KR20010034561A - 키랄 아민류의 효소 합성 개선 - Google Patents

키랄 아민류의 효소 합성 개선 Download PDF

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Abstract

2-아미노프로판은 트란스아미나제와 함께 케톤으로부터 키랄 아민의 입체 선택성 합성에서 아민 도너로 사용된다. 전형적인 실시형태에서, (S)-1-메톡시-2-아미노프로판은, 상당량의 메톡시아세톤이 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판으로 전환되고, 2-아미노프로판이 아세톤으로 전환될 때까지, 아민 도너로서 2-아미노프로판의 존재하에 메톡시아세톤을 트란스아미나제와 접촉시켜서 제조한다. 제 2실시형태에서, L-알라닌은 아민 도너로서 2-아미노프로판의 존재하에 피루브산을 트란스아미나제와 접촉시켜서 제조한다.

Description

키랄 아민류의 효소 합성 개선{IMPROVEMENTS IN THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF CHIRAL AMINES}
본 명세서에 참고 자료로 통합된 게시물인, 미국 특허 제 4,950,606호, 제 5,169,780호, 제 5,300,437호 및 제 5,360,724호는 아미노산 트란스아미나제를 사용한 키랄 아민류의 풍부한 거울상 이성질체를 설명한다. 아미노산 트란스아미나제는 슈도모나스(Pseudomonas), 에쉐리히아(Escherichia), 바실루스(Bacillus), 사카로마이시즈(Saccharomyces), 한세뉼라(Hansenula), 칸디다(Candida), 스트렙토마이시즈(Streptomyces), 아스페르질루스(Aspergillus), 및 붉은빵곰팡이(Neurospora)를 포함하는 다양한 미생물에서 발견되는 효소에 의존하는 피리독살 인산염으로 공지되었다. 두 아미노산 트란스아미나제(EC 2.6.1.18 및 EC 2.6.1-19)는 결정화되고, 요나하 등[Yonaha et al., Agric. Biol. Chem., 47(10), 2257-2265(1983)]에 의해 특성화된다.
본 발명은 아미노기를 함유하는 키랄 화합물(예를 들어, 키랄 아민류)의 효소 합성 개선에 관한 것이다.
미국 특허 제 4,950,606호, 제 5,169,780호, 및 제 5,300,437호에는 트란스아미나제-함유 유기체의 개별종이 아미노 억셉터 및 단독 질소 소스로서 아민과 함께 케모스탯 배양 즉, 일정하지만 제한된 화학적 환경에서 배양됨으로써 분리될 수 있다는 것이 개시되어 있다. 따라서, 상기한 특허에 있는 분리된 전형적인 종은 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로 특징된다(American Type Culture Collection에 의해). 보통 오메가 아미노산 트란스아미나제는 아미노기가 말단, 아키랄(비-키랄) 탄소원자에 있는 아미노산을 신진 대사시키고, 이러한 케모스탯 배양에서 질소 소스로 사용되는 아민은 동일한 형태 즉, n-옥틸아민, 시클로헥실아민, 1,4-부탄디아민, 1,6-헥산디아민, 6-아미노헥산산, 4-아미노부티르산, 티라민, 및 벤질아민과 같은 아키랄 아민류일 수 있다. 그러나, 이러한 케모스탯 배양에서 질소 소스로 사용되는 아민은 2-아미노부탄, α-페네틸아민, 및 2-아미노-4-페닐부탄과 같은 키랄 아민일 수 있다는 것이 동 특허에 기재되었다. L-리신, L-오르니틴, β-알라닌, 및 타우린과 같은 키랄 아미노산도 사용할 수 있다.
거울상 이성질체가 풍부한 것 외에도, 미국 특허 제 4,950,606호, 제 5,169,780호, 및 제 5,300,437호에는 아미노 도너 존재 하에, 구조식이 R1COR2(여기서, R1및 R2는 서로 다른 알킬기 또는 아릴기이다.)인 케톤상의 아미노산 트란스아미나제의 작용에 의한 아민의 키랄 형태의 입체 선택성 합성이 개시되어 있다. 개시된 아미노 도너는 케모스탯 배양에서 질소 소스로 사용되는 아민류와 유사하다; 예를 들면, 프로필 아민 및 벤질 아민과 같이 아미노기가 말단 탄소 원자 상에 있는 아키랄 아민류, (S)-2-아미노부탄과 같이 아미노기가 말단 탄소 원자 상에 있는 키랄 아민류, 및 L-알라닌 및 L-아스파르트산과 같은 키랄 아미노산.
본 발명은 이러한 트란스아미나제 아민 합성에서, 아미노기가 말단 탄소 원자에 있는 아키랄 아민류 또는 아미노기가 비말단 탄소 원자에 있는 키랄아민류에 비해 아키랄 아민 2-아미노프로판이 아민 도너로서 예상외로 뛰어나다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 아미노 도너 존재 하에서 케톤이 트란스아미나제와 접촉하는 키랄 아민의 공지된 입체 선택성 합성에 있어서, 아미노 도너로서 2-아미노프로판을 사용하는 것을 특징으로 하는 개선에 관한 것이다.
본 명세서에서 키랄 아민이라는 용어는 넓은 의미로 사용된다. 상기 참조된 특허에 기재된 바와 같이, 공지된 입체특이성 합성은 수소 원자 외에도, (i) 키랄 시클릭 구조를 형성하는 2가 기 또는 (ii) 구조 또는 키랄성이 서로 다른 두 치환체(수소와는 다른)를 운반하는 2차 탄소 원자에 결합된 1차 아미노기의 존재에 의해서만 특징을 갖는, 다른 혼합된 기능 형태의 다양한 종류의 지방족 및 지환족 화합물을 제조하는데 사용될 수 있다.
키랄 시클릭 구조를 형성하는 2가 기는 예를 들면, 2-메틸부탄-1,4-디일, 펜탄-1,4-디일, 헥산-1,4-디일, 헥산-1,5-디일, 2-메틸펜탄-1,5-디일이 포함된다. 따라서, 아민 도너로서 2-아미노프로판을 사용하는 본 개선은, 2-메틸시클로펜탄온으로부터 1-아미노-2-메틸시클로펜탄, 3-메틸시클로펜탄온으로부터 1-아미노-3-메틸시클로펜탄, 2-메틸시클로헥산온으로부터 1-아미노-2-메틸시클로헥산 등을 입체 특이성 합성하는데 사용할 수 있다.
또한, 2차 탄소 원자 상의 다른 두 치환체(상기 R1및 R2)는 광범위하게 다양할 수 있고, 알킬, 아르알킬, 아릴, 할로, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오, 시클로알킬, 카르복시, 카발콕시, 카르바모일, 카르바모일로 치환된 모노- 및 디-(저급 알킬), 트리플루오로메틸, 페닐, 니트로, 아미노, 아미노로 치환된 모노- 및 디-(저급 알킬), 알킬술포닐, 아릴술포닐, 알킬카르복사미도, 아릴카르복사미도 등과 상기한 것에 의해 치환된 알킬, 아르알킬, 또는 아릴을 포함한다.
따라서, 아민 도너로 2-아미노프로판을 사용하는 본 개선은, 또한 부탄온으로부터 2-아미노부탄, 1-히드록시부탄-2-온으로부터 2-아미노-1-부탄올, 피루브산으로부터 알라닌, 아세토페논으로부터 1-아미노-1-페닐에탄, 2-메톡시-5-플루오로아세토페논으로부터 1-아미노-1-(2-메톡시-5-플루오로페닐)에탄, 레불린산으로부터 γ-아미노-펜타논산, 1-페닐프로판-1-온으로부터 1-아미노-1-페닐프로판, 1-(4-브로모페닐)프로판-1-온으로부터 1-아미노-1-(4-브로모페닐)프로판, 1-(4-니트로페닐)프로판-1-온으로부터 1-아미노-1-(4-니트로페닐)-프로판, 1-페닐프로판-2-온으로부터 1-페닐-2-아미노프로판, 2-옥소-3-메틸부탄산으로부터 발린, 1-(3-트리플루오로메틸페닐)프로판-1-온으로부터 1-(3-트리플루오로메틸페닐)-2-아미노프로판, 히드록시프로판온으로부터 2-아미노프로판올, 메톡시옥시프로판온으로부터 1-메톡시-2-아미노프로판, 1-페닐부탄-1-온으로부터 1-아미노-1-페닐부탄, 1-페닐부탄-2-온으로부터 1-페닐-2-아미노부탄, 1-(2,5-디메톡시-4-메틸페닐)부탄-2-온으로부터 1-(2,5-디메톡시-4-메틸페닐)-2-아미노부탄, 1-(4-히드록시페닐)부탄-3-온으로부터 1-(4-히드록시페닐)-3-아미노부탄, 2-아세틸나프탈렌으로부터 1-아미노-1-(2-나프틸)에탄, 페닐피루브산으로부터 페닐알라닌, 2-케토글루타르산으로부터 글루탐산, 2-케토숙신산으로부터 아스파르트산 등을 입체 특이성 합성하는데 사용할 수 있다.
종래 기술에 기재된 아민 도너, 및 실제 이론적으로 사용가능한 아미노알칸 아미노 도너의 대부분과는 달리, 2-아미노프로판은 (i) 아키랄이 되고, (ii) 비-말단 지방족 탄소 원자 상에 아미노기를 갖는 비교적 독특한 조합을 갖는다. 따라서, 아미노산의 말단 또는 ω-위치에 있는 아미노기에 사실상 작용하는, 오메가-아미노산 트란스아미나제의 사용에도 불구하고, 비-말단 지방족 탄소 원자에 아미노기를 갖는 아미노 도너로 사용하면, 열역학적으로 이로울 수 있다. 다른 이론과 결합되기를 바라지는 않으나, 아미노산 트란스아미나제 반응의 존재 하에 알데히드를 형성하는 에틸아민, n-프로필 아민, n-옥틸아민, 1,4-부탄디아민, 1,6-헥산디아민, 6-아미노-헥산산, 4-아미노부티르산, 티라민, 또는 벤질아민과 같은, 말단 탄소 원자에 아미노기를 갖는 아민 도너를 사용하는 것과 반대로, 본 개선은 케톤인 경우 효소 반응의 부-생성물의 결과인 것으로 나타난다. 케토산으로부터 아미노산을 포함하는 반응에서, 아미노 도너로 이소프로필아민을 사용하는 열역학적인 측면에서의 장점은 평형상수가 거의 1,000이라는 것이다. 반응 카르보닐기의 화학적 환경에서 생기는 이러한 열역학적인 측면에서의 장점 때문에, 천연 또는 비천연인 케토산으로부터 모든 키랄 α-아미노산의 합성에 동등하게 사용할 수 있다.
이러한 열역학적인 측면에서의 장점에도 불구하고, 비말단 지방족 탄소 원자 상에 아미노기가 존재하면, 반드시 두 수소 원자를 가지는 경우에는 말단 탄소 원자 상에서의 치환으로 키랄성이 없지만, 일반적으로 키랄성이 생긴다. 트란스아미나제는 입체 선택성이기 때문에, 키랄 아민 도너를 사용하는 것은 이러한 아민의 절반만이 도너로 사용가능하다는 것을 의미한다. 상업적 관점에서 이들은 허용 불가능한 아미노 도너이다.
불행하게도, 비-말단 탄소 원자 상에 아미노기를 갖는 첫째 목적을 만족시키는 아미노(저급)알칸류의 상당 부분은 그 자체가 키랄이다. 따라서, 8개 이하의 탄소를 갖는 아미노알칸류에 대해 한정하여 고려하면, 이론적으로 아미노기가 삼치환된 탄소(아미노 도너가 되기 위해, 화합물은 또한 탄소 원자 상의 하나 이상의 사용가능한 수소 원자를 아미노기가 결합된 것에 운반해야 한다.) 상에 있지 않은 130 이상의 가능한 동족 또는 이성체 아민류가 있을 것으로 평가된다. 이러한 130개의 가능한 아미노 도너 중에서, 반 이하(54)는 비-말단 탄소 원자 상에 아미노기를 갖고, 이들 중 93%(50)는 키랄이다. 비-말단 탄소 원자 상에 아미노기를 갖는 알킬 아민류 중에 단지 4개가 아키랄이고, 이들 중 3개는 비용 및 사용가능성 면에서 금지되고, 아민 도너로도 부적절하다: 3-아미노-펜탄, 2,2-디메틸-3-아미노펜탄, 및 4-아미노헵탄. 따라서, 아미노 도너로서 이론적으로 적절한 모든 아미노(저급)알칸류 중에서, 2-아미노프로판만이 (i) 말단 탄소 원자 상에 아미노기를 가지고, 따라서 말단 탄소 원자 상에 아미노기가 있는 아미노알칸에 열역학적 특성이 있고, (ii) 반응에 완전히 사용가능하도록 아키랄이고, 및 (iii) 비용 및 사용가능성 면에서 허용가능하다. 또한, 2-아미노프로판은 부산물로서 쉽게 회복가능하고, 그 자체로 상업적인 아세톤을 생성하는 이점이 있다.
실제로 효소 전환은 단리된 비-성장 세포를 이용하거나, 또는 가용성 아미노산 트란스아미나제 제제를 이용한 통상적인 배양 기술에 의해 영향을 받는다. 아미노산 트란스아미나제는 세포 유리 추출물 또는 전체 세포 제제로서 유리 형태일 수 있고, 또는 가교 결합된 덱스트란 또는 아가로오스, 실리카, 폴리아미드, 또는 셀룰로오스와 같은 적절한 지지체 또는 매트릭스 상에 고정될 수 있다. 또한, 폴리아크릴아미드, 알긴산염, 섬유 등에 캡슐화될 수 있다. 이러한 고정 방법은 문헌(예를 들면, Methods of Enzymology, 44, 1976 참조)에 개시되어 있다.
필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 피리독살 인산염과 같은 피리독사민 소스를 첨가하는 것이 유리하다.
실시예 1
본 발명은 상당량의 메톡시아세톤이 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판으로 전환(및 2-아미노프로판이 동시에 아세톤으로 전환)될 때까지 반응하고, 형성된 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판이 분리되는, 아민 도너로서 2-아미노프로판의 존재 하에 메톡시아세톤이 트란스아미나제와 접촉하게 되는, 농약 합성용 화학 중간체인 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판 제조에 의해 실시화될 수 있다. 전체 효소 변환은 하기와 같이 그릴 수 있다:
일염기 인산 나트륨 5 밀리몰 및 250 mL의 농축된 염산을 1000 mL의 물에 첨가하였다. 이 혼합물을 냉수조에서 5 - 10 ℃로 냉각하고, 258 mL의 2-아미노프로판에 이어 206 mL의 메톡시아세톤(98%)을 첨가하였다. 이 혼합물을 혼합하고, 필요시, 수산화나트륨 또는 염산을 사용하여 pH 를 7.5로 조절하였다. 이 혼합물을 온도 조절 및 교반 장치와 함께 3 L 둥근 바닥 반응기로 이동시켰다. 반응 혼합물의 온도가 30 ±1 ℃에서 안정된 후, 0.2 mM의 피리독살 5'-인산염을 첨가하였다. 필요시, pH를 7.5로 조절하고, 소량의 물을 첨가하여 혼합물의 부피를 1800 mL로 만들었다.
효소 용액은 분리하여 제조하였다. 200mL의 5mM 인산나트륨 용액(pH 7.5), 0.2mM의 피리독살 5'-인산염 및 (S)-트란스아미나제를 함유하는 2g(건조 무게)의 바실루스 세포를 첨가하였다. 세포를 완전히 현탁했을 때, 효소 용액을 상기한 반응 혼합물에 가했다.
최종 반응 발효액은 1.5 M의 2-아미노프로판 및 1.0 M의 메톡시아세톤을 함유하였다. 반응은 30 ±1 ℃ 및 pH 7.5 에서 8시간 동안 진행하였고, 여기서 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판은 99% 이상의 ee와 함께 0.6M의 농도로 반응 혼합물에 존재하였다.
5mL의 농축된 염산을 첨가하여 반응을 종결하고, 플래시 증류하여 미반응 메톡시아세톤 및 부산물인 아세톤을 단일 컷에 제거하였다. 이 증류액 말기의 분리 컬럼 증류를 수행하여 메톡사아세톤 및 아세톤을 분리할 수 있다. 50% 수성 수산화나트륨의 270 mL를 반응 혼합물에 첨가하여 아민을 탈양성자하였다. 그리고 나서, 단일 컷으로 증류하여 혼합물로부터 아민을 제거하고, 분별 증류로 잔류 2-아미노프로판으로부터 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판을 분리하여, 물을 50% 함유하는 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판 125g을 수득하였다. 이 생성물은 기체 크로마토그래피 분석에 의한 측정과 같이 화학적 및 거울상 이성질체적으로 순도가 99% 이상이었다.
실시예 2
본 발명은 상당량의 피루브산이 L-알라닌으로 전환되고, 동시에 2-아미노프로판이 아세톤으로 전환될 때까지 반응을 계속하여, 아미노 도너로서 2-아미노프로판의 존재 하에 피루브산이 트란스아미나제와 접촉하게 되는, 유용한 아미노산인 L-알라닌의 합성에 의해 더욱 실시화될 수 있다. 전체 효소 변환은 하기와 같이 그릴 수 있다:
피루브산 나트륨(50mM, 0.165g) 및 염화수소 이소프로필아민(50mM, 6.5 몰 용액 0.23ml)을 29.0ml의 50mM 인산 이수소 나트륨 용액에 용해하고, pH를 7.5로 조절하였다. 피리독살 인산염(1.0mM, 8.0mg)을 첨가하고, (S)-트란스아미나제를 함유하는 E. coli 세포 8mg을 첨가했더니, 최종 부피가 30ml이고, 최종 pH가 7-5이었다. 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 이소프로필아민 아세톤 및 L-알라닌의 농도를 HPLC 및 GC로 측정하고, L-알라닌 농도가 100을 초과하는 상기 반응에서 Keq와 동등한 45.6mM으로 측정되었다.
E. coli 세포(0.3g)를 함유하는 (R)-트란스아미나제를 사용하여 동일한 반응을 실시하는 경우, 농도가 46mM가 되도록 결정된 D-알라닌으로 전환이 진행하였다.
실시예 3
L-알라닌의 합성
L-알라닌 합성의 분리 실시예에서, 피루브산 나트륨(1M, 110.0g) 및 이소프로필아민 염산염(1M, 6.5몰 용액 153ml)을 800ml의 50mM 인산 이수소 나트륨 완충 용액에 용해하고, pH를 7.5로 조절하였다. 피리독살 인산염(1mM, 265mg)에 이어 (S)-트란스아미나제를 함유하는 E. coli 세포 5g을 첨가했더니, 최종 부피가 1리터이고, 최종 pH가 7.5이었다. 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 이소프로필아민 및 L-알라닌의 농도를 HPLC로 측정하고, 아세톤의 농도를 GC로 측정하였다. 생성된 L-알라닌의 농도는 거의 1000에 가까운 반응에 대한 평형상수와 동등하게 970mM으로 측정되었다.
실시예 4
L-2-아미노부티르산의 합성
케토부티르산 나트륨(50mM, 186mg) 및 이소프로필아민(50mM, 6.5 몰 용액의 0.23ml)을 29ml의 50mM 인산 이수소 나트륨 완충 용액에 용해하고, pH를 7.5로 조절하였다. 피리독살 인산염(1mM, 8.0mg)에 이어 (S)-트란스아미나제를 함유하는 E. coli 세포 100mg을 첨가했더니, 최종 부피가 30ml이고, 최종 pH가 7.5이었다. 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 이소프로필아민 및 L-2-아미노부티르산의 농도를 HPLC로 측정하고, 아세톤의 농도를 G-C로 측정하였다. 생성된 L-아미노부티르산의 농도는 500 이상의 반응에 대한 평형상수와 동등하게 48mM으로 측정되었다.
실시예 5
첨가 아미노산의 합성
본질적으로 실시예 4에 기재된 방법과 같이, L-글루탐산염, L-메티오닌, 및 L-노르발린의 합성은 각각 해당 케토산의 나트륨염에서 나타냈다: 2-케토글루타르산(50mM, 252mg), 4-메틸티오-2-옥소부티르산(50mM, 255mg), 및 2-케토발레르산(50mM, 207mg). 모든 경우에 (S)-트란스아미나제는 각각 45, 47, 및 46mM의 농도에서 오직 아미노산의 L-이성질체만을 생성하였다.

Claims (3)

  1. 아미노 도너 존재 하에서 케톤을 트란스아미나제와 접촉시키는 키랄 아민의 입체 선택성 합성으로서, 아민 도너로서 2-아미노프로판을 사용하는 것을 포함하여 이루어지는 개선된 합성.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 키랄 아민이 키랄 아미노산인 것을 특징으로 하는 합성.
  3. 상당량의 메톡시아세톤이 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판으로 전환되고, 2-아미노프로판이 아세톤으로 전환되고, (S)-1-메톡시-2-아미노프로판을 분리할 때까지 아민 도너로서 2-아미노프로판의 존재 하에 메톡시아세톤을 트란스아미나제와 접촉시키는 것을 포함하여 이루어지는 (S)-1-메톡시-2-아미노프로판의 제조 방법.
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