ES2345734T3 - Proceso para la preparacion de aminas quirales opticamente activas. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación de una amina quiral ópticamente activa y piruvato como subproducto alfa-cetona que comprende: a) proporcionar un aceptor amino y alanina como donante amino, b) hacer reaccionar el aceptor amino y el donante amino con una transaminasa selectiva de (R) o (S), c) obtener la amina quiral ópticamente activa deseada y piruvato como subproducto alfa-cetona y d) eliminar el piruvato de la mezcla de reacción con una descarboxilasa.
Description
Proceso para la preparación de aminas quirales
ópticamente activas.
La presente invención está relacionada con un
proceso para la preparación de aminas quirales ópticamente
activas.
activas.
Las aminas quirales tienen un papel importante
en la industria farmacéutica, agroquímica y química. Frecuentemente
se utilizan como intermediarios o sintones para la preparación de
varias sustancias fisiológicamente activas, por ejemplo
farmacéuticamente activas, como derivados de la cefalosporina o
pirrolidina. En un gran número de las diferentes aplicaciones de
las aminas quirales, sólo una forma ópticamente activa concreta, el
enantiómero (R) o el (S) posee la actividad fisiológica deseada.
Por lo tanto, existe la clara necesidad de proporcionar procesos
para la preparación de aminas quirales en forma ópticamente
activa.
Estas necesidades se cubren parcialmente
preparando aminas quirales mediante cristalización de sales
diastereoméricas mediante la adición de ácidos carboxílicas
quirales (Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116,
806-843). Otros métodos químicos utilizan la
síntesis enantioselectiva mediante la reducción de precursores
proquirales con dobles enlaces C=N.
Además, es conocida la escisión estereoselectiva
de racematos utilizando varias enzimas, como proteasas, amidasas o
lipasas (Bornscheuer y Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis
(2005), Wiley-VCH Weinheim). También es conocido
que las transaminasas específicas, es decir
\alpha-transaminasas, lo que incluye las
aminotransferasas de \alpha-aminoácidos, son
adecuadas para la preparación de aminoácidos ópticamente puros
(Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62,
3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng.
(2003) 83, 226-234, JP 011 53084 A2 (1998), JP 633
04986 A2 (1988), PE 0 248 357 A2 y Ziehr et al., Biotechnol.
Bioeng. (1987) 29, 482-487).
Shin y Kim (Biotechnology and Bioengineering,
1999, 65 (2), 206-211) describen un proceso para la
síntesis asimétrica de aminas quirales con una
\omega-transaminasa (Vibrio fluvialis
JS17).
Hwang y Kim (Enzyme and Microbial Technology,
2004, 34, 429-436) describen un proceso para
producir aminas quirales ópticamente activas mediante la reacción
de un aceptor amino y un donante amino en presencia de una
\omega-transaminasa.
Cho et al. (Biotechnology and
Bioengineering, 2003, 81 (7), 783-789) describen una
síntesis simultanea de un (S)-aminoácido
enantioméricamente puro y (R)-aminas utilizando
reacciones transaminasa acopladas.
Sin embargo, estos procesos anteriores poseen
varias desventajas. Aunque los procesos enzimáticos habitualmente
utilizan unas condiciones moderadas favorables, al contrario que los
métodos clásicos, y consiguen una estereoselectividad razonable,
estos utilizan regularmente enzimas, cuya especificidad de
substrato, enantioselectividad y/o tasas de conversión no son
suficientemente elevadas para aplicarse a procesos industriales.
Además, una de las desventajas más importantes de utilizar
transaminasas para la preparación de aminas ópticamente activas la
representa el fenómeno frecuentemente observado de inhibición del
sustrato y el producto. Por lo tanto es uno de los objetivos de la
presente invención proporcionar un proceso mejorado para preparar
aminas quirales ópticamente activas, en particular un proceso con
una especificidad de sustrato mejorada, una enantioselectividad
mejorada y en particular que permite una conversión de los eductos
de hasta el 100%.
La presente invención soluciona los problemas
técnicos subyacente a la presente invención al proporcionar un
proceso para la preparación de una amina quiral ópticamente activa y
piruvato como subproducto \alpha-cetona que
comprende a) proporcionar un aceptor amino y alanina como donante
amino, b) hacer reaccionar el aceptor amino y el donante amino con
una transaminasa selectiva de (R) o (S), c) obtener la amina quiral
ópticamente activa deseada y piruvato como un subproducto
\alpha-cetona y d) eliminar el piruvato de la
mezcla de reacción con una descarboxilasa. De acuerdo con una
realización preferible de la presente invención, en un paso
subsiguiente adicional opcional del proceso, la amina quiral
ópticamente activa obtenida en los pasos c) y d) se aísla y
purifica a partir de la mezcla de reacción obtenida en los pasos c)
y d).
\newpage
La reacción de la presente invención sigue el
principio del siguiente esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un proceso para la síntesis asimétrica de aminas quirales mediante
la utilización de al menos una transaminasa para la transaminación
de un grupo amino a partir de alanina como donante amino a un
aceptor amino, formándose así el producto deseado. Dependiendo de la
preferencia de enantiómero de la transaminasa específica utilizada,
se obtiene una amina quiral ópticamente activa de la configuración
óptica deseada, es decir el enantiómero (R) o (S). Por lo tanto,
utilizar en una realización de la presente invención una
transaminasa selectiva de (S) para la síntesis asimétrica genera el
enantiómero (S) deseado de la amina quiral mientras utilizar en
otra realización de la presente invención una transaminasa
selectiva de (R) genera el enantiómero (R) deseado. Además de las
aminas activas ópticamente deseadas, la reacción resulta en
piruvato como un subproducto \alpha-cetona a
partir del donante amino utilizado y posiblemente del aceptor amino
y donante amino no convertidos.
En el contexto de la presente invención, una
transaminasa es una enzima dependiente de piridoxalfosfato que
cataliza la transferencia de grupos amino. Las transaminasas se
clasifican como E.C. 2.6.1.X. En una realización particularmente
preferible de la presente invención, la transaminasa es una
transaminasa selectiva de (R) o (S), en particular en una
realización preferible es una
\omega-transaminasa.
En el contexto de la presente invención una
\omega-transaminasa es una enzima preferiblemente
con el código de clasificación E.C.2.6.1.18. Estas
aminotransaminasas se caracterizan porque utilizan
principalmente aminas como sustratos. Estas enzimas también se
caracterizan por mostrar una constante de equilibrio de las
reacciones catalizadas por \omega-transaminasas
que es superior a 1. Las \omega-transaminasas que
pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen
por ejemplo en Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25,
1843-1846, Shin et al., Biotechnol. Bioeng.
(1997) 55, 348-358, Shin y Kim, Book of Abstracts,
217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March
21-25, (1999) 180, Shin y Kim, Biosc. Biotechnol.
Biochem. (2001) 65, 1782-1788 y Shin y Kim,
Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534-540.
Por lo tanto, en una realización preferible de
la presente invención, la transaminasa selectiva de (R) o (S), en
particular la \omega-transaminasa selectiva de (R)
o (S) utilizada en el presente proceso es una transaminasa
selectiva de (R) o (S), en particular una
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S)
obtenida de Vibrio fluvialis, en particular a partir de la
cepa JS17. En una realización más preferible, la transaminasa
selectiva de (R) o (S) es de Alcaligenes denitrificans, en
particular de la cepa Y2k-2. En una realización más
preferible, la transaminasa selectiva de (R) o (S) es de
Klebsiella pneumoniae, en particular de la cepa YS2F. En una
realización más preferible, la transaminasa selectiva de (R) o (S)
es de Bacillus thuringiensis, en particular de la cepa JS64. Para
la nomenclatura de las cepas véase Shin y Kim, 1998, mencionado
anteriormente. Por supuesto, la presente invención también incluye
bajo el término transaminasa selectiva de (R) o (S), y en particular
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S), un
extracto de un organismo, como un microorganismo o una célula, que
contiene una transaminasa selectiva de (R) o (S), en particular una
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S), o una
célula o microorganismo vivo o muerto que comprende por sí mismo una
transaminasa selectiva de (R) o (S), en particular una
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S). Tal
microorganismo o célula o extracto o enzima transaminasa selectiva
de (R) o (S) puede utilizarse en forma inmovilizada o no
inmovilizada. La transaminasa selectiva de (R) o (S), en particular
la \omega-transaminasa selectiva de (R) o (S),
puede ser también una transaminasa selectiva de (R) o (S) obtenida
de forma recombinante, o de aparición natural o modificada
genéticamente, en particular una
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S), que
está codificada parcialmente o completamente por una secuencia de
ácido nucleico o un derivado del mismo contenido en uno de los
organismos anteriormente identificados o equivalentes a estos.
En el contexto de la presente invención el
término amina quiral ópticamente activa está relacionado con el
mismo sujeto o materia que el término amina quiral
enantioméricamente activa. Estos términos en particular se refieren
a una preparación que está esencialmente pura, y en una realización
aún mas preferible libre del enantiómero no deseado. De acuerdo con
esto, una amina quiral ópticamente activa esencialmente comprende un
exceso de un enantiómero o incluso consiste sólo en un
enantiómero.
En particular, en el contexto de la presente
invención, una amina quiral ópticamente activa posee una pureza
óptica de al menos un 70%, en particular más del 90% y en el mejor
de los casos >99%.
En la presente invención, la pureza óptica se
proporciona en el % de exceso de un enantiómero respecto al otro
enantiómero. Por lo tanto, la pureza óptica en % es el cociente de
la diferencia entre las concentraciones de enantiómero (R) y de
(S), y el sumatorio de las concentraciones de ambos enantiómeros
(pureza óptica de A en % = ([A]-[B]):([A]+[B]) x 100, en el que A y
B representan las concentraciones de los enantiómeros (R) y (S) o
viceversa).
En la presente invención, es preferible que el
aceptor amino se convierta en la amina quiral deseada en una
conversión de al menos un 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 y en particular
un 100%. Las concentraciones para analizar la pureza óptica y la
conversión pueden determinarse por ejemplo mediante cromatografía de
gases (GC) o métodos foto- o fluorométricos.
En el contexto de la presente invención un
aceptor amino es una molécula capaz de aceptar un grupo amino
transferido desde un donante amino por una transaminasa selectiva
de (R) o (S), en particular una
\omega-transaminasa selectiva de (R) o (S). En
una realización particularmente preferible de la presente invención,
el aceptor amino contiene una funcionalidad cetona. En una
realización particularmente preferible de la presente invención el
aceptor amino se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido
fenilpirúvico, una sal del mismo, ácido pirúvico, una sal del
mismo, acetofenona, 2-cetoglutarato,
3-oxobutirato, 2-butanona,
3-oxopirrolidina (3-OP),
3-piridilmetilcetona (3-PMK), éster
etílico del ácido 3-oxobutírico
(3-OBEE), éster metílico del ácido
3-oxopentanoico (3-OPME),
N-1-boc-oxopiperidinona,
N-1-boc-3-oxopirrolidina
(B3OP), 3-oxo-piperidina,
alquil-3-oxo-butonoates,
metoxiacetona y 1-oxotetralona.
En una realización particularmente preferible el
aceptor amino es B3OP.
En el contexto de la presente invención un
donante amino es una molécula capaz de proporcionar un grupo amino
a un aceptor amino utilizando una transaminasa selectiva de (R) o
(S), en particular una \omega-transaminasa
selectiva de (R) o (S).
Son donantes amino la
\beta-alanina, alanina, en particular
D,L-alanina, L-alanina o
D-alanina. Los productos cetona son el ácido
fenilpirúvico, una sal del mismo, ácido pirúvico, una sal del mismo,
ácido glioxílico, una sal del mismo, acetofenona,
2-cetoglutarato, acetona,
3-oxobuti-rato,
2-butanona, 3-oxopirrolidina
(3-OP),
3-piridilmetil-cetona
(3-PMK), éster etílico del ácido
3-oxobutírico (3-OBEE), éster
metílico del ácido 3-oxopentanoico
(3-OPME),
N-1-boc-3-oxopiperidinona
y
N-1-boc-3-oxopirrolidina
(B3OP) o una sal, por ejemplo un cloruro, de cualquiera de los
mismos. El subproducto \alpha-cetona de acuerdo
con la presente invención es piruvato.
De acuerdo con la presente invención el donante
amino es alanina, en particular L-alanina.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con un proceso para la preparación de
una amina quiral ópticamente activa que se selecciona de entre el
grupo de aminas con un grupo amino ópticamente activo, en
particular aminas con grupos alquilo, grupos alquilo ramificados o
grupos arilalquilo. En particular, estas aminas, en particular las
aminas mono- o bicíclicas, son en particular aminas cíclicas de 5 a
6 miembros, o hidrocarburos heterocíclicos S-, O- o
N-sustituidos, o aminas aromáticas, en particular
aminas aromáticas sustituidas con alquilo o alcoxi. En una
realización preferible, las aminas quirales obtenidas se seleccionan
de entre el grupo que consiste en fenilalanina, alanina,
3-aminopiperidina,
alquil-3-amino-butanoatos,
3-aminopirrolidina (3-AP),
3-piridil-1-etilamina
(3-PEA),
N-1-boc-3-aminopirrolidina
(B3AP), éster etílico del ácido 3-aminobutírico
(3-ABEE), éster metílico del ácido
3-aminopentanoico (3-APME),
\alpha-metil-bencilamina
(\alpha-MBA), 1-aminotetralina,
\alpha-metil-4-(3-piridil)-butanamina,
glutamato, \beta-aminobutirato,
sec-butilamina, metoxiisopropilamina, derivados de
la 3-aminopirrolidina,
1-N-Boc-3-aminopiperidina,
cefalosporina y derivados de la cefalosporina.
En una realización particularmente preferible,
la presente invención, por lo tanto, prevé hacer reaccionar 3OP con
una transaminasa selectiva de (S) o (R) y alanina como donante amino
para obtener 3AP (S) o (R) ópticamente activa.
En una realización más preferible, la presente
invención prevé hacer reaccionar 3-PMK con una
transaminasa selectiva de (R) o (S) y alanina como donante amino
para obtener 3-PEA (R) o (S) ópticamente activa.
En otra realización preferible de la presente
invención, la invención prevé hacer reaccionar
3-OBEE con una transaminasa selectiva de (R) o (S)
y alanina como donante amino para obtener 3-ABEE (R)
o (S) ópticamente activo.
En otra realización preferible, la invención
prevé hacer reaccionar 3-OPME con una transaminasa
selectiva de (R) o (S) y alanina como donante amino para obtener
3-APME (R) o (S) ópticamente activo.
En otra realización preferible, la invención
prevé hacer reaccionar B3OP con una transaminasa selectiva de (R) o
(S) y alanina como donante amino para obtener B3AP (R) o (S)
ópticamente activa.
\newpage
En una realización particularmente preferible la
invención está relacionada con una reacción entre B3OP y el donante
amino alanina, en presencia de una transaminasa para obtener B3AP
ópticamente activa y piruvato, en el que la reacción se realiza a
un pH de 5,0 a 9,5, preferiblemente de 6,0 a 7,0, en particular de
6,0 a 6,9, durante un periodo de tiempo de 30 a 70 minutos, en
particular de 40 a 65 minutos, en particular de 50 a 60
minutos.
En una realización particularmente preferible,
dicha transaminasa es una transaminasa selectiva de (R). En otra
realización preferible, dicha transaminasa es una transaminasa
selectiva de (S).
En una realización preferible, dicha reacción de
B3OP con el donante amino alanina se realiza en presencia de al
menos una descarboxilasa de piruvato (PDC). En otra realización
preferible, dicha reacción de B3OP con el donante amino alanina en
presencia de al menos una descarboxilasa de piruvato se realiza
mientras simultáneamente se introduce nitrógeno gaseoso en la
mezcla de reacción para la eliminación del acetaldehído obtenido del
piruvato formado por acción de la PDC.
En otra realización preferible, dicha reacción
de B3OP con el donante amino alanina en presencia de al menos una
descarboxilasa de piruvato se realiza en presencia de al menos una
alcohol deshidrogenasa (ADH) para la eliminación del acetaldehído
obtenido del piruvato formado por acción de la PDC.
En otra realización preferible, dicha reacción
de B3OP con el donante amino alanina, en presencia de al menos una
descarboxilasa de piruvato se realiza mientras se introduce
simultáneamente nitrógeno gaseoso en la mezcla de reacción, en la
que al menos una alcohol deshidrogenasa está presente en el medio de
reacción para eliminar el acetaldehído obtenido a partir del
piruvato formado por acción del PDC.
En otra realización preferible de la presente
invención, la invención prevé hacer reaccionar acetofenona con una
transaminasa selectiva de (R) o (S) y alanina como donante amino
para obtener \alpha-MBA (R) o (S) ópticamente
activa.
En otra realización preferible, la presente
invención prevé hacer reaccionar como aceptor amino, en particular
hidrocarburos mono- o bicíclicos, cíclicos de 5 a 6 miembros que
contienen grupos oxo o heterocíclicos S-, O- o
N-sustituidos o aromáticos, en particular aromáticos
sustituidos con alquilo o alcoxi, con alanina como donante amino y
una transaminasa selectiva de (R) o (S) para obtener aminas
ópticamente activas, en particular aminas mono- o bicíclicas, en
particular aminas cíclicas de 5 a 6 miembros o hidrocarburos
heterocíclicos S-, O- o N-sustituidos o aminas
aromáticas, en particular aminas aromáticas sustituidas con alquilo
o alcoxi, en particular en forma (S) o (R).
En una realización particularmente preferible de
la presente invención, el aceptor amino y el donante amino alanina
se hacen reaccionar con la transaminasa selectiva de (R) o (S) en
medio acuoso, por ejemplo un tampón fisiológico. En una realización
particularmente preferible la reacción de transaminación se realiza
a un pH en el rango de 5,0 a 9,5, de 5 a 9, en particular de 7 a
8,5. La invención prevé, en una realización particularmente
preferible, hacer reaccionar el aceptor amino y el donante amino a
un valor de pH entre 6,0 y 7,0, preferiblemente entre 6,0 y
6,9.
En una realización particularmente preferible,
la reacción se realiza en un rango de temperatura de 10 a 65ºC,
preferiblemente de 20 a 50ºC, en particular de 18 a 25ºC,
preferiblemente de temperatura ambiente o de 34ºC a 39ºC y en
particular a 37ºC. En otra realización preferible de la presente
invención, el aceptor amino y el donante amino se proporcionan en
una proporción molar de 1:50 a 1:200, en particular de 1:50 a 1:100,
en particular de 1:100, y en particular de 1:1 a 1:5, en particular
de 1:1 a 1:2. En una realización preferible de la presente invención
la actividad enzimática puede ser de 1 a 20.000 \mumol/min.
En otra realización preferible, la reacción se
realiza durante un tiempo de reacción de 30 a 70, preferiblemente
de 40 a 65, en particular de 50 a 60 minutos.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente
invención se proporciona un proceso para la preparación de una amina
quiral ópticamente activa de acuerdo con lo anteriormente
mencionado, lo que significa de acuerdo con ello que en un primer
paso del proceso a) se proporcionan un aceptor amino y como donante
amino alanina, en un segundo paso del proceso b) se hacen
reaccionar el aceptor amino y el donante amino con al menos una
transaminasa selectiva de (R) o (S), preferiblemente una
\omega-transaminasa, en un tercer paso del proceso
c) se obtienen una amina quiral ópticamente pura y piruvato como
subproducto \alpha-cetona, y en el que en un paso
adicional del proceso d) el subproducto cetona, en particular el
subproducto \alpha-cetona, obtenido en el paso c)
se elimina de la mezcla de reacción obtenida mediante una reacción
con una enzima, lo que significa por escisión enzimática utilizando
una descarboxilasa.
En una realización particularmente preferible,
el producto cetona, es decir el piruvato, obtenido en el paso c) se
elimina mediante la reacción con una descarboxilasa de piruvato
(PDC), por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas
mobilis o Zymobacter palmae, preferiblemente produciendo
así acetaldehído y CO2.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir el piruvato, obtenido se elimina mediante la acción de una PDC
y en el que el acetaldehído así formado se elimina por ejemplo
mediante un tratamiento químico, enzimático o físico.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir piruvato, obtenido se elimina por acción de una PDC y en el
que el acetaldehído así formado se elimina por ejemplo mediante la
alimentación de nitrógeno gaseoso en la mezcla de reacción,
preferiblemente mediante la alimentación de dicho nitrógeno gaseoso
de forma continua en la mezcla de reacción, para eliminar el
acetaldehído de la mezcla de reacción.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir piruvato, obtenido se elimina por acción de una PDC y en el
que el acetaldehído así formado se elimina haciendo reaccionar el
acetaldehído con al menos una alcohol deshidroxigenasa (ADH) para
eliminar el acetaldehído de la mezcla de reacción y convertirlo en
etanol.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir piruvato, obtenido se elimina por acción de una PDC y en el
que el acetaldehído así formado se elimina aplicando una presión
reducida a la mezcla de reacción.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir piruvato, obtenido se elimina por acción de una PDC y en el
que el acetaldehído así formado se elimina mediante reacciones
químicas.
En otra realización preferible, la invención
está relacionada con un proceso, en el que el producto cetona, es
decir piruvato, obtenido se elimina por acción de una PDC y en el
que el acetaldehído así formado se elimina alimentando nitrógeno
gaseoso en la mezcla de reacción, preferiblemente alimentando dicho
nitrógeno gaseoso de forma continua en la mezcla de reacción, y en
el que adicionalmente se hace reaccionar el acetaldehído con al
menos una alcohol deshidroxigenasa (ADH) para eliminar el
acetaldehído de la mezcla de reacción y convertirlo en etanol.
En otra realización preferible de la presente
invención, el producto cetona, es decir el piruvato, obtenido en el
paso c) se elimina de forma continua de la mezcla de reacción.
Estas realizaciones particularmente preferibles
proporcionan la ventaja de obtener una tasa de conversión
particularmente elevada, ya que el producto cetona como subproducto,
es decir el piruvato, del presente proceso se elimina de la
reacción de equilibrio. La reacción se fuerza en dirección de los
productos, proporcionando así una elevada estereoselectividad y una
muy elevada conversión a los productos deseados.
La presente invención también está relacionada
con procesos para la preparación de compuestos fisiológicamente
activos o sus precursores y/o intermediarios en la producción de los
mismos, en particular seleccionados de entre el grupo de derivados
de la 3-aminopirrolidina, cefalosporina, derivados
de la cefalosporina, ácido borónico heterocíclico,
L-dihidroxifenilalanina (LDopa),
\alpha-metildopa, D-fenilglicina,
\beta-hidroxifenilglicina, fosfinotricina,
derivados pirimido y derivados pirrolidona, en el que se utiliza
cualquiera de los procesos de la presente invención anteriormente
identificados. En el contexto de la presente invención, un compuesto
fisiológicamente activa es un compuesto que es fisiológicamente
activo en plantas, animales, humanos, levaduras o microorganismos,
como los protozoos, bacterias o virus, es decir que interacciona con
el metabolismo del organismo.
Otras realizaciones preferibles de la presente
invención son las descritas en las subreivindicaciones.
La presente invención se ilustra en más detalle
en los siguientes ejemplos y en las figuras que los acompañan.
Las figuras que los acompañan ilustran la
presente invención.
La Figura 1 muestra un cromatograma en capa
fina.
La Figura 2 muestra la actividad relativa de la
\omega-TA de V. fluvialis en función del
valor de pH.
La Figura 3 muestra la reducción relativa de la
concentración de B3AP en función de incubaciones con varias
sustancias.
La Figura 4 muestra la reducción relativa de la
conversión de B3AP en presencia de piruvato y acetaldehído.
La Figura 5 muestra la conversión de B3OP a B3AP
a lo largo del tiempo a varias presiones.
La Figura 6 muestra la conversión relativa de
B3OP a B3AP en presencia de varias PDC.
La Figura 7 muestra el efecto de un aumento de
la concentración de alanina y un aumento de la concentración de PDC
en la síntesis asimétrica de B3AP.
La Figura 8 muestra la conversión de B3OP a B3AP
a concentraciones de alanina aumentadas.
La Figura 9 muestra la conversión dependiente de
PLP relativa de B3OP a B3AP.
La Figura 10 muestra la conversión relativa de
B3OP a B3AP dependiente de la presencia de N2.
La Figura 11 muestra la conversión relativa de
B3OP a B3AP en presencia de una ADH.
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La síntesis asimétrica de B3AP se realizó en
tubos de reacción de 1,5 ml. Se utilizó B3OP como aceptor amino en
una concentración de 5 mM (7,5 \mumol). La concentración del
donante amino utilizado L-alanina fue de 5 mM. Los
reactivos y condiciones de reacción utilizados son evidentes a
partir de la Tabla 1 a continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
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El tampón utilizado fue fosfato sódico 50 mM, pH
7. TA7 indica la \omega-transaminasa de Vibrio
fluvialis (Jülich Fine Chemicals, Alemania). TA8 indica la w
transaminasa de Alcaligenes denitrificans (Jülich Fine
Chemicals, Alemania). Como lactato deshidrogenasa se utilizó un
extracto de Escherichia coli. Además, se utilizó NADH a una
concentración final de 10 mM. La concentración de descarboxilasa de
piruvato se varió. Se utilizaron 1,5 unidades (20 \mul) y 15
unidades (200 \mul) de la descarboxilasa de piruvato de
Saccharomyces cerevisiae (PDC1). Se utilizaron 2
unidades
(3,4 \mul) y 20 unidades (34 \mul) de la descarboxilasa de piruvato de Zymomonas mobilis (PDC2).
(3,4 \mul) y 20 unidades (34 \mul) de la descarboxilasa de piruvato de Zymomonas mobilis (PDC2).
En referencia a la tabla 2 anterior, es evidente
que en cada una de las seis series que utilizan la
\omega-transaminasa TAB, se pudo conseguir un
grado muy elevado de pureza óptica del (S)-B3AP
obtenido. También se observó que independientemente de si se
utilizaba TA7 o TA8 el grado de conversión sólo era moderado, si el
equilibrio de la reacción no estaba influenciado (serie 1).
Utilizando alanina en un exceso de 10-50 veces sólo
se mejora ligeramente la conversión. En las series 3, 4, 5 y 6 el
producto cetona de la reacción, es decir el piruvato, se eliminó
durante la reacción de transaminación de la reacción de equilibrio.
La utilización de TA8 junto con lactato deshidrogenasa de E.
coli (serie 6) dio lugar a un grado de conversión extremadamente
mejorado manteniendo e incluso mejorando la enantioselectividad.
Esencialmente lo mismo es válido para la enantioselectividad que
proporciona la descarboxilasa de piruvato de Zymomonas
mobilis (series de 3 a 5). PDC1, sin embargo, sólo aumenta
ligeramente la conversión, PDC2 aumenta la tasa de conversión de
forma moderada (serie 4) si se hace reaccionar durante 24 horas
mientras en una reacción de 72 horas (serie 5) la conversión se
mejoró de forma drástica. Todas las reacciones tuvieron lugar
durante 24 horas excepto la serie 5, que duró 72 horas.
La Figura muestra el cromatograma en capa fina
de las reacciones realizadas de acuerdo con la tabla 1. "A"
indica la \omega-transaminasa de Alcaligenis
denitrificans y "V" la \omega-transaminasa de
Vibrio fluvialis. "K" indica la serie 1 que utiliza
sólo TA7 o TA8 (serie 1). PDC1 indica la serie con de descarboxilasa
de piruvato Saccharomyses cerevisiae (serie 3), LDH la serie con
lactato deshidrogenasa de Escherichia coli (serie 6) y PDC2
la serie con descarboxilasa de piruvato de Zymomonas mobilis
(tras 24 y 72 horas) (serie 4 y 5). Por lo tanto, los resultados
claramente muestran que la producción de (S)-B3AP a
partir de la cetona proquiral B3OP puede realizarse con una
enantioselectividad muy elevada. Utilizando las
\omega-transaminasas como únicas enzimas en el
proceso de preparación, sin embargo, se consigue una conversión
moderado. Esta tasa de conversión moderada puede verse enormemente
mejorada si se elimina el piruvato del equilibrio, en particular
utilizando lactato deshidrogenasa o descarboxilasa de piruvato.
Utilizar la descarboxilasa de piruvato posee la ventaja, entre
otras, de que no es necesario el reciclado de cofactor (NADH).
Además proporciona de forma ventajosa la eliminación enzimática de
piruvato con PDC y por lo tanto proporciona la ventaja adicional de
eliminar o evitar la inhibición de producto (producto cetona) y tira
del equilibrio de la reacción hacia la derecha consiguiendo una
mayor conversión (caso ideal del 100%).
La serie 6 no pertenece a la presente
ilustración.
La síntesis se realizó en una cubeta de cuarzo
utilizando 50 \mul de piruvato 100 mM, 4 unidades/ml de
\omega-TA de Vibrio fluvialis (a partir de
aquí también Vfl) (12 \mul) y 388 \mul de tampón fosfato sódico
50 mM con variaciones de pH desde pH 6,0 a pH 7,4 en pasos de 0,2
unidades. La reacción se inició con 50 \mul de
(S)-\alphaMBA 100 mM como donante amino y se midió
el aumento de la absorción a entre 250 y 260 nm. El aumento de la
absorción es debido a la acetofenona formada. Los demás sustratos no
contribuyen de forma significativa a la absorción, de forma que la
velocidad de la reacción puede determinarse mediante la medida de
absorción de la acetofenona. El valor alcanzado a pH 7,4 se tomó
como el 100% y la actividad relativa en el resto de valores de pH
se calculó como es evidente a partir de la Figura 2. La Figura 2
muestra la actividad relativa de la \omega-TA de
V. fluvialis en relación a un valor de pH dado.
La Figura 2 muestra que a valores de pH menores,
como 6,0, 6,2 o 6,4 todavía se presenta una actividad considerable,
por ejemplo del 11% a pH 6.0. Por lo tanto, este resultado demuestra
que incluso a un pH bajo, es posible obtener una actividad
transaminasa significativa, permitiendo hacer reaccionar los
sustratos a un pH inferior, lo que a su vez permite aumentar la
conversión utilizando una PDC, que es sensible a valores de pH
superiores.
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En este ejemplo, se muestra la síntesis
asimétrica de B3AP a partir de alanina y B3OP en presencia y
ausencia de una descarboxilasa de piruvato (PDC).
Para cada valor de pH, 6,0, 6,4 y 7,0, se
realizaron tres series de experimentos. La serie 1 utilizó la PDC
de Zymomonas mobilis (extracto celular salvaje), la serie 2
utilizó la de Zymobacter palmae (recombinante en E.
coli) y la serie 3 era un control sin PDC, que utiliza sólo la
transaminasa. Para obtener resultados comparables, las actividades
de ambas PDC se han determinado a pH 6 con un ensayo alcohol
deshidrogenasa y se utilizó la misma cantidad de actividad de PDC
en las series identificadas anteriormente.
La Tabla 3 indica los volúmenes de sustancia
utilizada en \mul. Cada serie de reacción se realizó por
triplicado a valores de pH 6,0, 6,4 y 7,0. El valor de pH se ajustó
mediante el tampón de la solución de sustrato B3OP. La actividad de
la PDC fue de alrededor de 2,5 unidades/ml a pH 7. El sustrato y las
concentraciones de enzima también son evidentes a partir de la
tabla 3 a continuación. Se tomó una muestra de 100 \mul tras 10
minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, y la reacción se
detuvo mediante la adición de 100 \mul de NaOH 1M. La
cuantificación de la concentración de B3AP se realizó utilizando CE
(electroforesis capilar).
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La Tabla 4 a continuación muestra la conversión
a diferentes valores de pH para las diferentes PDC. Es evidente que
la utilización de la PDC aumenta la conversión. También es evidente
que la PDC de Z. palmae (Zpa) causa una es conversión algo
superior que la PDC de Z. mobilis (Zmo). También es evidente
que los valores de pH inferiores, como 6,0 o 6,4, dan lugar a un
aumento notable de la conversión en las series que utilizan PDC, lo
cual no se observa en el control sin PDC. En todas las series de
reacción podía observarse que tras 120 minutos la conversión
disminuía.
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Para mostrar la estabilidad de B3AP en presencia
de varios reactantes se realizaron incubaciones de B3AP 1 mM en un
tubo de reacción durante 3 horas en presencia de varias sustancias,
como se indica en la Tabla 5 a continuación.
El ejemplo se realizó a un pH de 6 y 7 (tampón
fosfato sódico). Inmediatamente tras hacer reaccionar las sustancias
se tomó una muestra inicial To, y otra muestra T1 tras 3 horas.
Después de la extracción se determinó la concentración de amina con
un estándar interno (\alphaMBA) mediante CE. A partir de la
diferencia de las concentraciones obtenidas, se calculó el % de
reducción de la concentración de B3AP (véase la Figura 3).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La Figura 3 pone en evidencia que los diferentes
reactivos no afectan significativamente a la concentración de B3AP
(series de 1 a 9). Las series de reacción de 11 a 13 muestran la
influencia del acetaldehído. La serie 11 pone de manifiesto que en
ausencia de una transaminasa no hay reducción de la concentración de
B3AP, mientras en presencia de una transaminasa y de acetaldehído
puede observarse una fuerte reducción en la concentración de B3AP.
El acetaldehído funciona en la reacción transaminasa como aceptor
amino, como el piruvato, y obviamente da lugar a una reducción en
la concentración de B3AP.
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En este ejemplo, se muestra la actividad
transaminasa de la \omega-TA de V.
fluvialis y A. denitrificans en los sustratos B3AP y
piruvato, y en B3AP y acetaldehído.
Se hizo reaccionar B3AP 2 mM con piruvato 2 mM o
acetaldehído 2 mM (se hicieron reaccionar 36 \mul de transaminasa
de Alcaligenes denitrificans (Ade) o 6 \mul de transaminasa
de Vibrio fluvialis (Vfl) por cada 0,5 \mul de volumen de
reacción, correspondientes a 2 unidades/\mul de transaminasa,
durante 30 minutos). La Figura 4 muestra los resultados. De acuerdo
con ello, se convirtió B3AP a B3OP mediante ambas enzimas, tanto
con piruvato como con acetaldehído, sin ninguna diferencia
significativa.
En este ejemplo, se aplicó una presión reducida
a la mezcla de reacción para una reacción de síntesis asimétrica
para formar B3AP. Como control, se realizó la misma reacción bajo
presión normal y sin PDC.
Condiciones de reacción:
- Volumen final: 1,5 ml
- Tampón fosfato sódico 50 mM, pH 6
- 300 \mul transaminasa de Vibrio fluvialis
- 60 \mul Zpa-PDC (corresponden a 8 unidades/ml a pH 7)
- B3OP 5 mM
- D,L-alanina 10 mM
- TPP, PLP 0,1 mM
- MgCl_{2} 5 mM
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Se aplicó la presión reducida utilizando un
evaporador rotativo (150 mBar). La medida se efectuó utilizando
CE.
La Figura 5 muestra la conversión de B3OP a B3AP
a lo largo del tiempo a diferentes presiones. Es evidente que la
conversión es prácticamente independiente de la presión aplicada. La
conversión a una presión de 150 mbar es, respecto a la máxima
conversión alcanzada, similar a la conversión a una presión de 1000
mbar.
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En este ejemplo, se utilizaron tres
descarboxilasas de piruvato diferentes para la síntesis asimétrica
de B3AP. Las condiciones de reacción corresponden a las del ejemplo
6, excepto por la utilización de un pH de 7. Se utilizaron las PDC
de Z. mobilis, Z. palmae y una PDC de Biocatalytics (nº
catálogo PDC-101). Las actividades de las PDC en en
ensayo ADH fueron idénticas (1,6 unidades/ml).
La Figura 6 muestra que las tres PDC resultan en
conversiones esencialmente comparables.
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En este ejemplo se muestra la influencia de la
concentración de PDC sobre la conversión de B3OP a B3AP utilizando
alanina como donante amino. Además, se muestra la influencia de la
concentración de alanina en la conversión de B3OP a B3AP.
Las condiciones de reacción se proporcionan en
el ejemplo 6, excepto por la utilización de un pH de 7 y excepto si
se indica de otro modo. Se utilizó la TA de Zymobacter
palmae.
Como se evidencia a partir de la Figura 7, en
una reacción sin PDC, un aumento de 5 veces de la concentración de
alanina, de 5 mM a 25 mM, resulta en una duplicación de la
conversión (conversión del 12% frente al 5,3% tras 2 horas). En
presencia de PDC, la conversión aumenta hasta duplicarse con un
exceso de alanina de 5 veces (del 30% frente al 17% tras 90
minutos). En el caso de que la cantidad de PDC se aumente a la
concentración de alanina habitual de 1,6 unidades/ml a 50
unidades/ml, la conversión también aumenta, sin embargo sólo en un
factor < 2 (del 29% frente al 17% tras 40 minutos).
En una serie adicional de experimentos, se
muestra la influencia de una combinación de exceso de alanina y
exceso de PDC, tanto a un pH de 6 como de 7. La reacción es más
rápida a pH 6, mientras que tras alcanzar una conversión del 49%,
la concentración de B3AP también disminuye más rápidamente. A un pH
de 7 la conversión alcanza el 56%.
En cuatro reacciones, se utilizaron
concentraciones de alanina de 5 mM, 25 mM, 110 mM, 300 mM y 500 mM.
Para cada serie, se añadió un control sin PDC y una reacción con
PDC. El valor de pH se ajustó a pH 7,0. Se tomaron muestras cada
media hora para un tiempo de reacción de 3 horas. Los tiempos de
reacción de las conversiones proporcionada en la Figura 8 fueron de
40 minuto a 5 mM, 60 minutos a 25 mM y 90 minutos de 110 a 500
mM.
La Figura 8 muestra la conversión de la síntesis
asimétrica de B3AP a concentraciones elevadas de alanina.
La Figura 8 muestra claramente que la conversión
puede alcanzar de un 60 a un 70%. Es evidente que aumentar la
concentración de alanina de 25 a 110 mM tiene un efecto
significativo sobre la conversión de B3OP a B3AP y que un mayor
aumento hasta 500 mM sólo influencia ligeramente la conversión. La
influencia de la PDC sobre la conversión se reduce a medida que
aumenta la concentración de alanina.
De los datos de la reacción control, se calculó
la constante de equilibrio de la síntesis de B3AP como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
y
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Así, utilizando la concentración de B3AP medida,
la constante de equilibrio se calculó como:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 6 muestra los valores calculados. Así
la constante de equilibrio para la reacción con B3AP es 3,1 x
10^{3}. De esta manera, el sustrato B3OP es un sustrato adecuado
para la síntesis asimétrica al contrario que otras cetonas.
En este ejemplo, se muestra la influencia de PLP
(piridoxal-5'-fosfato) en la
conversión de B3OP a B3AP. Se analizaron las siguientes series de
reacciones.
a) Serie 1 utilizando PLP 0,1 mM sin añadir PLP
adicional.
b) En la serie 2, el PLP se añadió durante la
reacción tan pronto como empieza a desaparecer el color amarillo,
que se debe a la presencia de PLP en el medio de reacción. Con este
propósito, se añaden de 1 a 2 \mul de una solución saturada de
PLP, manteniendo así un fuerte color amarillo. La influencia sobre
la concentración de amina a través de este ligero incremento en
volumen se considera que está por debajo del 1% y puede, por lo
tanto, considerarse negligible.
c) Sin PLP presente y sin PLP añadida.
Condiciones de reacción: 1 ml de volumen final,
37 \mul de Vfl-transaminasa, B3OP 5 mM, tampón
fosfato pH 7,0. La concentración de L-alanina fue
de 110 mM. Las mediciones tomadas mediante CE y
\alpha-MBA se utilizaron como estándar
interno.
La Figura 9 muestra la conversión a lo largo del
tiempo. No parece haber una influencia significativa en la
conversión máxima debido a la adición de PLP en la serie b) en
comparación con la serie a). La reacción sin PLP parece ser más
lenta, aunque alcanza la misma conversión que el resto de
reacciones. La adición de PLP en la serie b) provoca una ligera
mayor reducción en la concentración de amina cuando se compara con
la serie control.
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El siguiente ejemplo detalla una forma de
mejorar la conversión de la síntesis asimétrica de B3AP mediante la
eliminación de acetaldehído.
Condiciones de reacción:
- Sustratos:
- B3OP 5 mM
- L-alanina 500 mM
- Zpa-PDC 32 U/ml
- Vfl-transaminasa 37 \mul/ml
- Tampón fosfato sódico pH 7,0
- PLP 0,1 mM y TPP (tiamina difosfato)
- MgCl_{2} 5 mM
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Ya que la solución de reacción contiene una
cantidad significativa de proteína, existe una fuerte tendencia a
la formación de espuma. Para eliminar dicha espuma, se añadió 0,6
\mul de un concentrado de antiespumante A (Sigma, polímero de
silicona) a la serie de reacción. El concentrado suprimió la
generación de espuma en gran medida pero no la inhibió por
completo. Para excluir que dicho concentrado de antiespumante inhibe
las enzimas, se suplementó una serie control sin la adición de
nitrógeno con antiespumante A.
Ya que la adición de nitrógeno seco conduce a
una evaporación de agua de la solución de reacción, el nitrógeno se
humedeció.
La Figura 10 muestra las conversiones relativas
calculadas de B3AP. El control con antiespumante A
(N_{2}-control: Vfl-TA,
Zpa-PDC, antiespumante, sin nitrógeno N2) sin la
adición de nitrógeno corresponde exactamente con la serie de la
reacción sin antiespumante A (Vfl-TA, ZpaPDC). Así,
las enzimas no se ven influidas por la adición del concentrado de
antiespumante. La serie (serie N2: Vfl-TA,
Zpa-PDC, antiespumante, N2) tratada con nitrógeno
mostró un aumento de la conversión tras 60, 90 y 180 minutos.
Condiciones de reacción:
- Volumen final: 1 ml
- 3,7 \mul de Vfl-transaminasa
- 32 unidades/ml de Zpa-PDC o PDC Biocatalytics o 3,2 unidades/ml de Zmo PDC
- B3OP 5 mM
- L-alanina 500 mM
- Cofactores PLP 0,1 mM y TPP, MgCl_{2} 5 mM
- pH 7, fosfato sódico
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 10 muestra la conversión de B3OP a
B3AP para las series de reacción identificadas anteriormente que
combina la Vfl-transaminasa con cada PDC.
En la Figura 10 la serie designada N2 es la
serie que contiene Vfl-transaminasa y
Zpa-PDC tratadas con nitrógeno y antiespumante A.
El control N2 es una muestra que contiene
Vfl-transaminasa, Zpa-PDC y
antiespumante A sin tratamiento con nitrógeno. Es evidente que
existe un aumento significativo en la conversión del control N2 en
la muestra N2 debido a la presencia de nitrógeno, que se inyectó en
la solución de reacción. Así, al inyectar nitrógeno en su forma
gaseosa en el medio de reacción aumenta significativamente la
conversión de B3OP a B3AP.
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Para eliminar el acetaldehído producido por la
reacción de PDC de la mezcla de reacción, puede utilizarse el ADH
para convertir el acetaldehído en etanol.
Condiciones de reacción:
- L-alanina 110 mM
- B3Op 5 mM
- 37 \mul/ml de Vfl-transaminasa
- 32 unidades/ml de Zpa PDC PLP 0,1 mM y TPP
- MgCl_{2} 5 mM
- Tampón fosfato sódico, pH 7
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Se muestran las siguientes series de
reacción:
Serie de reacción 1: reacción con PDC y
transaminasa
Serie de reacción 2: reacción con PDC y
transaminasa con etanol 5 mM (concentración final) y adición de
NADH.
Serie de reacción 3: reacción con PDC, ADH y
NADH
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El ADH utilizado fue el ADH de Saccharomyces
cerevisae con una actividad entre 50 y 100 unidades/ml. La
actividad de PDC fue de 32 unidades/ml.
Al inicio de la reacción, se añadió etanol
absoluto a la serie de reacción 2 en una concentración final de 5
mM. Al inicio de la reacción, se añadieron 5 \mumol de NADH a las
series de reacción 2 y 3 que corresponden a una concentración final
de NADH 5 mM. Tras 10 minutos, se añadió otros 2,4 \mumol de NADH
(4 \mul de una solución 0,6 M de NADH en tampón fosfato 50 mM, pH
8,5). La solución NADH se almacenó en hielo y se preparó
inmediatamente antes de utilizarla.
Los resultados se proporcionan en la Figura 11 y
la tabla 5. El efecto del ADH es muy evidente. La conversión
aumenta hasta aproximadamente el 90%. La serie control 2 sin ADH y
etanol 5 mM sólo se desvió ligeramente de la serie control 1. Así,
la adición de ADH aumenta enormemente l conversión en la síntesis
asimétrica de B3AP a partir de B3OP.
Claims (18)
1. Un proceso para la preparación de una amina
quiral ópticamente activa y piruvato como subproducto
alfa-cetona que comprende: a) proporcionar un
aceptor amino y alanina como donante amino, b) hacer reaccionar el
aceptor amino y el donante amino con una transaminasa selectiva de
(R) o (S), c) obtener la amina quiral ópticamente activa deseada y
piruvato como subproducto alfa-cetona y d) eliminar
el piruvato de la mezcla de reacción con una descarboxilasa.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la descarboxilasa es una descarboxilasa de piruvato
(PDC).
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación
2, en el que el acetaldehído formado por acción de la PDC se
elimina.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el acetaldehído se elimina mediante su reacción con al
menos una enzima.
5. El proceso de acuerdo con la reivindicación
4, en el que la enzima es una alcohol deshidrogenasa.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el acetaldehído se elimina alimentando con nitrógeno
gaseoso la mezcla de reacción.
7. El proceso de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el acetaldehído se elimina aplicando una presión
reducida a la mezcla de reacción.
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación
3, en el que el acetaldehído se elimina mediante métodos
químicos.
9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el aceptor amino se
selecciona de entre el grupo que consiste en ácido fenilpirúvico,
una sal del mismo, ácido pirúvico, una sal del mismo, acetofenona,
2-cetoglutarato, 3-oxobutirato,
2-butanona, 3-oxopirrolidina
(3-OP), 3-piridilmetilcetona
(3-PMK), éster etílico del ácido
3-oxobutírico (3-OBEE), éster
metílico del ácido 3-oxopentanoico
(3-OPME),
N-1-boc-3-oxopiperidinona,
N-1-boc-3-oxopirrolidina
(B30P), 3-oxo-piperidina,
alquil-3-oxo-butonoatos,
metoxiacetona y 1-oxotetralona.
10. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las aminas obtenidas son
aminas monocíclicas o bicíclicas, en particular aminas cíclicas de 5
a 6 miembros o hidrocarburos heterocíclicos S-, O- o
N-sustituidas o aminas aromáticas, en particular
aminas aromáticas sustituidas con alquilo o alcoxi.
11. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las aminas obtenidas se
seleccionan de entre el grupo que consiste en fenilalanina, alanina,
3-aminopiperidina,
alquil-3-amino-buta-noatos,
3-aminopirrolidina (3-AP),
3-piridil-1-etilamina
(3-PEA),
N-1-boc-3-aminopirrolidina
(B3AP), éster etílico del ácido 3-aminobutírico
(3-ABEE), éster metílico del ácido
3-aminopentanoico (3-APME),
\alpha-metilbencilamina
(\alpha-MBA), 1-aminotetralina,
\alpha-metil-4-(3-piridil)-butanamina,
glutamato, \beta-aminobutirato,
sec-butilamina, metoxiisopropilamina, derivados de
3-aminopirrolidina,
1-N-boc-3-aminopiperidina,
cefalosporina y derivados de cefalosporina.
12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la
\omega-transaminasa es de Vibrio fluvialis,
Alcaligenes denitrificans, Klebsiella pneumoniae o Bacillus
thuringiensis.
13. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la amina quiral ópticamente
activa obtenida en los pasos c) o d) se elimina de la mezcla de
reacción.
14. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el proceso se realiza en
una mezcla de reacción con un pH de 5,0 a 9,5.
15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el proceso se realiza
durante un tiempo de reacción de 40 a 70 minutos.
16. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se realiza en
presencia de al menos una descarboxilasa de piruvato y al menos una
alcohol deshidrogenasa.
17. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se realiza en
presencia de al menos una descarboxilasa de piruvato, al menos una
alcohol deshidrogenasa y adicionalmente en presencia de nitrógeno
gaseoso (N2).
18. Un proceso para la preparación de un
compuesto fisiológicamente activo seleccionado de entre el grupo de
los derivados de 3-aminopirrolidona, cefalosporina,
derivados de cefalosporina, ácidos borónicos heterocíclicos,
L-dihidroxifenilalanina (LDopa),
\alpha-metildopa, D-fenilglicina,
\beta-hidroxifenilglicina, fosfinotricina,
derivados pirimido y derivados pirrolidona, en el que se utiliza el
proceso de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 17.
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