CN1079837C - 从分枝层壁菌制备环胞多肽a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到从分枝层壁菌某种(TolyPocladium sp.)制备环胞多肽A的方法，包括制备上述TolyPocladium某菌种发酵培养基的步骤。从上述发酵培养基中提取真菌生物量而得到一甲醇提取液，通过蒸发去除甲醇而得到第一种残余物。从这第一种残余物水溶液中制备出乙酸乙酯提取液，对其脱色和浓缩而得到第二种残余物，对第二种残余物进行纯化步骤处理。
Description
本发明涉及从如下所述的分枝层壁菌(Tolypocladium sp.)中制备环胞多肽A的方法。
人们通常都知道，环胞多肽A作为器官移植手术中防止器官排斥的—种免疫抑制剂具有有益的用途。按照已知方法，环胞多肽可通过对变形分枝层壁菌(Tolypocladium varium)真菌菌株的培养而制备成复合物。英国第2227489号专利披露了生产环胞多肽复合物或其组分(即环胞多肽A、环胞多肽B和环胞多肽C)的一种微生物方法。该已知方法建议在一营养培养基上培养变形分枝层壁菌(Tolypocladium varium)真菌菌株来生产环胞多肽复合物。如同通常在发酵液体培养基中所用的那样，该营养培养基含有碳源、有机及无机氮源和无机盐。发酵象通常一样在有氧条件下进行，温度为25～30℃。如需要的话，将所生成的环胞多肽复合物加以分离，并提纯而生成纯化复合物。
该已知方法建议了一种优选的发酵培养基，它含有作为氮源的胨、硫酸铵和胰蛋白胨。优选的碳源为葡萄糖、麦芽糖和山梨糖醇。培养物变形分枝层壁菌Sp nov Cy/93存放号为NCAlM(P)F-001005。已知方法未提到仅生产环胞多肽A且其纯度不低于98％的方法。
本发明的目的在于提出一种制备环胞多肽A的改良性方法。
本发明的另一目的在于提出一种制备高产率环胞多肽A的方法。
本发明还有一个目的是提出一种制备具有基本均一纯度环胞多肽A的方法。
本发明使用了一新真菌分枝层壁菌(Tolypocladium)的某一菌种，其保藏号为NRRL 18950。与本发明中所用菌种相关的分枝层壁菌其它菌种的特性如表1所示。
表1
分枝层壁菌不同菌种特性之比较
| 特 性 | T.inflatum | T.Cylindrosporum | T.geodus | Tolypocladium sp. |
| 生 长菌 落Hypac-大小分生孢子梗瓶梗担孢小梗 | 缓慢白色、垫状毛茸茸大小：不明1-1.5-2μm短小、瓶梗具鳞状基础，侧面及未端有稠密的涡纹不明丝状 | 缓慢白色及米色、垫状毛茸茸，菌落背面无色大小：15-20mm1-1.5-3μm；细胞2.5-2.7μm长同T.inflatum大小：3-5×2-2.8μm细、丝状，有时弯曲大小：1.5-2×0.3-0.5μm | 缓 慢白色、垫状毛茸茸大小：不明1-1.5-2μm同T.inflatum不明丝状 | 正 常白色至米色、垫状毛茸茸，菌落背面为米黄色大小：20-30mm2-6μm；细胞6-30μm长短小、圆筒状瓶梗具鳞状基础，侧面及未端有涡纹大小：4-3×2-4μm细、丝状、有时弯曲大小：2-4×0.6-1.2μm |
表1(续)
| T.inflatum | T.Cylindrosporum | T.geodus | Tolypocladium种 | |
| 分生孢子 | 透明光滑单细胞 | 透明、光滑、单细胞；单个及20个或更多为组聚集，通常球形，有时近平行、圆筒状、有时圆未端略弯曲大小：4-5.8×1.2-1.6μm | 透明光滑单细胞 | 透明、光滑、单细胞球形至圆筒形有时圆未端略弯曲单独分生(2-4×1.2μm)和侧面及未端粘液头相聚集(数量为2-10，大小为2-6×1-3μm) |
依据本发明，可提供从如下的分枝层壁菌某菌种中制备环胞多肽A的一种方法，其包括：把上述分枝层壁菌某菌种在—营养培养基中发酵而得到一种发酵培养基，用甲醇从上述发酵培养基中提取真菌生物量而得到一甲醇提取液，通过蒸发步骤从上述提取液中去除甲醇而得到第一种残余物，从该残余物中制备出水溶液，再从该水溶液中制备出乙酸乙酯提取液，把该提取液脱色和浓缩而得到第二种残余物，然后分两步对其进行层析法提纯，即第一步是以硅胶柱为固相，而以己烷、氯仿和甲醇混合溶剂为移动相；第二步则以树脂柱为固相，以甲醇为移动相。
该方法细节将随后进行详尽讨论。其中包括两类发酵技术，即(i)静态发酵和(ii)固态底物发酵。
依据本发明，把少量土在无菌水中悬浮，然后用蒸馏水高度稀释。把所烯释的土壤悬浮液的一小部分撒在培养基上。
培养基的PH值可维持在6.5，内合右旋糖、胨、琼脂和水。在培养基中加入适量的试剂(硫酸链霉素)以防止细菌生长。
然后，把上述制备的土壤悬浮液撒在上述培养基的固体表面上，取合适的容器盛装，如陪氏培养皿。
在约22-30℃温度下对培养皿进行培育。7天后会注意到有大量真菌菌落生成。当认为真菌菌落的生长达到满意程度时就中止其生长。
把单个真菌菌落移到少量含有同上培养基成分的试管中，把试管口。封闭并在25℃条件贮存。
对菌落残余在显微镜下进行检查并鉴定至属水平。其中一个菌落具有分枝层壁菌真菌的特性，发现如表1所示。本发明中的这种分枝层壁菌菌种在—营养培养基上生长，该培养基含有葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和无菌水，PH保持在4-6之间；把—匙该菌种孢子悬浮液接种到琼脂斜面培养基上，斜面培养基含麦芽汁、酵母膏和琼脂，PH值为4-6，培养琼脂斜面培养基直到培养物达到操作程度。
当生长足够时，把培养物转移到玻璃安瓶中进行冻干处理。
在利用固相态发酵作用获取环胞多肽A的情况下，把如上得到的主种子接种到—液体培养基中。经过足够的生长后，把培养物转移到固体底物发酵浅盘中，盘中含无菌小麦麦夫/稻麦夫，PH值控制在4-6之间。将相对湿度维持在约85-90％，温度条件为25-30℃并通气，在固体底物上开始出现真菌的生长。把真菌生长连同营养培养基用甲醇进行提取并蒸发处理而得到第一种残余物，把该残余物溶于无菌水中而得到—水溶液。把该水溶液的乙酸乙酯提取液脱色并浓缩而得到第二种残余物。将第二种残余物进行二步层析法处理，第一步用硅胶柱，第二步为树脂柱。第一步中以己烷、氯仿和甲醇混合溶剂(比例为10∶9∶1)作为移动相。第二步层析中用甲醇作为移动相。于是在这两步层析中得到了高纯度的环胞多肽A。
在静态发酵方法中，把主种子分二阶段接种到—液体培养基中而形成该菌种的种菌。该液体培养基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和无菌水，培养3-4天，此为第一阶段。在25℃下培养2-3天，此为第二阶段，把所得到的种菌转移到静态发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖、甘油、酪蛋白酸水解物、麦芽汁、胨、PL-α氨基丁酸和无菌水，PH值为4～6，并发酵21天。上述培养基具体组成为2～6％的葡萄糖、2～5.5％的甘油、1.5～5.5％的酪蛋白酸水解物、0.5～4.5％的麦芽汁，0.25～2.5％的胨、0.1～3％的DL-α氨基丁酸，其余为无菌水。
举例来说，培养基含4％的葡萄糖、4％的甘油、3％的酪蛋白酸水解物、2％的麦芽汁、1％的胨、0.5％的DL-α氨基丁酸。
如果培养基成分超出上述范围，环胞多肽A的产量就非常低。
将在上述静态发酵培养基上生长的Tolypocladium真菌生物量进行过滤，把由此回收的真菌生物量在有机溶剂(如甲醇)中进行提取。把甲醇从该甲醇提取液中蒸发掉而得到第一种残余物，把该残余物溶解在蒸馏水中而得到—水溶液；用乙酸乙酯对该水溶液进行提取而得—乙酸乙酯提取液。将该提取液用钠溶液冲洗并蒸发而得到第二种残余物，对该残余物进行上面所述的二步柱层析分离。
两种柱层析都能得到98％纯度的环胞多肽A。
在下面的流程图示中，我们解释了利用静态发酵步骤制备环胞多肽A的典型过程。
表2
利用静态发酵的本发明方法的环胞多肽A的产量
利用固态底物发酵(SSF)制备环胞多肽A的方法如下所示。(10批的平均值) 
| 试验 | 环胞多肽A产量(培养基毫克/升) | 纯度％ |
| 粗品形式 纯品形式 | ||
| 1.2.3.4.5.6. | 1519.6 1132.01798.0 1268.81889.0 1226.41749.8 1280.01801.4 1238.01887.0 1394.0 | 98.298.599.6100.099.999.9 |
| 1774.1 1256.3 | 99.4 |
不同分枝层壁菌种的分离源及其环胞多肽产量
| 菌 种 | 来 源 | 环胞多肽(毫克/升) | 参考资料 |
| 分枝层壁菌某菌种T.inflatumUAMH Acc.No.24722880400245534594474048284900 | 土壤/落叶层生境陆生无脊椎动物粘菌孢子囊水松属P.contorta下土壤muskec土土高山草地中洗刷的有机颗粒土高品腐殖土蛹表面(Mycobbates某种) | 不明101±6134±411223±7532±2745±3812±1160±3515±8 | Gams.Persoonia)1971)6：185-191Isaac et al.Antimicrob.AgentsChemother(1990)34：121-127.同上同上同上同上同上同上同上 |
(续)
| 菌 种 | 来 源 | 环胞多肽(毫克/升) | 参考资料 |
| 4901Atcc 34921NRRL 8044T.Cylindrosporum本发明中静态发酵所用的分枝层壁菌某菌种(Tolypocldium sp.) | 湿性有机物质不明不明伊蚊属种类的幼蚊蚊子繁殖生境土壤 | 24±12130及170101不明2000±100 | 同上Lee&Agathos，Aopl.Microbiol，Biotechnol(1991)34：513-517.Von Wartburg&TraberProc.Allercv(1986)38：28-45.Soares et.al.Proc.Pao.Annu.Conf.Calif.Mosq.Vector ControlAssoc.(1979)47：51-54及Weiser andPillai，Entomophaga(1981)26：357-361未公开资料 |
Claims (16)
1)一种从分枝层壁菌某种(Tolypocladium sp.)制备环胞多肽A的方法，其包括：把上述分枝层壁菌在—营养培养基中发酵而得到—发酵培养基，用甲醇提取上述发酵培养基中的真菌生物量而得到—甲醇提取液，通过蒸发步骤从上述提取液中去除甲醇而得到第一种残余物，制备上述第一种残余物的水溶液，制备该水溶液的乙酸乙酯提取液，将上述提取液脱色并浓缩而得到第二种残余物，然后分二步对其进行层析法纯化，即第一步以硅胶柱为固相，以己烷、氯仿和甲醇混合溶剂为移动相，第二步以树脂柱为固相而以甲醇为移动相。
2)根据权利要求1的方法，其中发酵步骤以静态发酵进行。
3)根据权利要求1的方法，其中发酵步骤以固体底物发酵进行。
4)根据权利要求1的方法，其中接种到营养培养基中的上述分枝层壁菌某菌种为主种子。
5)根据权利要求4的方法，培养基中含有上述分枝层壁菌某菌种悬浮孢子，培养基成分为葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和无菌水，PH值维持在4-6之间，把—匙该菌种孢子悬浮液接种到琼脂斜面培养基中，该斜面培养基含麦芽汁、酵母膏和琼脂，PH值为4-6，对琼脂斜面培养基进行培养直到培养物中形成孢子，这样来得到主种子。
6)根据权利要求1的方法，其包括形成该菌种之种菌的步骤，而接种到发酵培养基中至少有两种阶段。
7)根据权利要求6的方法，其中上述第一阶段步骤包括把主种子转移至培养基中，该培养基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和无菌水，PH值为4～6，生长3-4天。
8)根据权利要求6的方法，其中上述第二阶段步骤包括把来自第一阶段的培养物转移到—培养基中，该培养基含葡萄糖、胨、酪蛋白酸水解物和无菌水，PH值为4-6，生长2-3天。
9)根据权利要求5的方法，其中培养步骤进行10-14天。
10)根据权利要求1和2的方法，其中营养培养基含葡萄糖、甘油、酪蛋白酸水解物、麦芽汁、胨和DL-α氨基丁酸和无菌水、PH值为4-6。
11)根据权利要求10的方法，其中上述培养基含2-6％的葡萄糖、2-5.5％的甘油、1.5-5.5％的酪蛋白酸水解物、0.5-4.5％的麦芽汁、0.25-2.5％的胨、0.1-3％的DL-α氨基丁酸、其余为无菌水。
12)根据权利要求1的方法，其中先用碳酸氢钠溶液乙酸乙酯提取液后用水冲洗来进行脱色步骤。
13)根据权利要求1的方法，其中上述生物量的甲醇提取液是用甲醇摇动生物量而制成，并把由此得到的甲醇提取液进行快速蒸发处理而得到一面糊状残余物。
14)根据权利要求13的方法，其中把甲醇残余物溶解于蒸馏水中而获得—水溶液，然后用乙酸乙酯提取而得到—乙酸乙酯部分提取液，对此用碳酸氢钠处理并用水冲洗。
15)根据权利要求14的方法，通过快速蒸发而得到乙酸乙酯部分的浓缩物。
16)根据权利要求1的方法，其中上述混合溶剂由己烷、氯仿和甲醇组成，其比例为10∶9∶1。
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| US4289851A (en) * | 1977-05-10 | 1981-09-15 | Sandoz Ltd. | Process for producing cyclosporin derivatives |
| US5256547A (en) * | 1991-04-06 | 1993-10-26 | Arzneimittel Dresden Gmbh | Process for making and isolating cyclosporin a by fermentation |
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