AT507050A1 - Verfahren zur herstellung von aminen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Aminen aus entsprechenden Carbonylverbindungen durch formale, enzymatisch katalysierte, reduktive Aminierung.

Optisch aktive Amine sind aufgrund ihrer vielfältigen Einsatzmöglichkeiten und ihrer pharmakologischen Eigenschaften von großer Bedeutung. Beispielsweise werden sie zur Enantiomerentrennung, als chirale Zusätze sowie als Grundbausteine zur Herstellung neurologischer, kardiovaskulärer, immunologischer, hypertonussenkender, infektionshemmender und antiemetischer Arzneimittel eingesetzt. In den meisten Fällen hängt die pharmakologische Aktivität dieser Amine mit der Konfiguration ihres stereogenen Zentrums zusammen. Unter diesem Gesichtpunkt ist die Entwicklung von Verfahren zur Bildung von enantiomerenreinen Aminen von besonderem Interesse.

Obwohl einige Verfahren der organisch-chemischen reduktiven Aminierung, u.a. die Leuckart-Wallach-Reaktion, gut fachbekannt sind, ist deren Stereoselektivität üblicherweise gering. Selbst bei Verwendung von Komplexen aus Übergangsmetallen und chiralen Liganden als Katalysatoren werden nur mäßige Enantiomerenüber-schüsse erzielt.

Auch zahlreiche biochemische/biokatalysierte Verfahren der Transaminierung sind bekannt, bei denen beispielsweise Enantiomerengemische deracemisiert, d.h. kinetisch getrennt oder aufgelöst, werden, wobei unter anderem Transaminasen als Hauptenzym eingesetzt werden. So wurden etwa Racemate von 1-Cyclopropylethyl-amin und sec-Butylamin mittels einer ^-spezifischen Transaminase am jeweiligen (7^-Enantiomer angereichert und gleichzeitig Pyruvat als Aminoakzeptor zu Alanin reduziert (M. Höhne, K. Robins, U. T. Bomscheuer, Adv. Synth. Catal. 350, 807-812 (2008)). Zudem wurden optisch aktives N-geschütztes 3-Aminopynrolidin und N-ge-schütztes 3-Aminopiperidin durch kinetische Racemtrennung enantiomerenangerei-chert (K. Robins, U. Bomscheuer, M. Höhne; Lonza AG; WO 2008/28654). Nachteile solcher Deracemisierungen sind; a) die maximale Ausbeute von nur 50 %, da ja das unerwünschte Enantiomer zum Keton oxidiert wird, b) das Erfordernis, dieses Keton vom gewünschten Enantiomer abzutrennen, und c) der Verbrauch großer Mengen an -1 -

Aminoakzeptor. Nachstehendes Schema veranschaulicht allgemein die Hauptreaktionen bei kinetischer Racemtrennung:

Kinetische Auflösung:

Transaminase

Pyruvat (.-Ala

Der Nachteil der geringen Ausbeute kann - zumindest theoretisch - durch asymmetrische Synthese nur des gewünschten Amin-Enantiomers aus dem Keton behoben werden. So beschreiben etwa M. Höhne, S. Kühl, K. Robins und U. T. Bornscheuer in ChemBioChem 9, 363-365 (2008), die asymmetrische Synthese von Aminen, z.B. (S)-a-Methylbenzylamin durch Aminierung von Ketonen, z.B. Acetophenon, mittels einer Transaminase unter gleichzeitiger Oxidation von z.B. L-Alanin zu Pyruvat als Nebenprodukt. Die Nachteile solcher Verfahren bestehen darin, dass a) weiterhin äquimolare Mengen an Alanin oder anderer Aminodonoren verbraucht werden, b) weiterhin äquimolare Mengen an Nebenprodukten, wie z.B. Pyruvat, anfallen, die vom gewünschten Amin abgetrennt werden müssen, und c), die Gleichgewichtslage bei solchen asymmetrischen Synthesereaktionen. So betragen bei der Herstellung von α-Aminosäuren durch asymmetrische Synthese die Gleichgewichtskonstanten für die Reaktion der jeweiligen Ketosäure zur Aminosäure zwar rund 1, so dass ca. 50 % Umsatz möglich sind. Für andere wünschenswerte Amine liegt das Gleichgewicht jedoch weit aufseiten des Ketons. Beispielsweise beträgt die Gleichgewichtskonstante für die obige Reduktion von Acetophenon zu (S)-a-Methylbenzylamin nur 8,8 x 10"4, was bedeutet, dass Ausgangs- und Endprodukt in einem Verhältnis von über 1000:1 vorliegen. In nachstehendem allgemeinen Reaktionsschema solcher asymmetrischen Synthesen ist dies durch die Länge der Reaktionspfeile angedeutet.

Transaminase

Asymmetrische Synthese:

L-AIa Pyruvat

Zur Verschiebung des Gleichgewichts wurde vorgeschlagen, das als Nebenprodukt anfallende Keton zu entfernen, was beispielsweise im Falle von Pyruvat entweder mittels einer Lactat-Dehydrogenase (LDH) oder einer Pyruvat-Decarboxylase (PDC) erfolgen kann.

NADH NAO

In beiden Fällen werden jedoch zur Synthese des gewünschten Amin-Enantiomers erneut äquimolare Mengen an Alanin benötigt (d.h. verbraucht) und fallen äquimolare Mengen an Milchsäure oder Acetaldehyd an. LDH verbaucht darüber hinaus auch äquimolare Mengen an NADH, so dass so genanntes "Cofaktor-Recycling" vonnöten ist, wie dies nachstehend näher erklärt wird. Aufgrund der großen Mengen an Nebenprodukten sind außerdem nur niedrige Konzentrationen des Keton-Substrats im Reaktionssystem möglich; siehe beispielsweise Figur 1 auf S. 364 von ChemBio-Chem 9, 363-365 (2008), wo eine Konzentration von 5 mM als 100 % Umsatz beschrieben wird.

In Appl. Environ. Microbiol. 63, 4651 (1997), beschreiben Galkin et al. die asymmetrische Synthese von α-Aminosäuren aus den entsprechenden α-Ketosäuren unter Durchführung mehrerer gekoppelter enzymatischer Katalyseprozesse. Zur Herstellung der L-Aminosäuren wird die in Form von Ammoniak bereitgestellte Aminofunk-tionalität mittels einer Aminosäure-Dehydrogenase (AADH) auf die jeweilige Keto-säure übertragen, wobei der Cofaktor NADH zu NAD+ oxidiert wird, wie in nachstehendem Schema dargestellt ist. ···· Μ ·· • · · · · • · · · · • · · · · • · · · · • Μ #·

Als "Cofaktor-Recycling" wird mittels einer Formiat-Dehydrogenase (FDH) Ameisensäure zu Kohlendioxid oxidiert, wobei NAD* wiederum zu NADH reduziert wird.

Zur Herstellung der D-Aminosäuren wenden Galkin et al. jedoch ein aufwändigeres System an, das nachstehend schematisch gezeigt wird.

NAß NAD* AI*R iMkQäBüKAIa.

D-Aminosäure

Darin stammt die Aminofunktionalität erneut von Ammoniak, wird jedoch zunächst mittels einer - wiederum NADH als Cofaktor verbrauchenden - L-Alanin-Dehydroge-nase (L-AlaDH) auf Pyruvat übertragen, um L-Alanin zu erhalten. Letzteres wird mittels einer Alanin-Racemase (AlaR) in die D-Form umgewandelt, von der die Aminofunktionalität mittels einer D-Aminosäure-Aminotransferase (DAAT) auf die a-Keto-säure zu übertragen, was schließlich die gewünschte D-Aminosäure liefert. Das Cofaktor-Recycling erfolgt analog mittels des FDH/Formiat/C02-Systems. Sämtliche in dieser Arbeit beschriebenen Enyzme werden von mit Plasmiden entsprechend transformierten E.coli-Zellen produziert. Die Nachteile dieses Standes der Technik liegen darin, dass a) zwei unterschiedliche Reaktionssysteme und Enzymkombinationen zur Herstellung der beiden a-Aminosäure-Enantiomere eingesetzt werden müssen, b) keine sonstigen Ketone außer α-Ketosäuren umgesetzt werden -4- ·· ·· • · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· • · • · • · • · • ·· können, c) bei der Herstellung von D-Aminosäuren das als Cosubstrat dienende Alanin in einem eigenen Schritt isomerisiert werden muss, was das Verfahren ingesamt verkompliziert und die Kosten erhöht, und d) dass zahlreiche im Handel erhältliche Transaminasen α-Aminosäuren nicht als Cosubstrat nutzen können, wie dies beispielsweise von A. Iwasaki et al. in mehreren Studien (Appl. Microbiol. Biotechnol. 69, 499-505 (2006); Biotechnol. Lett. 25, 1843-1846 (2003)) sowohl für (R)- als auch für (S)-selektive Transaminasen von Arthrobacter bzw. Pseudomonas für diverse Aminosäuren, einschließlich Alanin, beschrieben wird.

Ziel der Erfindung war vor diesem Hintergrund die Entwicklung eines enzymkatalysierten Verfahrens, durch das andere optisch aktive Amine als α-Aminosäuren aus den entsprechenden Ketonen mittels asymmetrischer Synthese in guter Reaktionsausbeute, mit hohem Enantiomerenüberschuss und auf ökonomischere Weise hergestellt werden können.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Aminen (2) aus den entsprechenden Carbonylverbindungen (1) mittels gemeinsamer Durchführung mehrerer enzymatischer Katalyseprozesse gemäß folgendem Reaktionsschema A erreicht: -5- Λ.

AD-red (3) AD-ox (4)

NH4+ CoF-ox CoF-red

HS-red (5) HS-ox (6) Schema A worin: R und R' ausgewählt sind aus Wasserstoff und unverzweigten, verzweigten und zyklischen Kohlenwasserstoffen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls Heteroatome und/oder Carboxylgruppen enthalten, wobei R und R' gegebenenfalls zu einem Ring verbunden sind, mit der Maßgabe, dass Carboxylgruppen nicht direkt an das Carbonyl-Kohlenstoff-atom gebunden sind, "AD-red" für einen Aminodonor in seiner reduzierten Form steht, "AD-ox" für den Aminodonor in seiner oxidierten Form steht, "CoF-red" für einen Cofaktor in seiner reduzierten Form steht, "CoF-ox" für den Cofaktor in seiner oxidierten Form steht, "HS-red" für ein Hilfssubstrat in seiner reduzierten Form steht und "HS-ox" für das Hilfssubstrat in seiner oxidierten Form steht, indem a) mittels einer ω-Transaminase als Enzym A eine Aminogruppe von einem Aminodonor (3) auf die Carbonylverbindung (1) übertragen wird, wobei das Amin (2) gebildet wird und geichzeitig der Aminodonor von der reduzierten Form (3) in die oxidierte, d.h. desaminierte, Form (4) übergeführt wird,

b) die oxidierte Form (4) des Aminodonors mittels eines Enzyms B, das eine von Ammoniak bzw. Ammonumionen NH4+ stammende Aminogruppe darauf überträgt, in die reduzierte Form (3) rezykliert wird, wobei gleichzeitig ein Cofaktor von der reduzierten in die oxidierte Form übergeführt wird, c) der oxidierte Cofaktor mittels eines Enzyms C - unter gleichzeitiger Oxidation eines Hilfssubstrats HS von der reduzierten Form (5) zur oxidierten Form (6) - in die reduzierte Form rezykliert wird.

Auf diese Weise kann unter Einsatz einer Kombination nur dreier Enzyme eine große Vielfalt von Ketonen und Aldehyden zu den entsprechenden Aminen reduziert werden, wobei in der Summenreaktion lediglich Ammoniak als Quelle der Aminogruppe sowie ein kostengünstiges Hilfssubstrat als Reduktionsmittel verbraucht werden. Werden als Carbonylverbindungen (1) Ketone, d.h. Verbindungen, in denen R und R' * H sind, eingesetzt, können daraus im Wesentlichen enantiomerenreine Amine der nachstehenden Formel (2a) hergestellt werden. NH2

(2a)

Aufgrund der Zyklierung des als Cosubstrat der ω-Transaminase dienenden Aminodonors fallen keine teuren Nebenprodukte in großen (z.B. äquimolaren) Mengen an, was höhere Konzentrationen der Reaktanden im System ermöglicht. Gleichzeitig wird dadurch das Reaktionsgleichgewicht stetig in Richtung des Amins verschoben, so dass auch nach dem Stand der Technik praktisch unzugängliche Amine in guten Ausbeuten synthetisiert werden können. Der Aminodonor braucht selbst zudem keine chirale Verbindung zu sein, wodurch Racemisierungsschritte gänzlich entfallen können.

Vorzugsweise wird als Aminodonor (3) und als Enzym B eine Kombination aus einem Amin und einer dafür spezifischen Dehydrogenase ausgewählt, wobei auf hohe Umsatzzahlen und Kostengünstigkeit zu achten ist. Der Aminodonor braucht zwar, wie -7- ·» ·· ···· ·· • · · · • · · · • · · · ·· • ♦ ♦ · zuvor erwähnt, kein chirales Amin zu sein, im Hinblick auf die Spezifität der Reaktionen und die Enantiomerenreinheit des herzustellenden Aminprodukts (2) werden jedoch vorzugsweise chirale Verbindungen als Aminodonoren eingesetzt. In diesen Fällen wird in besonders bevorzugten Ausführungsformen eine sozusagen "bispezifi-sche" ω-Transaminase als Enzym A eingesetzt, d.h. eine ω-Transaminase, die in der Lage ist, sowohl Aminodonoren mit (R)- als auch solche mit ^-Konfiguration als Co-substrat zu nutzen. Dadurch kann allein durch die Wahl des Enantiomers des Amino-donors - bei ansonsten identischen Reaktanden und Reaktionsbedingungen - festgelegt werden, welches der beiden möglichen Enantiomere des gewünschten Amins gezielt synthetisiert wird. Dies ermöglicht eine effiziente Nutzung bestehender Produktionsanlagen zur abwechselnden Synthese beider Enantiomere einer Zielverbindung, ohne dass aufwändige Systemumstellungen vonnöten wären.

Aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit, hohen Spezifität und Kostengünstigkeit sind weiters Kombinationen aus α-Aminosäuren und dafür spezifischen Aminosäure-Dehydrogenasen bevorzugt. Als nicht chirales Amin kann so auch Glycin als einfachste α-Aminosäure eingesetzt werden, vorzugsweise wird jedoch wiederum ein chiraler Vertreter dieser Klasse, wie z.B. Alanin, Valin, Leucin, Serin oder Glutaminsäure, gewählt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte ω-Transaminase wird vorzugsweise aus mikrobiellen, noch bevorzugter bakteriellen, ω-Transaminasen, z.B. von Bacil-//, z.B. Bacillus licheniformis, B. megaterium, Brevibacteria, z.B. ß. linens, Pseudomonaden, z.B. Pseudomonas aeruginosa, P. putida oder P. fluorescens, P. riboflavina, P. thuringiensis, Alcaligenes, z.B. A denitrificans, Arthmbacter, Mesorhizobia, Flavo-bacteria, z.B. Flavobacterium rigense, Mycobacteria, z.B. M. smegmatis, Sarcinae, z.B. Sarcina albida, Chromobacteria, z.B. C. iodinum, C. violaceum, Klebsiellae, z.B. Klebsiella pneumoniae, oder Vibrionen, z.B. Vibrio fluvialis, ausgewählt, sind als fertige Präparate von diversen Lieferanten (u.a. Codexis, LibraGen und EnzySource) erhältlich und bieten neben der leichten Erhältlichkeit und den damit verbundenen geringen Kosten auch die Vorteile hoher Reaktivität und Spezifität. -8-

Als Cofaktor kann NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid), NADP (Nicotinamid-Ade-nin-Dinucleotid-Phosphat), FAD (Flavin-Adenin-Dinucleotid) oder FMN (Flavin-Mono-nucleotid) eingesetzt werden, wobei NAD oder NADP aufgrund der großen Anzahl an Enzymen mit Spezifität für diese Cofaktoren bevorzugt werden.

Die Art und Weise des Cofaktor-Recyclings ist nicht speziell eingeschränkt. Vorzugsweise werden als Hilfssubstrate HS und Enzyme C jedoch Kombinationen aus For-miat/Formiat-Dehydrogenase, Glucose/Glucose-Dehydrogenase, Glucose-6-phos-phat/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase eingesetzt, da diese Systeme leicht und kostengünstig verfügbar sind. Auch die Kombination H2/Nucleotid-Hydrogenase kann zum Cofaktor-Recycling eingesetzt werden, da hier lediglich H+ als oxidierte Form des Hilfssubstrats anfällt, was die Anzahl der Reaktanden im System verringert und höhere Konzentrationen des Hauptsubstrats (1) ermöglicht. Besonders bevorzugt ist aus demselben Grund eine Kombination aus Ammoniumformiat und Formiat-Dehy-drogenase, da dieses Substrat im erfindungsgemäßen Verfahren zur Gänze aus dem entfernt wird: Formiat wird zu CO2 oxidiert, das bei saurem oder neutralem pH aus der Lösung entweicht und damit das Gleichgewicht zur Produktseite verschiebt, und das Ammoniumion dient als Amino-Quelle der Synthese und wird zunächst in die oxidierte Form des Aminodonors und anschließend in das gewünschte Aminprodukt eingebaut.

BEISPIELE

Nachstend wird die Erfindung anhand von nichteinschränkenden Beispielen näher beschrieben. Alle eingesetzten Reagenzien, einschließlich der Enzyme, sind frei im Handel erhältlich und wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt.

Beispiele 1 bis 25 - Reduktion verschiedener Carbonylverbindungen

Im folgenden enzymkatalysierten Reaktionssystem wurden die in Tabelle 1 zusammen mit weiteren Reaktionsbedingungen angegebenen Carbonylverbindungen zu den entsprechenden Aminen reduziert. Die Reaktionen wurden in 2-ml-Mikroeprou- -9-

vetten bei 30 °C über eine Reaktionszeit von 24 h in 850 μΙ Natriumphoshat-Puffer (100 mM, pH 7), ergänzt mit 1 mM Pyridoxal-5'-phosphat als Coenzym für das Enzym A, d.h. die ω-Transaminase, durchgeführt.

Als Enzym A wurde eine von drei bakteriellen ω-Transaminasen (in der Tabelle: "TA") von Codexis Inc., Redwood City, CA, USA, Katalognummern ATA-113 (in der Folge kurz "TA-1"), ATA-117 ("TA-2") und ATA-114 ("TA-3"), eingesetzt, die den Angaben des Herstellers zufolge zur Aminierung bzw. Desaminierung von unverzweigten oder verzweigten Alkylketonen, Arylketonen, Ketosäuren, Aminen und Aminosäuren dienen. Von beiden Enzymen wurde jeweils die gleiche Menge, nämlich 2 mg eines Rohpräparats, in den Reaktionsgemischen eingesetzt. Untersuchungen der Aktivität ergaben jedoch, dass diese Menge bei TA-1 1,38 Units (U), bei TA-2 5,7 U und bei TA-3 0,23 U entsprach, wobei 1 U hierin als jene Menge an Enzym definiert ist, die bei 22 °C in Natriumboratpuffer (100 mM, pH 9) ausgehend von a-Methylben-zylamin die Bildung von 1 pmol Acetophenon pro Minute katalysierte. Somit war bei der späteren Bewertung der Ergebnisse zu berücksichtigen, dass im Fall von TA-2 jeweils etwa die 4fache Enzymaktivität von TA-1 und die 25fache Enzymaktivität von TA-3 für die Katalyse zur Verfügung stand. TA-1 und TA-3 sind Enzyme mit L- bzw. fS^-Spezifität, d.h. mit L-Aminosäuren als Cosubstraten werden aus Ketonen die (Sj-Enantiomere der entsprechenden Amine hergestellt. Andererseits fanden die Erfinder heraus, dass TA-2 die Übertragung der Aminogruppe von D-Aminen als Aminodonoren auf das Keton-Substrat zum Erhalt von (RJ-Aminen zwar rascher katalysierte, aber durchaus auch in der Lage war, mit L-Aminen als Aminodonoren (R)-Amine aus Ketonen zu synthetisieren. Unabhängig von der Konformation des Aminodonors konnte somit mit TA-2 gezielt das (R)-Enan-tiomer gebildet werden.

Als Aminodonoren wurden L- oder D-Alanin (L-Ala, D-Ala) bzw. L- oder D-Valin (L-Val, D-Val) in Konzentrationen von jeweils 250 mM eingesetzt. Obwohl für den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens lediglich katalytische Mengen des Aminodonors erforderlich sind, läuft die Reaktion rascher ab, wenn größere Mengen zuge- -10-

gen sind, wie in späteren Beispielen gezeigt wird. Dasselbe gilt für die entsprechenden Aminosäure-Dehydrogenasen ("AADH"), d.h. bzw. L- und D-Aminosäure-Dehy-drogenasen (L- und D-AADH), z.B. L- und D-Alanin-Dehydrogenase (L-AlaDH, D-AlaDH), die in dieser Beispielgruppe jeweils in einer Konzentration von 6 ΙΕ/ml (gemäß den Angaben des Lieferanten, Fluka) zugesetzt wurden.

Als Cofaktor wurde NAD in einer Konzentration von 1 mM zum Natriumboratpuffer zugesetzt. Zum Cofaktor-Recycling diente das System Ammoniumformiat/Formiat-Dehydrogenase in einer Ammoniumformiat-Konzentration von 150 mM und einer Konzentration an Formiat-Dehydrogenase von 10 ΙΕ/ml. Zusätzlich wurden 150 pl DMSO zur Reaktionslösung zugesetzt.

Schließlich wurden jeweils 50 mM des entsprechenden Ketons im Reaktionsgemisch gelöst, das Gemisch auf 30 °C erwärmt und unter leichtem Schütteln 24 h lang reagieren gelassen.

Danach wurden die Reaktionen durch Zusatz von 200 ml 10 N NaOH gequencht und die Gemische zweimal mit Ethylacetat (600 μΙ x 2) extrahiert. Die organische Phase wurde jeweils über wasserfreiem Na2S04 getrocknet und filtriert.

Die chemischen Ausbeuten (in % d. Th.) und Enantiomerenüberschüsse ("enantio-meric excess", e.e., in %) wurden nach Derivatisierung der erhaltenen Amine gas-chromatographisch auf einem Varian-Gaschromatographen, Modell GC 3900 mit einer Säule der Type CP Chirasil-Dex CB DF 0,25 (25 m x 0,32 mm) bestimmt. Die Derivatisierung erfolgte mittels Überführung in die entsprechenden Acetamide durch Zusatz eines 20fachen Überschusses, bezogen auf das Aminprodukt, an Essigsäureanhydrid und 1 mg 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) als Katalysator zur Ethylacetat-Lösung der Amine. Nach dem Waschen mit Wasser zur Entfernung von überschüssigem Anhydrid und Trocknen der organischen Phase über wasserfreiem Na2S04 wurde diese direkt in den Gaschromatographen injiziert. -11 -

Tabelle 1

Beispiel Nr. Substrat d) TA Amino-donor (3) Amin (2) Amin (% d.Th.) e.e. (%) 1 Cr1· TA-1 L-Ala nh2 er 6 >99 (S) 2 II TA-2 D-Ala II 58 >99 (R) 3 TA-1 L-Ala 92 93 (S) 4 II TA-2 D-Ala II 66 >99 (R) 5 II TA-2 L-Ala II 11 >99 (R) 6 II TA-3 L-Ala II 12 91 (S) 7 TA-1 L-Ala 51 >99 (S) 8 II TA-2 D-Ala II 71 >99 (R) 9 cA TA-1 L-Ala cA. <1 - 10 II TA-2 D-Ala II 94 - 11 cA TA-1 L-Ala nh2 Cr" 27 >99 (S) 12 II TA-2 D-Ala II <1 n.b. 13 vCnr TA-1 L-Ala nh2 0 56 >99 (S) 14 II TA-2 D-Ala II 97 >99 (R) -12- ······· ···; ·· ·· ·· · ·· · · __.—I nh2 Q \ Cbz 32 n.b. 15 Cbz TA-1 L-Ala 16 II TA-2 D-Ala II >98 n.b. L-Ala NH, 0 Χλ0Β >99 94 (S) 17 AA. TA-1 NH, X/ >99 >99 (S) 18 Ax TA-1 L-Ala II >99 >99 (R) 19 II TA-2 D-Ala 20 Cj-A TA-1 L-Ala Q o 14 86 (S) D-Ala II >99 >99 (R) 21 II TA-2 22 JUq TA-1 L-Ala NH2 Ad 76 34 (S) II 75 >99 (R) 23 II TA-2 D-Ala __— 82 62 (S) 24 JUO TA-1 L-Ala D-Ala II 96 >99 (R) 25 II TA-2 _______ n.b.: nicht bestimmbar

Cbz: Carbobenzoxy-Schutzgruppe, -CO-O-CHz-CeHs

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass beide verwendeten Enzyme die Aminierung diverser Ketone zu chiralen Aminen katalysieren konnten. Die Amine fielen in überwiegend guter chemischer Ausbeute und zumeist nahezu enantiomerenrein an. Mit TA-2 konnte auch das getestete Aldehyd, 2-Phenylpropionaldehyd, zum primären -13-

Amin reduziert werden, so dass das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Reduktion von Aldehyden zu endständigen Aminen anwendbar ist. Die Gegenwart von Heteroatomen oder von Funktionalitäten wie Ether- und Carboxylgruppen stört die erfindungsgemäße enzymatische Katalyse nicht.

Somit kann ein definiertes prochirales Carbonylsubstrat (1) mittels eines ansonsten unveränderten Reaktionssystems durch entsprechende Auswahl der Transaminase und ihres Cosubstrats wahlweise zum (S)- oder zum (/?)-Enantiomer aminiert werden. Wie Beispiel 5 darüber hinaus belegt, kann unter Verwendung "bispezifischer” Transaminasen sowohl die L- als auch die D-konfigurierte Aminosäure eingesetzt werden. Somit weist das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Stand der Technik erhebliche Vorteile auf.

Beispiele 26 bis 33 - Variation von Reaktantenkonzentrationen

In den folgenden Beispielen wurde Beispiel 3 mit 2-Pentanon als Substrat im Wesentlichen wie oben beschrieben wiederholt, wobei jedoch die Mengen (in Äquivalenten, "Äqu.", bezogen auf das Substrat (1), bzw. in "ΙΕ/ml") an Aminodonor (3) (L-Ala-nin, L-Ala), an dessen Dehydrogenase (L-Alanin-Dehydrogenase, L-AlaDH), und an Hilfssubstrat (Ammoniumformiat, HCOONH4) wie in Tabelle 2 angegeben variiert wurden, um die Einflüsse auf den Reaktionsablauf zu untersuchen. L-AlaDH wurde jeweils in Konzentrationen von 6 ΙΕ/ml bzw. (in Beispiel 29) von 15 ΙΕ/ml zugesetzt. In Beispiel 30 wurden zusätzlich zu 1 Äqu. Ammoniumformiat 3 Äqu. Ammoniumchlorid als Ammoniumquelle zugesetzt. -14- ·· ·· • ·

• · ··♦· ·· ·« • · · · « • · · · 9 • · · · « • · · · ♦ • ·· «· ·· • · • ··· • · · • · · ··

Tabelle 2

Beispiel Nr. Substrat (1) L-Ala (Äqu.) L-AlaDH (lE/ml) HCOONH4 (Äqu.) Amin (% d.Th.) e.e. (%) 26 I nh2 ('S>2-Pentylamin 5 6 1 81 94 27 5 6 2 90 94 28 5 6 3 92 93 29 5 15 2 96 95 30 1 6 2 52 97 31 1 6 3 54 97 32 2 6 2 66 97 33 5 6 1+3* 94 97 *: 1 Äqu. HCOONH4 + 3Äqu. NH4CI.

Die Ergebnisse in der Tabelle zeigen erwartungsgemäß, dass größere Überschüsse der jeweiligen Reaktanten eine raschere Reaktion, d.h. innerhalb derselben Reaktionszeit von 24 h einen höheren Umsatz zum gewünschten Amin bewirkten, wobei der Enantiomerenüberschuss in allen Fällen deutlich über 90 % lag. Beispiel 26 belegt, dass auch 1 Äquivalent Ammoniumformiat als Stickstoffquelle (Ammonium) und Reduktionsmittel (Formiat) der Summenreaktion ausreicht, um das erfindungsgemäße Verfahren mit recht guter Ausbeute von über 80 % durchführen zu können. Der Zusatz einer weiteren Stickstoffquelle in Beispiel 33 beschleunigte das Verfahren allerdings signifikant. Die Erhöhung der L-AlaDH-Konzentration in Beispiel 29 auf das 2,5fache bewirkte im direkten Vergleich mit Beispiel 27 nur eine geringfügige Beschleunigung. Der Einsatz von nur 1 Äquivalent des Cosubstrats L-Alanin brachte hingegen die stärkste Verringerung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit mit sich.

Die einzelnen Einflüsse wurden in den folgenden Beispielen näher untersucht. -15-

Beispiele 34 bis 38 - Variation der Ammoniumformiat-Konzentration

In den folgenden Beispielen wurde Beispiel 22 mit 4-Phenylbutanon als Substrat im Wesentlichen wie oben beschrieben wiederholt, wobei jedoch die Menge (in Äquivalenten, "Äqu.", bezogen auf das Substrat (1)) an Ammoniumformiat (AF) wie in Tabelle 3 angegeben variiert wurden.

Tabelle 3

Beispiel Substrat HCOONH4 Amin e.e. Nr. (D (Äqu.) (% d.Th.) (%) 34 JUq nh2 * 1 74 32 35 2 64 32 36 3 85 33 37 ^0 4 90 32 38 föM-Phenylisobutylamin 5 85 32

Die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, dass die Reaktion ab etwa 3 Äquivalenten Ammoniumformiat als Aminoquelle und Reduktionsmittel mit zufrieden stellender Geschwindigkeit ablief. Der verhältnismäßig geringe Enantiomerenüberschuss, der auch schon in Beispiel 22 zu beobachten war, resultierte hingegen wohl aus zu niedriger Spezifität der verwendeten ω-Transaminase TA-1 für das Substrat. Wie zuvor in Beispiel 23 gezeigt wurde, konnte das (R)-Enantiomer mittels TA-2 in ähnlicher Ausbeute, aber nahezu enantiomerenrein hergestellt werden. Für eine Produktion dieses Amins in größerem Maßstab wäre demnach eine optimierte ω-Transaminase zu ermitteln, was jeder einschlägige Fachmann anhand von Routine-Reihenversuchen mit handelsüblichen Enzymen bzw. durch Screening von Mutanten-Bibliotheken leicht bewerkstelligen kann. -16- ·♦ ···· • · 1 « » · · ·· ··

Beispiele 39 bis 43 - Variation der Dehydrogenase-Konzentration

In den folgenden Beispielen wurde Beispiel 3 mit 2-Pentanon als Substrat im Wesentlichen wie oben beschrieben wiederholt, wobei jedoch nur 0,5 anstelle von 5 Äquivalenten an L-Alanin als Cosubstrat eingesetzt wurden und die Konzentration (in "lE/ml") von L-Alanin-Dehydrogenase (L-AlaDH) wie in Tabelle 4 angegeben variiert wurde.

Tabelle 4

Beispiel Substrat L-AlaDH Amin e.e. Nr. (1) (lE/ml) (% d.Th.) (%) 39 0 II 2 27 96 40 4 27 96 41 6 30 96 42 CSJ-2-Pentylamin 8 30 96 43 10 32 93

Den obigen Werten ist - wie bereits zuvor in Tabelle 2 - zu entnehmen, dass die Konzentration der L-Alanin-Dehydrogenase kaum einen Einfluss auf die Gesamtreaktion hat, zumal eine Verfünffachung derselben eine nicht einmal 20%ige Umsatzsteigerung bewirkte. Der Einsatz nur eines Zehntels der Menge an L-Alanin von Beispiel 3 bewirkte jedoch - wie ebenfalls bereits aus Tabelle 2 zu erkennen - einen deutlichen Umsatzrückgang auf nur rund 30 %.

Beispiele 44 bis 53 - Variation der Reaktionszeit

In den folgenden Beispielen wurde Beispiel 3 mit 2-Pentanon als Substrat im Wesentlichen wie oben beschrieben wiederholt, wobei jedoch nur 0,5 anstelle von 5 Äquivalenten an L-Alanin als Cosubstrat eingesetzt wurden und die Reaktionszeit (in h) wie in Tabelle 5 angegeben variiert wurde. Diese Versuche wurden unter anderem durchgeführt, um zu zeigen, dass das Cosubstrat L-Alanin tatsächlich regeneriert -17- ··♦♦ ·· • ♦ « ·· ·· ·· • ♦ · · · • · · · ··· • · · · · · • · ♦ · · ♦ ·· ·· ·· wird. Im Allgemeinen ist freilich eine höhere Konzentration einzusetzen, um eine zufrieden stellend rasche Reaktion zu ermöglichen. Weitere Vorversuche hatten zudem ergeben, dass das Reaktionssystem ohne Aminosäure-Dehydrogenase als Enzym B zu keinem nennenswerten Umsatz führt, da die aus dem Cosubstrat (3) gebildete a-Ketosäure die Transaminase hemmt, wie dies in der Einleitung beschrieben wurde.

Tabelle 5

Beispiel Substrat Zeit Amin e.e. Nr. d) (h) (% d.Th.) (%) 44 1 4 >99 45 2 12 98 46 3 12 98 47 21 31 96 48 I nh2 23 32 96 49 24 32 96 50 ('S^-Pentylamin 25 32 94 51 42 47 94 52 44 47 94 53 68 56 92

Es wurde somit gezeigt, dass die Reaktion unter Verwendung von nur 0,5 Äquivalenten des Cosubstrats zwar langsamer abläuft aber dennoch zu Ausbeuten über 50 % der Theorie führt, was nur möglich ist, wenn das Cosubstrat rezykliert wird. Andererseits fällt auch auf, dass der Enantiomerenüberschuss mit längerer Reaktionszeit aufgrund von allmählicher Racemisierung langsam, aber stetig abnahm, was - abgesehen von wirtschaftlichen Überlegungen - ein weiterer Grund dafür ist, die Reaktionen möglichst rasch ablaufen zu lassen. -18- ·· • · · • · · • · · ·· • ··· • · 4 • · 4 ·· ···· ·» ·» • · · · « β ♦ · · · • ♦ ♦ · ♦ ♦ · · · · • ·♦ ·♦

Beispiele 54 bis 65 - Variation von Reaktantenkombinationen

In den folgenden Beispielen wurde Beispiel 22 mit 4-Phenylbutanon als Substrat im Wesentlichen wie oben beschrieben wiederholt, wobei jedoch verschiedene Reaktanten wie in Tabelle 6 angegeben variiert wurden. Konkret wurden Kombinationen unterschiedlicher Cosubstrate: L-Alanin (L-Ala), L-Glutamat (Glmt), L-Glutaminsäure (Glu); unterschiedlicher Enzyme B: L-Alanin-Dehydrogenase (L-AlaDH) verschiedener Hersteller, Glutamat-Dehydrogenase (GIxDH), L-Glutaminsäure-Dehydrogenase (GluDH); unterschiedlicher Cofaktoren: NAD, NADP; unterschiedlicher Hilfesubstrate: Formiat, Glucose; unterschiedlicher Enzyme C: Formiat-Dehydrogenase (FDH) mit verschiedenen Cofaktorspezifitäten (NAD oder NADP nutzend), D-Glucose-Dehydro-genase (GDH); und unterschiedlicher Aminoquellen: Ammoniumformiat (HCOONH4), Ammoniumchlorid (NH4CI), getestet.

Die Zusammensetzungen der Reaktionsgemische waren im Wesentlichen wie für die Beispiele 1 bis 25 beschrieben, wobei in jedem Fall 5 Äquivalente (bezogen auf das Keton) des Cosubstrats, bei Verwendung von Glucose/GDH als Cofaktor-Recycling-System 1,2 Äquivalente Glucose und 25 ΙΕ/ml GDH und bei Verwendung von Ammoniumchlorid als Aminoquelle 1,2 Äquivalente davon eingesetzt wurden. -19-

Tabelle 6

Beispiel Nr. Co- substrat Enzym B Co- faktor Hilfs substrat Enzym C Amino- quelle Amin (% d.Th.) 54 Glmt GIxDH NADP HCOCr FDH HCOONH4 2 55 L-Ala L-AlaDHa NADP HCOO* FDH HCOONH4 17 56 L-Ala L-AlaDHD NADP HCOO' FDH HCOONH4 16 57 Glu GluDH NADP HCOO’ FDH HCOONH4 12 58 L-Ala L-AlaDHb NADP Glucose GDH HCOONH4 26 59 Glu GluDH NADP Glucose GDH HCOONH4 3 60 L-Ala L-AlaDHa NADP Glucose GDH NH4CI 38 61 L-Ala L-AlaDHa NAD HCOO’ FDH HCOONH4 79 62 L-Ala L-AlaDHD NAD HCOO' FDH HCOONH4 68 63 Glu GluDH NAD HCOO' FDH HCOONH4 37 64 L-Ala L-AlaDHD NAD Glucose GDH HCOONH4 74 65 L-Ala L-AlaDHa NAD Glucose GDH NH4CI 68 a: L-Alanin-Dehydrogenase von Sigma. b: L-Alanin-Dehydrogenase von Fluka.

Die Enantiomerenüberschüsse betrugen in allen Fällen über 90 %. Die Ergebnisse belegen, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit den unterschiedlichsten Reak-tanten-Kombinationen ausführbar ist, wobei unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten (und folglich auch unterschiedliche Ausbeuten nach 24 h) und Enantiomeren-reinheiten erzielt werden. Der durchschnittliche Fachmann ist jedoch ohne übermäßiges Experimentieren in der Lage, die für das jeweilige Keton bzw. Aldehyd geeignete Kombination herauszufinden und diese wie in den obigen Beispielen dargelegt zu optimieren.

Somit stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wertvolle Erweiterung des Stand der Technik dar, da auf diese Weise auch verschiedenste andere Carbonylverbindungen als α-Aminosäuren mittels enzymatischer Katalyse auf wirtschaftliche und umweltfreundliche Weise sowie - im Falle von Ketonen - mitunter im Wesentli- -20- ·· ·· ·· • · · • · · • · · • · · ·· ·· • · • ··· • · · • · · ·%·· ·· • · · · · • · · ♦ · • · · · · • · · · · • ·· ·· ·· chen enantiomerenrein hergestellt werden können. Es werden ausschließlich kostengünstige Hilfssubstrate verbraucht, die für die Umgebung unschädlich und/oder in anderen chemischen Prozessen ersetzbar sind. Mittels eines einzigen Reaktionssystems, in dem eine Kombination nur dreier Enzyme zum Einsatz kommt, können unter bloßer Änderung des Hauptenzyms, d.h. der ω-Transaminase, beide Enantiomere chiraler Amine synthetisiert werden. Aufgrund der sehr einfachen Reaktionsführung ist ein Upscaling auf industrielle Maßstäbe problemlos möglich, weswegen die gewerbliche Anwendbarkeit der Erfindung außer Frage steht. -21 -

Claims (11)

1. * · · * Μ • I « · · • · · * M« • · · · · « • · · · · · ·· ·· ·· ···· Μ

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Aminen (2) aus den entsprechenden Carbonyl verbindungen (1) mittels gemeinsamer Durchführung mehrerer enzymatischer Katalyseprozesse gemäß folgendem Reaktionsschema A:

   NH, λ; (2) AD-red (3) AD-ox (4)

   NH4+ W /Enzym C\ HS-red (5) HS-ox (6) Schema A worin: R und R' ausgewählt sind aus Wasserstoff und unverzweigten, verzweigten und zyklischen Kohlenwasserstoffen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls Heteroatome und/oder Carboxylgruppen enthalten, wobei R und R' gegebenenfalls zu einem Ring verbunden sind, mit der Maßgabe, dass Carboxylgruppen nicht direkt an das Carbonyl-Kohlenstoff-atom gebunden sind, "AD-red" für einen Aminodonor in seiner reduzierten Form steht, "AD-ox" für den Aminodonor in seiner oxidierten Form steht, "CoF-red" für einen Cofaktor in seiner reduzierten Form steht, "CoF-ox" für den Cofaktor in seiner oxidierten Form steht, -23- φφ « · • φφφ • φ · • φ · #« Φ·ΦΦ ·· ·· t· • ♦ • · φ φ • · ·· ·« "HS-red" für ein Hilfssubstrat in seiner reduzierten Form steht und "HS-ox" für das Hilfssubstrat in seiner oxidierten Form steht, indem a) mittels einer ω-Transaminase als Enzym A eine Aminogruppe von einem Aminodonor (3) auf die Carbonylverbindung (1) übertragen wird, wobei das Amin (2) gebildet wird und geichzeitig der Aminodonor von der reduzierten Form (3) in die oxidierte Form (4) übergeführt wird, b) die oxidierte Form (4) des Aminodonors mittels eines Enzyms B, das eine von Ammoniak bzw. Ammoniumionen NH/ stammende Aminogruppe darauf überträgt, in die reduzierte Form (3) rezykliert wird, wobei gleichzeitig ein Cofaktor von der reduzierten in die oxidierte Form übergeführt wird, c) der oxidierte Cofaktor mittels eines Enzyms C - unter gleichzeitiger Oxidation eines Hilfssubstrats HS von der reduzierten Form (5) zur oxidierten Form (6) - in die reduzierte Form rezykliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylverbindungen (1) Ketone mit R und R' * H sind, aus denen im Wesentlichen enantiome-renreine Amine der folgenden Formel (2a) hergestellt werden:

   (2a)
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Aminodonor (3) ein Amin und als Enzym B eine Dehydrogenase eingesetzt werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Aminodonor (3) eine chirales Amin eingesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Aminodonor (3) eine α-Aminosäure und als Enzym B eine Aminosäure-Dehydrogenase eingesetzt werden. -24-
6. 6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als ω-Transaminase eine bakterielle Transaminase eingesetzt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine ω-Transaminase eingesetzt wird, in der Lage ist, sowohl Amino-donoren (3) mit (R)- als auch solche mit ^-Konfiguration als Cosubstrat zu nutzen.
8. 8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Cofaktor NAD, NADP, FAD oder FMN eingesetzt wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Cofaktor NAD oder NADP eingesetzt wird.
10. 10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfesubstrat HS und als Enzym C eine aus Formiat/Formiat-Dehy-drogenase, Glucose/Glucose-Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat/Glucose-6-phos-phat-Dehydrogenase und H2/Nucleotid-Hydrogenase ausgewählte Kombination eingesetztwird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kombination aus Ammoniumformiat und Formiat-Dehydrogenase eingesetzt wird. und Universität Graz / durch'.

    Wien, am | 7, Juni 2QW Angewandte Biokatalyse-Konpetenzzentom GmbH -25-