Verfahren zur Herstellung von (R)- und (S)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylestern durch enzymatische Reduktion
Die Erfindung betrifft ein Nerfahren zur Herstellung von (R)- und (S)-8-Chlor-6-hydroxy- octansäurealkylestern der Formel I durch enzymatische Reduktion einer geeigneten prochi- ralen Ketoverbindung.
R = Alkyl
Die Synthese der -Liponsäure im technischen Maßstab erfolgt ausgehend von 8-Chlor-6- oxo-octansäurealkylestern, welche durch ΝaBH4-Reduktion in 8-Chlor-6-hydroxy-octansäure- alkylester überfuhrt werden (Lit.: Kleemann und Engel, Pharmaceutical Substances, 3rd Ed., Thieme, 1999, S. 1860). Durch eine nachfolgende dreistufige Synthesesequenz wird die racemische α-Liponsäure in hoher Gesamtausbeute erhalten. Neben der Synthese von racemi- scher α-Liponsäure ist auch die Synthese der reinen Enantiomere zum gezielten pharmazeutischen Einsatz von großer Wichtigkeit (siehe dazu z.B. EP 04 27 247). Es bietet sich an, die Synthese der reinen Enatiomeren analog dem etablierten wirtschaftlichen Syntheseverfahren des racemischen Wirkstoffes durchzuführen. Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Darstellung der enantiomerenreinen Zwischenstufen entwickelt, siehe unter anderem DE- A- 19533882. Enantioselektive Reduktionen prochiraler Ketonverbindungen zu chiralen sekundären Alkoholen, welche als Zwischenstufen in alternativen Syntheserouten zu enantiomerenreinen α-Liponsäuren fuhren, finden sich in DE-A-197 09 069. Bei allen Nerfahren werden vielstufige Synthesesequenzen durchlaufen, die teilweise mit aufwendigen Reinigungsoperationen verbunden sind oder aber auf Racematspaltung ( DE 4137773 ) basieren, wodurch - ohne Rückführung durch Racemisierung oder Inversion - die maximale Ausbeute eines Enantiomers 50% beträgt. Die niedrige Gesamtausbeute dieser Nerfahren lassen diese als wirtschaftlich unrentabel erscheinen. Keines der beschriebenen Nerfahren basiert auf einer
direkten, einstufigen Darstellung einer enantiomerenreinen Zwischenstufe des etablierten wirtschaftlichen Verfahrens zur Synthese der racemischen α-Liponsäure. Die Aufgabe der Erfindung bestand also darin, ein Verfahren zur Herstellung bestimmter Zwischenprodukte zur Herstellung der (R)- und (S)- α-Liponsäure und der (R)- und (S)- α- Liponsäure selber anzugeben, das eine Herstellung dieser Verbindungen sowie der Zwischenprodukte mit hoher Ausbeute und hoher Enantiomerenreinheit möglich macht. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass man 8-Chlor-6-oxo-octansäurealkylester enzyma- tisch mittels Alkoholdehydrogenasen oder Carbonylreduktasen reduziert. Bei dieser Umsetzung erhält man entweder den (R) oder (S)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester der im Anspruch angegebenen Formel (R)-LT oder (S)-LT.
Die Erfindung geht auf die Erkenntnis zurück, dass der eingesetzte Ausgangsester in einfacher Weise und sehr wirkungsvoll mittels bekannter Alkoholdehydrogenasen bzw. Carbonylreduktasen reduziert werden kann. In der Literatur findet man gewisse Hinweise, dass sich Dehydrogenasen zur Synthese von chiralen Verbindungen eignen könnten (siehe unter anderem Kragl und Kula, in Stereoselecti- ve Biotransformations, Herausgeber R. Patel, Marcel Dekker, 2000, Seiten 839-866.) Die allgemeinen Aussagen dieser und ähnlicher Literaturstellen lassen sich aber nicht auf komplexe Ausgangsverbindungen übertragen. Ein Fachmann befürchtet hier regelmäßig Nebenreaktionen sowie eine verminderte Enantioselektivität. So konnte in der Literatur nur ein Beispiel für die biokatalytische Reduktion eines Chlorethylketons gefunden werden (Mele et al., J. Org. Chem. 1991, 56, 6019). Hierbei wird durch Ganzzellbiotransformation (Saccharomyces cerevisiae) ein Chlorethyl-aryl-keton zum chiralen sekundären Alkohol reduziert. Die Reduktion verläuft weder hoch chemo- noch hoch enantioselektiv. Bei der Reduktion von Chlor- ethylketonen mit Biokatalysatoren, die wie im Fall von Verbindungen der Formel I einen zweiten sperrigen Substituenten besitzen, ist aufgrund des hohen Raumanspruches der Substituenten eine Vorhersage, ob ein bestimmter Biokatalysator eine solche Verbindung als Substrat akzeptiert, nicht möglich.
Aus J. Org. Chem. 66, 8682-84 (2001) geht hervor, dass man ein 8-Chlor-3-hydroxy- oxtansäurealkylester durch Reduktion aus dem entsprechenden Keton mit gereinigter Carbo- nylreduktase und ganzen Zellen erhalten kann. Die EP 0 939 132 AI offenbart eine enzymatische Reduktion von 4-Halogen-3-ketobuttersäureestern. In J. Org. Chem. 63, 1102-08 (1998) wird die Reduktion von 3-Chlor-4-keto-octansäureethylestern beschrieben. Aus EP 0 487 986
A2 ist bekannt (3S)-3-Hydroxyoctandisäurediester zur Herstellung von Liponsäure durch Reduktion mit Bäckerhefe zu erhalten.
Überraschenderweise zeigen verschiedene Alkoholdehydrogenasen und Carbonylreduktasen eine hohe Akzeptanz bezüglich der Verbindungen der Formel I als Substrat (analytischer Assay), welche auch in präparativen Umsetzungen bestätigt werden konnte.
Die Erfindung wird in Anspruch 1 und weiteren abhängigen Ansprüchen genauer angegeben. Bei der erfindungsgemäßen Umsetzung kommen allgemein bekannte Cofaktoren zum Einsatz, wie beispielsweise NAD(H), NADP(H), FADH . Vorzugsweise verwendet man NAD(H) oder NADP(H). Die Konfiguration der erhaltenen 8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester wird von dem eingesetzten Enzym bestimmt. So werden durch Reduktion von 8-Chlor-6-oxo-octansäure- alkylestern mittels Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobium brokii enantiomerenreine (R)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester erhalten. Im Falle der Reduktion mittels Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase wird enantioselektiv (S)-8-Chlor-6-hydroxyoctansäure- alkylester (ee > 65%) gebildet. Enzyme, welche eine Aktivität mit den Verbindungen der Formel I als Substrat zeigen, sind in nachfolgender Tabelle aufgeführt. Die Enzyme sind kommerziell erhältlich.
Die Ausgangsverbindungen zur Herstellung der Zwischenprodukte, die prochiralen-8-chlor-6- oxo-octansäurealkylester können auf bekanntem Wege gewonnen werden (L.J.Reed et al., J. Am. Chem. Soc. 1955, 774, 416).
Y-ADH Hefe-Alkoholdehydrogenase
HL-ADH Pferdeleber-ADH
READH Rhodococcus erythropolis-ADK CPCR Candidaparapsilosis-Caxbo__y\τQάuktase
CEADH Candida boidinü-ADH
Ei ADH Lactobacillus kefir-ADH
EEADH Lactobacillus brevis-ADH
TBAOH Thermoanaerobium brokii-ADU
TΕA Triethanolamin
Tris Trishydroxymethylaminomethan
Kpi Gemisch Monokalium- und Dikaliumphosphat DTT Dithiothreitol
Für präparative Umsetzungen erweist es sich als vorteilhaft ein Cofaktorregenerierungssystem in die enzymatische Biotransformation einzubeziehen. Als besonders vorteilhaft erweisen sich Cofaktorregenerierungssysteme, welche eine Gleichgewichtsverschiebung der Hauptreaktion bewirken. So kann beispielsweise im Fall von Reduktionen mit Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase vorteilhaft eine substratgekoppelte Cofaktorregenerierung in Gegenwart eines Überschusses eines sekundären Alkohols (z.B. 2-Propanol) erfolgen. Alternativ können
enzymgekoppelte Cofaktorregenerierungssysteme (z.B. Formiatdehydrogenase
(FDH)/Formiat) eingesetzt werden, die dazu genutzt werden können, NAD(P) zu NAD(P)H zu reduzieren. Das entstehende CO aus der Oxidation des Cosubstrates Natrium-Formiat entweicht als Gas und wird so dem Gleichgewicht entzogen. Es sind sowohl NAD- als auch NADP-abhängige Formiatdehydrogenasen in der Literatur beschrieben und kommerziell erhältlich.
Die absolute Konfiguration der optischen Isomere der 8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester der Formel I wurde mittels Vergleich der Vorzeichen der spezifischen optischen Drehwerte mit Literaturdaten ( Gewald et al. , DE 195 33 881 ) bestimmt. Weiterhin wurden die relativen Gehalte der optischen Isomere der 8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester der Formel I durch GC an Säulen mit chiraler Phase mit einer Nachweisgrenze von < 0.5% ermittelt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die (R)- und (S)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäure- alkylester der Formel I auf einfache und wirtschaftliche Weise in hoher chemischer und optischer Ausbeute (theoretisch 100% chemische und optische Ausbeute) in einem einstufigen Verfahren zugänglich zu machen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der in dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen enantiomerenreinen Octansäurealkylester zur Herstellung von (R)- oder (S)-α- Liponsäure in an sich bekannter Weise. Üblicherweise werden in den bekannten Verfahren die Chlorhydroxyoctansäurealkylester in die korrespondierenden Dichloroctansäurealkylester umgewandelt. Die bekannte Liponsäurestruktur erhält man dann in einem weiteren Reaktionsschritt durch Schwefeleinführung.
Als Beispiel für die enantioselektive Herstellung eines 8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkyl- esters entsprechend der vorliegenden Erfindung wird im folgendem Schema die Herstellung des enantiomerenreinen (R)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäuremethylesters gezeigt.
NADPH NADP
.CO.
NaHCO,
FDH
In analoger Weise sind (S)-8-Chlor-6-hydroxy-octansäurealkylester zugänglich, indem als Biokatalysator beispielsweise Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase eingesetzt wird. Die Synthese von (+)- und (-)- α-Liponsäuren ausgehend von (+)- und (-)-8-Chlor-6-hydroxy- octansäurealkylestern kann entsprechend den bekannten Nerfahren durchgeführt werden. Die Erfindung wird durch nachfolgendes Beispiel näher erläutert.
Beispiel 1
100 mg (0.5 mmol) 8-Chlor-6-oxo-octansäuremethylester (Substrat), gelöst in 50 ml 50 mM TRIS-Puffer pH 7, enthaltend 0.1 mM DTT und 0.5 mM ΝADP, werden mit jeweils 2 U / mg(Substrat) TBADH und FDH (ΝADP-abhängig) versetzt und bei 37°C gerührt. Aufarbeitung nach Standardmethoden liefert enantiomerenreinen (ee > 99.5%) (i?)-8-Chlor-6-hydroxy- octansäuremethylester (Produkt).