DE69925267T2 - Verbesserung der enzymatischen synthese von chiralen aminen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen bei der enzymatischen Synthese von chiralen Verbindungen mit einer Aminogruppe, z.B. chiralen Aminen.
  • In den US-Patentschriften 4,950,606, 5,169,780, 5,300,437 und 5,360,724 wird die Enantiomerenanreicherung chiraler Amine durch Verwendung einer Aminosäure-Transaminase beschrieben. Aminosäure-Transaminasen sind bekannte Pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme, die in verschiedenen Mikroorganismen einschließlich Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Saccharomyces, Hansenula, Candida, Streptomyces, Aspergillus und Neurospora anzutreffen sind. Von Yonaha et al., AgriC. Biol. Chem., 47 (10), 2257-2265 (1983), wurden die beiden Aminosäure-Transaminasen EC 2.6.1.18 und EC 2.6.1-19 kristalliert und charakterisiert.
  • Gemäß den US-Patentschriften 4,950,606, 5,169,780 und 5,300,437 können einzelne Stämme von Transaminase enthaltenden Organismen durch Chemostatkultur isoliert werden, d.h. durch Kultivierung in einer konstanten, aber eingeschränkten chemischen Umgebung mit einem Aminagruppenakzeptor und einem Amin als alleiniger Stickstoffquelle. Ein typischer, auf diese Art und Weise in den zitierten Patentschriften isolierter Stamm wurde (von der American Type Culture Collection) als Bacillus megaterium charakterisiert. Omega-Aminosäure-Transaminasen metabolisieren normalerweise Aminosäuren, in denen die Aminogruppe an einem endständigen, achiralen (nicht chiralen) Kohlenstoffatom steht, und das in einer derartigen Chemostatkultur als Stickstoffquelle verwendete Amin kann vom gleichen Typ sein, nämlich achirale Amine wie n-Octylamin, Cyclohexylamin, 1,4-Butandiamin, 1,6-Hexandiamin, 6-Aminohexansäure, 4-Aminobuttersäure, Tyramin und Benzylamin. In denselben Patentschriften wird jedoch angegeben, daß es sich bei dem in derartigen Chemostatkulturen als Stickstoffquelle verwendeten Amin auch um ein chirales Amin wie 2-Aminobutan, α-Phenethylamin und 2-Amino-4-phenylbutan handeln kann. Es kommen auch chirale Aminosäuren wie L-Lysin, L-Ornithin, β-Alanin und Taurin in Betracht.
  • Neben der Enantiomerenanreicherung wird in den US-Patentschriften 4,950,606, 5,169,780 und 5,300,437 die stereoselektive Synthese einer chiralen Form eines Amins durch Einwirkung einer Aminosäure-Transaminase auf ein Keton der Formel R2COR2, worin R1 und R2 für verschiedene Alkyl- oder Arylgruppen stehen, in Gegenwart eines Aminogruppendonators beschrieben. Die beschriebenen Aminogruppendonatoren ähneln den in Chemostatkulturen als Stickstoffquelle verwendeten Aminen; z.B. achirale Amine, in denen die Aminogruppe sich an einem endständigen Kohlenstoffatom befindet, wie ein Propylamin und Benzylamin, chirale Amine, in denen die Aminogruppe sich an einem endständigen Kohlenstoffatom befindet, wie (S)-2-Aminobutan, und chirale Aminosäuren wie L-Alanin und L-Asparaginsäure.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß das achirale Amin 2-Aminopropan unerwarteterweise als Aminogruppendonator bei derartigen Transaminase-Aminsynthesen im Vergleich mit entweder achiralen Aminen, in denen die Aminogruppe sich an einem endständigen Kohlenstoffatom befindet, oder chiralen Aminen, in denen die Aminogruppe sich an einem nicht endständigen Kohlenstoffatom befindet, besser abschneidet. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verbesserung der bekannten stereoselektiven Synthese eines chiralen Amins, bei der man ein Keton in Gegenwart eines Aminogruppendonators mit einer Transaminase in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminogruppendonator 2-Aminopropan verwendet.
  • Der Begriff chirales Amin wird hier in seinem breitesten Sinne verwendet. Wie in den oben zitierten Patentschriften beschrieben, kann die bekannte stereospezifische Synthese auf die Herstellung einer breiten Palette aliphatischer und alicyclischer Verbindungen mit verschiedenen und gemischten funktionellen Typen angewandt werden, die nur durch die Anwesenheit einer primären Aminogruppe, die an ein sekundäres Kohlenstoffatom gebunden ist, welches neben einem Wasserstoffatom entweder (i) eine zweiwertige Gruppe, die eine chirale cyclische Struktur bildet, oder (ii) zwei (von Wasserstoff verschiedene) Substituenten, die sich in Struktur oder Chiralität voneinander unterscheiden, trägt, gekennzeichnet sind.
  • Beispiele für zweiwertige Gruppen, die eine chirale cyclische Struktur bilden, sind u.a. 2-Methylbutan-1,4-diyl, Pentan-1,4-diyl, Hexan-1,4-diyl, Hexan-1,5-diyl und 2-Methylpentan-1,5-diyl. Die in Rede stehende Verbesserung der Verwendung von 2-Aminopropan als Aminagruppendonator kann somit bei der stereospezifischen Synthese von 1-Amino-2-methylcyclopentan aus 2-Methylcyclopentanon, 1-Amino-3-methylcyclopentan aus 3-Methylcyclopentanon, 1-Amino-2-methylcyclohexan aus 2-Methylcyclohexanon usw. verwendet werden.
  • Die beiden unterschiedlichen Substituenten an dem sekundären Kohlenstoffatom (R1 und R2 oben) können auch breit variieren; hierzu gehören u.a. Alkyl, Aralkyl, Halogen, Hydroxy, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkylthio, Cycloalkyl, Carboxy, Carbalkoxy, Carbamoyl, mono- und di(niederalkyl)substituiertes Carbamoyl, Trifluormethyl, Phenyl, Nitro, Amino, mono- und di(niederalkyl)substituiertes Amino, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Alkylcarboxamido, Arylcarboxamido usw. sowie durch die vorstehenden Reste substituiertes Alkyl, Aralkyl oder Aryl.
  • Die in Rede stehende Verbesserung der Verwendung von 2-Aminopropan als Aminogruppendonator kann somit bei der stereospezifischen Synthese von 2-Aminobutan aus Butanon, 2-Amino-1-butanol aus 1-Hydroxybutan-2-on, Alanin aus Brenztraubensäure, 1-Amino-1-phenylethan aus Acetophenon, 1-Amino-1-(2-methoxy-5-fluorphenyl)ethan aus 2-Methoxy-5-fluoracetophenon, γ-Aminopentansäure aus Lävulinsäure, 1-Amino-1-phenylpropan aus 1-Phenyl-propan-1-on, 1-Amino-1-(4-bromphenyl)propan aus 1-(4-Bromphenyl)propan-1-on, 1-Amino-1-(4-nitrophenyl)propan aus 1-(4-Nitrophenyl)propan-1-on, 1-Phenyl-2-aminopropan aus 1-Phenylpropan-2-on, Valin aus 2-Oxo-3-methylbutansäure, 1-(3-Trifluormethylphenyl)-2-aminopropan aus 1-(3-Trifluormethylphenyl)propan-1-on, 2-Aminopropanol aus Hydroxypropanon, 1-Methoxy-2-aminopropan aus Methoxyoxypropanon, 1-Amino-1-phenylbutan aus 1-Phenylbutan-1-on, 1-Phenyl-2-aminobutan aus 1-Phenylbutan-2-on, 1-(2,5-Dimethoxy-4-methylphenyl)-2-aminobutan aus 1-(2,5-Dimethoxy-4-methylphenyl)butan-2-on, 1-(4-Hydroxyphenyl)-3-aminobutan aus 1-(4-Hydroxyphenyl)butan-3-on, 1-Amino-1-(2-naphthyl)ethan aus 2-Acetylnaphthalin, Phenylalanin aus Phenylbrenztraubensäure, Glutaminsäure aus 2-Ketoglutarsäure, Asparaginsäure aus 2-Ketobernsteinsäure und dergleichen verwendet werden.
  • Im Gegensatz zu den Aminogruppendonatoren aus dem Stand der Technik und in der Tat des größten Teils der theoretisch zur Verfügung stehenden Aminoalkan-Aminogruppendonatoren besitzt 2-Aminopropan die relativ einzigartige Kombination von (i) Achiralität und (ii) Stellung der Aminogruppe an einem nicht endständigen aliphatischen Kohlenstoffatom. Somit wurde ungeachtet der Verwendung einer Omega-Aminosäure-Transaminase, die in der Natur auf eine Aminogruppe in der terminalen oder ω-Position einer Aminosäure wirkt, gefunden, daß die Verwendung als Aminogruppendonator mit einer Aminogruppe an einem nicht endständigen aliphatischen Kohlenstoffatom einen thermodynamischen Vorteil ergibt. Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie scheint es sich so zu verhalten, daß diese Verbesserung darauf zurückzuführen ist, daß als Nebenprodukt der enzymatischen Reaktion in einem derartigen Fall ein Keton anfällt, wohingegen die Verwendung eines Amino gruppendonators mit einer Aminogruppe an einem endständigen Kohlenstoffatom, wie Ethylamin, n-Propylamin, n-Octylamin, 1,4-Butandiamin, 1,6-Hexandiamin, 6-Aminohexansäure, 4-Aminobuttersäure, Tyramin oder Benzylamin, in Gegenwart einer Aminosäure-Transaminase-Reaktion zur Bildung von Aldehyd führt. Bei Reaktionen, bei denen Aminosäuren aus Ketosäuren hergestellt werden, führt der thermodynamische Vorteil der Verwendung von Isopropylamin als Aminogruppendonator zu einer Gleichgewichtskonstante von ungefähr 1000. Da dieser thermodynamische Vorteil von der chemischen Umgebung der reagierenden Carbonylgruppe herrührt, gilt dies gleichermaßen für die Synthese aller chiralen α-Aminosäuren aus Ketosäuren, ob sie nun natürlich sind oder nicht.
  • Ungeachtet dieses thermodynamischen Vorteils führt die Gegenwart der Aminogruppe an einem nicht endständigen aliphatischen Kohlenstoffatom im allgemeinen zu Chiralität, wohingegen eine Substitution an einem endständigen Kohlenstoffatom, das notwendigerweise zwei Wasserstoffatome aufweist, Chiralität ausschließt. Da die Transaminase stereoselektiv ist, steht bei Verwendung eines chiralen Aminogruppendonators nur die Hälfte eines derartigen Amins als Donator zur Verfügung. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist dies für einen Aminogruppendonator untragbar.
  • Leider ist der bei weitem größte Teil der Amino(nieder)alkane, die die erste Vorgabe einer Aminogruppe an einem nicht endständigen Kohlenstoffatom erfüllen, selbst chiral. Unter Beschränkung auf Aminoalkane mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen gibt es somit schätzungsweise mindestens 130 mögliche homologe und isomere Amine, in denen die Aminogruppe nicht an einem dreifach substituierten Kohlenstoffatom steht (um ein Aminogruppendonator zu sein, muß die Verbindung an dem Kohlenstoffatom, an das die Aminogruppe gebunden ist, auch mindestens ein verfügbares Wasserstoffatom enthal ten). Von diesen 130 möglichen Aminogruppendonatoren haben weniger als die Hälfte (54) eine Aminogruppe an einem nicht endständigen Kohlenstoffatom, und davon sind 93% (50) chiral. Nur 4 der Alkylamine mit einer Aminogruppe an einem nicht endständigen Kohlenstoffatom sind achiral, und davon verbieten sich 3 aus Kosten- und Verfügbarkeitsgründen und sind wiederum als Aminogruppendonatoren ungeeignet: 3-Aminopentan, 2,2-Dimethyl-3-Aminopentan und 4-Aminopeptan. Von allen theoretisch als Aminogruppendonatoren geeigneten Amino(nieder)alkanen weist nur 2-Aminopropan (i) eine Aminogruppe an einem nicht endständigen Kohlenstoffatom auf und ist somit gegenüber Aminoalkanen, in denen die Aminogruppe sich an einem endständigen Kohlenstoffatom befindet, thermodynamisch begünstigt, ist nur 2-Aminopropan (ii) achiral, so daß es vollständig für die Reaktion zur Verfügung steht, und ist nur 2-Aminopropan (iii) im Hinblick auf Kosten und Verfügbarkeit akzeptabel. 2-Aminopropan hat außerdem den weiteren Vorteil, daß es als Nebenprodukt Aceton bildet, welches leicht zurückzugewinnen ist und salbst einen Handelsartikel darstellt.
  • Die eigentliche enzymatische Umwandlung kann nach herkömmlichen Kultivierungstechniken mit isolierten, aber nicht wachsenden Zellen oder mit einer löslichen Aminosäure-Transaminase-Präparation durchgeführt werden. Die Aminosäure-Transaminase kann in freier Form, entweder als zellfreies Extrakt oder als Ganzzellenpräparation, oder auf einem geeigneten Träger oder einer geeigneten Matrix, wie vernetztem Dextran oder Agarose, Siliciumdioxid, Polyamid oder Cellulose, immobilisiert sein. Sie kann auch in Polyacrylamid, Alginaten, Fasern oder dergleichen verkapselt sein. Verfahren für eine derartige Immobilisierung werden in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Methods of Enzymology, 44, 1976).
  • Der Zusatz einer Pyridoxamin-Quelle wie Pyridoxalphosphat ist nicht unbedingt notwendig, aber im allgemeinen vorteilhaft.
  • BEISPIEL 1
  • Die Erfindung kann anhand der Herstellung von (S)-1-Methoxy-2-aminopropan, einem chemischen Zwischenprodukt für die Synthese von Agrochemikalien, beispielhaft erläutert werden. Hierbei bringt man Methoxyaceton in Gegenwart von 2-Aminopropan als Aminogruppendonator mit einer Transaminase in Berührung, bis eine wesentliche Menge von Methoxyaceton in (S)-1-Methoxy-2-aminopropan umgewandelt ist (und 2-Aminopropan gleichzeitig in Aceton umgewandelt ist), und isoliert das so gebildete (S)-1-Methoxy-2-aminopropan. Die enzymatische Transformation kann insgesamt folgendermaßen dargestellt werden:
    Figure 00070001
  • Fünf Millimol Natriumdihydrogenphosphat und 250 mL konzentrierte Salzsäure wurden zu 1000 mL Wasser gegeben. Die Mischung wurde in einem Eis-Wasser-Bad auf 5-10°C abgekühlt und mit 258 mL 2-Aminopropan gefolgt von 206 mL Methoxyaceton (98%ig) versetzt. Unter Mischen wurde der pH-Wert dieser Mischung je nachdem entweder mit Natriumhydroxid oder mit Salzsäure auf 7,5 eingestellt. Die Mischung wurde in einen 3-L-Rundkolben mit Temperaturregelung und Rührapparat überführt. Nachdem sich die Temperatur der Reaktionsmischung bei 30 ± 1°C stabilisiert hatte, wurden 0,2 mM Pyridoxal-5'-phosphat zugegeben. Der pH-Wert wird gegebenenfalls wieder auf 7,5 eingestellt, und das Volumen der Mischung kann durch Zugabe einer kleinen Menge Wasser auf 1800 mL gebracht werden.
  • Die Enzymlösung wurde separat hergestellt. 200 mL 5 mM Natriumphasphatlösung (pH 7,5) wurden mit 0,2 mM Pyridoxal-5'-phosphat und 2 g (Trockengewicht) Bacillus-Zellen mit einer (S)-Transaminase versetzt. Nach vollständiger Suspendierung der Zellen wurde die Enzymlösung in die oben beschriebene Reaktionsmischung eingetragen.
  • Die fertige Reaktionsbrühe enthielt 1,5 M 2-Aminopropan und 1,0 M Methaxyaceton. Nach 8 Stunden Reaktion bei 30 ± 1°C und pH 7,5 lag (S)-1-Methoxy-2-aminopropan in der Reaktionsmischung in einer Konzentration von 0,6 M mit einem ee von mehr als 99% vor.
  • Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 5 mL konzentrierter Salzsäure wurden nicht umgesetztes Methoxyaceton und das Nebenprodukt Aceton mittels Flashdestillation in einem einzigen Schnitt entfernt. Dieses Destillat kann einer separaten Säulendestillation zur Trennung des Methoxyacetons und Acetons unterworfen werden. Die Reaktionsmischung wurde zur Deprotonierung der Amine mit zweihundertsiebzig Milliliter 50%iger Natronlauge versetzt. Dann wurden die Amine aus der Mischung in einem einzigen Schnitt abdestilliert, wonach durch eine separate Destillation (S)-1-Methoxy-2-aminopropan von restlichem 2-Aminopropan getrennt wurde, was 125 g (5)-1-Methoxy-2-aminopropan mit 50% Wasser ergab. Das Produkt besitzt gemäß gaschromatographischer Analyse eine chemische Reinheit und Enantiomerenreinheit von mehr als 99%.
  • BEISPIEL 2
  • Die Erfindung kann ferner anhand der Herstellung von L-Alanin, einer wertvollen Aminosäure, beispielhaft erläutert werden. Hierbei bringt man Brenztraubensäure in Gegenwart von 2-Aminopropan als Aminogruppendonator mit einer Transaminase in Berührung, bis eine wesentliche Menge von Brenztraubensäure in L-Alanin und 2-Aminopropan gleichzeitig in Aceton umgewandelt ist. Die enzymatische Transformation kann insgesamt folgendermaßen dargestellt werden:
    Figure 00090001
  • Natriumpyruvat (50 mM, 0,165 g) und Isopropylaminhydrochlorid (50 mM, 0,23 ml einer 6,5-molaren Lösung) wurden in 29,0 ml 50 mM Natriumdihydrogenphosphatlösung gelöst, wonach der pH-Wert auf 7,5 eingestellt wurde. Dann wurde Pyridoxalphosphat (1,0 mM, 8,0 mg), gefolgt von 8 mg E.-coli-Zellen mit einer (S)-Transaminase zugegeben, so daß das Endvolumen 30 ml und der End-pH-Wert 7-5 betrug. Nach 24 Stunden Inkubieren bei 30°C wurden die Konzentrationen von Isopropylamin, Aceton und L-Alanin mittels HPLC und GC bestimmt, wobei sich eine L-Alanin-Konzentration von 45,6 mM ergab, was einem KG1-Wert für die obige Reaktion von mehr als 100 entspricht.
  • Bei Durchführung einer analogen Reaktion unter Verwendung von (R)-Transaminase enthaltenden E.-coli-Zellen (0,3 g) ergab sich eine D-Alanin-Konzentration von 46 mM.
  • BEISPIEL 3
  • Synthese von L-Alanin
  • In einem separaten Beispiel für die Synthese von L-Alanin wurden Natriumpyruvat (1 M, 110,0 g) und Isopropylaminhydrochlorid (1 M, 153 ml einer 6,5- molaren Lösung) in 800 ml 50 mM Natriumdihydrogenphosphatpuffer gelöst, wonach der pH-Wert auf 7,5 eingestellt wurde. Dann wurde Pyridoxalphsophat (1 mM, 265 Milligramm) gefolgt von 5 Gramm E.-coli-Zellen mit einer (S)-Transaminase zugegeben, so daß das Endvolumen 1 Liter und der End-pH-Wert 7,5 betrug. Nach 24 Stunden Inkubieren bei 30°C wurden die Konzentrationen von Isopropylamin und L-Alanin mittels HPLC bestimmt, und die Acetonkonzentration wurde mittels GC bestimmt. Die Konzentration des produzierten L-Alanins betrug 970 mM, was einer Gleichgewichtskonstante für die Reaktion von ungefähr 1000 entspricht.
  • BEISPIEL 4
  • Synthese von L-2-Aminobuttersäure
  • Natriumketobutyrat (50 mM, 186 Milligramm) und Isopropylamin (50 mM, 0,23 ml einer 6,5-molaren Lösung) wurden in 29 ml 50 mM Natriumdihydrogenphosphatpuffer gelöst, wonach der pH-Wert auf 7,5 eingestellt wurde. Dann wurde Pyridoxalphosphat (1,0 mM, 8,0 mg) gefolgt von 100 mg E.-coli-Zellen mit einer (S)-Transaminase zugegeben, so daß das Endvolumen 30 ml und der End-pH-Wert 7,5 betrug. Nach 24 Stunden Inkubieren bei 30°C wurden die Konzentrationen von Isopropylamin und L-2-Aminobuttersäure mittels HPLC bestimmt, und die Acetonkonzentration wurde mittels GC bestimmt. Die Konzentration der produzierten L-2-Aminobuttersäure betrug 48 mM, was einer Gleichgewichtskonstante für die Reaktion von mehr als 500 entspricht.
  • BEISPIEL 5
  • Synthese zusätzlicher Aminosäuren
  • In Anlehnung an die in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweisen wurde die Synthese von L-Glutamat, L-Methionin und L-Norvalin aus den Natriumsalzen der entsprechenden Ketosäuren 2-Ketoglutarsäure (50 mM, 252 Milligramm), 4-Methylthio-2-oxobuttersäure (50 mM, 255 Milligramm) bzw. 2-Ketovaleriansäure (50 mM, 207 Milligramm) demonstriert. In allen Fällen produzierte die (S)-Transaminase ausschließlich das L-Isomer der Aminosäure in Konzentrationen von 45, 47 bzw. 46 mM.

Claims (3)

  1. Stereoselektive Synthese eines chiralen Amins, bei dem man ein Keton in Gegenwart eines Aminogruppendonators mit einer Transaminase in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminogruppendonator 2-Aminopropan verwendet.
  2. Synthese nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem chiralen Amin um eine chirale Aminosäure handelt.
  3. Verfahren zur Herstellung von (S)-1-Methoxy-2-aminopropan, bei dem man Methoxyaceton in Gegenwart von 2-Aminopropan als Aminogruppendonator mit einer Transaminase in Berührung bringt, bis eine wesentliche Menge von Methoxyaceton in (S)-1-Methoxy-2-aminopropan und 2-Aminopropan in Aceton umgewandelt ist, und das (S)-1-Methoxy-2-aminopropan isoliert.
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