CN1164736C - 利用洋葱伯克霍氏德氏菌JS-02制备系列D-α-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
D-α-氨基酸是一类具有光学活性的化合物，在医药、食品和农药领域有广泛的用途。本发明采用由土壤筛选的洋葱伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02，中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是：CCTCC NO.M202047为拆分催化剂，一步把系列5-取代海因转化成系列D-α-氨基酸。利用该方法制备D-苯丙氨酸，底物浓度可达5%，收率可达80%；制备D-色氨酸收率也在74.8%左右，底物浓度可达3.0%；制备D-缬氨酸收率也在72.8%左右，底物浓度可达3.0%；制备D-蛋氨酸收率也在85.2%左右，底物浓度可达3.0%。
Description
技术领域
D-α-氨基酸是一类具有光学活性的化合物，在医药、食品和农药领域有广泛的用途。如D-苯丙氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-蛋氨酸是合成多肽药物的重要组分；D-丙氨酸是合成甜味剂阿力甜的关键组分；D-缬氨酸是制备光学活性杀虫剂的重要成分等。
背景技术
目前这类物质的合成方法，通常采用消旋体的化学拆分方法。以D-苯丙氨酸为例，目前采用的制备方法为：首先经化学合成制备得到DL-苯丙氨酸，利用氨基酰化酶法拆分得到L-苯丙氨酸和N-乙酰-D-苯丙氨酸，经分离获得的N-乙酰-D-苯丙氨酸在稀酸作用下低温水解得到D-苯丙氨酸；另有采用不对称合成方法制备D-苯丙氨酸的文献报道。但以上制备方法或工艺复杂和制备收率低、或所用过渡金属催化剂价格昂贵，导致D-苯丙氨酸的制备成本不能满足应用需要。
近年来，随着药物研究的进展，肽类药物已经逐渐成为药物研究领域的热点，D-α-氨基酸由于其独特的代谢特性而成为了肽类药物制备的限制性组分；同时食品和农药的发展也带动了D-氨基酸在食品添加剂和手性农药合成中的需求。D-氨基酸的低成本、高收率制备技术成为了氨基酸的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用从土壤中筛选而得的微生物伯克霍氏德氏属的菌种，通过微生物所产酶的催化作用，将系列DL-5取代海因化合物直接转化为D-α-氨基酸类物质，即：
(R代表烷基、苯基、苄基、吲哚基或其他取代基)
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
用于本发明中进行D-氨基酸生产的微生物洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02(以下简称为JS-02菌株)，其具有产生D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶的能力，可以用于本发明中生产D-氨基酸。该菌株于2001年在我国江苏省南京地区土壤中分离而得，其于2002年9月6日经过中科院微生物研究所鉴定，然后于2002年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCNO.M202047。
JS-02菌株具有下述性质
1、形态特征
在普通营养琼脂培养基上于37℃下培养24小时后，用光学显微镜及电子显微镜分别观察菌丝的形态和孢子形态、表面结构。结果表明，该菌呈现杆状，不形成芽孢，有端生鞭毛，一般为1-2条，可以移动。
2、生理生化特征
(1)明胶液化，阴性
(2)淀粉水解，阴性
(3)硝酸盐还原，阴性
(4)亚硝酸盐还原，阴性
(5)反硝化，阴性
(6)荧光色素，阴性
(7)水溶性非荧光色素，阴性
(8)严格好氧，阳性
(9)兼性厌氧，阴性
(10)接触酶，阳性
(11)氧化酶，阳性
(12)PHB，阳性
(13)甲基红试验，阴性
(14)VP试验，阴性
(15)精氨酸双水解酶，阴性
(16)O/F试验，氧化
3、碳源利用
产酶微生物JS-02菌株的培养：以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、山梨醇、蔗糖或乳糖。淀粉、醇类和有机酸利用情况不佳；作为氮源有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏；Co2+对产酶有明显的促进作用。JS-02菌株所产的酶是诱导酶，发酵过程必须加0.1-0.5％的N-氨甲酰苯丙氨酸作为诱导剂；该菌是好氧培养菌，在pH5-9温度25-40℃的通气条件下，生长良好。
在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20-30小时，发酵结束后，离心收集菌体作为酶法合成的催化剂。
在酶法反应过程中，DL-5取代海因在酶的作用下不对称水解，其中仅有D型的5取代基海因能发生水解反应，反应产生D-α-氨基酸。L-型的5取代基海因在反应条件下能自动消旋促进了水解反应的进程，形成了水解、消旋、再水解的反应序列，直至反应底物被完全水解为止。同时在反应过程中为防止氧对酶的抑制作用，在反应过程中通入氮气进行保护；
酶反应过程中，DL-5取代海因的起始浓度为2-5％，pH7-10；反应温度25-40℃；反应时间为20-75小时。
反应结束后，离心去除菌体和杂质，然后在减压条件下55-60℃浓缩结晶得到D-氨基酸粗品，重结晶得到氨基酸精品。
这种制备方法工艺简单、成本低、产品比旋度高，并具有良好的通用性。
具体实施方式
实施例一：
取葡萄糖20.0g、玉米浆15.0g、NaCl3.0g、MgSO4·7H2O0.5g、KH2PO41.0g、CoCl20.1g、N-氨甲酰苯丙氨酸1.5g、加水1000ml、调PH7.0-7.2，溶解后分装入250ml三角瓶中，每瓶装50ml，而后加8层纱布，用牛皮纸包好后，0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。
将冰箱内保存的菌种，取出后，接在新鲜斜面上，培养24小时，接入上述制好的液体培养基中，32℃ 180转/分摇床振荡培养24小时后，5000转/分离心机离心25分钟，收集菌体，制成菌悬液(每100ml菌悬液含湿菌体40克左右)。
取DL-5-苄基海因3.0g装入准备好的500ml三角瓶中，并分别加入无离子水100ml，调PH9.0，然后在每个三角瓶中加入菌悬液10ml。用氮气将三角瓶空间内的氧气置换后加胶塞塞紧后，在摇床上震荡反应。反应时间分别为48小时。反应结束后在4000转/分离心机上离心30分钟，去除菌体和杂质，真空减压55-60℃浓缩。经酒精洗涤后，过滤结晶烘干后得D-苯丙氨酸2.21g，纯度为97.8％；
实施例二：
培养基组成及消毒条件同实例一。菌种培养14小时后接入制好的液体培养基中，30℃180转/分摇床振荡培养30小时后，5000转/分离心机离心25分钟，收集菌体，制成菌悬液(每100ml菌悬液含湿菌体40克左右)。
取DL-5-吲哚甲基海因4.0g装入准备好的500ml三角瓶中，并分别加入无离子水100ml，调PH9.0，然后在每个三角瓶中加入菌悬液10ml。用氮气将三角瓶空间内的氧气置换后加胶塞塞紧后，在摇床上震荡反应。反应时间分别为42小时。反应结束后在4000转/分离心机上离心30分钟，去除菌体和杂质，真空减压55-60℃浓缩。经酒精洗涤后，过滤结晶烘干后得D-色氨酸2.71g，纯度为95.8％；
实施例三：
培养基组成及消毒条件同实例一。菌种培养18小时后接入制好的液体培养基中，32℃180转/分摇床振荡培养30小时后，5000转/分离心机离心30分钟，收集菌体，制成菌悬液(每100ml菌悬液含湿菌体40克左右)。
取DL-5-甲硫乙基海因3.0g装入准备好的500ml三角瓶中，并分别加入无离子水100ml，调PH9.0然后在每个三角瓶中加入菌悬液10ml。用氮气将三角瓶空间内的氧气置换后加胶塞塞紧后，在摇床上震荡反应。反应时间分别为36小时。反应结束后在4000转/分离心机上离心25分钟，去除菌体和杂质，真空减压55-60℃浓缩。经酒精洗涤后，过滤收集结晶烘干后得D-蛋氨酸2.42g，纯度为97.7％
实施例四：
培养基组成及消毒条件同实例一。菌种培养18小时后接入制好的液体培养基中，32℃180转/分摇床振荡培养30小时后，5000转/分离心机离心25分钟，收集菌体，制成菌悬液(每100ml菌悬液含湿菌体40克左右)。
取DL-5-异丙基海因海因3.0g分别装入准备好的500ml三角瓶中，并分别加入无离子水100ml，调PH9.0后在每个三角瓶中加入菌悬液10ml。用氮气将三角瓶空间内的氧气置换后加胶塞塞紧后，在摇床上震荡反应。反应时间分别为72小时。反应结束后在4000转/分离心机上离心25分钟，去除菌体和杂质，真空减压55-60℃浓缩。经酒精洗涤后，过滤收集结晶烘干后得D-缬氨酸1.86g，纯度为96.5％。
Claims (3)
1、洋葱伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02，其在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号是：CCTCC NO.M202047。
2、保藏号为CCTCC NO.M202047的洋葱伯克霍氏德氏菌JS-02的培养方法，其特征是洋葱伯克霍氏德氏菌JS-02的发酵培养过程中，以单糖或双糖作为碳源，有机氮源为氮源，添加诱导剂N-氨甲酰苯丙氨酸和生长促进剂金属离子Co2+。
3、利用保藏号为CCTCC NO.M202047的洋葱伯克霍氏德氏菌JS-02制备系列D-α-氨基酸的方法，其特征是利用洋葱伯克霍氏德氏菌JS-02，通过微生物所产酶的催化作用，将系列DL-5取代海因化合物直接转化为D-α-氨基酸类物质，其中，DL-5取代海因化合物作为反应底物，其浓度在2-5％；反应在水溶液内进行；反应在充氮气保护的条件下进行。
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