KR100360675B1 - 사이클로스포린a제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톨리포클레이디엄 에스피.에서 발효배지를 구성하여 사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 관한 것이다. 균류 집단체는 상기 발효배지에서 추출하여 메탄올 추출물을 얻고, 이를 증발하여 메탄올을 제거한 후 최초의 잔류물을 얻는다. 에틸아세트산 추출물은 상기 최초의 잔류물의 수용액에서 얻어지며 이를 변색.농축시켜서 두번째 잔류물을 얻게 되며 이를 정제시켜서 사이클로스포린 A를 제조하는 것이다.

Description

사이클로스포린 A 제조방법

본 발명은 톨리포클레이디엄 에스피.(Tolypocladium sp. )에서 사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 사이클로스포린 A는 이식수술시 장기의 거부반응을 방지하는 면역억제제로서 효과적으로 사용되고 있다. 종래의 사이클로스포린 A 는 톨리포클레이디엄 베리엄 펑거스(Tolypocladium varium fungus) 종의 균주를 배양시킴으로써 착체로 제조된다..

영국특허 제 2227489호는 사이클로스포린 착체 또는 그 조성물 즉, 사이클로스포린 A, 사이클로스포린 B와 사이클로스포린 C를 제조하기 위한 미생물학적 방법을 소개하고 있다. 종래의 상기 방법은 톨리포클레이디엄 베리엄 펑거스종을 영양배지에서 배양시킴으로써 사이클로스포린 착체의 제조를 설명한다.

영양배지는 탄소원, 유기 및 무기질소원과 미네랄염등이며 이들은 발효부용에서 널리 이용되고 있다. 발효는 통상적으로 호기성 조건하에 온도 25내지 30℃에서 행해진다. 이에 따라 제조된 사이클로스포린 착체는 분리, 정제하여 정제된 착체를 만드는 것이 바람직하다.

기존의 방법은 우선적인 발효배지로 질소원으로 펩톤, 황산 암모늄과 트립톤을 제안하고 있다. 또한 우선적인 탄소원으로서는 포도당, 말토스 및 소르비톨이 있으며 배양균인 톨리포클레이디엄 베리엄 펑거스종인 제 Cy/93 호는 NCAIM (P) F-001005으로 기탁되어 있다. 기존의 방법들은 오직 사이클로스포린 A만을 제조하는 방법과 98% 정도의 고순도를 가진 사이클로스포린 A를 제조하는 방법을 제시하지 못하고 있다.

본 발명의 목적은 사이클로스포린 A의 제조를 위하여 개선된 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 고순도를 가진 사이클로스포린 A를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 극히 균일한 순도의 사이클로스포린 A를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 신규한 균류 톨리포클레이디엄 에스피.를 사용하며 이는 NRRL, 제 18950호로 기탁되어 있다. 본 발명의 종들과 관련하여 톨리포클레이디엄의 다른 종들을 비교하면 다음 표 1과 같다.

표 1 톨리포클레이디엄의 다른 종들에 대한 특성비교

본 발명에 따르면, 톨리포클레이디엄 에스피.에서 사이클로스포린 A를 제조함에 있어서, 상기 톨리포클레이디엄 에스피.를 영양배지에서 발효시켜 발효된 배지를 얻고, 상기 발효된 배지에서 균류집단을 메탄올로 추출하여 그 메탄올 추출액을 얻는다. 그리고 나서 상기 추출액을 증발시켜서 메탄올을 제거하고 최초의 잔류물을 얻는다. 상기 수용액의 에틸아세트산 추출물을 제조한후, 이를 변색.농축시킴으로써 두번째의 잔류물을 얻으며, 이를 두가지 단계 즉, 첫번째 단계는 고체상의 실라카겔 컬럼과 이동상의 헥산, 클로로포름 및 메탄올의 용매혼합물이며, 두번째 단계는 고체상의 수지컬럼과 이동상의 메탄올에서 크로마토그래피로 두번째 잔류물을 정제하여 사이클로스포린 A를 제조한다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 두가지 형태의 발효방법 즉, 1) 정적인 발효방법과 고체기질 발효방법을 기술한다.

본 발명에 따르면, 우선 소량의 흙을 취하여 멸균수와 함께 섞어 현탁액을 만들고 나서 증류수로 몇배 희석시킨후 소량의 희석된 흙현탁액을 배양배지에 뿌린다.

배양배지는 pH 6.5를 유지하고 포도당, 펩톤, 한천 및 물로 구성된다. 황산스트렙토마이신등과 같은 항생제를 필요한 양만큼 배양배지에 첨가하여 세균의 번식을 방지하여야 한다.

상기와 같이 제조된 흙현탁액은 배양배지의 고체 표면위에 뿌리고 평판접시와 같은 적당한 용기위에 놓는다. 평판접시에서의 배양은 약 22∼30℃의 온도에서 행한다. 이렇게하면 수주일 후에 균류 콜로니의 실질적인 성장을 볼 수 있다. 균류 콜로니의 성장이 만족스럽다고 판단되는 경우에, 성장속도를 중단시킨다.

개개의 균류 콜로니를 시험관이 부착된 소량의 동일한 배양배지에 옮겨서 봉인하고 25℃에서 보관한다.

또한 나머지 콜로니는 현미경으로 조사하여 해당 속명을 확인한다. 그들중의 하나는 진균류인 톨리포클레이디엄의 특성을 가지고 있으며 그 내용을 표-1 에 제시한 바 있다. 본 발명의 톨리포플레이디엄 에스피.는 pH 4-6에서 유지시킨 포도당, 펩톤, 카제인산 가수분해물과 멸균수를 함유하고 있는 영양배지속에서 성장시키고나서, 고리형의 포자현탁액인 톨리포클레이디엄 에스피.를 pH 4-6의 맥아추출물, 효모추출물과 한천을 함유하는 한천 슬로프(slopes)에 접종시킨다. 따라서 본 궤도에 오를때까지 한천 슬로프에서 배양을 계속한다.

충분한 성장이 이루워진 경우, 그 배양물을 유리앰플로 옮겨서 동결건조시킨다.

고체상태의 발효에서 사이클로스포린 A를 얻기 위해서는, 우선 상기에서 얻어진 시험 균주를 액체배지에 접종한다. 충분히 성장시킨후 그 배양물을 멸균된 밀기울과 쌀기울을 함유하고 pH 4∼6으로 고정되어 있는 고체기질 발효접시에 옮긴다. 25∼30℃의 온도에서 통풍을 시키면서 상대습도를 85-90%로 유지시킴으로써 균류의 성장이 고체기질에서 나타난다. 영양배지에서 성장된 균류를 메탄올로 추출하고 이를 증발시켜서 최초의 잔류물을 얻는다. 이 잔류물을 멸균수에 용해시켜서 수용액을 만든다. 상기 총액의 에틸아세트산 추출물을 변색,농축하여 두번째 잔류물을 얻는다. 두번째 잔류물은 2단계의 컬럼 크로마토그래피를 거치는데 즉, l단계는 실리카겔 컬럼이며 2단계는 수지컬럼에서 행한다. 1단계에서 헥산, 클로로포름 및 메탄올의 배합비는 이동상으로 10:9:1이다. 두번째 단계의 크로마토그래피에서 메탄올이 이동상으로 사용된다. 고순도의 사이클로스포린 A는 이와같이 두단계의 크로마토그래피를 거쳐서 얻어진다.

정적인 발효방법으로 사이클로스포린 A를 얻기 위해서는, 우선 균종의 접종력을 증강시키기 위하여 시험 균주를 두가지 단계로 액체배지에 접종한다. 배지는 포도당, 펩톤, 카제인산 가수분해물 및 살균수로 구성된다. 1단계에서는 2∼3일간 배양시키고 또한 2단계에서는 25℃에서 2∼3일간 배양시키고 나서, 얻어진 접종물을 pH 4-6에서 포도당, 글리세롤, 카제인산 가수분해물, 펩톤의 맥아 추출물과 DL-알파아미노 부탄산 및 멸균수로 구성된 정적인 발효배지에 옮겨서 21일동안 발효를 시킨다. 또한 상기 배지는 2-6%의 포도당, 2-5.5%의 글리세롤, 1.5-5.5%의 카제인산 가수분해물, 0.5∼4.5%의 맥아추출물, 0.25∼2.5%의 펩톤, 0.1∼3%의 DL-알파아미노 부탄산 및 멸균수로 구성한다.

본 발명을 실시예에 따라 설명하면, 배지는 4%의 포도당, 4%의 글리세롤, 3%의 카제인산 가수분해물, 2%의 맥아 추출물, 1%의 펩톤과 0.5%의 DL-알파아미노 부탄산으로 구성된다.

사이클로스포린의 수율은 그 원료의 배합이 규정범위를 초과하는 경우 크게 낮아지게 된다.

상기 정적인 발효배지에서 성장시킨 톨리포클레이디엄 균류체를 여과시킨후에 회수된 진균체는 메탄올등의 유기용매로 추출한다. 메탄올 추출물로부터 메탄올을 증발시킨후 최초의 잔류물이 얻어지는데, 이 잔류물을 증류수에 용해시켜서 수용액을 만든다. 이 수용액을 에틸아세트산으로 추출하여 에틸아세트산 추출물을 만들고, 이 추출물은 나트륨으로 세척하여 증발시키면 두번째 잔류물을 얻게된다. 이 잔류물은 상기에서 기술한 두가지 단계의 컬럼 크로마토그래피로 분리하게 된다.

두가지의 컬럼 크로마토그래피 방법은 순도가 98%의 사이클로스포린 A를 제공한다. 하기의 공정도에서 정적인 발효단계를 이용하여 사이클로스포린 A의 전형적인 제조방법을 설명한다.

표-2

본 발명의 정적인 발효방법으로 제조된 사이클로스포린 A의 수율

Claims (16)

1. 톨리포클레이디엄 에스피.에서 사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 있어서, NRRL No. 18950으로 기탁된 톨리포클레이디엄 에스피.를 영양 배지에서 발효시켜 발효된 배지를 얻고, 상기 발효된 배지에서 균류집단을 메탄올로 추출하여 그 메탄올 추출액을 얻은후 상기 추출액을 증발시켜서 메탄올을 제거하고 최초의 잔류물을 얻으며, 상기 수용액의 에틸아세트산 추출물을 제조한후, 이를 변색.농축시킴으로써 두번째의 잔류물을 얻으며, 이를 두가지 단계 즉, 첫번째 단계는 고체상의 실라카겔 컬럼과 이동상의 헥산, 클로로포름 및 메탄올의 용매 혼합물이며, 두번째 단계는 고체상의 수지컬럼과 이동상의 메탄올에서 크로마토그래피로 두번째 잔류물을 정제함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 발효방법은 정적인 발효방법으로 시행함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 발효방법은 고체기질 발효방법으로 시행함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 영양배지에 접종되는 상기 톨리포클레이디엄 에스피.를 시험균주로 함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
5. 제 4 항에 있어서, 본 발명의 톨리포클레이디엄 에스피.는 pH 4-6에서 유지시킨 포도당, 펩톤, 카제인산 가수분해물과 멸균수를 함유하고 있는 영양배지속에서 성장시키고나서, 고리형의 포자현탁액인 톨리포클레이디엄 에스피.를 pH 4-6의 맥아추출물, 효모추출물과 한천을 함유하는 한천 슬로프에 접종시킴으로써 시험균주를 얻을때까지 한천 슬로프에서 배양을 계속함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
6. 제 1 항에 있어서, 발효배지에 접종하고자 두단계의 방법으로 접종물을 증강함음 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 첫번째 단계는 시험균주를 pH 4-6에서 포도당, 펩톤, 카제인산 가수분해물 및 멸균수로 구성된 배지에 옮겨서 3-4일 동안 성장하게 함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 두번째 단계는 첫번째 단계에서 얻어진 배양물을 pH 4-6에서 포도당, 펩톤, 카제인산 가수분해물 및 멸균수로 구성된 배지에 옮겨서 2-3일 동안 성장하게 함을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
9. 제 5 항에 있어서, 배양단계가 10-14일 동안 배양을 행해짐을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
10. 제 1 항과 2항에 있어서, 영양배지는 pH 4-6에서 포도당, 글리세롤, 카제인산 가수분해물, 맥아 추출물, 펩톤 DL-알파 아미노부탄산과 멸균수로 구성됨을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 2~6%의 포도당, 2~5.5%의 글리세롤, 1.5∼5.5%의 카제인산 가수분해물, 0.5∼4.5%의 맥아 추출물, 0.25∼2.5%의 펩톤, 0.1∼3%의 DL-알파아미노 부탄산 및 멸균수로 구성됨을 특징으로 하는 사이클로스포틴 A 제조방법.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 변색공정이 중탄산나트륨과 함께 에틸아세트산으로 세척되고 이어서 물로 세척됨을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 균집단체의 메탄올 추출물은 균집단체를 메탄올로 진탕하고 얻어진 메탄올 추출물을 순간 증발시켜서 끈적끈적한 잔류물을 얻음을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
14. 제 13 항에 있어서, 메탄올 추출물을 증류수에 용해시켜 수용액을 만든후 에틸아세트산으로 추출하여 에틸아세트산 분획을 얻고 이를 중탄산나트륨과 물로 세척됨을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
15. 제 14 항에 있어서, 에틸아세트산 분획의 농축물은 순간 증발로부터 얻어짐을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 용매혼합물은 헥산, 클로로포름과 메탄올의 구성비가 각각 10:9:1로 구성됨을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 제조방법.