ES2243051T3

ES2243051T3 - Mejoras en la sintesis enzimatica de aminas quirales.

Info

Publication number: ES2243051T3
Application number: ES99911250T
Authority: ES
Inventors: Wei Wu; Mohit B. Bhatia; Craig M. Lewis; Wei Lang; Alice Wang; George W. Matcham
Original assignee: Celgro
Current assignee: Celgro
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2019-03-10
Also published as: KR20010034561A; SK284352B6; UA64784C2; EP1075534A4; HUP0101056A2; WO1999046398A1; DE69925267T2; NZ506405A; TR200002604T2; CZ20003177A3; EP1075534B8; ATE295424T1; EP1075534B1; NO20004036D0; SK13382000A3; HUP0101056A3; NO319671B1; CN1154746C; EP1075534A1; NO20004036L

Abstract

Síntesis estereoselectiva de una amina quiral, en la cual, se procede a poner en contacto una cetona, con una transaminasa, en presencia de un donante de amino, la cual comprende la utilización de 2-aminopropano, como donante de amina.

Description

Mejoras en la síntesis enzimática de aminas quirales.

La presente invención, se refiere a mejoras en las síntesis enzimática de compuestos quirales que contienen un grupo amino; por ejemplo, aminas quirales.

Las patentes estadounidenses US 4.950.606, US 5.169.780, 5.300.437 y 5,360.724, describen el enriquecimiento anantiomérico de aminas quirales, mediante la utilización de una transaminasa de aminoácidos. Las transaminasas de aminoácidos, son enzimas piridoxal fosfato dependientes, las cuales son conocidas, y que se encuentran en varios microorganismos, incluyendo los Pseudomonas, Eschrichia, Bacillus, Saccharomices, Hansenula, Candida, Estreptomyces, Aspergillus, y Neurospora. Dos transaminasas de aminoácidos, EC 2.6.1.18 y EC 2.6.1-19, han sido cristalizadas y caracterizadas por parte de Yonaha et al., Agric. Biol. Chem. 47 (10), 2257 - 2265 (1983).

Las patentes estadounidenses US 4.950.606, US 5.169.780 y 5.300.437, dan a conocer el hecho de que, las cepas individuales de organismos que contienen transaminasas, pueden aislarse mediante un cultivo quimioestato, es decir, procediendo a cultivar en un entorno medioambiental químico, constante pero restringido, con un aceptor amino, y una amina, como únicamente fuente de nitrógeno. Una cepa típica de esta forma aislada, en las patentes anotadas, se caracterizó (por parte de la American Type Culture Collection), como Bacillus megaterium. Normalmente, las transaminasas de aminoácidos omega, metabolizan aminoácidos, en los cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono aquiral (no quiral), terminal, y la amina utilizada, como fuente de nitrógeno, en tal tipo de cultivo quimioestato, puede ser del mismo tipo, a saber, aminas aquirales tales como las n-octilamina, ciclohexilamina, 1,4-butanodiamina, 1,6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutírico, tiramina, y bencilamina. Se reporta también, en las mismas patentes, no obstante, el hecho de que, la amina utilizada como fuente de nitrógeno, en tales tipos de cultivos quimioestatos, puede ser una amina quiral, tal como las 2-aminobutano, \alpha-fenetilamina, y 2-amino-4-fenilbutano. Los aminoácidos quirales, tales como la L-lisina, L-ornitina, \beta-alanina, y taurina, pueden también
utilizarse.

Adicionalmente a un enriquecimiento enantiomérico, las patentes estadounidenses US 4.950.606, US 5.169.780 y 5.300.437, dan a conocer la síntesis de estereoselectivadad de una forma quiral de una amina, mediante la acción de una transaminasa de aminoácidos, sobre una cetona de la fórmula R^{1}COR^{2}, en la cual, R^{1} y R^{2}, son grupos alquilo o arilo diferentes, en presencia de un donante amino. Los donantes amino dados a conocer, son similares a las aminas utilizadas como fuente de nitrógeno en los cultivos quimioestatos; por ejemplo, aminas aquirales, en las cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono terminal, tal como una propilamina y bencilamina, aminas quirales en las cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono terminal, tal como el (S)-2-aminobutano, y aminoácidos quirales, tales como la L-alanina y el ácido L-aspártico.

La presente invención, se basa en el descubrimiento del hecho de que, la amina quiral 2-aminopropano, de una forma sorprendente e inesperada, es superior, como donante de amina, en tal tipo de síntesis de aminas de las transaminasas, si se compara con ambas, las aminas aquirales, en la cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono terminal, o las aminas quirales, en las cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono no terminal. La invención, constituye así, de esta forma, la mejora en la síntesis estereoselectiva conocida de una amina quiral, en la cual, se procede a poner en contacto una cetona, con una transaminasa, en presencia de un donante amino, o utilizando 2-aminopropano como donante de amina.

El término amina quiral, se emplea aquí, en su más amplio sentido. Tal y como se describe en las patentes anteriormente referenciadas, arriba, puede emplearse la síntesis estereoespecífica conocida, a la preparación de amplia variedad de compuestos alifáticos y alicíclicos de tipos funcionales diferentes y mezclados, caracterizada por la presencia de un grupo amino primario, unido a un átomo de carbono secundario, el cual, adicionalmente a un átomo de hidrógeno, porta ambos (i) un grupo divalente que forma una estructura cíclida quiral, o (ii) dos sustituyentes (distintos que el hidrógeno) los cuales difieren el uno con respecto al otro en estructura o quiralidad.

Los grupos divalentes que forman una estructura cíclica quiral, incluyen, por ejemplo, al 2-metilbutano-1,4-diílo, pentano-1,4-diílo, hexano-1,4-diílo, hexano-1,5-diílo, 2-metilpentano-1,5-diílo. Así, de esta forma, la presente mejora de la utilización de 2-aminopropano, como donante de amina, puede utilizarse en la síntesis estereoespecífica de 1-amino-2-metilciclopentano, a partir de 2-metilciclopentanona, 1-amino-3-metilciclopentano a partir de 3-metilciclopentanona, 1-amino-3-metilciclohexano a partir de 2-metilciclohexanona, etc.

Los dos sustituyentes diferentes en el átomo de carbono secundario (R^{1} y R^{2}, arriba), pueden también variar ampliamente, e incluyen a los alquilo, aralquilo, arilo, halo, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior, cicloalquilo, carboxi, cabalcoxi, carbamoílo, carbamoílo, mono- y di(alquilo inferior)-sustituido, trifluorometilo, fenilo, nitro, amino, amino mono- y di(alquilo inferior)-sustituido, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etc., así como también alquilo, aralquilo, o arilo, sustituidos por los anteriores.

Así, de esta forma, la presente mejora de la utilización de 2-aminopropano, como donante de amina, puede también utilizarse en la síntesis estereoespecífica de aminobutano a partir de butanona, de 2-amino-1-butanol a partir de 1-hidroxibutan-ona, de alanina a partir de ácido pirúvico, de 1-amino-1-feniletano, a partir de acetofenona, de 1-amino-1-(2-metoxi-5-fluorfenil)etano a partir de 2-metoxi-5-fluoroacetofenona, de ácido \gamma-amino-pentanóico a partir del ácido levulínico, de 1-amino-1-fenilpropano, a partir de 1-fenilpropan-1-ona, de 1-amino-1-(4-bromofenil)propano a partir de 1-(4-bromofenil)propan-1-ona, de 1-amino-1-(4-nitrofenil)propan-1-ona a partir de 1-(4-nitrofenil)propan-1-ona, de 1-fenil-2-aminopropano a partir del 1-fenilpropan-2-ona, de valina a partir de ácido 2-oxo-3-metilbutanóico, del 1-(3-trifluorometilfenil)-2-aminopropano a partir de 1-(3-trifluorometilfenil)propan-1-ona, del 2-aminopropanol a partir de hidroxipropano, del 1-metoxi-2-aminoprapano a partir de metoxioxipropano, del 1-amino-fenilbutano a partir de 1-fenilbutan-1-ona, del 1-fenil-2-aminobutano a partir 1-fenilbutan-2-ona, del 1-(2,5-dimetoxi-4-metifenil)-2-aminobutano a partir de 1-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)butan-2-ona, del 1-(4-hidroxifenil)-3-aminobutano a partir de 1-(4-diroxifenil)butan-3-ona, del 1-amino-1-(2-naftil)etano a partir de 2-actilnaftaleno, la fenilalanina a partir de ácido fenilpirúvico, del ácido glutámico a partir del ácido 2-cetoglutárico, del ácido aspártico, a partir del ácido 2-cetosuccínico, y por el estilo.

Como contraste a los donates de amina reportados en el arte anterior de la técnica especializada y, de hecho, a la mayoría de donantes de aminoalcano los cuales son teóricamente obtenibles, el 2-aminopropano, posee la combinación relativamente única de que (i) sea aquiral y (ii) tenga el grupo amino en un carbono alifático no terminal. No obstante, a pesar de ello, la utilización de transaminasas de aminoácidos omega, la cual, de una forma natural, actúa en un grupo amino, en la posición terminal ó posición \omega de un aminoácido. Se ha encontrado que, la utilización de un donante de amina el cual tenga un grupo amino en un átomo de carbono, no alifático, proporciona una ventaja termodinámica. Sin pretender ligarlo a ninguna teoría, acontece el hecho de que, esta mejora, es una consecuencia del producto secundario de la reacción enzimática, siendo, en tal caso, una cetona, al contrastarse con la utilización de un donante de amina que tenga un grupo amino en un átomo de carbono terminal, tal como la etilamina, n-propilamina, n-octilamina, 1,4-butanodiamina, 1,6-hexanodiamina, ácido 6-amino-hexanóico, ácido 4-aminobutírico, tiramina o bencilamina, el cual forma aldehído en presencia de una reacción de transaminasa de aminoácidos. En las reacciones que involucran aminoácidos procedentes de cetoácidos, la ventaja termodinámica de utilizar isopropilamida, como donante de amino, tiene como resultado una constante de equilibrio, de aproximadamente 1.000. Debido al hecho de que, esta ventaja termodinámica, proviene del entorno medioambiental quiral, del grupo carbonilo que reacciona, esto se aplica igualmente a la síntesis de todos los \alpha-amino-acidos quirales a partir de sus cetoácidos, bien ya sean naturales o no naturales.

A pesar de esta ventaja termodinámica, la presencia del grupo amino en un átomo de carbono alifático, no terminal, tiene generalmente como resultado una quiralidad, como contraste a la sustitución en un átomo de carbono terminal, el cual, teniendo necesariamente dos átomos de hidrógeno, imposibilita la quiralidad. Puesto que, la transaminasa, es estereoselectiva, la utilización de un donante de amina quiral, significa que, únicamente la mitad de tal tipo de amina, es asequible como donante. Desde un punto de vista comercial, esto es inaceptable, para un donante amino.

Desafortunadamente, la amplia mayoría de aminoalcanos(inferiores) que satisfacen este objetivo de tener un grupo amino en un átomo de carbono no terminal, son en sí mismos quirales. Así, de este modo, limitando la consideración de a los aminoalcanos que no tengan más de 8 átomos de carbono, se estima que, de una forma teórica, existen por lo menos 130 posibles aminas homólogas e isoméricas, en las cuales, el grupo amino, no se encuentra en un átomo de carbono trisustituido (para ser un donante de amino, el compuesto, debe también portar por lo menos un átomo de hidrógeno asequible en el átomo de carbono, al cual se encuentra unido el grupo amino). De estos 130 posibles donantes de amino, menos de la mitad (54), tienen un grupo amino en un átomo de carbono no terminal, y de éstos un 93% (50), son quirales. Únicamente 4 de las alquilaminas que tienen un grupo amino en un átomo de carbono no terminal, son aquirales y, de éstas, 3 son prohibitivas, en términos de costo y asequibilidad o posibilidad de obtención y, otra vez, inapropiadas como donantes de amina: 3-amino-pentano, 2,2-dimetil-3-aminopentano, y 4-aminoheptano. Así, de esta forma, todos los amino-alcanos(inferiores) teóricamente apropiados como donantes amino, únicamente el 2-aminopropano, (i) tiene un grupo amino en un átomo de carbono no terminal y así, de este modo, se encuentra termodinámicamente favorecido, con respecto a los alminoalcanos, en los cuales, el grupo amino, se encuentra en un átomo de carbono terminal, (ii) es aquiral, de tal forma que es completamente aprovechable para la reacción, y (iii) es aceptable en términos de coste y disponibilidad. Como una ventaja adicional, el 2-aminopropano, genera también un producto secundario, acetona, la cual es fácilmente recuperable, y que es, en sí misma, un artículo del
comercio.

La conversión enzimática efectiva, puede verse afectada mediante las técnicas convencionales de cultivo, con células aisladas pero no en crecimiento, o con una preparación de transaminasa de aminoácidos, soluble. La transaminasa de aminoácidos, puede encontrarse en una forma libre, tanto como un extracto exento de células, o como una preparación de células enteras, o inmovilizada sobre un vehículo o matriz, tal como un dextrano o agarosa reticulados, sílice, poliamida, o celulosa. Ésta puede también encontrarse encapsulada en poliacrilamida, alginatos, fibras, o por el estilo. Los procedimientos para tal tipo de inmovilización, se encuentran descritos en la literatura correspondiente a la bibliografía especializada (véase, por ejemplo, Methods of Ezymology, 44, 1976).

Si bien no es necesario, es generalmente ventajoso el añadir una fuente de piridoxamina, tal como el piridoxal fosfato.

Ejemplo 1

La invención, puede ejemplificarse mediante la preparación de (S)-1-metoxi-2-aminopropano, un intermediario químico par la síntesis de productos químicos agrícolas, en la cual, se procede a poner en contacto metoxiacetona con unatransaminasa, en presencia de 2-aminopropano, como un donante de amina, permitiendo que la reacción continúe, hasta que, una cantidad substancial de metoxicetona, se haya convertido en (S)-1-metoxi-2-aminopropano (y, el 2-aminopropano, se haya convertido simultáneamente en acetona, y aislando el (S)-1-metoxi-2-aminopropano de este modo formado. La transformación enzimática en su totalidad, puede representarse de la forma que sigue a continuación:

1

\vskip1.000000\baselineskip

Se procedió a añadir cinco milimol de fosfato sódico monobásico y 250 ml de ácido clorhídrico concentrado, a 100 ml de agua. La mezcla, se enfrió a una temperatura de 5 - 10ºC, en un baño de hielo-agua, y se añadieron 258 ml de 2-aminopropano, seguido de 206 ml de metoxiacetona (98%). La mezcla, se agitó y, el pH, se ajustó a un valor de 7,5, con bien ya fuere hidróxido sódico, o bien ya fuere ácido clorhídrico, en la cantidad necesaria. Después de que la temperatura de la mezcla se estabilizara a un nivel de 30 \pm 1ºC;, se añadieron 0,2 mM de piridoxal 5'-fosfato. El valor pH, se reajusta a un nivel de 7,5, en caso necesario, y puede añadirse una reducida cantidad de agua, para llevar el volumen de la mezcla a un valor de 1800 ml.

La solución de la enzima, se preparó separadamente. A 200 ml de 5 mM de solución de fosfato sódico (pH 7,5), se añadieron 0,2 mM de piridoxal 5'-fosfato y 2 g (peso seco) de células Bacillus, que contenían una (S)-transaminasa. Cuando las células se encontraban completamente suspendidas, la solución de enzima, se suministró al interior de la mezcla de reacción descrita anteriormente, arriba.

El caldo final de reacción, contenía 1,5 M de 2-aminoproano y 1,0 M de metoxiacetona. La reacción, progresó durante un transcurso de tiempo de 8 horas, a una temperatura de 31 \pm 1ºC, y a un valor pH de 7,5, en cuyo punto, el (S)-1-metoxi-2-aminopropano, se encontraba presente en la mezcla de reacción, a una concentración de 0,6 M, y ee (enantiómeros) mayor del 99%.

La reacción, se terminó mediante la adición de 5 ml de ácido clorhídrico concentrado, se continuó mediante destilación flash (de evaporación instantánea), para eliminar la metoxiacetona no reaccionada, y el producto secundario, en un solo corte. Una columna separada de destilación de este destilado, puede conducirse a continuación, de forma tardía, para separar la metoxiacetona y la acetona. Se añadieron doscientos setenta mililitros de hidróxido sódico acuoso, al 50%, a la mezcla de reacción, para desprotonizar las aminas. Se procedió, a continuación, a eliminar las aminas de la mezcla, mediante destilación, como un corte individual y se separó (S)-1-metoxi-2-aminopropano del 2-aminopropano residual, mediante una destilación por separado, para proporcionar 125 mg de (S)-1-metoxi-2-aminopropano, el cual contenía un 50% de agua. El producto, es químicamente y anantioméricamente puro, en un porcentaje mayor a un 99%, según se determina mediante análisis de cromatografía de gas.

Ejemplo 2

La invención, puede ejemplificarse adicionalmente, mediante la síntesis de L-alanina, un aminoácido de utilidad, en la cual, se procede a poner en contacto ácido pirúvico con una transaminasa, en presencia de 2-aminopropano, como un donante de amina, permitiendo que la reacción continúe, hasta que, una cantidad substancial de ácido pirúvico, se haya convertido en L-alanina y, el 2-aminopropano, se haya convertido simultáneamente en acetona. La transformación enzimática en su totalidad, puede representarse de la forma que sigue a continuación:

2

Se procedió a disolver piruvato sódico (50 mM, 0,165 g) y clorhidrato de isopropilamina (50 mM, 0,23 ml, de una solución 6,5 molar), en 29,0 ml de una solución de dihidrogenofosfato sódico 50 mM y, el valor pH, se ajustó a un nivel de 7,5. Se añadió piridoxal fosfato (1,0 mM, 8,0 mg) seguido de 8 mg de células E.coli, que contenían una (S)-transaminasa, de tal forma que, el volumen final, fuera de 30 ml y, el pH final, fuera de un valor de 7 - 5. Después de proceder a incubar, a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, se midieron las concentraciones de isopropilamina, acetona y L-alanina, mediante HPLC y GC, y la concentración de L-alanina, se determinó que era de 45,6 mM, equivalente a un K_{eq} para la reacción anterior, de arriba, en un exceso de 100.

Cuando se llevó a cabo una reacción análoga, utilizando células de E. coli (0,3 g), que contenían (R)-transaminasa, la conversión, progresó a una concentración de D-alanina, la cual se determinó que era de 46 mM.

Ejemplo 3 Síntesis de L-Alanina

En un ejemplo por separado de la síntesis de L-alanina, se procedió a disolver piruvato sódico (1 M, 110,0 g), y clorhidrato de isopropilamina (1 M, 153 ml, como una solución 6,5 molar), en 800 ml de un tampón de dihidrogenofosfato sódico 50 mM, y el pH, se ajustó a un valor de 7,5. Se procedió a añadir piridoxal fosfato (1 mM, 265 miligramos), seguido de 5 gramos células de E.coli, que contenían una (S)-transaminasa, de tal forma que, el volumen final, fuera de 1 litro y, el pH final, fuera de un valor de 7,5. Después de proceder a incubar, a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, se midieron las concentraciones de isopropilamina y L-alanina, mediante HPLC y, la concentración de acetona, mediante GC. La concentración de L-alanina producida, se determinó que era de 970 mM, equivalente a un equilibrio constante de la reacción, de aproximadamente 1000.

Ejemplo 4 Síntesis de L-Alanina

Se procedió a disolver cetobutirato sódico (50 mM, 186 miligramos) e isopropilamina (50 mM, 0,23 ml, de una solución 6,5 molar), en 29 ml de un tampón de dihidrogenofosfato sódico 50 mM, y el pH, se ajustó a un valor de 7,5. Se procedió a añadir piridoxal fosfato (1 mM, 265 miligramos), seguido de 100 miligramos de células de E. coli, que contenían una (S)-transaminasa, de tal forma que, el volumen final, fuera de 30 ml y, el pH final, fuera de un valor de 7,5. Después de proceder a incubar, a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, se midieron las concentraciones de isopropilamina y de ácido L-2-aminobutírico, mediante HPLC y, la concentración de acetona, mediante G-C. La concentración de ácido L-aminobutírico producido, se determinó que era de 48 mM, equivalente a un equilibrio constante de la reacción, en un exceso de 500.

Ejemplo 5 Síntesis de aminoácidos adicionales

Siguiendo esencialmente el procedimiento descrito en el ejemplo 4, se demostró la síntesis de L-glutamato, L-metionina y L-norvalina, a partir de las sales de sodio de los correspondientes cetoácidos: ácido 2-cetoglutárico (50 mM, 252 miligramos), ácido 4-metiltio-2-oxobutírico (50 mM, 255 miligramos), y ácido 2-cetovalérico (50 mM, 207 miligramos), respectivamente. En todos los casos, la (S)-transaminasa produjo exclusivamente el isómero L del aminoácido, a concentraciones de 45, 47 y 46 mM, respectivamente.

Claims

1. Síntesis estereoselectiva de una amina quiral, en la cual, se procede a poner en contacto una cetona, con una transaminasa, en presencia de un donante de amino, la cual comprende la utilización de 2-aminopropano, como donante de amina.

2. Síntesis, según la reivindicación 1, en donde, 1 amina quiral, es un aminoácido quiral.

3. Procedimiento de preparación de (S)-1-metoxi-2-aminoproano, el cual comprende el poner en contacto metoxiacetona, con una transaminasa, en presencia de 2-aminopropano, como donante de amina, hasta que, una cantidad substancial de metoxicetona, se convierta en (S)-1-metoxi-2-aminopropano y 2-aminopropano, y el 2-aminopropano, se convierta en acetona, y aislando el(S)-1-metoxi-2-aminopropano.