DE60013939T2 - Stereoselektive Transaminase, deren kodierende Gen und deren Verwendungen - Google Patents

Stereoselektive Transaminase, deren kodierende Gen und deren Verwendungen Download PDF

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Yoshiki Nishinomiya-shi Takashima
Satoshi Takarazuka-shi Mitsuda
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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das in der Lage ist eine Transaminierung stereoselektiv zu katalysieren, ein Gen, das dieses Protein codiert, und Verwendungen davon.
  • BESCHREIBUNG DES FACHGEBIETS
  • Eine durch die Formel (3) repräsentierte optisch aktive Aminoverbindung: X1-C*H(NH2)-(CH2)m-R1 (3)(wobei X1 ein gegebenenfalls substituierter C1-C9-Alkylrest, ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest, ein gegebenenfalls substituierter C7-C17-Arylalkylrest, ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest, ein gegebenenfalls substituierter C5-C15-Heteroarylalkylrest, eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe, eine Cyanogruppe, ein Halogenatom oder ein Wasserstoffatom ist, R1 ein C1-C6-Alkylrest, eine Carboxylgruppe, ein C2-C6-Alkyloxycarbonylrest oder ein Wasserstoffatom ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und * ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist), ist eine Verbindung, die als Zwischenprodukt für die Synthese einer Verbindung verwendbar ist, die in verschiedenen Anwendungen verwendbar ist.
  • Zum Beispiel ist eine durch die Formel (10) repräsentierte, optisch aktive Form einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung: X5-(CH2)r-CH(NH2)-R9 (10)(wobei X5 eine gegebenenfalls substituierte Phenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Naphthylgruppe ist, R9 ein C1-C6-Alkylrest ist und r eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist), eine Verbindung, die als Zwischenprodukt für die Synthese eines pharmazeutisch wirksamen Stoffes wie etwa eines Mittels zur Behandlung von Diabetes, eines Mittels gegen Fettsucht, eines Bronchodilators und dergleichen, wie auch eines Pestizids wie etwa eines Fungizids, eines Herbizids und dergleichen verwendbar ist, wohingegen eine durch die Formel (8) repräsentierte optisch aktive Aminoverbindung:
    Figure 00020001
    (wobei X4 ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest, ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest, ein gegebenenfalls substituierter C1-C3-Alkylrest, eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, R7 und R8 gleich oder unterschiedlich sein und jeweils ein Wasserstoffatom oder ein C1-C3-Alkylrest sein können, p eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), eine Verbindung ist, die als Zwischenprodukt für die Synthese eines pharmazeutisch wirksamen Stoffes wie etwa eines Mittels zur Behandlung von Wachstumsstörun-gen, eines Antikoagulans, eines krebshemmenden Mittels und dergleichen verwendbar ist.
  • Ein bekannter, in der Herstellung einer vorstehend beschriebenen optisch aktiven Aminoverbindung verwendeter Biokatalysator ist zum Beispiel eine aus einem zur Gattung Arthrobacter gehörenden Mikroorganismus abgeleitete Transaminase, die in der Lage ist eine optisch aktive Aminoverbindung aus einer bestimmten Ketonverbindung als Ausgangsmaterial herzustellen (WO97/15682, WO98/48030). Eine aus einem zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus abgeleitete D-Aminosäure-Transaminase, die in der Läge ist eine optisch aktive D-Aminosäure aus einer bestimmten Ketonsäureverbindung als Ausgangsmaterial herzustellen (JP-B-5-5472), ist ebenfalls bekannt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Proteins, das eine herausragende Fähigkeit besitzt eine optisch aktive Aminoverbindung effizient herzustellen, eines Gens, das dieses Protein codiert und der Verwendungen davon.
  • Unter Berücksichtigung dieser Gegebenheiten haben die genannten Erfinder intensiv Biokatalysatoren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung untersucht. Als Ergebnis haben sie ein neues Protein, das in der Lage ist eine Transaminierung stereoselektiv zu katalysieren und ein Gen, das dieses Protein codiert, und Verwendungen davon gefunden und haben die vorliegende Erfindung ausgeführt.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt bereit:
    • 1. ein Protein (im Folgenden als "das erfindungsgemäße Protein" bezeichnet) mit:
    • (a) eine Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1;
    • (b) eine Aminosäuresequenz, umfassend einen einzelnen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1;
    • (c) eine Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 60% oder höher zeigt;
    • (d) eine Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 80% oder höher zeigt; oder
    • (e) eine Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 90% oder höher zeigt.
    • 2. Ein Protein, das die Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 hat.
    • 3. Ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1, umfassend einen Aminosäureaustausch von Threonin nach Alanin, der an einer Position auftritt, die der Aminosäureposition Nr. 2 einer Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 entspricht.
    • 4. Ein Gen, das ein Protein codiert (im Folgenden als "das erfindungsgemäße Gen" bezeichnet) mit:
    • (a) einer Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1;
    • (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend einen einzelnen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1;
    • (c) einer Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz von Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 codiert wird;
    • (d) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 60% oder höher zeigt;
    • (e) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 80% oder höher zeigt; oder
    • (f) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 90% oder höher zeigt.
    • 5. Ein Gen, das eine der folgenden Nucleotidsequenzen hat (im Folgenden als "das erfindungsgemäße Gen" bezeichnet):
    • (a) eine Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2; und
    • (b) eine Nucleotidsequenz, umfassend einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin, der an einer Position auftritt, die Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 entspricht;
    • (c) eine Nucleotidsequenz von etwa 1020 bp, die ein Protein codiert, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und welche durch PCR amplifizierbar ist, wobei als Primer verwendet werden ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 28 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 hat, oder ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 11 hat, und ein Oligonucleotid, das eine zu der Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 999 bis 1020 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 komplementäre Nucleotidsequenz hat und als Matrize eine chromosomale DNA, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu Mycobacterium gehört.
    • 6. Ein Gen gemäß vorstehendem Punkt 5, das die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 hat.
    • 7. Das Gen gemäß vorstehendem Punkt 5, umfassend einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin, der an einer Position auftritt, die Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen von Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 entspricht.
    • 8. Ein Gen, umfassend einen Promotor, der in der Lage ist in einer Wirtszelle zu funktionieren und in funktioneller Weise mit dem Gen gemäß vorstehendem Punkt 4 verbunden ist.
    • 9. Ein Vektor, enthaltend das Gen gemäß vorstehendem Punkt 4 (im Folgenden als "der erfindungsgemäße Vektor" bezeichnet).
    • 10. Eine Transformante, die das Gen gemäß vorstehendem Punkt 4 in eine Wirtszelle eingeführt hat (im Folgenden als "die erfindungsgemäße Transformante" bezeichnet).
    • 11. Eine Transformante, die den Vektor gemäß vorstehendem Punkt 9 in eine Wirtszelle eingeführt hat.
    • 12. Die Transformante gemäß vorstehendem Punkt 10 oder 11, wobei die Wirtszelle eine Mikroorganismuszelle ist.
    • 13. Ein Verfahren zur Herstellung einer Transformante, umfassend einen Schritt des Transduzierens des Gens gemäß vorstehendem Punkt 4 oder des Vektors gemäß vorstehendem Punkt 9 in eine Wirtszelle.
    • 14. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß vorstehendem Punkt 1, umfassend einen Schritt des Züchtens eines Mikroorganismus, der das Gen gemäß vorstehendem Punkt 4 hat.
    • 15. Das Verfahren gemäß vorstehendem Punkt 14, wobei der Mikroorganismus die Transformante gemäß vorstehendem Punkt 10 oder 11 ist.
    • 16. Ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung, repräsentiert durch die Formel (6):
      Figure 00050001
      wobei X2 eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Naphthylgruppe ist, R4 ein C1-C6-Alkylrest ist und n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, umfassend die Umsetzung einer durch Formel (4) repräsentierten Ketonverbindung: X2-(CH2)n-CO-R4 (4)wobei X2, R4 und n die vorstehend definierten Bedeutungen haben, in Gegenwart einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung, die durch Formel (5) repräsentiert wird: R5-CH(NH2)-R6 (5)wobei R5 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest, eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest ist, R6 ein Wasserstoffatom, ein C1-C6-Alkylrest, eine Carboxylgruppe oder eine C2-C5-Alkyloxycarbonylgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung durch das Protein gemäß vorstehendem Punkt 1, 2 oder 3 katalysiert wird.
    • 17. Ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung, die durch Formel (8) repräsentiert wird:
      Figure 00050002
      wobei X4 ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest, ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest, ein gegebenenfalls substituierter C1-C3-Alkylrest, eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, R7 und R8 gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, einen C1-C3-Alkylrest oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, p eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, umfassend die Umsetzung einer durch Formel (7) repräsentierten Ketonverbindung: X4-(CR7R8)p-CO-(CH2)q-COOH (7)wobei X4, R7, R8, p und q die vorstehend definierten Bedeutungen haben, in der Gegenwart einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung, die durch Formel (2) repräsentiert wird: R2-CH(NH2)-R3 (2)wobei R2 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest, eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest ist, R3 ein Wasserstoffatom, ein C1-C6-Alkylrest, eine Carboxylgruppe oder ein C2-C5-Alkyloxycarbonylrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung durch das Protein gemäß vorstehendem Punkt 1, 2 oder 3 katalysiert wird.
  • Im weiteren Verlauf dieser Beschreibung und der folgenden Ansprüche ist der Begriff "umfassen" und Variationen davon wie etwa "umfasst" oder "umfassend", wenn der Kontext es nicht anders erfordert, so zu verstehen, dass er die Einbeziehung einer/eines bestimmten ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe ganzer Zahlen oder Schritte, aber nicht den Ausschluß jeder/jedes anderen ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe ganzer Zahlen oder Schritte bedeutet.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
    • Sequenz ID Nr. 6 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 7 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 8 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 9 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 10 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 11 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
    • Sequenz ID Nr. 12 ist ein für PCR konzipierter Oligonucleotidprimer
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genau beschrieben.
  • Ein erfindungsgemäßes Protein schließt ein Protein mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen ein:
    • (a) einer Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1;
    • (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend einen Aminosäureaustausch, der in einem Teil auftritt, der einem Teil einer Aminosäuresequenz entspricht, die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentiert wird;
    • (c) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 60% oder höher zeigt;
    • (d) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und ein monomeres Molekulargewicht von etwa 37 kDa hat, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 80% oder höher zeigt; und
    • (e) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zur Gattung Mycobacterium gehört, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 60% oder höher zeigt. Typischerweise können ein Protein mit einer von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die einen Aminosäureaustausch von Threonin nach Alanin an einer Position umfasst, die der Aminosäureposition Nr. 2 einer von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz entspricht, und ein Protein mit einem monomeren Molekulargewicht von etwa 37 kDa, das aus Mycobacterium aurum SC-S423 erhalten werden kann und das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, als Beispiele dienen.
  • Die Aminosäuresequenz des vorstehend beschriebenen Proteins kann auf eine geeignete Länge verkürzt werden, so lange es nicht die Fähigkeit verliert, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und kann zum Beispiel ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Aminosäurepositionen Nr. 23 bis Nr. 339 in der von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz sein.
  • Das erfindungsgemäße Protein besitzt die Fähigkeit eine Transaminierung stereoselektiv zu katalysieren, mindestens die Fähigkeit Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln. Zum Beispiel wird 1 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0), der das erfindungsgemäße Protein enthält, mit 400 mM (als Endkonzentration) eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin, 10 mM (als Endkonzentration) Acetophenon und 20 μM (als Endkonzentration) Pyridoxal-5-phosphat (PLP) versetzt, um ein Reaktionsgemisch zu erhalten, das bei etwa 30 bis 40°C für etwa 2 Stunden bis 4 Tage gehalten und dann auf die Menge von darin gebildetem, optisch aktivem 1-Phenylethylamin untersucht wird, womit bestimmt wird, ob die vorstehend beschriebene Fähigkeit vorhanden ist oder nicht. Diese Vorgehensweise verwendet ein Verfahren zur Quantifizierung eines optisch aktiven 1-Phenylethylamins, das in den später beschriebenen Beispielen ausgeführt wird.
  • Eine durch das erfindungsgemäße Protein stereoselektiv katalysierte Transaminierung kann zum Beispiel eine Reaktion sein, in der die Ketonverbindung (1) in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) in die optisch aktive Aminoverbindung (3) umgewandelt wird, eine Reaktion, in der die Ketonverbindung (4) in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (5) in die optisch aktive Aminoverbindung (6) umgewandelt wird, eine Reaktion, in der die Ketonverbindung (7) in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) in die optisch aktive Aminoverbindung (8) umgewandelt wird, eine Reaktion, in der das Verhältnis des in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) enthaltenen Isomers der Aminoverbindung (9) in der Gegenwart der Ketonverbindung (14) verbessert wird, eine Reaktion, in der das Verhältnis der in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (10) enthaltenen optisch aktiven Aminoverbindung (12) in der Gegenwart der Ketonverbindung (11) verbessert wird und so weiter.
  • In der vorliegenden Erfindung ist eine Aminosäureidentität mit der von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz eine Identität mit der gesamten von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz und es wird eine in einem Fall stärker bevorzugt, in dem die Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz der Aminosäurepositionen Nr. 23 bis Nr. 339 in Sequenz ID Nr. 1 höher ist. Typischerweise ist die Aminosäureidentität 80% oder höher, stärker bevorzugt 90% oder höher und besonders 95% oder höher.
  • Das erfindungsgemäße Gen schließt ein Gen, das ein Protein mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen codiert:
    • (a) einer Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1;
    • (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend einen Aminosäureaustausch, der in einem Teil auftritt, der einem Teil einer Aminosäuresequenz entspricht, die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentiert wird;
    • (c) einer Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz von Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 2, codiert wird;
    • (d) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 60% oder höher zeigt;
    • (e) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und ein monomeres Molekulargewicht von etwa 37 kDa hat, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 80% oder höher zeigt; und
    • (f) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln und aus einem Mikroorganismus erhalten werden kann, der zur Gattung Mycobacterium gehört, wobei diese Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 1, von 60% oder höher zeigt, und ein Gen mit einer der folgenden Nucleotidsequenzen ein:
    • (a) einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 2; und
    • (b) einer Nucleotidsequenz, umfassend einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin, der an einer Position auftritt, die Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert durch Sequenz ID Nr. 2, entspricht;
    • (c) einer Nucleotidsequenz von etwa 1020 bp, die durch PCR amplifiziert wird, wobei als Primer verwendet werden ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 28 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 2, hat oder ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 11, hat, und ein Oligonucleotid, das eine zu der Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 999 bis 1020 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 2, komplementäre Nucleotidsequenz hat und als Matrize eine chromosomale DNA, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu Mycobacterium gehört und welche ein Protein codiert, das in der Lage ist Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln. Typischerweise können ein Gen mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz und ein Gen mit einer Nucleotidsequenz, die einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin umfasst, der an einer Position auftritt, die der Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz entspricht, als Beispiele dienen.
  • Das vorstehend beschriebene Gen kann zum Beispiel ein natürlich vorkommendes Gen oder ein Gen sein, das durch Mutagenese eines natürlich vorkommenden Gens mit Hilfe einer ortsspezifischen Mutagenese oder einer Zufalls-Mutagenese hergestellt wurde.
  • Um ein natürlich vorkommendes Gen zu suchen, wird ein Mikroorganismus, der in der Lage ist Acetophenon in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin umzuwandeln, untersucht und die bevorzugt zu unter suchenden Mikroorganismen gehören zur Gattung Mycobacterium wie etwa Mycobacterium aurum, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium chubuense und dergleichen.
  • Das erfindungsgemäße Gen kann durch ein nachstehend aufgeführtes Verfahren hergestellt werden.
  • Chromosomale DNA wird aus einem Mikroorganismus, der zur Gattung Mycobacterium gehört, wie etwa der Mycobacterium aurum-Stamm SC-S423 [hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag mit der von der folgenden internationalen Hinterlegungsbehörde erteilten Eingangsnummer FERM BP-7009 (Original-Hinterlegung datiert auf 30. März 1998) bei National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology], gemäß den herkömmlichen gentechnischen Verfahren hergestellt, wie etwa in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., und dergleichen beschrieben. Daran anschließend wird die isolierte DNA als Matrize in einer Polymerse-Kettenreaktion (im Folgenden als PCR bezeichnet) unter den nachstehend angegebenen Bedingungen verwendet, wobei als Primer ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 28 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 2, hat oder ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr. 11, hat und ein Oligonucleotid, das eine zu der Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nrn. 999 bis 1020 in der Nucleotidsequenz, repräsentiert von Sequenz ID Nr: 2, komplementäre Nucleotidsequenz hat, verwendet werden, wodurch eine DNA, die eine die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierte Aminosäuresequenz codierende Nucleotid-sequenz hat oder eine DNA, die eine Nucleotidsequenz hat, die eine Aminosäuresequenz codiert, in der eine oder mehrere Aminosäuren in der von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz deletiert, substituiert, hinzugefügt oder eingefügt sind, amplifiziert wird.
  • In diesem Verfahren kann die PCR die Bedingungen verwenden, in denen eine Reaktionslösung verwendet wird, die 4 dNTPs in einer Endkonzentration von jeweils 200 μM, 2 der vorstehend beschriebenen Primer in einer Endkonzentration von jeweils 200 nM, Taq-DNA-Polymerse und Pwo-DNA-Polymerase in einer Gesamtkonzentration von 26 mU/μl und eine als Matrize eingesetzte chromosomale DNA in einer Endkonzentration von 1 ng/μl enthält, und bei 95°C für 2 Minuten gehalten wird und dann insgesamt 25 Zyklen unterzogen wird, wobei jeder Zyklus aus 15 Sekunden bei 96°C, gefolgt von 15 Sekunden bei 60°C, gefolgt von 1 Minute bei 72°C besteht, und dann bei 72°C für 10 Minuten gehalten wird. Ein als Primer in dieser PCR eingesetztes Oligonucleotid kann auf der Grundlage der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz entsprechend konzipiert und synthetisiert werden und der PCR unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen unterzogen werden, wodurch eine DNA, die eine partielle Aminosäuresequenz der von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz codiert, typischerweise eine DNA, die die Aminosäure sequenz der Aminosäurenummern 23 bis 339 in der von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierten Aminosäuresequenz codiert oder eine DNA als Variante davon, in der ein oder mehrere Nucleotide in der Nucleotidsequenz deletiert, substituiert, hinzugefügt oder eingefügt sind, amplifiziert wird. An das 5'-Ende des in der vorstehend beschriebenen PCR verwendeten Primers kann eine zusätzliche Nucleotidsequenz wie etwa eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz angefügt sein. Typischerweise kann ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 11 oder 12 repräsentierten Nucleotidsequenz als Beispiel angeführt werden. Wenn eine DNA-Genbank, die durch Einfügen einer chromosomalen DNA oder einer cDNA in einen Vektor enstanden ist, als Matrize. verwendet wird, werden ein Oligonucleotid, das eine aus der Nucleotidsequenz, die die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierte Aminosäuresequenz codiert, ausgewählte Nucleotidsequenz hat (z. B. ein Oligonucleotid, das eine Nucleotidsequenz von etwa 14 oder mehr Nucleotiden vom 5'-Ende der Nucleotidsequenz hat, die die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierte Aminosäuresequenz codiert) und ein Oligonucleotid von etwa 14 oder mehr Nucleotiden, das eine zu einer Nucleotidsequenz in der Nähe der Insertionsstelle der DNA in den zur Konstruktion der Genbank eingesetzten Vektor komplementäre Nucleotidsequenz hat, als Primer zur Durchführung der PCR eingesetzt, wodurch eine DNA amplifiziert wird, die eine Nucleotidsequenz hat, die die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierte Aminosäuresequenz codiert.
  • Die auf diese Weise amplifizierte DNA kann dann gemäß den herkömmlichen gentechnischen Verfahren, wie etwa in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., und dergleichen beschrieben, in einen Vektor cloniert werden. Typischerweise kann beispielsweise der von Invitrogen erhältliche Plasmidvektor pCRII oder der von Stratagene erhältliche Plasmidvektor pBluescript II in der Clonierung eingesetzt werden.
  • Das erfindungsgemäße Gen kann auch durch Hybridisierung einer Genbank aus einer chromosomalen DNA oder einer cDNA, abgeleitet von einem Mikroorganismus, der zur Gattung Mycobacterium gehört, mit einer DNA von etwa 15 Nucleotiden oder mehr als Sonde mit einer Nucleotidsequenz, die die von Sequenz ID Nr. 1 repräsentierte Aminosäuresequenz codiert, unter den nachstehenden Bedingungen, gefolgt vom Nachweis einer DNA, an die diese Probe spezifisch bindet, erhalten werden.
  • Ein Verfahren zur Hybridisierung einer Genbank aus chromosomaler DNA oder cDNA mit einer Sonde kann eine Koloniehybridisierung oder eine Plaquehybridisierung sein und ist abhängig von der Art des für die Herstellung der Genbank eingesetzten Vektors. Wenn die verwendete Genbank mit einem Plasmidvektor konstruiert wird, wird eine Koloniehybridisierung durchgeführt. Typischerweise wird die DNA einer Genbank in einen Mikroorganismus transduziert, der die Replikation eines zur Herstellung der Genbank eingesetzten Plasmidvektors ermöglicht, um eine Transformante zu erhalten, die dann verdünnt und auf einem Agarnährmedium ausgestrichen wird, das dann inkubiert wird, bis Kolonien erscheinen. Wenn die Genbank mit einem Phagenvektor hergestellt wird, wird eine Plaquehybridisierung durchgeführt. Typischerweise wird ein Mikroorganismus, der die Replikation eines zur Herstellung der Genbank eingesetzten Phagenvektors ermöglicht, mit einem Genbank-Phagen unter Bedingungen vermischt, die es gestatten, dass eine Infektion auftritt, und dann weiter mit einem Weichagarnährmedium vermischt, das dann auf einem Agarnährmedium verteilt wird. Dann wird das Nährmedium inkubiert, bis Plaques erscheinen. In jedem der vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren wird dann eine Membran auf die Oberfläche des wie vorstehend beschrieben inkubierten Agarnährmediums gelegt, um eine Transformante oder einen Phagen auf die Membran zu übertragen. Nach der Behand-lung dieser Membran mit Alkali, gefolgt von einer Neutralisierung, wird die DNA auf der Membran immobilisiert. Im Falle einer Plaquehybridisierung wird das vorstehend beschriebene Agarnährmedium typischerweise mit einer Nitrocellulosemembran oder einer Nylonmembran, nämlich Hybond-N+ (Handelsname von Amersham), bedeckt und kann für etwa 1 Minute stehen, wodurch es einem Phagenpartikel ermöglicht wird, an die Membran adsorbiert zu werden. Dann wird die Membran für etwa 3 Minuten in eine alkalische Lösung (1.5 M Natriumchlorid, 0.5 N NaOH) getaucht, um die Phagenpartikel aufzulösen, um eine Elution der Phagen-DNA auf die Membran zu bewirken, gefolgt vom Eintauchen für etwa weitere 5 Minuten in eine Neutralisierungslösung (1.5 M Natriumchlorid, 0.5 M Tris-HCl-Puffer, pH 7.5). Nach dem Waschen der Membran mit einer Waschlösung (0.3 M Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat, 0.2 M Tris-HCl-Puffer, pH 7.5) für etwa 5 Minuten, wurde ein Backvorgang bei zum Beispiel etwa 80°C für etwa 90 Minuten durchgeführt, um die Phagen-DNA an der Membran zu immobilisieren.
  • Die auf diese Weise vorbereitete Membran wird dann einer Hybridisierung mit der vorstehend beschriebenen DNA als Sonde unterzogen. Die Hybridisierung kann zum Beispiel gemäß der Beschreibung in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press durchgeführt werden.
  • Eine als Sonde eingesetzte DNA kann mit einem radioaktiven Isotop mit einem von Boehringer oder TAKARA SHUZO Co., Ltd. erhältlichen Random Labeling-Kit markiert werden und die Markierung kann auch mit der Durchführung einer PCR bewirkt werden, unter Verwendung einer Sonden-DNA als Matrize, wobei (α-32P)dCTP an Stelle von dCTP in einem gewöhnlichen PCR-Reaktionsgemisch eingesetzt wird. Wenn eine als Sonde verwendete DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wird, kann das von Amersham erhältliche ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection-System eingesetzt werden.
  • Während verschiedene Reagenzien und Temperaturbedingungen in einer Hybridisierung eingesetzt werden können, wird eine Vorhybridisierungslösung, die 450 bis 900 mM Natriumchlorid, 45 bis 90 mM Natriumcitrat zusammen mit 0.1 bis 1.0% Natriumdodecylsulfat (im Folgenden als SDS bezeichnet), 0 bis 200 μg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält, gegebenenfalls mit Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon in einer Konzentration von jeweils 0 bis 0.2%, bevorzugt eine Vorhybridisierungslösung, die 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1.0% SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA enthält, in einem Volumen von 50 bis 200 μl pro 1 cm2 einer wie vorstehend beschrieben vorbereiteten Membran bereitgestellt und die Membran wird in diese Lösung über einen Zeitraum von 1 bis 4 Stunden bei 42 bis 65°C, bevorzugt für 2 Stunden bei 65°C, eingetaucht. Dann wird eine Hybridisierungslösung, die 450 bis 900 mM Natriumchlorid, 45 bis 90 mM Natriumcitrat zusammen mit 0.1 bis 1.0% SDS, 0 bis 200 μg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält, gegebenenfalls mit Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon in einer Konzentration von jeweils 0 bis 0.2%, bevorzugt eine Hybridisierungslösung, die 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1.0% SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA enthält, gemischt mit der wie vorstehend beschrieben hergestellten Sonde (entsprechend 1.0 × 104 bis 2.0 × 106 cpm pro 1 cm2 der Membran), in einem Volumen von 50 bis 200 μl pro 1 cm2 einer Membran bereitgestellt und die Membran wird in diese Lösung über einen Zeitraum von 12 bis 20 Stunden bei 42 bis 65°C, bevorzugt für 16 Stunden bei 65°C, eingetaucht, wodurch die Hybridisierung bewirkt wird.
  • Nach dieser Hybridisierung wird die Membran herausgenommen und zweimal für 15 Minuten mit einer Lösung, die 15 bis 300 mM Natriumchlorid, 1.5 bis 30 mM Natriumcitrat und 0.1 bis 1.0% SDS enthält, bei 42 bis 65°C, bevorzugt mit einer Lösung, die 15 mM Natriumchlorid, 1.5 mM Natriumcitrat und 1.0% SDS enthält, bei 65°C gewaschen. Danach wird die Membran mit 2 x SSC-Lösung (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat) vorsichtig abgespült und dann getrocknet. Diese Membran wird zum Beispiel einer Autoradiographie unterzogen, um die Lage der Sonde auf der Membran nachzuweisen, wodurch nachgewiesen wird, wo sich die DNA, die mit der eingesetzten Sonde hybridisiert, auf der Membran befindet. Ein der Lage der auf der Membran nachgewiesenen DNA entsprechender Clon wird auf dem ursprünglich eingesetzten Agarnährmedium identifiziert und wird gepickt, um den Clon, der die entsprechende DNA besitzt, zu isolieren.
  • Die wie vorstehend beschrieben erhaltene DNA kann gemäß den herkömmlichen gentechnischen Verfahren, wie etwa in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., und dergleichen beschrieben, in einen Vektor cloniert werden. Ein zu verwendender Vektor kann zum Beispiel pUC119 (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), pTV118N (TAKARA SHUZO Co., Ltd.), pBluescriptII (Toyobo Co., Ltd.), pCRII-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia), pKK331-1 (Pharmacia) und dergleichen sein.
  • Die Nucleotidsequenz der wie vorstehend beschrieben erhaltenen DNA kann zum Beispiel durch ein von F. Sänger, S. Nicklen und A. R. Coulson in "Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A." 74 (1977), S. 5463–5467 beschriebenes Didesoxy- Terminator-Verfahren sequenziert werden. Eine Sequenzierungsprobe des Nucleotids kann auch mit einem handelsüblichen Reagenz wie etwa dem von Perkin Elmer erhältlichen ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit hergestellt werden.
  • Ein durch die wie vorstehend beschrieben erhaltene DNA codiertes Protein kann durch ein nachstehend als Beispiel erläutertes Verfahren auf seine Fähigkeit, eine Transaminierung stereoselektiv zu katalysieren, überprüft werden. Dabei wird die entsprechende DNA so in einen Vektor eingefügt, dass sie stromabwärts mit einem Promotor verbunden ist, der in der Lage ist in einer Wirtszelle zu funktionieren und der Vektor wird in die Wirtszelle transduziert, um eine Transformante zu erhalten. Dann wird eine Kultur der Transformante mit einer Ketonverbindung (1) in Gegenwart einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) umgesetzt, um ein Reaktionsprodukt zu liefern, das dann analysiert wird. Auf diese Weise kann eine Transformante identifiziert werden, die in der Lage ist, überwiegend eine optisch aktive Amnioverbindung (3), herzustellen, und diese Transformante sollte ein entsprechendes Gen haben, das ein Protein mit dieser Fähigkeit codiert. Noch typischer wird eine Kultur der vorstehend beschriebenen Transformante zum Beispiel in einem 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) suspendiert, der 10 mM Acetophenon, 400 mM racemisches Gemisch von sek.-Butylamin und 20 μM Pyridoxal-5-phosphat (PLP) enthält, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten, das in ein 1.5 ml-Probenröhrchen gegeben wird, das dann unter Schütteln auf einem Schüttler bei etwa 30°C bis etwa 40°C für einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bis etwa 4 Tagen inkubiert wird. 200 μl der Suspension wurden nach dieser Inkubation mit 400 μl Methanol vermischt und gerührt und bei 10000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der filtriert wird, um ein Filtrat zu erhalten, das mit Gaschromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (im Folgenden als HPLC bezeichnet) analysiert wird, um das hergestellte 1-Phenylethylamin zu quantifizieren und dessen optische Reinheit abzuschätzen, wodurch beurteilt wird, ob die Transformante als repräsentative Fähigkeit, eine Transaminierung stereoselektiv zu katalysieren oder nicht, die Fähigkeit hat, optisch aktives 1-Phenylethylamin herzustellen.
  • Um das erfindungsgemäße Gen in einer Wirtszelle zu exprimieren wird ein Gen, bestehend aus einem Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren und mit dem erfindungsgemäßen Gen in einer funktionellen Weise verbunden ist, ein Vektor, der das erfindungsgemäße Gen enthält, in eine Wirtszelle transduziert. Der hier verwendete Ausdruck "in einer funktionellen Weise" bezeichnet eine Bedingung, unter der das erfindungs-gemäße Gen in einer Weise an einen Promotor gebunden ist, die eine Expression unter der Regulation durch den Promotor erlaubt, wenn das erfindungsgemäße Gen in eine Wirtszelle transduziert wurde. Diese Promotoren können zum Beispiel ein Promotor des Lactose-Operons von E. coli, ein Promotor des Tryptophan-Operons von E. coli oder ein synthetischer Promotor sein, der in der Lage ist in einer E. coli-Zelle zu funktionieren, wie etwa der tac-Promotor oder der trc-Promotor. Ebenso kann ein natürlicherweise dem erfindungsgemäßen Gen entsprechender Promotor eingesetzt werden. Im Allgemeinen wird das erfindungsgemäße Gen, das in einer funktionellen Weise mit einem Promotor verbunden ist, der in der Lage ist in einer Wirtszelle zu funktionieren, in einen Vektor wie etwa die vorstehend beschriebenen eingebaut, der dann in eine Wirtszelle transduziert wird. Diese Vektoren können zum Beispiel ein Vektor mit einem Selektionsmarkergen (z. B. Antibiotikaresistenz verleihende Gene wie etwa das Kanamycin-Resistenzgen, das Neomycin-Resistenzgen) zum Zweck der Selektion einer Transformante auf der Basis eines Phänotyps dieser Selektionsmarkergene sein, in die das erfindungsgemäße Gen transduziert wird.
  • Eine Wirtszelle, in die das erfindungsgemäße Gen oder der das erfindungsgemäße Gen enthaltende Vektor transduziert wird, kann zum Beispiel eine Zelle eines Mikroorganismus, klassifiziert als Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Mycobacterium und dergleichen, sein. Ein Verfahren zur Transduzierung des erfindungsgemäßen Gens in eine Wirtszelle kann jedes der üblicherweise in Abhängigkeit von den Wirtszellen ausgewählten sein und kann zum Beispiel ein in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., beschriebenes Calciumchlorid-Verfahren oder ein in "Methods in Electroporation: Gene Pulser/E. coli Pulser System", Bio-Rad Laboratories (1993) beschriebenes Elektroporationsverfahren sein.
  • Eine Transformante, in die das erfindungsgemäße Gen oder der das erfindungsgemäße Gen enthaltende Vektor transduziert wird, kann auf der Basis eines Phänotyps eines Selektionsmarkergens, das in einem Vektor enthalten ist, in den das erfindungsgemäße Gen eingebaut ist, wie zuvorstehend beschrieben, selektiert werden. Um sicherzustellen, dass die Transformante das erfindungsgemäße Gen oder den das erfindungsgemäße Gen enthaltenden Vektor besitzt, wird DNA aus der Transformante isoliert und herkömmlichen Verfahren unterzogen, wie etwa den in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press beschriebenen (Identifizierung über Restriktionskarten, Nucleotidsequenzierung, Southern-Hybridisierung, Western-Hybridisierung und dergleichen).
  • Das erfindungsgemäße Protein kann zum Beispiel durch Züchtung eines Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Gen hergestellt werden. Dieser Mikroorganismus kann einer sein, der in der Lage ist das erfindungsgemäße Gen zu exprimieren und das erfindungsgemäße Protein herzustellen, wie etwa ein aus dem natürlichen Habitat isolierter Wildtypstamm eines Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Gen, eine Variante, abgeleitet aus diesen Wildtypstämmen mittels einer Behandlung mit einem Reagenz oder UV. Weiterhin kann die durch Transduzierung des erfindungsgemäßen Gens oder des das erfindungsgemäße Gen enthaltenden Vektors in eine Wirtszelle erhaltene Transformante als Beispiel angeführt werden. Noch typischer kann der Mycobacterium aurum-Stamm SC-S432, der ein von uns isolierter Wildtypstamm ist, als Beispiel angeführt werden. Ein durch Transduzierung des in funktioneller Weise mit einem tac-Promotor oder einem lac-Promotor verbundenen erfindungsgemäßen Gens in eine Wirtszelle erhaltener E. coli wie etwa E. coli JM109/ptrc9 kann ebenso als Beispiel angeführt werden.
  • Ein zur Züchtung eines Mikroorganismus mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Gen verwendetes Nährmedium kann jedes der üblicherweise zur Züchtung eines Mikroorganismus eingesetzten sein, das geeignete Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, organische und anorganische Salze enthält. Kohlenstoffquellen können zum Beispiel Saccharide wie etwa Glucose, Fructose, Saccharose, Dextrin und dergleichen, Zuckeralkohole wie etwa Glycerin, Sorbit und dergleichen, organische Säuren wie etwa Fumarsäure, Citronensäure, Pyruvat und dergleichen einschließen. Die zu einem Nährmedium zuzugebende Menge der vorstehend aufgelisteten Kohlenstoffquellen beträgt üblicherweise etwa 0.1% (Gew./Vol.) bis etwa 10% (Gew./Vol.), bezogen auf die Gesamtmenge des Nährmediums.
  • Stickstoffquellen können zum Beispiel Ammoniumsalze anorganischer Säuren wie etwa Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und dergleichen, Ammoniumsalze organischer Säuren wie etwa Ammoniumfumarat, Ammoniumcitrat und dergleichen, organische Stickstoffquellen wie etwa Fleischextrakt, Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsamenöl, getrocknete Hefe, Caseinhydrolysat und dergleichen wie auch Aminosäuren einschließen. Von diesen vorstehend aufgelisteten können Ammoniumsalze organischer Säuren, organische Stickstoffquellen und Aminosäuren meist auch als Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die zuzugebende Menge der Stickstoffquellen beträgt üblicherweise etwa 0.1% (Gew./Vol.) bis etwa 10% (Gew./Vol.), bezogen auf die Gesamtmenge des Nährmediums.
  • Anorganische Salze können zum Beispiel Phosphate wie etwa Kaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Natriumphosphat, Dinatriumphosphat und dergleichen, Chloride wie etwa Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Kobaltchlorid-Hexahydrat und dergleichen, Sulfate wie etwa Magnesiumsulfat, Eisensulfat-Heptahydrat, Zinksulfat- Heptahydrat, Mangansulfat-Trihydrat und dergleichen sein, und die zuzugebende Menge beträgt üblicherweise etwa 0.0001% (Gew./Vol.) bis etwa 1% (Gew./Vol.), bezogen auf die Gesamtmenge des Nährmediums.
  • In einer Alternative können diese Medien im Voraus mit einer kleinen Menge einer Aminoverbindung wie etwa der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminogruppen enthaltenden Verbindungen oder der optisch aktiven Aminoverbindungen supplementiert sein, die zu einer Steigerung in der Produktion des erfindungsgemäßen Proteins durch den vorstehend beschriebenen Mikroorganismus beitragen können, und eine Aminoverbindung dient auch als Stickstoffquelle und Kohlenstoffquelle zur Züchtung eines vorstehend beschriebenen Mikroorganismus. Die Menge eines wie vorstehend beschrieben zuzugebenden Amins beträgt üblicherweise etwa 0.001% (Gew./Vol.) oder mehr, bevorzugt etwa 0.01% (Gew./Vol.) bis 1% (Gew./Vol.), bezogen auf die Gesamtmenge des Nährmediums.
  • Im Fall einer Wirtszelle, in die ein Gen, das durch Verbindung des erfindungsgemäßen Gens in einer funktionellen Weise mit einem Lactose induzierten Promotor wie etwa dem tac-Promotor, trc-Promotor, lac-Promotor und dergleichen hergestellt wurde, transduziert wird, kann ein Mittel zur Induktion der Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins wie etwa Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) zu dem vorstehend beschriebenen Nährmedium zugegeben werden.
  • Ein Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Gen kann gemäß einem üblicherweise zur Züchtung eines Mikroorganismus verwendeten Verfahrens gezüchtet werden, einschließlich einer Züchtung in Flüssigphase wie etwa Züchtung in einem Kreisschüttler, Züchtung in einem Reziprokschüttler, Gefäßfermentation ("jar fermentation") (Züchtung in einem Gefäßfermenter) und einer Züchtung in einem Tank oder einer Züchtung in der Festphase. Wenn ein Gefäßfermenter eingesetzt wird, sollte sterile Luft üblicherweise mit einer Belüftungsrate von etwa dem 0.1-fachen bis etwa 2-fachen des Kulturflüssigkeitsvolumens pro Minute in den Gefäßfermenter eingeleitet werden. Die Temperatur, bei der die Züchtung durchgeführt wird, kann in einem Bereich variieren, der das Wachstum eines Mikroorganismus gestattet und reicht üblicher-weise von etwa 15°C bis etwa 40°C und der pH-Wert des Nährmediums reicht von etwa 6 bis etwa 8. Die Züchtungszeit kann in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen variieren und beträgt üblicherweise etwa 1 Tag bis etwa 10 Tage.
  • Das erfindungsgemäße Protein, zum Beispiel von einem Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Gen hergestellt, kann in verschiedenen Formen wie etwa als Kultur eines Mikroorganismus, der das erfindungsgemäße Protein herstellt, als Zelle eines Mikroorganismus, die das erfindungsgemäße Protein herstellt, als ein durch Behandlung einer solchen Zelle erhaltenes Material, als zellfreier Extrakt eines Mikroorganismus, als grob gereinigtes Protein, als gereinigtes Protein und dergleichen zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung verwendet werden. Ein durch Behandlung einer vorstehend beschriebenen Zelle erhaltenes Material schließt zum Beispiel eine lyophylisierte Zelle, eine mit Aceton getrocknete Zelle, eine zermahlene Zelle, ein Autolysat einer Zelle, eine mit Ultraschall behandelte Zelle, eine mit Alkali behandelte Zelle, eine mit organischem Lösungsmittel behandelte Zelle und dergleichen ein. In einer Alternative kann das erfindungsgemäße Protein in einer der verschiedenen vorstehend beschriebenen Formen gemäß bekannter Verfahren wie etwa einem Verfahren mit Bindung an einen Träger, das eine Adsorption an einen anorganischen Träger wie etwa ein Silicagel oder eine Keramik, eine Cellulose oder ein Ionenaustauscherharz beinhaltet, wie auch einem Einschlußverfahren, das den Einschluß in eine polymere Matrix wie etwa ein Polyacrylamidgel, ein Schwefel enthaltendes Polysaccharidgel (z. B. ein Carrageningel), ein Alginsäuregel oder ein Agargel beinhaltet, immobilisiert werden und dann zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung verwendet werden.
  • Als Verfahren zur Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins aus einer Kultur eines Mikroorganismus mit dem erfindungsgemäßen Gen können herkömmliche, in der Proteinaufreinigung eingesetzte Verfahren wie etwa die nachfolgend beschriebenen verwendet werden.
  • Zunächst werden die Zellen aus einer Kultur eines Mikroorganismus durch Zentrifugation oder ein gleichwertiges Verfahren geerntet und dann physikalisch durch Ultraschallbehandlung, DYNOMILL-Behandlung oder Behandlung mit einer FRENCH PRESS oder chemisch durch eine grenzflächenaktive Substanz oder ein Zellen lysierendes Enzym wie etwa Lysozym zerstört. Aus der so erhaltenen Suspension wird unlösliches Material mit einem Membranfilter zur Herstellung eines zellfreien Extrakts entfernt, der dann durch ein entspre-chendes Trenn- und Reinigungsverfahren wie etwa einer Kationenaustauschchromatographie, einer Anionenaustauschchromatographie, einer hydrophoben Chromatographie, einer Gelfil-trationschromatographie und dergleichen aufgetrennt wird, wodurch das erfindungsgemäße Protein aufgereinigt wird. Die in diesen Chromatographien eingesetzten Trägermaterialien schließen zum Beispiel ein Trägerharz wie etwa Cellulose, Dextran und Agarose, verbunden mit einer Carboxymethyl (CM)-gruppe, einer Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppe, einer Phenylgruppe oder einer Butylgruppe ein. Eine im Handel erhältliche, bereits mit einem Trägermaterial wie etwa Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP (Handelsname von Amersham Pharmacia Biotech), TSK-Gel G3000SW (Handelsname, TOSOH CORPO-RATION) gepackte Säule kann ebenfalls eingesetzt werden.
  • Ein Verfahren zur Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins wird nachstehend als Beispiel erläutert.
  • Die Zellen eines Mikroorganismus, die das erfindungsgemäße Protein herstellen, werden durch Zentrifugation geerntet und dann in einem Puffer wie etwa 20 mM Bis-Tris-Propan/HCl-Puffer (pH 7.0) suspendiert. Die Suspension wird für etwa 20 Minuten mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen und die so erhaltene Suspension wird bei etwa 13000 × g für etwa 15 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der dann zur Entfernung von unlöslichen Bestandteilen über einen Membranfilter filtriert wird, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Der so erhaltene zellfreie Extrakt wird dann zum Beispiel auf eine Q-Sepharose FF-Säule (Handelsname, Amersham Pharmacia Biotech) geladen und die Säule wird mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten eluiert, um eine Reihe von Fraktionen zu erhalten. Eine das erfindungsgemäße Protein enthaltende Fraktion wird dann zum Beispiel auf eine Phenyl-Sepharose HP-Säule (Handelsname, Amersham Pharmacia Biotech) geladen und die Säule wird mit einem linearen Ammoniumsulfat-Gradienten eluiert, um eine Reihe von Fraktionen zu erhalten. Eine das erfindungsgemäße Protein enthaltende Fraktion wird über eine Ultrafiltrationsmembran oder etwas Gleichwertiges aufkonzentriert und dann zum Beispiel auf eine TSK-Gel G3000 SW-Säule (600 mm × 7.5 mm ID) (Handelsname, TOSOH CORPORATION) geladen und zum Beispiel mit einem 50 mM Natriumphosphat puffer, der 0.15 M Natriumchlorid enthält, eluiert, um eine Reihe von Fraktionen zu erhalten, wodurch das erfindungsgemäße Protein aufgereinigt wird. Die das erfindungsgemäße Protein enthaltende Fraktion kann zum Beispiel auf die Fähigkeit hin ausgewählt werden, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln.
  • Die optisch aktive Aminoverbindung (3) kann durch die Umsetzung des erfindungsgemäßen Proteins in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) mit der Ketonverbindung (1) erhalten werden (bezeichnet als "Herstellverfahren 1", wie vorstehend beschrieben).
  • In der Ketonverbindung (1) ist X1 ein gegebenenfalls substituierter C1-C9-Alkylrest (C1-C9-Alkylrest, substituierter C1-C9-Alkylrest), ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest (C6-C14-Arylrest, substituierter C6-C14-Arylrest), ein gegebenenfalls substituierter C7-C17-Arylalkylrest (C7-C17-Arylalkylrest, substituierter C7-C17-Arylalkylrest), ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest (C4-C12-Heteroarylrest, substituierter C4-C12-Heteroarylrest), ein gegebenenfalls substituierter C5-C15-Heteroarylalkylrest (C5-C15-Heteroarylalkylrest, substituierter C5-C15-Heteroarylalkylrest), eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe, eine Cyanogruppe, ein Halogenatom oder ein Wasserstoffatom. Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass die Gruppe mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einem C1-C2-Alkylthiorest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe und einem Halogenatom besteht, mit der Maßgabe, dass der Ausdruck "substituiert" auch bedeutet, dass der C6-C14-Arylrest oder der C4-C12-Heteroarylrest mit einer Carboxylgruppe substituiert ist. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Aminogruppe sowie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • R1 kann zum Beispiel ein Wasserstoffatom, ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe; eine Carboxylgruppe, ein C2-C5 (gerad- oder verzweigtkettiger)-Alkyloxycarbonylrest wie etwa eine Methoxycarbonyl-, Ethoxyvarbonyl-, Propyloxycarbonyl-Butyloxycarbonylgruppe sein.
  • In der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) ist R2 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest (C1-C6-Alkylrest, substituierter C1-C6-Alkylrest), eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe) und ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest (C7-C10-Phenylalkylrest, substituierter C7-C10-Phenylalkylrest). Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass die Gruppe mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einer Methylthiogruppe und einem Halogenatom besteht. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino- und Carboxylgruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • R3 kann zum Beispiel ein Wasserstoffatom, ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe; eine Carboxylgruppe; ein C2-C5 (gerad- oder verzweigtkettiger)-Alkyloxycarbonylrest wie etwa eine Methoxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl-, Propyloxycarbonyl-, Butyloxycarbonylgruppe sein.
  • Falls die Aminogruppen enthaltende Verbindung (2) ein asymmetrisches Kohlenstoffatom hat, kann jedes der optischen Isomere oder ein Gemisch davon entsprechend ausgewählt und verwendet werden. Die Aminogruppen enthaltende Verbindung (2) sollte eine von der optisch aktiven Aminoverbindung (3) verschiedene Verbindung sein (hier wird eine nur in der Stereoisomerie wie etwa optischen oder geometrischen Isomerien unterschiedliche Verbindung nicht als eine unterschiedliche Verbindung angesehen). Daher verwendet eine im erfindungsgemäßen Herstellverfahren 1 ausgewählte Kombination der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) und einer optisch aktiven Aminoverbindung (3) niemals R2 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2), der identisch zu X1 in der optisch aktiven Aminoverbindung (3) ist, gleichzeitig mit R3 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2), der nicht identisch mit dem -(CH2)m-R1-Rest in der optisch aktiven Aminoverbindung (3) ist.
  • Das erfindungsgemäße Herstellverfahren 1 wird üblicherweise in einer wäßrigen Pufferlösung durchgeführt, die Salze anorganischer Säuren wie etwa ein Alkalimetallphosphat wie etwa Natriumphosphat und Kaliumphosphat oder Salze organischer Säuren wie etwa ein Alkalimetallacetat wie etwa Natriumacetat und Kaliumacetat enthält und die Konzentrationen der Ketonverbindung (1) und der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) in einem Reaktionsgemisch des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens 1 sind üblicherweise 30% (Gew./Vol.) oder niedriger, bevorzugt 0.01 bis 20% (Gew./Vol.). Das Gewichtsverhältnis der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) zu der Ketonverbindung (1) ist üblicherweise 0.01 bis 100, wobei das Gewichtsverhältnis der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) zu der Ketonverbindung (1) so relativ hoch wie 10 bis 100 zum Zweck einer vorteilhaften Reaktionsrate und einer höheren Ausbeute der optisch aktiven Aminoverbindung (3) sein kann. Die Menge des erfindungsgemäßen Proteins kann in Abhängigkeit von der Reaktionszeit und der Selektivität für die hergestellte optisch aktive Aminoverbindung (3) variieren. Wenn das erfindungsgemäße Protein als aufgereinigtes oder grob aufgereinigtes Enzym verwendet wird, beträgt die Menge üblicherweise die 0.001- bis 2-fache derjenigen der Ketonverbindung (1), bevorzugt die 0.002- bis 0.5-fache, und wenn es als Kultur eines Mikroorganismus, einer nicht behandelten oder behandelten Zelle eines Mikroorganismus verwendet wird, dann beträgt die Menge üblicherweise die 0.01- bis 200-fache derjenigen der Ketonverbindung (1), bevorzugt die 0.1- bis 50-fache. Die Reaktionstemperatur beträgt übli cherweise 10 bis 70°C, bevorzugt 20 bis 60°C. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs beträgt üblicherweise 4 bis 12, bevorzugt 5 bis 11. Die Reaktionszeitdauer kann wie gewünscht variieren und beträgt üblicherweise 1 Stunde bis 7 Tage.
  • Ein Reaktionssystem des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens 1 kann weiterhin ein Hilfsmittel wie etwa ein grenzflächenaktives Mittel, ein Coenzym und ein organisches Lösungsmittel enthalten, um die Reaktionszeitdauer zu verkürzen und die Ausbeute der optisch aktiven Aminoverbindung (3) zu steigern und diese Hilfsmittel können wie erforderlich alleine oder in Kombination miteinander zu einem Reaktionsgemisch zugegeben werden. Das grenzflächenaktive Mittel, das verwendet werden kann, schließt zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, Polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether, Cetylpyridiniumbromid und dergleichen ein und das Coenzym schließt zum Beispiel ein Pyridoxal-5-phosphat (PLP) und dergleichen ein. Das organische Lösungsmittel schließt zum Beispiel ein Alkan wie etwa n-Heptan, Cyclohexan und Isooctan, einen Ether wie etwa Methyl-tert.-butylether, einen Alkohol wie etwa Methanol, Isopropanol und n-Octanol, ein Sulfoxid wie etwa DMSO und dergleichen ein.
  • Die mit dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren 1 erhaltene optisch aktive Aminoverbindung (3) kann durch bekannte Verfahren aus einem Reaktionsgemisch isoliert werden. Zum Beispiel wird eine Kultur eines Mikroorganismus oder eine behandelte oder nicht behandelte Zelle dieses Mikroorganismus aus dem Reaktionsgemisch durch eine Zentrifugation abgetrennt, um einen Überstand zu erhalten, auf den dann Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie angewendet werden, um die optisch aktive Aminoverbindung (3) zu liefern, oder der dann angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Diethylether und Toluol extrahiert wird, um eine organische Phase zu entfernen, und dann wird eine wäßrige Phase basisch gemacht und in ähnlicher Weise mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, um eine wäßrige Phase zu entfernen, und dann wird das Lösungsmittel unter verrin-gertem Druck abgezogen und eine weitere Aufreinigung wird, falls erforderlich, durchgeführt, zum Beispiel durch eine Destillation, um die optisch aktive Aminoverbindung (3) zu liefern.
  • Die optisch aktive Aminoverbindung (6) wird durch die Umsetzung des erfindungsgemäßen Proteins in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (5) mit der Ketonverbindung (4) erhalten (bezeichnet als "Herstellverfahren 2", wie vorstehend beschrieben).
  • In der Ketonverbindung (4) ist X2 eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe), eine gegebenenfalls substituierte Naphthylgruppe (Naphthylgruppe, substituierte Naphthylgruppe). Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass eines oder mehrere Wasserstoffatome in einer Phenyl- oder Naphthylgruppe, üblicherweise 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Phenylgruppe und 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Naphthylgruppe mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Methylendioxygruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe und einem Halogenatom besteht. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino- und Carboxylgruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • R4 ist ein C1-C6-Alkylrest, bevorzugt ein C1-C3-Alkylrest, stärker bevorzugt eine Methyl- und Ethylgruppe.
  • Die Ketonverbindung (4) kann zum Beispiel Acetophenon, 2-Methoxyacetophenon, 3-Methoxyacetophenon, 2,4-Dichloracetophenon, 3,4-Dichloracetophenon, 3-Cyanoacetophenon, 4-Hydroxyacetophenon, 4-Methoxyacetophenon, 4-Methylacetophenon, 4-Chloracetophenon, 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)propan-2-on, 1-(4-Methoxyphenyl)propan-2-on, 1-(4-Chlorphenyl)propan-2-on, 1-(4-Hydroxyphenyl)propan-2-on, 1-(4-Methylphenyl)propan-2-on, 1-(3,4-Methylendioxyphenyl)propan-2-on, 1-Phenylpropan-l-on, α-Acetonaphthon, β-Acetonaphthon und dergleichen sein.
  • R5 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (5) ist ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest, (C1-C6-Alkylrest, substituierter C1-C6-Alkylrest), eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe), ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest (C7-C10-Phenylalkylrest, substituierter C7-C10-Phenylalkylrest) und dergleichen.
  • Ein C1-C6-Alkylrest kann zum Beispiel ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl-, Pentyl-, Hexylgruppe sein und ein C7-C10-Phenylalkylrest kann zum Beispiel ein C7-C10-Phenyl (gerad- oder verzweigtkettig)-alkylrest wie etwa eine Benzyl-, 2-Phenylethyl-, 3-Phenylpropyl-, 4-Phenylbutyl-, α-Methylbenzylgruppe sein.
  • Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass eines oder mehrere Wasserstoffatome in einem C1-C6-Alkylrest, einer Phenylgruppe oder einem C7-C10-Phenylalkylrest, üblicherweise 1 bis 2 Wasserstoffatome eines C1-C6-Alkylrests, 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Phenylgruppe oder 1 bis 3 Wasserstoffatome eines C7-C10-Phenylalkylrests mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einer Methylthiogruppe und einem Halogenatom besteht, bevorzugt einer Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino-, Carboxyl-, Methylthiogruppe und Fluor-, Chlor und Bromatomen.
  • Ein substituierter C1-C6-Alkylrest kann zum Beispiel eine Carboxymethyl-, Carboxyethyl-, 1-Aminoethyl-, 3-Aminopropyl-, 4-Aminobutyl-, Hydroxymethyl-, Methylthioethylgruppe sein und eine substituierte Phenylgruppe kann zum Beispiel eine p-Hydroxyphenyl-, p-Chlorphenyl-, m,p-Dihydroxyphenylgruppe sein und ein substituierter C7-C10-Phenylalkyl rest kann zum Beispiel eine p-Hydroxyphenylethyl-, p-Chlorphenylmethyl-, 1-Phenyl-1-hydroxymethylgruppe sein.
  • R6 kann zum Beispiel ein Wasserstoffatom, ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe; eine Carboxylgruppe; ein C2-C5 (gerad- oder verzweigtkettiger)-Alkyloxycarbonylrest wie etwa eine Methoxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl-, Propyloxycarbonyl-, Butyloxycarbonylgruppe sein.
  • Die Aminogruppen enthaltende Verbindung (5) kann zum Beispiel eine α-Aminosäure wie etwa Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Asparapinsäure, Glutaminsäure, Methionin, Lysin, Serin, Leucin, Isoleucin und Phenylserin wie auch deren (C1-C4-Alkyl)ester; ein aliphatisches Amin wie etwa Propylamin, 1,2-Diaminopropan, n-Butylamin, sek.-Butylamin, 1,4-Diaminobutan, 2-Aminopentan, n-Hexylamin und 2-Aminoheptan; ein Phenylalkylamin wie etwa 1-Phenyl-ethylamin, 2-Phenylethylamin, Benzylamin, 3-Amino-1-phenylbutan und 4-Amino-1-phenylpentan; ein Aminoalkohol wie etwa 2-Amino-1-propanol und dergleichen sein. Falls die Aminogruppen enthaltende Verbindung (5) ein asymmetrisches Kohlenstoffatom hat, kann jedes der optischen Isomere oder ein Gemisch davon entsprechend ausgewählt und verwendet werden. Die Aminogruppen enthaltende Verbindung (5) sollte eine von der optisch aktiven Aminoverbindung (6) verschiedene Verbindung sein (hier wird eine nur in der Stereoisomerie wie etwa optischen oder geometrischen Isomerien unterschiedliche Verbin-dung nicht als eine unterschiedliche Verbindung angesehen). Daher verwendet eine im erfin-dungsgemäßen Herstellverfahren 2 ausgewählte Kombination der Aminogruppen enthalten-den Verbindung (5) und der optisch aktiven Aminoverbindung (6) niemals R5 in der Amino-gruppen enthaltenden Verbindung (5), der identisch zu dem X2-(CH2)n Rest in der optisch aktiven Aminoverbindung (6) ist, gleichzeitig mit R6 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (5), der identisch mit R4 in der optisch aktiven Aminoverbindung (6) ist.
  • Das erfindungsgemäße Herstellverfahren 2 kann unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen im Hinblick auf Herstellverfahren 1 durchgeführt werden.
  • Die mit dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren 2 erhaltene optisch aktive Aminoverbindung (6) kann durch bekannte Verfahren aus einem Reaktionsgemisch isoliert werden. Zum Beispiel wird eine Kultur eines Mikroorganismus, nicht behandelt oder behandelt, durch eine Zentrifugation getrennt, um dann angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Diethylether und Toluol extrahiert zu werden, um eine organische Phase zu entfernen, und dann wird eine wäßrige Phase basisch gemacht und in ähnlicher Weise mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, um eine wäßrige Phase zu entfernen, und dann wird das Lösungsmittel unter verringertem Druck abgezogen und eine weitere Aufreinigung wird, falls erforderlich, durchgeführt, zum Beispiel durch eine Destillation, um die optisch aktive Aminoverbindung (6) zu liefern.
  • Eine durch das Herstellverfahren 2 gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbare optisch aktive Aminoverbindung (6) kann eine mit einer durch Formel (6) angegebenen sterischen Konfiguration sein, wie etwa die nachstehend aufgelisteten.
  • 1-Phenylethylamin, 1-(2-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(3-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamin, 1-(3,4-Dichlorphenyl)ethylamin, 1-(3-Cyanophenyl)ethylamin, 1-(4-Hydroxyphenyl)ethylamin, 1-(4-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(4-Methylphenyl)ethylamin, 1-(4-Chlorphenyl)ethylamin, 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Methoxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Chlorphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Hydroxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Methylphenyl)-2-aminopropan, 1-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-aminopropan, 1-Phenyl-1-aminopropan, 1-(α-Naphthyl)ethylamin, 1-(β-Naphthyl)ethylamin und dergleichen.
  • Die optisch aktive Aminoverbindung (8) kann durch die Umsetzung des erfindungsgemäßen Proteins in Gegenwart der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) mit der Ketonverbindung (7) erhalten werden (bezeichnet als "Herstellverfahren 3", wie vorstehend beschrieben).
  • In der Ketonverbindung (7) ist X4 ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest (C6-C14-Arylrest, substituierter C6-C14-Arylrest), ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest (C4-C12-Heteroarylrest, substituierter C4-C12-Heteroarylrest), ein gegebenenfalls substituierter C1-C3-Alkylrest (C1-C3-Alkylrest, substituierter C1-C3-Alkylrest), eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe oder ein Wasserstoffatom.
  • Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffatome in dem Arylrest, dem Heteroarylrest oder dem Alkylrest, üblicherweise 1 bis 2 Wasserstoffatome eines C6-C14-Arylrests, 1 bis 2 Wasserstoffatome eines C4-C12-Heteroarylrests oder 1 bis 2 Wasserstoffatome eines C1-C3-Alkylrests mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Methylthiogruppe und einem Halogenatom besteht, mit der Maßgabe, dass der Ausdruck "substituiert" auch bedeutet, dass der C6-C14-Arylrest oder der C4-C12-Heteroarylrest mit einer Carboxylgruppe substituiert ist, bevorzugt einer Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino-, Methylthiogruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatomen.
  • R7 und R8 können gleich oder unterschiedlich sein und jeder repräsentiert ein Wasserstoffatom, einen C1-C3-Alkylrest oder eine Hydroxylgruppe.
  • Ein C1-C3-Alkylrest kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- und Isopropylgruppe sein.
  • p ist eine ganze Zahl von 0 bis 3 und q ist eine ganze Zahl von 0 bis 2.
  • Ein C6-C14-Arylrest kann zum Beispiel eine Phenyl- und Naphthylgruppe sein und ein C4-C12-Heteroarylrest kann zum Beispiel ein heteroaromatischer Ring, der 1 oder mehrere Schwefelatome in seinem Ringsystem enthält, wie etwa ein 2-Thienyl- und 3-Thienylrest, ein heteroaromatischer Ring, der 1 bis mehrere Stickstoffatome in seinem Ringsystem enthält, wie etwa ein 2-Indolyl-, 3-Indolyl-, 2-Imidazolyl-, 4-Imidazolyl- und 5-Imidazolylrest sein und ein C1-C3-Alkylrest kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- und Isopropylgruppe sein.
  • Die Ketonverbindung (7) kann zum Beispiel Brenztraubensäure, β-Hydroxybrenztraubensäure, 2-Keto-3-mercaptopropionsäure, 2-Keto-3-hydroxybuttersäure, 2-Keto-4-(methylthio)buttersäure, 3-Methyl-2-oxobuttersäure, 4-Methyl-2-oxovaleriansäure, 3-Methyl-2-oxovaleriansäure, Tri-methylbrenztraubensäure, Phenylbrenztraubensäure, 4-Chlorphenylbrenztraubensäure, 4-Cyanophenylbrenztraubensäure, α-Naphthylbrenztraubensäure, β-Naphthylbrenztraubensäure, p-Hydroxybenzoylameisensäure, 2-Keto-4-phenylbuttersäure, 3-(2-Thienyl)brenztraubensäure, 3-Hydroxy-3-phenylbrenztraubensäure, 4-Hydroxyphenylbrenztraubensäure, Indol-3-brenztraubensäure, Oxalessigsäure, 2-Ketosuccinamidsäure, α-Ketoglutarsäure, 2-Keto-5-amino-5-oxopentan-säure, 2-Keto-6-aminohexansäure, 2-Keto-5-guanidinopentansäure, 2-Keto-3-(4-imidazolyl)-propionsäure, 2-Ketobuttersäure, 3-Ketobuttersäure, 3-Keto-3-phenylpropionsäure und dergleichen sein.
  • Im erfindungsgemäßen Herstellverfahren 3 kann die Aminogruppen enthaltende Verbindung (2) gemäß Herstellverfahren 1 verwendet werden. Es sollte jedoch eine von der optisch aktiven Aminoverbindung (8) verschiedene Verbindung sein (hier wird eine nur in der Stereoisomerie wie etwa optischen oder geometrischen Isomerien unterschiedliche Verbindung nicht als eine unterschiedliche Verbindung angesehen). Daher verwendet eine im erfindungsgemäßen Herstellverfahren 3 ausgewählte Kombination der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2) und der optisch aktiven Aminoverbindung (8) niemals R2 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2), der identisch zu dem X4 (CR7R8)p-Rest in der optisch aktiven Aminoverbindung (8) ist, gleichzeitig mit R3 in der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (2), der identisch mit dem -(CH2)q-COOH-Rest in der optisch aktiven Aminoverbindung (8) ist.
  • Das erfindungsgemäße Herstellverfahren 3 kann unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen unter Bezug auf Herstellverfahren 1 durchgeführt werden.
  • Die durch das Herstellverfahren 3 hergestellte optisch aktive Aminoverbindung (8) kann eine mit einer durch Formel (8) angegebenen sterischen Konfiguration sein wie etwa die nachstehend aufgelisteten.
  • α-Aminosäuren wie etwa Alanin, Serin, Cystein, Threonin, Methionin, Valin, Leucin, Isoleucin, tert.-Leucin, Phenylalanin, p-Chlorphenylalanin, p-Cyanophenylalanin, α-Naphthylalanin, β-Naphthylalanin, p-Hydroxyphenylglycin, Homophenylalanin, 3-(2-Thienyl)alanin, Phenylserin, Tyrosin, Tryptophan, Asparapinsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Lysin und Arginin, Histidin, 2-Aminobuttersäure, β-Aminosäuren wie etwa 3-Aminobuttersäure und 3-Amino-3-phenylpropionsäure und dergleichen.
  • Der Anteil des Isomers der Aminoverbindung (9) kann durch Umsetzung des erfindungsgemäßen Proteins in Gegenwart der Ketonverbindung (14) mit der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) erhöht werden (bezeichnet als "Verbesserungsverfahren A", wie vorstehend beschrieben).
  • Der Ausdruck, dass der Anteil des Isomers der Aminoverbindung (9) im erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahren A erhöht wird, bedeutet, dass das Verhältnis des Isomers der Aminoverbindung (9) zu einem anderen Isomer als dem Isomer der Aminoverbindung (9) in den zwei optischen Isomeren auf der Basis eines an die Aminogruppe in einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) gebundenen asymmetrischen Kohlenstoffatoms erhöht wird.
  • In der Ketonverbindung (14) ist R2 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest (C1-C6-Alkylrest, substituierter C1-C6-Alkylrest), eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe) und ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest (C7-C10-Phenylalkylrest, substituierter C7-C10-Phenylalkylrest). Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass eine Gruppe mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einer Methylthiogruppe und einem Halogenatom besteht. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino- und Carboxylgruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • R3 kann zum Beispiel ein Wasserstoffatom, ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe; eine Carboxylgruppe; ein C2-C5 (gerad- oder verzweigtkettiger)-Alkyloxycarbonylrest wie etwa eine Methoxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl-, Propyloxycarbonal-, Butyloxycarbonylgruppe sein.
  • In der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) ist X1 ein gegebenenfalls substituierter C1-C9-Alkylrest (C1-C9-Alkylrest, substituierter C1-C9-Alkylrest), ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest (C6-C14-Arylrest, substituierter C6-C14-Arylrest), ein gegebenenfalls substituierter C7-C17-Arylalkylrest (C7-C17-Arylalkylrest, substituierter C7-C17-Arylalkylrest), ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest (C4-C12-Heteroarylrest, substituierter C4-C12-Heteroarylrest), ein gegebenenfalls substituierter C5-C15-Heteroarylalkylrest (C5-C15-Heteroarylalkylrest, substituierter C5-C15-Heteroarylalkylrest), eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe, eine Cyanogruppe, ein Halogenatom oder ein Wasserstoffatom. Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass ein Rest mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einem C1-C2-Alkylthiorest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe und einem Halogenatom besteht, mit der Maßgabe, dass der Ausdruck "substituiert" auch bedeutet, dass der C6-C14-Arylrest oder der C4-C12-Heteroarylrest mit einer Carboxylgruppe substituiert ist. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino-, und Methylthiogruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • Während das Verhältnis der als Ausgangsmaterial im erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahren A eingesetzten optischen Isomere der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) nicht im Besonderen begrenzt ist, ist es industriell vorteilhaft, ein racemisches Gemisch der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) zu verwenden, da diese Aminogruppen enthaltende Verbindung (13) häufig als racemisches Gemisch erhältlich ist.
  • Das erfindungsgemäße Verbesserungsverfahren A wird üblicherweise in einer wäßrigen Pufferlösung durchgeführt, die Salze anorganischer Säuren wie etwa ein Alkalimetallphosphat wie etwa Natriumphosphat und Kaliumphosphat und Salze organischer Säuren wie etwa ein Alkalimetallacetat wie etwa Natriumacetat und Kaliumacetat enthält und die Konzentrationen der Ketonverbindung (14) und der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) in einem Reaktionsgemisch des erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahrens A sind üblicherweise 30% (Gew./Vol.) oder niedriger, bevorzugt 0.01 bis 20% (Gew./Vol.). Das Gewichtsverhältnis der Ketonverbindung (14) zu der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) ist üblicherweise 0.01 bis 100, während das Gewichtsverhältnis einer Ketonverbindung (14) zu der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13) so relativ hoch wie 1 bis 10 zum Zweck einer vorteilhaften Reaktionsrate und einer höheren Ausbeute des Isomers der Aminoverbindung (9) sein kann. Die Menge des erfindungsgemäßen Proteins kann in Abhängigkeit von, der Reaktionszeitdauer und der Selektivität für das hergestellte Isomer der Aminoverbindung (9) variieren. Wenn das erfindungsgemäße Protein als aufgereinigtes oder grob aufgereinigtes Enzym verwendet wird, beträgt die Menge üblicherweise die 0.001- bis 2-fache derjenigen der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13), bevorzugt die 0.002- bis 0.5-fache, und wenn es als Kultur eines Mikroorganismus, nicht behandelte oder behandelte Zelle eines Mikroorganismus verwendet wird, dann beträgt die Menge üblicherweise die 0.01- bis 200-fache derjenigen der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (13), bevorzugt die 0.1- bis 50-fache. Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise 10 bis 70°C, bevorzugt 20 bis 60°C. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs beträgt üblicherweise 4 bis 12, bevorzugt 5 bis 11. Die Reaktionszeitdauer kann wie gewünscht variieren. Je länger die Reaktionszeit wird, desto höher wird das Isomerenverhältnis einer Aminoverbindung und das Ergebnis bewirkt, dass die optische Reinheit verbessert wird. Sie kann zum Beispiel etwa 1 Stunde bis 7 Tage betragen.
  • Ein Reaktionssystem des erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahrens A kann weiterhin ein Hilfsmittel wie etwa ein grenzflächenaktives Mittel, ein Coenzym und ein organisches Lösungsmittel enthalten, um die Reaktionszeitdauer zu verkürzen und die Ausbeute des Isomers der Aminoverbindung (9) zu steigern und diese Hilfsmittel können wie erforderlich allein oder in Kombination miteinander zu einem Reaktionsgemisch zugegeben werden. Das grenzflächenaktive Mittel, das verwendet werden kann, kann zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, Polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether, Cetylpyridiniumbromid und dergleichen sein und das Coenzym kann zum Beispiel ein Pyridoxal-5-phosphat (PLP) und dergleichen sein. Das organische Lösungsmittel kann zum Beispiel ein Alkan wie etwa n-Heptan, Cyclohexan und Isooctan, ein Ether wie etwa Methyl-tert.-butylether, ein Alkohol wie etwa Methanol, Isopropanol und n-Octanol, ein Sulfoxid wie etwa DMSO und dergleichen sein.
  • Das mit dem erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahren A erhaltene Isomer der Aminoverbindung (9) kann durch bekannte Verfahren aus einem Reaktionsgemisch isoliert werden. Zum Beispiel wird eine Kultur eines Mikroorganismus oder eine behandelte oder nicht behandelte Zelle dieses Mikroorganismus aus dem Reaktionsgemisch durch eine Zentrifugation abgetrennt, um einen Überstand zu erhalten, auf den dann Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie angewendet werden, um das Isomer der Aminoverbindung (9) zu liefern oder der dann angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Diethylether und Toluol extrahiert wird, um eine organische Phase zu entfernen und dann wird eine wäßrige Phase basisch gemacht und in ähnlicher Weise mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, um eine wäßrige Phase zu entfernen und dann wird das Lösungsmittel unter verringertem Druck abgezogen und eine weitere Aufreinigung wird, falls erforderlich, durchgeführt, zum Beispiel durch eine Destillation, um das Isomer der Aminoverbindung (9) zu liefern.
  • Der Anteil des Isomers der Aminoverbindung (12) kann durch Umsetzung des erfindungsgemäßen Proteins in Gegenwart der Ketonverbindung (11) mit der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (10) erhöht werden (hier im Folgenden als erfindungsgemäßes "Verbesserungsverfahren B" bezeichnet).
  • In der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (10) ist X5 eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe), eine gegebenenfalls substituierte Naphthylgruppe (Naphthylgruppe, substituierte Naphthylgruppe). Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass eines oder mehrere Wasserstoffatome in der Phenyl- oder der Naphthylgruppe, üblicherweise 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Phenylgruppe und 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Naphthylgruppe mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Methylendioxygruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe und einem Halogen atom besteht. Ein bevorzugter Substituent kann zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino- und Carboxylgruppe wie auch Fluor-, Chlor und Bromatome sein.
  • R9 ist ein C1-C6-Alkylrest, bevorzugt ein C1-C3-Alkylrest, stärker bevorzugt eine Methyl- und Ethylgruppe.
  • Die Aminogruppen enthaltende Verbindung (10) kann zum Beispiel 1-Phenylethylamin, 1-(2-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(3-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamin, 1-(3,4-Dichlorphenyl)ethylamin, 1-(3-Cyanophenyl)ethylamin, 1-(4-Hydroxyphenyl)ethylamin, 1-(4-Methoxyphenyl)ethylamin, 1-(4-Methylphenyl)ethylamin, 1-(4-Chlorphenyl)ethylamin, 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Methoxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Chlorphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Hydroxyphenyl)-2-aminopropan, 1-(4-Methylphenyl)-2-aminopropan, 1-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-aminopropan, 1-Phenyl-1-aminopropan, 1-(α-Naphthyl)ethylamin, 1-(β-Naphthyl)ethylamin und dergleichen sein.
  • Während das Verhältnis der als Ausgangsmaterial im erfindungsgemäßen Verbesserungsverfahren B eingesetzten optischen Isomere der Aminogruppen enthaltenden Verbin dung (10) nicht im Besonderen begrenzt ist, ist es industriell vorteilhaft, ein racemisches Gemisch der Aminogruppen enthaltenden Verbindung (10) zu verwenden, da diese Aminogruppen enthaltende Verbindung (10) häufig als racemisches Gemisch erhältlich ist.
  • R10 in der Ketonverbindung (11) ist ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest (C1-C6-Alkylrest, substituierter C1-C6-Alkylrest), eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe (Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe) und ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest (C7-C10-Phenylalkylrest, substituierter C7-C10-Phenylalkylrest).
  • Der hier verwendete Ausdruck "substituiert" bedeutet, dass eines oder mehrere Wasserstoffatome in dem C1-C6-Alkylrest, der Phenylgruppe oder dem C7-C10-Phenylalkylrest, üblicherweise 1 bis 2 Wasserstoffatome eines C1-C6-Alkylrests, 1 bis 2 Wasserstoffatome einer Phenylgruppe oder 1 bis 3 Wasserstoffatome eines C7-C10-Phenylalkylrests mit den gleichen oder unterschiedlichen Substituenten substituiert sind, ausgewählt aus einer Gruppe, die zum Beispiel aus einem C1-C3-Alkylrest, einem C1-C2-Haloalkylrest, einem C1-C2-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe, einer Cyanogruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einer Methylthiogruppe und einem Halogenatom besteht, bevorzugt einer Methyl-, Ethyl-, Monochlormethyl-, Trifluormethyl-, Methoxy-, Methylendioxy-, Hydroxyl-, Cyano-, Amino-, Carboxyl-, Methylthiogruppe und Fluor-, Chlor und Bromatomen.
  • Ein C1-C6-Alkylrest kann zum Beispiel ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl-, Pentyl-, Hexylgruppe sein und ein C7-C10-Phenylalkylrest kann ein C7-C10-Phenyl (gerad-, oder verzweigtkettiger)-alkylrest wie etwa eine Benzyl-, 2-Phenylethyl-, 3-Phenylpropyl-, 4-Phenylbutyl-, α-Methylbenzylgruppe sein.
  • Ein substituierter C1-C6-Alkylrest kann zum Beispiel eine Carboxymethyl-, Carboxyethyl-, 1-Aminoethyl-, 3-Aminopropyl-, 4-Aminobutyl-, Hydroxymethyl-, Methylthioethylgruppe sein und eine substituierte Phenylgruppe kann zum Beispiel eine p-Hydroxyphenyl-, p-Chlorphenyl-, m,p-Dihydroxyphenylgruppe sein und ein substituierter C7-C10-Phenylalkylrest kann eine p-Hydroxyphenylethyl-, p-Chlorphenylmethyl-, 1-Phenyl-1-hydroxymethylgruppe sein.
  • R11 kann ein Wasserstoffatom, ein gerad- oder verzweigtkettiger C1-C6-Alkylrest wie etwa eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe; eine Carboxylgruppe; ein C2-C5 (gerad- oder verzweigtkettiger)-Alkyloxycarbonylrest wie etwa eine Methoxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl-, Propyloxycarbonyl-, Butyloxycarbonylgruppe sein.
  • Die Ketonverbindung (11) kann zum Beispiel ein Keton wie etwa Aceton und 2-Butanon, ein Aldehyd wie etwa Propionaldehyd und Benzaldehyd, die Ketonsäure wie etwa Oxalessigsäure, Brenztraubensäure und α-Ketobuttersäure, ein Alkalimetallsalz der vorstehend beschrie-benen Ketonsäure wie etwa Natriumpyruvat und ein Alkylester einer Ketonsäure wie etwa Methylpyruvat und dergleichen sein.
  • Das erfindungsgemäße Verbesserungsverfahren B kann unter ähnlichen Bedingungen wie den vorstehend beschriebenen im Hinblick auf Verbesserungsverfahren A durchgeführt werden.
  • Es ist vorgesehen, dass das durch Verbesserungsverfahren B erhaltene Verhältnis eines Isomers der Aminoverbindung (12) zu einem von dem Isomer der Aminoverbindung (12) verschiedenen Isomer erhöht wird.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nicht dazu dienen sollen, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken, weiter beschrieben.
  • Die quantitative Analyse der optisch aktiven Aminoverbindung in den Beispielen 1 bis 8 wurde mit Gaschromatographie unter den nachstehend in Abschnitt (1) beschriebenen Bedingungen durchgeführt, während die Bestimmung der optischen Reinheit der Aminoverbindung mit HPLC unter den nachstehend in Abschnitt (2) beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurde. Die quantitative Analyse und die Bestimmung der optischen Reinheit der optisch aktiven Aminoverbindungen in den Beispielen 12 bis 15 wurden nach der nachstehend in Abschnit (3) beschriebenen Derivatisierung mit HPLC unter den nachstehend in Abschnitt (4) beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
  • (1) Quantitative Analyse der Aminoverbindung (Gaschromatographie)
    • – Säule: DB-17 (Innendurchmesser: 0.25 mm, Beschichtungsdicke: 0.25 μm, Länge: 30 m, J&W)
    • – Säulenbedingungen: Die Temperatur wird von 80°C auf 250°C erhöht (Rate: 5°C/min).
    • – Detektor: FID (Detektionstemperatur: 250°C)
  • (2) Bestimmung der optischen Reinheit einer Aminoverbindung (HPLC)
    • – Säule: OA-4100 oder OA-4800 (SUMIKA CHEMICAL ANALYSIS SERVICE, LTD)
    • – Laufmittel: n-Hexan:Ethanol:Trifluoressigsäure = 240:10:1
    • – Detektionswellenlänge: 254 nm
  • (3) Derivatisierung einer Aminoverbindung
  • 50 μl eines Reaktionsgemischs werden mit 100 μl einer 4 mg/ml Lösung von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-glucopyranosyl-isothiocyanat (GITC, WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD) in Acetonitril und 50 μl einer 2 mg/ml Lösung von Triethylamin in Acetonitril versetzt und bei 30°C für 30 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wird durch einen 0.2 μm-Filter filtriert, um ein Filtrat zu erhalten, das als Probe für eine HPLC verwendet wird.
  • (4) Quantitative Analyse und Bestimmung der optischen Reinheit einer Aminoverbindung (HPLC)
    • – Säule: SUMIPACKS ODS L-03-4615 (SUMIKA CHEMICAL ANALYSIS SERVICE, LTD)
    • – Säulentemperatur: 35°C
    • – Flussrate: 1 ml/min
    • – Detektionswellenlänge: UV 254 nm
    • – Elutionsmittel A: 20 mM KH2PO4 (pH 3.7)
    • – Elutionsmittel B: Acetonitril
    • – Elutionsbedingung: Das Verhältnis von B im Elutionsmittel variiert von 10% bis 60% in Abhängigkeit der Analyten.
  • Beispiel 1 (Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins)
    • (1) Ein 500 ml-Sakaguchikolben mit 100 ml sterilisiertem Nährmedium (pH 7.0) mit 0.2% (Gew./Vol.) Glycerin, 0.1% (Gew./Vol.) Natriumpyruvat, 0.2% (Gew./Vol.) (R)-1-Phenylethylamin, 0.45% (Gew./Vol.) Dikaliumphosphat, 0.3% (Gew./Vol.) Kaliumphosphat, 0.01% (Gew./Vol.) Magnesiumsulfat, 0.0001% (Gew./Vol.) Eisensulfat-Heptahydrat, 0.0001% (Gew./Vol.) Zinksulfat-Heptahydrat, 0.0001% (Gew./Vol.) Mangansulfat-Trihydrat und 0.0001% (Gew./Vol.) Cobaltchlorid-Hexahydrat wurde mit 1 mL einer Kultur des Mycobacterium aurum-Stamms SC-S423 angeimpft, der zuvor in einem Nährmedium ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet worden war, und bei 30°C für 7 Tage unter reziprokem Schütteln inkubiert wurde. 4 L der so erhaltenen Kultur wurden zur Ernte der Zellen zentrifugiert (10000 × g, 10 Minuten) und die so erhaltenen feuchten Zellen wurden zweimal mit 100 mL 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) gewaschen, um 18 g feuchter Zellen zu erhalten.
    • (2) 16 g der so erhaltenen feuchten Zellen wurden in 60 ml 20 mM Bis-Tris-Propan/HCl-Puffer (pH 7.0) mit 20 μM Pyridoxal-5-phosphat (PLP) suspendiert. Die Suspension wurde durch Ultraschallbehandlung für 20 Minuten aufgeschlossen (SONIFIER, Handelsname von Branson Sonic Power) und dann zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert (bei 13000 × g für 15 Minuten). Der erhaltene Überstand wurde durch einen Membranfilter (0.45 μm) filtriert, um ein Filtrat zu erhalten, das als zellfreier Extrakt verwendet wurde. Dieser zellfreie Extrakt wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (26 mm ϕ × 10 cm, Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen und mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten (Gradientenrate: 0.01 M/min, Natriumchlorid-Konzentration: von 0 M bis 0.6 M, Flussrate: 8 ml/min) in 20 mM Bis-Tris-Propan/HCl-Puffer (pH 7.0) eluiert. Eine über 0.35 M bis 0.45 M Natriumchlorid eluierte 80 ml-Fraktion wurde aufgefangen. 63 ml dieser Fraktion wurden mit Ammoniumsulfat in einer Endkonzentration von 0.8 M versetzt und auf eine Phenyl-Sepharose HP-Säule (16 mm ϕ × 10 cm, Amersham Pharmacia Biotech) geladen und mit einem linearen Ammoniumsulfat-Gradienten (Gradientenrate: 0.008 M/min, Ammoniumsulfat-Konzentration: von 0.8 M bis 0 M, Flussrate: 3 ml/min) in 20 mM Bis-Tris-Propan/HCl-Puffer (pH 7.0) eluiert. Eine über 0.4 M bis 0.35 M Ammoniumsulfat eluierte 24 ml-Fraktion wurde aufgefangen und als Enzymlösung verwendet.
    • (3) Die wie in Abschnitt (2) beschrieben erhaltene Enzymlösung wurde mit einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gel: PhastGel Gradient 10–15, Pufferstreifen: PhastGel SDS-Pufferstreifen, System: Phast System, alle von Amersham Pharmacia Biotech) analysiert, die praktisch nur eine einzelne Bande zeigte. Darüberhinaus wurde die Enzymlösung auf eine Gelfiltrationssäule TSK-Gel G3000SW (600 mm × 7.5 mm ID, Tosoh Corporation) geladen und mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.0) mit 0.15 M Natriumchlorid eluiert. Als Ergebnis wurde eine Aktivität zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung in einer Fraktion nachgewiesen, die an einer Position eluiert wurde, die ein Molekulargewicht von etwa 310 kDa anzeigte.
  • Beispiel 2
  • 200 μl der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung wurden mit 200 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) verdünnt und zu 800 μl einer 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0)-Lösung mit 10 μMol Acetophenon, 100 μMol eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) zugegeben und das Gemisch wurde bei 40°C für 71 Stunden gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde eine optisch aktive Aminoverbindung im Reaktionsgemisch quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ausbeute von 1-Phenylethylamin bei 19.9% lag, wobei der Anteil des optischen Isomers der R-Form bei 100% lag.
  • Beispiel 3
  • 200 μl der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung wurden mit 200 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) verdünnt und zu 800 μl einer 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0)-Lösung mit 10 μMol Acetophenon, 100 μMol D-Alanin und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) zugegeben und das Gemisch wurde bei 40°C für 3 Stunden gehalten. Danach wurde ein Aliquot des Reaktionsgemischs der Quantifizierung der Aminoverbindung unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ausbeute von 1-Phenylethylamin bei 2.6% lag, wobei der Anteil des optischen Isomers der R-Form bei 100% lag.
  • Beispiel 4
  • 360 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6) mit 5 μMol eines racemischen Gemischs der in Tabelle 1 gezeigten Aminoverbindungen, 10 μMol Natriumpyruvat und 0.01 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) wurden mit 140 μl der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung versetzt, wenn 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch der Aminoverbindung verwendet wurde, oder mit 140 μl der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung, die 2-fach mit 0.1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6) verdünnt worden war, versetzt, wenn 1-(3,4-Dichlorphenyl)ethylamin oder 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-2-aminopropan verwendet wurde, und das Gemisch wurde bei 40°C für 1 Stunde umgesetzt. Das im Reaktionsgemisch verbleibende Verhältnis der optischen Isomere der Aminoverbindung wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00330001
  • Beispiel 5
    • (1) Ein 500 ml-Sakaguchikolben mit 100 ml sterilisiertem Nährmedium mit 0.2% (Gew./Vol.) Glycerin, 0.1% (Gew./Vol.) Natriumpyruvat, 0.2% (Gew./Vol.) (R)-1-Phenylethylamin, 0.45% (Gew./Vol.) Dikaliumphosphat, 0.3% (Gew./Vol.) Kaliumphosphat, 0.01% (Gew./Vol.) Magnesiumsulfat, 0.0001% (Gew./Vol.) Eisensulfat-Heptahydrat, 0.0001% (Gew./Vol.) Zinksulfat-Heptahydrat, 0.0001% (Gew./Vol.) Mangansulfat-Trihydrat und 0.0001% (Gew./Vol.) Cobaltchlorid-Hexahydrat wurde mit 1 mL einer Kultur des Mycobacterium aurum-Stamms SC-S423 angeimpft, der zuvor in einem Nährmedium ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet worden war, und bei 30°C für 7 Tage unter reziprokem Schütteln inkubiert wurde.
    • (2) Die so erhaltene Kultur wurde zur Ernte der feuchten Zellen zentrifugiert (10000 × g, 10 Minuten).
    • (3) Die so erhaltenen feuchten Zellen wurden in 2 ml 100 mM Glycinpuffer (pH 9.0) suspendiert. 1260 μl einer 0.2%-igen (Vol./Vol.) wäßrigen Lösung (pH 9.0) von 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch wurden mit 200 μl einer 2.2%-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Natriumpyruvatlösung, 440 μl 100 mM Glycinpuffer (pH 9.0) und 100 μl der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Zellsuspension versetzt und bei 30°C für 21.5 Stunden inkubiert. Ein Aliquot des Reaktionsgemischs wurde mit dem doppelten Volumen Methanol versetzt und gründlich gerührt und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen und einen Über-stand zu erhalten, der dann einer Gaschromatographie unterzogen wurde, die zeigte, dass 54% des 1-Phenylethylamins verschwunden waren. Das verbleibende Reaktionsgemisch wurde mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 12 eingestellt und dann wurde das verbliebene 1-Phenylethylamin in Diethylether extrahiert. Die optische Reinheit des 1-Phenylethylamins im Extrakt wurde mit HPLC bestimmt und die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis der (R)-Form zur (S)-Form 0 zu 100 betrug.
  • Beispiel 6
    • (1) 1 L einer Kultur, die durch Züchtung von 10 500 ml-Sakaguchikolben in einer der in Abschnitt (1) von Beispiel 5 ähnlichen Weise erhalten wurde, wurde zur Ernte der Zellen zentrifugiert (10000 × g, 10 Minuten) und die erhaltenen feuchten Zellen wurden in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert.
    • (2) 630 μl einer wäßrigen Lösung von 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch, die durch Lösen von 200 μl 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch und 900 μl einer 2 N wäßrigen Schwefelsäurelösung in 100 ml destilliertem Wasser erhalten wurde, wurden mit 100 μl einer 2.2%-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Natriumpyruvatlösung versetzt und weiter mit 100 μl eines 1 M Puffers bei jedem der verschiedenen pH-Werte (eingesetzt wurden Citratpuffer bei pH-Wert 5 bis 6, Kaliumphosphatpuffer bei pH-Wert 6 bis 8, Tris-HCl-Puffer bei pH-Wert 8 bis 9, Glycinpuffer bei pH-Wert 9 bis 10, Carbonatpuffer bei pH-Wert 11) und 70 μl destilliertem Wasser versetzt und dann mit 100 μl der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Zellsuspension versetzt, um die Reaktion zu starten. Nach Inkubation bei 30°C für 1 Stunde wurde ein Aliquot des Reaktionsgemischs mit dem doppelten Volumen Methanol versetzt, gründlich gerührt, zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, der dann einer Gaschromatographie unterzogen wurde. Die Rate der Abnahme der Aminoverbindung wurde als relativer Wert bezogen auf den Wert 100 bei pH-Wert 6 (Citratpuffer) verglichen.
  • Tabelle 3
    Figure 00360001
  • Beispiel 7
  • 630 μl einer wäßrigen Lösung von 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch, die durch Lösen von 200 μl 1-Phenylethylamin als racemisches Gemisch und 900 μl einer 2 N wäßrigen Schwefelsäurelösung in 100 ml destilliertem Wasser erhalten wurde, wurden mit 100 μl einer 2.2%-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Natriumpyruvatlösung versetzt und weiter mit 100 μl Glycinpuffer bei pH-Wert 9 und 70 μl destilliertem Wasser versetzt und dann mit 100 μl einer Zellsuspension, die in einer der in Abschnitt (1) von Beispiel 6 ähnlichen Weise erhalten wurde, vereinigt, um die Reaktion zu starten. Nach Inkubation bei jeder Temperatur im Bereich von 20°C bis 60°C für 1 Stunde wurde ein Aliquot des Reaktionsgemischs mit dem doppelten Volumen Methanol versetzt. Das Gemisch wurde gründlich gerührt, zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, der dann einer Quantifizierung mit Gaschromatographie unterzogen wurde. Die Rate der Abnahme der Aminoverbindung wurde als relativer Wert bezogen auf den Wert 100 bei 50°C verglichen.
  • Tabelle 4
    Figure 00370001
  • Beispiel 8
  • 1370 μl einer 0.02%-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung (pH 9.0) von 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamin als racemisches Gemisch wurden mit 200 μl einer 2.2%-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Natriumpyruvatlösung und 230 μl 100 mM Glycinpuffer (pH 9.0) versetzt und dann mit 200 μl der in Abschnitt (1) von Beispiel 6 erhaltenen Zellsuspension versetzt und bei 30°C für 110 Stunden inkubiert. Ein Aliquot des Reaktionsgemischs wurde mit dem doppelten Volumen Methanol versetzt und gründlich gerührt und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, der dann einer Quantifizierung mit Gaschromatographie unterzogen wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass 46% des 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamin verschwunden waren. Das verbleibende Reaktionsgemisch wurde mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 12 eingestellt und dann wurde das verbliebene 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamin in Diethylether extrahiert. Die optische Reinheit des 1-(2,4-Dichlorphenyl)ethylamins im Extrakt wurde mit HPLC bestimmt und die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis der (R)-Form zur (S)-Form 20 zu 80 betrug.
  • Beispiel 9
  • 2 ml der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung wurde viermal einer HPLC auf einer Umkehrphasensäule unterzogen. Die HPLC mit der Umkehrphasensäule wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
  • [Bedingungen der Umkehrphasen-HPLC]
    • – Säule: Protein-RP, 250 mm × 4.6 mm ID, Teilchengröße: 5 μm (YMC(KK))
    • – Säulentemperatur: Raumtemperatur
    • – Flussrate: 1 ml/min
    • – Detektion: UV 230 nm
    • – Elutionsmittel A: Destilliertes Wasser mit 0.1% Trifluoressigsäure
    • – Elutionsmittel B: Acetonitril mit 0.08% Trifluoressigsäure
    • – Elutionsbedingungen: Eine Probe wurde auf eine mit Elutionsmittel A äquilibrierte Säule aufgetragen und dann wurde der Anteil von Elutionsmittel B von 0% auf 80% über einen Zeitdauer von 40 Minuten erhöht, wodurch eine Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Elutionsmittel A und Elutionsmittel B bewirkt wurde.
  • Eine bei einem Anteil von Elutionsmittel B von etwa 60% eluierte Fraktion wurde erhalten. Die erhaltene Fraktion (3 mL-Aliquot) wurde lyophilisiert und ein Teil der lyophilisierten Probe wurde auf ein Gasphasen-Proteinsequenziergerät 470 A (APPLIED BIOSYSTEMS) gegeben, um die Aminosäuresequenz des Aminoterminus des erfindungsgemäßen Proteins zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemäße Protein eine von Sequenz ID Nr. 3 repräsentierte Aminosäuresequenz besitzt.
  • Der Rest der lyophilisierten Probe wurde in destilliertem Wasser gelöst und mit 2 μl einer 1 mg/ml Trypsinlösung versetzt und bei 37°C für 24 Stunden gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde die Lösung einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, um die Trypsin gespalte-nen Fragmente zu isolieren und aufzureinigen. Die Bedingungen der Umkehrphasen-HPLC waren, wie nachstehend beschrieben.
  • [Bedingungen der Umkehrphasen-HPLC]
    • – Säule: ODS-A211, 250 mm × 4.6 mm ID, Teilchengröße: 5 μm (SUMIKA CHEMICAL ANALYSIS SERVICE, LTD)
    • – Säulentemperatur: Raumtemperatur
    • – Flussrate: 1 ml/min
    • – Detektion: UV 230 nm
    • – Elutionsmittel A: 0.1% Trifluoressigsäure/Wasser
    • – Elutionsmittel B: 0.08% Trifluoressigsäure/Acetonitril
  • Elutionsbedingungen: Eine Probe wurde auf eine mit einem Lösungsmittelgemisch aus 95% Elutionsmittel A:5% Elutionsmittel B äquilibrierte Säule aufgetragen und der Anteil von Elutionsmittel B auf 65% über eine Zeitdauer von 60 Minuten erhöht, wodurch eine Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus Elutionsmittel A und Elutionsmittel B bewirkt wurde.
  • Jedes erhaltene Trypsin gespaltene Fragment wurde in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, auf seine Aminosäuresequenz untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die gespaltenen Fragmente die von Sequenz ID Nrn. 4 und 5 repräsentierten Aminosäuresequenzen besaßen.
  • Beispiel 10 (Gewinnung einer DNA mit einer partiellen Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens)
  • (1) Isolierung chromosomaler DNA des Mycobacterium aurum-Stamms SC-S423
  • Ein sterilisiertes Nährmedium mit 0.5% (Gew./Vol.) Glucose, 1.0% (Gew./Vol.) Pepton, 1.25% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 1.0% (Gew./Vol.) Malzextrakt und 0.5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid wurde mit dem Mycobacterium aurum-Stamm SC-S423 angeimpft und für 64 Stunden gezüchtet und dann wurden 1000 mL der erhaltenen Kultur zur Ernte der Zellen zentrifugiert. Die so erhaltenen Zellen wurden in 900 ml sterilisiertem Nährmedium mit 100 μg/ml D-Cycloserin, 1.4% (Gew./Vol.) Glycin, 60 mM EDTA und 200 μg/ml Lysozym resuspendiert und bei 30°C für 21 Stunden inkubiert.
  • 900 ml dieser erhaltenen Suspension wurde zur Ernte der Zellen zentrifugiert. Die so erhaltenen Zellen wurden in 10 ml einer Pufferlösung (pH 8.0, 50 mM Tris, 50 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid) resuspendiert. Zu der Suspension wurde SDS in einer Endkonzentration von 0.5% zugegeben und weiterhin wurde Proteinase K (Boehringer Mannheim) in einer Endkonzentration von 200 μg/ml zugegeben und das Gemisch wurde bei 55°C für 18 Stunden inkubiert.
  • Aus der Suspension wurde die DNA nach Inkubation mit einem Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Verfahren extrahiert und die extrahierte Fraktion wurde mit Ethanol versetzt, der auf –20°C gehalten worden war und die ausfallende DNA wurde auf einen Glasstab gewickelt. Diese DNA wurde luftgetrocknet, in einer TE-Pufferlösung (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) gelöst, zu der eine RNase in einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt wurde, und bei 37°C für 1 Stunde gehalten. Dies wurde als chromosomale DNA-Probe eingesetzt.
  • (2) Primersynthese
  • Auf der Basis der von Sequenz ID Nr. 4 repräsentierten Aminosäuresequenz wurde ein Gemisch (hier im Folgenden als Primer G-24-1 bezeichnet) des Oligonucleotids mit einer von Sequenz ID Nr. 6 repräsentierten Nucleotidsequenz synthetisiert. Ebenso wurde auf Basis der von Sequenz ID Nr. 5 repräsentierten Aminosäuresequenz ein Gemisch (hier im Folgenden als Primer RG32-1 bezeichnet) des Oligonucleotids mit einer von Sequenz ID Nr. 7 repräsentierten Nucleotidsequenz synthetisiert. Die Oligonucleotidsynthese wurde mit einem automatischen DNA-Synthesegerät Modell 380 A (APPLIED BIOSYSTEMS) durchgeführt.
  • (3) PCR-Amplifizierung und Clonierung der DNA mit einer partiellen Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens [I]
  • Mit dem in Abschnitt (2) von Beispiel 10 synthetisierten Primer G24-1 und Primer RG32-1 wurde eine PCR durchgeführt, in der die in Abschnitt (1) von Beispiel 10 hergestellte chromosomale DNA als Matrize eingesetzt wurde. Die PCR wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des von CLONTECH erhältlichen Advantage cDNA PCR-Kits hergestellt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionssgemischs]
    • Chromosomale DNA-Probe (1 ng/μl) 1 μl
    • Primer (je 10 μM) Je 0.5 μl × 2 Typen
    • × 50 dNTPs-Mix (je 10 mM) 0.5 μl
    • × 10 cDNA-PCR-Reaktionspuffer 2.5 μl
    • × 50 Advantage cDNA Polymerase-Mix 0.5 μl
    • Steriles redestilliertes Wasser 19.5 μl
  • [Temperaturbedingungen]
    • 1) 94°C 1 Minute
    • 2) 94°C 30 Sekunden
    • 3) 68°C 3 Minuten
    • 4) 94°C 20 Sekunden
    • 5) 68°C 3 Minuten
    • 6) 68°C 3 Minuten
  • Ein Zyklus, bestehend aus den Schritten 4) und 5), wurde 34-mal wiederholt.
  • Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und die Produkte wurden untersucht und die Ergebnisse zeigten, dass etwa 800 bp DNA amplifiziert wurden. Diese DNA wurde in eine "PCR-Produkt-Insertionsstelle" des Plasmidvektors pCRII mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) ligiert und die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm JM109 (unter Verwendung hoch kompetenter JM109 von TOYOBO Co., Ltd.) transduziert, um Transformanten zu erhalten.
  • Daraufhin wurde die Plasmid-DNA, die die erhaltene Transformante besaß, isoliert und mit einem Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit und einem automatischen Nucleotid-Sequenziergerät, Modell 373 A, sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Plasmid eine DNA mit einer Nucleotidsequenz (730 bp) der Nucleotidpositionen Nrn. 231 bis 960 in der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz enthielt.
  • (4) PCR-Amplifizierung und Clonierung der DNA mit einer partiellen Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens [II]
  • Auf der Basis der in Abschnitt (3) von Beispiel 10 erhaltenen Nucleotidsequenz von 730 bp wurde ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 8 repräsentierten Nucleotidsequenz synthetisiert.
  • Eine nach dem in Abschnitt (1) von Beispiel 10 beschriebenen Verfahren isolierte chromosomale DNA wurde partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3AI gespalten und in die multiple Clonierungsstelle des Plasmidvektors pUC118 ligiert. Dann wurde eine PCR mit der ligierten DNA als Matrize und einem Oligonucleotid mit der von Sequenz ID Nr. 8 repräsentierten Nucleotidsequenz und dem RV-Primer (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) als Primer durchgeführt. Die PCR wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des von CLONTECH erhältlichen Advantage cDNA PCR-Kits hergestellt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionsgemischs]
    • Matrizen-DNA 5 μl
    • Primer (je 10 μM) Je 1 μl × 2 Typen
    • × 50 dNTP-Mix (je 10 mM) 1 μl
    • × 10 cDNA-PCR-Reaktionspuffer 5 μl
    • × 50 Advantage cDNA Polymerase-Mix 1 μl
    • Steriles redestilliertes Wasser 36 μl
  • [Temperaturbedingungen]
    • 1) 94°C (1 Minute)
    • 2) 94°C (0.5 Minuten)
    • 3) 68°C (3 Minuten)
    • 4) 68°C (3 Minuten)
  • Ein Zyklus, bestehend aus den Schritten 2) und 3), wurde 30-mal wiederholt.
  • Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unter zogen und die Produkte wurden untersucht und die Ergebnisse zeigten, dass etwa 1 kbp DNA amplifiziert wurde. Diese DNA wurde in die "PCR-Produkt-Insertionsstelle" des Plasmidvektors pCRII mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) ligiert und die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm JM109 (unter Verwendung hoch kompetenter JM109 von TOYOBO Co., Ltd.) transduziert, um Transformanten zu erhalten.
  • Daraufhin wurde die Plasmid-DNA, die die erhaltene Transformante besaß, isoliert und in ähnlicher Weise wie in Abschnitt (3) von Beispiel 10 sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Plasmid eine Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nrn. 1 bis 230 in der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz enthielt.
  • (5) PCR-Amplifizierung und Clonierung der DNA mit einer partiellen Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens [III]
  • Auf der Basis der in Abschnitt (3) von Beispiel 10 erhaltenen Nucleotidsequenz von 730 bp wurden ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 9 repräsentierten Nucleotidsequenz und ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 10 repräsentierten Nucleotidsequenz synthetisiert.
  • Eine nach dem in Abschnitt (1) von Beispiel 10 beschriebenen Verfahren isolierte chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und mit einer EcoRI-Kassette (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines von TaKaRa erhältlichen Takara LA PCR in vitro-Clonierungskits hergestellt. Die verwendeten Bedingungen waren wie folgt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionsgemischs]
    • Restriktionsenzym behandelte DNA 5 μl
    • EcoRI- Kassette 2.5 μl (20 ng/μl)
    • Ligierungskit Ver2 Lsg. I 15 μl
    • Ligierungskit Ver2 Lsg. II 7.5 μl
  • Nach Umsetzung bei 16°C für 30 Minuten wurde die DNA durch eine Ethanolfällung erhalten und in 5 μl TE-Puffer gelöst.
  • 1 μl der so erhaltenen DNA-Lösung wurde mit 13.5 μl sterilem redestilliertem Wasser gemischt und bei 94°C für 10 Minuten erhitzt. Damit als Matrize und mit dem Oligonucleotid mit der von Sequenz ID Nr. 9 repräsentierten Nucleotidsequenz und dem Kassettenprimer C1 (TaKaRa) als Primer wurde die PCR durchgeführt. Die PCR wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des von TaKaRa erhältlichen Takara LA PCR in vitro-Clonierungskits hergestellt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionsgemischs]
    • Matrizen-DNA 14.5 μl
    • Primer (je 10 μM) Je 1 μl × 2 Typen
    • dNTPs 8 μl
    • × 2 GC-Puffer 25 μl
    • LA Taq 0.5 μl (2.5 U)
  • [Temperaturbedingungen]
    • 1) 94°C (0.5 Minuten)
    • 2) 55°C (2 Minuten)
    • 3) 72°C (3 Minuten)
  • Ein Zyklus, bestehend aus den Schritten 1) bis 3), wurde 30-mal wiederholt.
  • Daraufhin wurde das Gemisch nach der vorstehend beschriebenen Reaktion 10-fach verdünnt und ein 1 μl-Aliquot wurde als Matrize verwendet und ein Oligonucleotid mit der von Sequenz ID Nr. 10 repräsentierten Nucleotidsequenz und der Kassettenprimer C2 (TaKaRa) wurden als Primer verwendet, um die PCR durchzuführen. Die PCR wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des von TaKaRa erhältlichen Takara LA PCR in vitro-Clonierungskits hergestellt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionsgemischs]
    • Matrizen-DNA 1 μl
    • Primer (je 10 μM) Je 1 μl × 2 Typen
    • dNTPs 8 μl
    • × 2 GC-Puffer 25 μl
    • LA Taq 0.5 μl (2.5 U)
    • Steriles redestilliertes Wasser 13.5 μl
  • [Temperaturbedingungen]
    • 1) 94°C (0.5 Minuten)
    • 2) 55°C (2 Minuten)
    • 3) 72°C (3 Minuten)
  • Ein Zyklus, bestehend aus den Schritten 1) bis 3), wurde 30-mal wiederholt.
  • Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und die Produkte wurden untersucht und die Ergebnisse zeigten, dass etwa die DNA amplifiziert wurde. Dieses DNA-Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in den pT7blue T-Vektor (Novagen) cloniert. Die DNA eines erhaltenen Plasmids wurde isoliert und in ähnlicher Weise wie in Abschnitt (3) von Beispiel 10 einer Nucleotidsequenzierung unterzogen. Als Ergebnis zeigte sich, dass dieses Plasmid eine Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nrn. 961 bis 1020 der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz enthielt (einen Teil der C-terminalen Seite).
  • Die Ergebnisse von Beispiel 10 (3) bis (5) zeigten, dass ein von Mycobacterium aurum SC-S423 abgeleitetes Gen eine von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierte Nucleotidsequenz enthält.
  • Beispiel 11 (Gewinnung einer modifizierten Gen-DNA)
  • Auf der Basis der in den Abschnitten (3) bis (5) von Beispiel 10 erhaltenen, von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz wurden ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 11 repräsentierten Nucleotidsequenz (hier im Folgenden als Primer F-4/NcoI bezeichnet) und ein Oligonucleotid mit einer von Sequenz ID Nr. 12 repräsentierten Nucleotidsequenz (hier im Folgenden als Primer R1030/BamHI bezeichnet) synthetisiert.
  • Mit Primer F-4/NcoI und Primer R1030/BamHI zusammen mit der nach dem in Abschnitt (1) von Beispiel 10 beschriebenen Verfahren hergestellten chromosomalen DNA als Matrize wurde eine PCR durchgeführt. Die PCR wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des von Boehringer Mannheim erhältlichen Expand High Fidelity PCR-Sytems hergestellt.
  • [Zusammensetzung des Reaktionsgemischs]
    • Genomische DNA-Vorratslösung (0.1 μg/μl) 1 μl
    • Primer (je 4 pMol/μl) Je 5 μl × 2 Typen
    • dNTPs-Mix (je 2.5 mM) 8 μl
    • × 10 Expand HF-Puffer mit 15 mM MgCl2 10 μl
    • Expand High Fidelity PCR-System-Enzymmix 0.75 μl
    • Steriles redestilliertes Wasser 71 μl
  • [Temperaturbedingungen]
    • 1) 95°C (2 Minuten)
    • 2) 96°C (15 Sekunden)
    • 3) 60°C (15 Sekunden)
    • 4) 72°C (1 Minute)
    • 5) 72°C (10 Minuten)
  • Ein Zyklus, bestehend aus den Schritten 2) bis 4), wurde 25-mal wiederholt.
  • Die PCR-Fragmente wurden mit NcoI und BamHI gespalten und mit einer Qiagen Purple Spin-Säule (Qiagen) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in die NcoI- und BamHI-Stellen stromabwärts des trc-Promotors in den Plasmidvektor pTrc99a (Amersham Pharmacia Biotech) ligiert und die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm JM109 transduziert, um Transformanten zu erhalten. Das Plasmid, das die so erhaltene Transformante besaß, wurde ptrc9 genannt. Daraufhin wurde die Nucleotidsequenz dieses Plasmids ptrc9, wie vorstehend beschrieben, mit einem ABI Prism-Sequenzierungskit (Perkin Elmer) bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass ptrc9 eine modifizierte Gen-DNA als erfindungsgemäßes Gen enthielt, deren Nucleotidsequenz einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin an einer Position enthielt, die der Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz (1020 bp) der Nucleotidpositionen Nrn. 1 bis 1020 in der von Sequenz ID Nr. 2 repräsentierten Nucleotidsequenz entsprach. Daher kann diese Vorgehensweise einfach als Transduktionsverfahren für einen Nucleotidaustausch verwendet werden und dadurch kann die modifizierte Gen-DNA als erfindungsgemäßes Gen erhalten werden.
  • Beispiel 12
  • 50 ml sterilisiertes LB-Medium mit Ampicillin (50 μg/ml) und IPTG (1 mM) wurden mit dem in Beispiel 11 hergestellten transformierten E. coli-Stamm JM109/ptrc9 angeimpft und unter Schütteln über Nacht bei 30°C gezüchtet und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 470 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) suspendiert.
  • Die vorstehend beschriebene Zellsuspension wurde mit 530 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6) mit 10 μMol Acetophenon, 400 μMol eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) versetzt und das Gemisch wurde bei 40°C für 6 Stunden bei 130 UpM gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde das Reaktionsgemisch einer quantitativen Analyse von 1-Phenylethylamin unterzogen. Als Ergebnis wurden 0.45 mM 1-Phenylethylamin im Reaktionsgemisch nachgewiesen, wobei der Anteil des optischen Isomers der R-Form bei 100% lag.
  • Beispiel 13
  • 5 ml sterilisiertes LB-Medium mit Ampicillin (50 μg/ml) und IPTG (1 mM) wurden mit dem in Beispiel 11 hergestellten transformierten E. coli-Stamm JM109/ptrc9 angeimpft und unter Schütteln über Nacht bei 30°C gezüchtet und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 280 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) suspendiert.
  • Die so erhaltene Zellsuspension wurde mit 720 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6) mit 10 μMol eines racemischen Gemischs von 1-Phenylethylamin, 20 μMol Natriumpyruvat und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) versetzt und das Gemisch wurde bei 40°C für 6 Stunden bei 130 UpM gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde das Reaktionsgemisch einer quantitativen Analyse von 1-Phenylethylamin unterzogen. Als Ergebnis wurde eine 50%-ige Ausbeute von 1-Phenylethylamin beobachtet, wobei die optische Rein-heit der S-Form bei 99.5% ee lag.
  • Beispiel 14
  • 280 μl der durch ein zu dem in Beispiel 13 ähnlichen Verfahren hergestellten Zellsuspension wurden mit 720 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6) mit 10 μMol (R)-1-Phenyl-ethylamin, 20 μMol Natriumpyruvat und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) versetzt und das Gemisch wurde bei 40°C für 7 Minuten bei 130 UpM gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde das Reaktionsgemisch der quantitativen Analyse einer optisch aktiven Aminosäure unterzogen und die Ergebnisse zeigten die Bildung von 5.9 mM Alanin, wobei die optische Reinheit der D-Form bei 73.8% ee lag.
  • Beispiel 15
  • 30 ml sterilisiertes LB-Medium mit Ampicillin (50 μg/ml) und IPTG (1 mM) wurden mit dem in Beispiel 11 hergestellten transformierten E. coli-Stamm JM109/ptrc9 angeimpft und unter Schütteln über Nacht bei 30°C gezüchtet und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 200 μl 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.0) suspendiert.
  • Die vorstehend beschriebene Zellsuspension wurde mit 820 μl 100 mM Phosphatpuffer (pH 6) mit 30 μMol (R)-1-Phenylethylamin, 30 μMol Lithium-β-Hydroxypyruvat und 0.02 μMol Pyridoxal-5-phosphat (PLP) versetzt und das Gemisch wurde bei 40°C für 60 Minuten unter Schütteln bei 130 UpM gehalten. Nach dieser Zeitdauer wurde das Reaktionsgemisch der quantitativen Analyse einer optisch aktiven Aminoverbindung unterzogen und die Ergebnisse zeigten die Bildung von 24.5 mM Serin, wobei die optische Reinheit der D-Form bei 99.4% ee lag.

Claims (17)

  1. Protein, mit: (a) einer Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1; (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend einen einzelnen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1; (c) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives, 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID Nr. 1 von 60% oder höher zeigt; (d) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs. von sek.-Butylamin umzuwandeln, und eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID Nr. 1 von 80% oder höher zeigt; oder (e) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID Nr. 1 von 90% oder höher zeigt.
  2. Protein nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 hat.
  3. Protein nach Anspruch 1, mit der Aminosäuresequenz, umfassend einen Aminosäureaustausch von Threonin nach Alanin, der an einer Position auftritt, die der Aminosäureposition Nr. 2 einer Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 entspricht.
  4. Gen, das ein Protein codiert mit: (a) einer Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr: 1; (b) einer Aminosäuresequenz, umfassend einen einzelnen Aminosäureaustausch in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1; (c) einer Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz von Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 codiert wird; (d) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 60% oder höher zeigt; (e) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 80% oder höher zeigt; oder (f) einer Aminosäuresequenz eines Proteins, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und die eine Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von Sequenz ID Nr. 1 von 90% oder höher zeigt.
  5. Gen, das eine der folgenden Nucleotidsequenzen hat: (a) eine Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis Nr. 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2; (b) eine Nucleotidsequenz, umfassend einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin, der an einer Position auftritt, die Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz repräsentiert durch Sequenz ID Nr. 2 entspricht; (c) eine Nucleotidsequenz von etwa 1020 bp; die ein Protein codiert, das in der Lage ist, Acetophenon in ein optisch aktives 1-Phenylethylamin in Gegenwart eines racemischen Gemischs von sek.-Butylamin umzuwandeln, und welche durch PCR amplifizierbar ist, wobei als Primer verwendet werden ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz der. Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 28 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 hat, oder ein Oligonucleotid, das die Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 11 hat, und ein Oligonucleotid, das eine zu der Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 999 bis 1020 komplementären Nucleotidsequenz in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 und als Matrix eine Chromosomen-DNA hat, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu Mycobacterium gehört.
  6. Gen nach Anspruch 5, das die Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 hat.
  7. Gen nach Anspruch 5, umfassend einen Nucleotidaustausch von Adenin nach Guanin, der an einer Position auftritt, die Nucleotidposition Nr. 4 einer Nucleotidsequenz der Nucleotidpositionen von Nr. 1 bis 1017 in der Nucleotidsequenz von Sequenz ID Nr. 2 entspricht.
  8. Gen, umfassend einen Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, der in funktioneller Weise mit dem Gen nach Anspruch 4 verbunden ist.
  9. Vektor, enthaltend das Gen nach Anspruch 4.
  10. Transformante, die das Gen nach Anspruch 4 in eine Wirtszelle eingeführt hat.
  11. Transformante, die den Vektor nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle eingeführt hat.
  12. Transformante nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Wirtszelle eine Mikroorganismuszelle ist.
  13. Verfahren zur Herstellung einer Transformante, umfassend einen Schritt des Transduzierens des Gens nach Anspruch 4 oder des Vektors nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, umfassend einen Schritt des Züchtens eines Mikroorganismus, der das Gen nach Anspruch 4 hat.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Mikroorganismus die Transformante nach Anspruch 10 oder 11 ist.
  16. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung repräsentiert durch Formel (6):
    Figure 00490001
    wobei X2 eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Naphthylgruppe ist, R4 ein C1-C6-Alkylrest ist und n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist, umfassend die Umsetzung einer durch Formel (4) repräsentierten Ketonverbindung: X2-(CH2)n-CO-R4 (4)wobei X2, R4 und n die oben definierten Bedeutungen haben, in Gegenwart einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung, die durch Formel (5) repräsentiert wird: R5-CH(NH2)-R6 (5)wobei R5 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest, eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest ist, R6 ein Wasserstoffatom, ein C1-C6-Alkylrest, eine Carboxylgruppe oder ein C2-C5-Alkyloxycarbonylrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung durch das Protein nach Anspruch 1, 2 oder 3 katalysiert wird.
  17. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminoverbindung, die durch Formel (8) repräsentiert wird:
    Figure 00500001
    wobei X4 ein gegebenenfalls substituierter C6-C14-Arylrest, ein gegebenenfalls substituierter C4-C12-Heteroarylrest, ein gegebenenfalls substituierter C1-C3-Alkylrest, eine Aminogruppe, eine Aminocarbonylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Guanidylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, R7 und R8 gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom, einen C1-C3-Alkylrest oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, p eine ganze Zahl von 0 bis 3 und q eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, umfassend die Umsetzung einer durch Formel (7) repräsentierten Ketonverbindung: X4-(CR7R8)p-CO-(CH2)q-COOH (7) wobei X4, R7, R8, p und q die oben definierten Bedeutungen haben, in der Anwesenheit einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung, die durch Formel (2) repräsentiert wird: R2-CH(NH2)-R3 (2)wobei R2 ein gegebenenfalls substituierter C1-C6-Alkylrest, eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe oder ein gegebenenfalls substituierter C7-C10-Phenylalkylrest ist, R3 ein Wasserstoffatom, ein C1-C6-Alkylrest, eine Carboxylgruppe oder ein C2-C5-Alkyloxycarbonylrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung durch das Protein nach Anspruch 1, 2 oder 3 katalysiert wird.
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