ
ムによる液体クロマトグラフィーで、反応液中のフェニ
ルアラニンのＤ一体、Ｌ一体の割合を調べたところ、い
ずれのサンプル中のフェニルアラニンもその１００チが
Ｌ一体であった。
ムによる液体クロマトグラフィーで、反応液中のフェニ
ルアラニンのＤ一体、Ｌ一体の割合を調べたところ、い
ずれのサンプル中のフェニルアラニンもその１００チが
Ｌ一体であった。
実施例６
エシェリヒア・コリに−１２（工ＦＯ３３０１） を
、実施例１に示した培地Ａ１２０ｍ１を含む坂ロフラス
コに１白金耳接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。
、実施例１に示した培地Ａ１２０ｍ１を含む坂ロフラス
コに１白金耳接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。
生育した菌体を遠心分離により集め、ｏ、５ｍｌの反応
液の濁度（６６０ｎｍで測定）が２５になるように菌体
量を調整し、３７℃で３時間反応を行なった。
液の濁度（６６０ｎｍで測定）が２５になるように菌体
量を調整し、３７℃で３時間反応を行なった。
反応液（ｐＨ８，０）は、３０ｍＭの各種α、ω−シア
ミンまたはω−アミノ酸、３０ｍＭフェニルピルビン酸
、０．１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭホウ酸緩衝
液を含有する。６時間後に反応液中に生成したフェニル
アラニンの量を表４に示した。
ミンまたはω−アミノ酸、３０ｍＭフェニルピルビン酸
、０．１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭホウ酸緩衝
液を含有する。６時間後に反応液中に生成したフェニル
アラニンの量を表４に示した。
反応液中にα、ω−ジアミンまたはω−アミノ酸のいず
れをも添加しない対照区ではフェニルアラニンの生成量
は４．６ｍＭであった。
れをも添加しない対照区ではフェニルアラニンの生成量
は４．６ｍＭであった。
実施例４
シュードモナス・アエルギノーザエＦＯ１８０全実施例
３と同様の方法で培養し、遠心分離によシ集めた菌体を
超音波処理により破砕した。さらに遠心分離により沈澱
物を除去し、１４ｍ９／ｍＡ’のタンパクを含む上清を
得た。
３と同様の方法で培養し、遠心分離によシ集めた菌体を
超音波処理により破砕した。さらに遠心分離により沈澱
物を除去し、１４ｍ９／ｍＡ’のタンパクを含む上清を
得た。
この上清０．３ ｍｌを含む全量１．０ｍ／の反応液中
で、フェニルアラニン合成反応を行々つた。反応液（ｐ
Ｈ９，０）は２０ｍＭプトレッシン、２０ｍＭフェニル
ピルビン酸、０．１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭ
トリス緩衝液を含有する。３７℃で５時間反応を行なっ
たところ、反応液中には４．５ｍＭのフェニルアラニン
が生じていた。プトレッシンを添加しない対照区では、
フェニルアラニンの生成量は０．４ｍＭであった。
で、フェニルアラニン合成反応を行々つた。反応液（ｐ
Ｈ９，０）は２０ｍＭプトレッシン、２０ｍＭフェニル
ピルビン酸、０．１ｍＭピリドキサール燐酸、８０ｍＭ
トリス緩衝液を含有する。３７℃で５時間反応を行なっ
たところ、反応液中には４．５ｍＭのフェニルアラニン
が生じていた。プトレッシンを添加しない対照区では、
フェニルアラニンの生成量は０．４ｍＭであった。
実施例２と同様の方法で生成したフェニルアラニンのＤ
一体、Ｌ一体の割合を調べたところ、その１００チがＬ
一体であることが確認された。
一体、Ｌ一体の割合を調べたところ、その１００チがＬ
一体であることが確認された。
Claims (3)
- （１）フェニルピルビン酸と一般式Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿
２）−＿ｎＮＨ＿２、（ｎ＝４〜７）で示されるα，ω
−ジアミン、またはフェニルピルビン酸と一般式 Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿２）−＿ｎＣＯＯＨ、（ｎ＝３〜５
）で示されるω−アミノ酸を、フェニルピルビン酸に対
してα，ω−ジアミン又はωアミノ酸からアミノ基を転
移させる能力を有する微生物の培養液、培養菌体または
菌体処理物に接触させることを特徴とするＬ−フェニル
アラニンの製造方法。 - （２）微生物がその培養液中に、α，ω−ジアミン（一
般式Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿２）−＿ｎＮＨ＿２、ｎ＝４〜
７）またはω−アミノ酸（一般式Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿２
）−＿ｎＣＯＯＨ、ｎ＝３〜５）を添加して培養された
ものであることを特徴とする特許請求範囲第一項記載の
方法。 - （３）微生物がエシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチ
ア（ｓｅｒｒａｔｉａ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒ
ｏｍｏｂａ−ｃｔｅｒ）またはシュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）の各属に属するものであることを特
徴とする特許請求範囲第一項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3447485A JPS61195696A (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3447485A JPS61195696A (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61195696A true JPS61195696A (ja) | 1986-08-29 |
Family
ID=12415245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3447485A Pending JPS61195696A (ja) | 1985-02-25 | 1985-02-25 | Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61195696A (ja) |
-
1985
- 1985-02-25 JP JP3447485A patent/JPS61195696A/ja active Pending
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