MXPA00008573A - Mejoras en la sintesis enzimatica de aminas quirales. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a 2-aminopropano como el donador amina en la síntesis estéreoselectiva a partir de una amina quiral de una cetona con una transaminasa. En una modalidad típica, (S)-1-metoxi-2-aminoapropano se prepara poniendo metoxiacetona en contacto con una transaminasa en la presencia de 2-aminopropano como un donador amina hasta que una cantidad sustancial de metoxiacetona se convierte en (S)-1-metoxi-2-aminopropano y 2-aminopropano se convierte en acetona. En una segunda modalidad, L-alanina se prepara poniendoácido pirúbico en contacto con una transaminasa en presencia de 2-aminopropano como un donador ami

Description

MEJORAS EN LA SINTESIS ENZIMATICA DE AMINAS QUIRALES DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona a mejoras en la síntesis enzimática de compuestos quirales que contienen un grupo amino; por ejemplo aminas quirales. Las Patentes Norteamericanas Nos. 4,950,606, 5, 169, 780', 530, 437, y 5, 360,724, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia, describen enriquecimiento enantiómerico de aminas quirales a través del uso de una transaminasa de aminoácido. Las transaminasas de aminoácido son conocidas de enzimas que dependen de fosfato piridoxal encontradas en varios microorganismos que incluyen Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Saccharomyces , Hansenula, Candida, Streptomyces , Aspergillus y Neurospora. Dos transaminasas de aminoácido, EC 2.6.1.18 y EC 2.6.1-19, han sido cristalizadas y caracterizadas por Yonaha et al., Agrie. Biol. Chem. , 47 (10), 2257-2265 (1983). •Las Patentes Norteamericanas Nos. 4,950,606, 5,169,780, y 5,300,437 describen que las cepas individuales de organismos que contienen transaminasa pueden ser aisladas por cultivo quimiostato, es decir, cultivando en una constante pero restringido ambiente químico con un aceptor amino y una amina como la fuente de nitrógeno sola. Una cepa típica de esta forma aislada en las patentes notables se caracteriza (por American Type Culture Collection) como Bacillus megateium . Normalmente las transaminasas de aminoácido omega metabolizan los áminoácidos en los cuales el grupo amino es un átomo de carbono terminal aquiral (no quiral) y la amina utilizada como la fuente de nitrógeno en tal cultivo quimiostato puede ser del mismo tipo, principalmente aminas aquirales tales como n-octilamina, ciclohexilamina, 1 , 4 -butanodiamina , 1 , 6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutirico, tiramina y bencilamina. Sin embargo, también se reporta en las mismas patentes, que la amina utilizada como la fuente de nitrógeno en tales cultivos quimiostatos pueden ser un amina quiral tales como 2-aminobutano, a-fenetilamina , y 2-amino-4-fenilbutano. Los aminoácidos quirales tales como L-lisina, L-ornitina, ß-alanina y taurina también pueden ser utilizados. Además del enriquecimiento enantiómerico, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,950,606, 5,169,780, y 5,300,437 describen la síntesis estéreoselectiva de una forma quiral de una amina mediante la acción de una transaminasa de aminoácido en una cetona de la fórmula R1COR2, en la cual R1 y R2 son grupos alquilo o arilo diferentes, en presencia de un donador amino. Los donadores amino descritos son similares a las aminas utilizadas como la fuente de nitrógeno en los cultivos -quimiostato; por ejemplo, aminas aquirales en las cuales el grupo amino es un átomo de carbono terminal, tal como propilamina y bencilamina, aminas quirales en las cuales el grupo amino es un átomo de carbono terminal, tal como (S)-2-aminobutano, y aminoácidos quirales, tales como L-alanina y ácido L-aspártico. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la amina aquiral 2-aminopropano es inesperadamente superior 'como un donador amina en tales síntesis de amina transaminasa a medida que se comparó con cualesquiera aminas en las cuales el grupo amino es un átomo de carbono terminal o aminas quirales en las cuales el grupo amino es un átomo de carbono no terminal. La invención de esta forma constituye la mejora en la síntesis estéreoselectiva conocida de una amina quiral en la cual una cetona se pone en contacto con una transaminasa en presencia de un donador amino, de utilización 2-aminopropano como el donador amina. El término amina quiral.se emplea en la presente en su sentido más amplio. Como se describe en las patentes antes referidas, la síntesis estereoespecífica conocida puede ser aplicada a la preparación de una amplia variedad de compuestos alifáticos y alicíclicos de diferentes tipos funcionales y mezclados, caracterizados solamente por la presencia de un grupo amino primario unido a un átomo de carbono secundario el cual, además de un átomo de hidrógeno, lleva ya sea (i) un grupo divalente que forma una estructura cíclica quiral, o (ii) dos sustituyentes (diferentes a hidrógeno) que difieren uno del otro en la estructura o quiralidad. Los grupos divalentes que forman una estructura cíclica quiral incluyen por ejemplo 2-metilbutano-l , 4-diilo, pentano-1 , 4-diilo, hexano-1, 4-diilo, hexano-1, 5-diilo, 2-metilpentano-1 , 5-diilo . De este modo la mejora actual para utilizar 2-aminopropano como el donador amina puede ser utilizado en la síntesis estereoespecífica de l-amino-2-metilciclopentano de 2-metilciclopentanona, l-amino-3-metilciclopentano de 3-metilciclopentanona , l-amino-2-metilciclohexano de 2-metilciclohexanona, etc. . Los dos sustituyentes diferentes en el átomos de carbono secundario (R1 y R2 anteriores) también pueden ampliamente variar e incluir alquilo, aralquilo, arilo, halo, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior, cicloalquilo, carboxi, cabalcoxi, carbamoilo, carbamoilo de mono- y di- (alquilo inferior) sustituido, trifluorometilo, fenilo, nitro, amino, amino de mono- y di- (alquilo inferior) sustituido, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etc. Así como alquilo, aralquilo, o arilo sustituido por los anteriores . De este modo la mejora actual para utilizar 2-aminopropano como el donador amina también puede ser utilizado en la síntesis estereoespecífica de 2-aminobutano de butanona, 2-amino-l-butanol de l-hidroxibutan-2-ona, alanina de ácido pirúbico, 1-amino-l-feniletano de acetofenona, 1-amino-l- (2-raetoxi-5-fluorofenil ) etano de 2-metoxi-5-fluoroacetofenona , ácido ?-amino-pentanóico de ácido levulínico, 1-amino-l-fenilpropano de 1-fenilpropan-l-ona , 1-amino-1- (4-bromofenil) ropano de 1- ( -bromofenil ) propan-1-ona, 1-amino-l- ( 4-nitrofenil) -propano de l-(4-nitrofenil) propan-l-ona, 1-fenil-2-aminopropano de 1-fenilpropan-2-ona, valina del ácido 2-oxo-3-metilbutanoico, 1- (3-trifluorometilfenil) -2-aminopropano de l-(3-trifluorometilfenil ) propan-l-ona, 2-aminopropanol de hidroxipropanona, l-metoxi-2-aminopropano de metoxioxipropano, 1-amino-l-fenilbutano de 1-fenilbutan-1-ona, 1-fenil-2-aminobutano de 1-fenilbutan-2-ona , l-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil ) -2-aminobutano de 1- (2, 5-dimetoxi-4-metilfenil ) butan-2-ona, 1- ( -hidroxifenil ) -3-aminobutano de 1- ( -hidroxifenil ) butan-3-ona , 1-amino-l- (2-naftil) etano de 2-acetilnaftaleno, fenilalanina de ácido fenilpirúvico, ácido glutámico de ácido 2-cetoglutáricb, ácido aspártico de ácido 2-cetosuccinico y similares. En contraste a los donadores amina reportados en la técnica anterior, y .ciertamente la mayoría de los donadores aminoalcano que están teóricamente disponibles, 2-aminopropano posee la combinación única relativamente de (i) siendo aquiral y (ii) teniendo el grupo amino en un átomo de carbono alifático no terminal. No obstante el uso una transaminasa omega-aminoácido que en la naturaleza actúa sobre un grupo amino en la terminal o posición ? de un aminoácido, se ha encontrado que el uso como un donador amino tiene un grupo amino en un átomo de carbono alifático no terminal que ofrece una ventaja termodinámica. Mientras no desee estar unido por cualquier teoría, parece que está mejora es una consecuencia del subproducto de la reacción enzimática en tal caso siendo una cetona, como contraste con el uso de un donador amina que tiene un grupo amino en un átomo de carbono terminal, tal como etilamina, AJ-propilamina, N-octilamina , 1 , 4-butanodiamina , 1 , 6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanóico, ácido 4-aminobutírico, tiramina, o bencilamina que forma aldehido en presencia de una reacción transaminasa de aminoácido. En las reacciones que involucran aminoácidos de cetoácidos, la ventaja termodinámica para utilizar isopropilamina como el donador amino da como resultado en un equilibrio constante de aproximadamente 1,000. Debido a que esta ventaja termodinámica desciende del ambiente químico del grupo carbonilo de reacción, esto aplica igualdad a la síntesis de todos los a-aminoácidos quirales a partir de sus cetoácidos, ya sea naturales o no naturales. 'No obstante esta ventaja termodinámica, la presencia del grupo amino en un átomo de carbono alifático no terminal generalmente resulta en quiralidad, como contrastada con la sustitución en un átomo de carbono terminal el cual, necesariamente tiene dos átomos de hidrógeno, que previenen la quiralidad. Puesto que la transaminasa es estéreoselectiva, el uso de un donador amina quiral significa que sólo la mitad de tal amina esté disponible como un donador. Desde un punto de vista comercial, es inaceptable para un donador amino. Desafortunadamente la inmensa mayoría de aminoalcanos ( inferiores ) satisfacen el primer objetivo que tiene un grupo amino en un átomo de carbono no terminal que son por si mismos quirales. De esta manera, limitando la consideración a los aminoalcanos que no tienen más de 8 átomos de carbono, se estima que teóricamente existen por lo ¦menos 130 homólogos posibles y aminas isoméricas en cuyo grupo amino no está en un átomo de carbono trisustituido (para ser un donador amino, el compuesto debe también llevar por lo menos un átomo de hidrógeno disponible en el átomo de carbono al cual el grupo amino está unido) . De estos 130 donadores amino posibles, menos de la mitad (54) tienen un grupo amino en un átomo de carbono no terminal y de estos 97% (50) son quirales. Solamente 4 de las aminas alquilo que tienen un grupo amino en un átomo de carbono no terminal son aquirales y de estos, tres son prohibidos en términos de costos y disponibilidad y nuevamente inadecuados como donadores amina: 3-amino-pentano , 2 , 2-dimetil-3-aminopentano y 4 -aminoheptano . Así de todos los amino (inferiores) aléanos teóricamente adecuados como donadores amino, sólo 2-aminopropano (i) tiene un grupo amino en un átomo de carbono terminal y de esta manera termodinámicamente favorecido sobre aminoalcanos en los cuales el grupo amino está en un átomo de carbono terminal, (ii) es aquiral para estar completamente disponilbe pora la reacción y, (iii) es aceptable en los términos de costos y disponibilidad. Como una ventaja adicional, 2-aminopropano también genera un subproducto, acetona, que es fácilmente recuperable y por si mismo un articulo de comercio. La conversión enzimática actual puede ser efectuada por técnicas de cultivo convencionales, con células aisladas pero sin -crecimiento, o con una preparación de transaminasa de aminoácido soluble. La transaminasa de aminoácido puede estar en forma libre, ya sea como una célula libre de extracto o una preparación celular completa, o inmovilizada en un soporte adecuado o matriz tal como dextrano o agarosa reticulada, sílice, poliamida o celulosa. También pueden estar encapsuladas en poliacrilamida, alginatos, fibras, o similares. Los' métodos para tal inmovilización se describen en la literatura (véase, por ejemplo, Methods of Enzymology, 44, 1976) . Aunque no necesariamente, generalmente es ventajoso para agregar a una fuente de piridoxamina tal como fosfato de piridoxal .

EJEMPLO 1 La invención puede ser e emplificada por la preparación de ( S ) -l-metoxi-2-aminopropano un intermediario químico para la síntesis de químicos agrícolas, en los cuales la metoxiacetona se pone en contacto con una transaminasa en presencia de 2-aminopropano como un donador amina, permitiendo a la reacción continuar hasta una cantidad sustancial de metoxiacetona que se convierta a (S) -1-metoxi-2-aminopropano (y 2-aminopropano es simultáneamente convertido a acetona), y se aisla el ( S ) l-metoxi-2-aminopropano así formado. La transformación enzimática total puede ser descrita como sigue: O NH7 CH,-C II-CHr-0—CH, + CH.-CIH—2 CH, ? NH2 o i ii CH3-CH-CH-0-CH3 + CH3-C-CH, (S) ' Cinco milimoles de fosfato de sodio monobásico y 250 mL de ácido clorhídrico concentrado se agregan a 1000 mL de agua. La mezcla se enfría a 5-10°C en un baño de agua helada y 258 mL de 2-aminopropano se agregan, seguido por 206 mL de metoxiacetona (98%) . Esta mezcla se mezcla y el pH se ajusta a 7.5 con ya sea hidróxido de sodio o ácido clorhídrico, como sea necesario. La mezcla se transfiere a un reactor de fondo redondo de 3 L con control de temperatura y aparato de agitación. Después de que la temperatura de reacción se establece a 30 ± 1°C, se agrega 0.2 mM de 5'-fosfato de piridoxal. El pH se reajusta a 7.5 si es necesario y una pequeña cantidad de agua puede ser agregada para traer el volumen de la mezcla a 1800 mL . La solución enzimática se prepara en forma separada. A 200 mL de 5 mM de solución de fosfato de sodio (pH 7.5), se agregan 0.2 mM de 5'-fosfato de piridoxal y 2 g (peso seco) de células de Baccillus, que contienen una (S)-transaminasa . Cuando las células se suspenden completamente, la solución de enzima se suministra en la mezcla de reacción descrita en lo anterior. El caldo de reacción final contiene 1.5 M de 2-aminopropano y 1.0 M de metoxiacetona . La reacción prosigue durante 8 horas a 30 ± 1°C y pH de 7.5 en el cual el punto ( S ) -l-metoxi-2-aminopropano se presenta en la mezcla de reacción en una concentración de 0.6 M con un ee mayor que 99%. La reacción se termina por la adición de 5 mL de ácido clorhídrico concentrado, seguido por destilación instantánea para remover la metoxiacetona sin reaccionar y el subproducto, la acetona, en un corte sencillo. Una destilación de columna separada de este último destilado puede ser conducido subsecuentemente para separar la metoxiacetona y acetona. Doscientos setenta mililitros de 50% de hidróxido de sodio acuoso se agregaron a la mezcla de reacción para desprotonar las aminas. Las aminas entonces se removieron de la mezcla por destilación como un corte sencillo y se separó (S) -l-metoxi-2-aminopropano de 2-aminopropano residual por una destilación separada para producir 125 g de (S) -l-metoxi-2-aminopropano que contiene 50% de agua. El producto es mayor que 99% química y enantioméricamente puro como se determina por análisis de cromatografía de gas. EJEMPLO 2 La invención puede ser además ejemplificada por la síntesis de L-alanina, un aminoácido útil, en el cual el ácido pirúbico se pone en contacto con una transaminasa en la presencia de 2-aminopropano como un donador amino, permitiendo que la reacción continúe hasta una cantidad sustancial de adición pirúbica que se convierte en L-alanina y 2-aminopropano que es simultáneamente convertida en acetona. La transformación enzimática total puede ser representada como sigue: O NH7 II i · ^ CH — C — COOH + CH3-CH— CH3 NH2 o I II CH3-CH— COOH + CH3-C- CH3 (S) El pirubato de sodio (50 mM, 0.165 g) y clorhidrato de isopropilamina (50 mM 0.23 mi de una solución de 6.5 molar) se disuelve en 29.0 mi de 50 mM de solución de fosfato dihidrógeno de sodio y el pH ajustado a 7.5. Se agregó fosfato de piridoxal (1.0 mM, 8.0 mg) , seguido por 8 mg de células de E. coli que contienen una ( S ) -transaminasa, para que el volumen final sea de 30 mi y el pH final 7-5. Después de la incubación a 30°C durante 24 horas, las concentraciones de isopropilamina, acetona y L-alanina se midieron por CLAP y GA y la · concentración de L-alanina determinada para ser 45.6 nM, equivalente a un Keq para la reacción anterior en exceso de 100. Cuando una reacción análoga se lleva a cabo utilizando (R) -transaminasa- que contiene células E. coli (0.3 g) , la conversión prosigue a una concentración de ion alanina determinada para ser 46 mM. EJEMPLO 3 Síntesis de L-Alanina En un ejemplo separado de la síntesis de L-alanina, el pirubato de sodio (1 M, 110.0 gramos) y el clorhidrato de isopropilamina (1 M, 153 mL de una solución molar de 6.5) se disolvió en 800 mi de amortiguador de fosfato de dihidrógeno de sodio 50 mM y el pH se ajustó a 7.5. Se agregó fosfato de piridoxal (1 mM, 265 miligramos) seguido por 5 gramos de células E. coli que contienen una ( S ) -transaminasa, para que el volumen final sea de 1 litro y el pH final sea de 7.5. Después de la incubación a 30°C durante 24 horas, las concentraciones de isopropilamina y L-alanina se determinaron por CLAP y la concentración de acetona por GC . La concentración de L-alanina producida se determinó a ser 970 mM, equivalente a un equilibrio constante para la reacción de aproximadamente 1000. EJEMPLO 4 Síntesis de ácido L-2-Aminobutírico Se disolvieron cetobutirato de sodio (50 mM, 186 miligramos) e isorpopilamina (50 mM, 0.23 mi de una solución molar 6.5) en 29 mi de amortiguador de fosfato dihidrógeno de sodio 50 mM y el pH ajustado a 7.5. Se agrega fosfato de pirixodal (1 M, 8.0 mg) , seguido por 100 miligramos de células E. coli que contienen una ( S ) -transaminasa, para que el volumen final sea de 30 mi y el pH final sea 7.5. Después de la incubación a 30°C durante 24 horas, las concentraciones de isopropilamina y ácido L-2-aminobutírico se determina por CLAP y la concentración de acetona por G-C. La concentración de ácido L-aminobutirico producido se determina para ser 48 mM, equivalente a un constante equilibrio para la reacción en exceso de 500. EJEMPLO 5 Síntesis de Aminoácidos Adicionales Siguiendo esencialmente los procedimientos descritos en el Ejemplo 4, la síntesis de L-glutamato, L-metionina y L-norvalina se demuestran a partir de las sales de sodio de los cetoácidos correspondientes: ácido 2-cetoglutárico (50 mM, 252 miligramos), ácido 4-metiltio-2-oxobutírico (50 mM, 255 miligramos), y ácido 2-cetovalérico (50 mM, 207 miligramos) respectivamente. En todos los casos la ( S ) -transaminasa produjo exclusivamente el L-isómero del aminoácido en concentraciones de 45, 47 y 46 mM, respectivamente . v.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES 1. En la síntesis estéreoselectiva de un amina quiral en la cual una cetona se pone en contacto con una transaminasa en la presencia de un donador amino, la mejora está caracterizada porque comprende utilizar 2-aminopropano como el donador amina.
2. 2. La síntesis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la amina quiral es un aminoácido quiral .
3. 3. El método para preparar ( S ) -l-metoxi-2-aminopropano caracterizado porque comprende poner metoxiacetona en contacto con una transaminasa en presencia de 2-aminopropano como un donador amina hasta una cantidad sustancial de metoxiacetona que se convierte en ( S ) -1-metoxi-2-aminopropano y 2-aminopropano se convierte en acetona, y se aisla el (S) -l-metoxi-2-aminopropano .