CN102808011B - 一种头孢菌素c的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤：（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下：葡萄糖：40-80h，流加4-11g/L·h；80-140h，流加9-21g/L·h；植物油：50-90h，流加1-6g/L·h；90-140h，流加3-8g/L·h；（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。本发明头孢菌素C的发酵方法操作方便，成本低廉，制备的头孢菌素C效价高，市场应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及头孢菌素C的发酵方法。
背景技术
头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)产生，是继青霉素之后又一重要的β-内酰胺抗生素，其结构与青霉素的结构相似，有一酰基侧链与一双环母核上的氨基相接，与青霉素一样都具有一个四元内酰胺环，但头孢菌素C具有六元二氢噻嗪环，代替了青霉素特征五元噻唑环。头孢菌素C的分子式C16H21O8N3S，分子量为415.4，结构式为：
头孢菌素类抗生素由于其抗菌谱广和过敏性弱的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物。头孢菌素C是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
头孢菌素C是顶头孢霉菌的次级代谢产物，在其合成过程中，需要补充足够的碳源。葡萄糖是常用的碳源，但是糖类物质会抑制头孢菌素C合成的关键酶，进而影响其正常合成。油脂则有利于头孢菌素C前提氨基酸的合成，进而可以促进头孢菌素C的合成，但其难溶于发酵液，过高浓度的油脂会导致发酵液供氧速率降低，因此会影响到菌体的生长，最终导致产物得率下降。
补充合适的碳源，是决定头孢菌素C产量极为关键的因素。郭元昕等，“豆油对头孢菌素C发酵影响的初步研究”，中国抗生素杂志，2010,35（10）:747-750研究发现，用顶头孢霉AC0508菌株发酵制备头孢菌素C，发酵培养基（%）：葡萄糖1.67，KH2PO4 0.4，（NH4）SO4 0.8，FeSO4·7H2O 0.005，CaCO3 1，发酵140h，在72h，84h，96三个时间添加点中，以72h添加豆油为最佳，72h的豆油添加以0.8%的添加效果最好，制备的头孢菌素C效价约为18000U/mL。
现有文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的效价低，难以满足工业化应用的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的头孢菌素C的发酵方法。
本发明头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤：
（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；
（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下：
葡萄糖：40-80h，流加4-11g/L·h；80-140h，流加9-21g/L·h；
植物油：50-90h，流加1-6g/L·h；90-140h，流加3-8g/L·h；
（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。
其中，步骤（1）所述顶头孢霉是保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉。
其中，步骤（1）中：一级种子和二级种子按照本领域常规方法即可制备得到，其中，活化后用于制备一级种子的顶头孢霉菌液浓度应不小于25%（mg/ml）。其余步骤可以按照冀志霞等，“头孢菌素C发酵过程代谢特征”，华东理工大学学报（自然科学报2006-11第32卷1275-1279）第1.2.6三级发酵记载的方法制备；也可按如下方法制备：a、一级种子：取顶头孢霉，按照1-2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5-7.5、27-29℃培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分：玉米浆20-30重量份、葡萄糖13-20重量份、蔗糖10-20重量份、植物油35-50体积、碳酸钙1-1.5重量份、消沫剂0.5-1.0体积份；b、二级种子：取一级种子，按照8-10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0-7.0、27-29℃培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分为：玉米浆16-25重量份、花生粉4-7重量份、黄豆粉4-7重量份、硫酸钙5-10重量份、葡萄糖6-10重量份、植物油40-50体积份、碳酸钙4-7重量份、消沫剂0.5-1重量份。
其中，步骤（2）所述发酵的条件是：发酵时间：140h；发酵温度：0-40h为28℃，40-140h为24-25℃；发酵pH为5.5-5.8。
其中，步骤（2）所述发酵培养基包含如下成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO4 0.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份。
前述重量份与体积份的比值为g/mL。
优选地，步骤（2）中：补入葡萄糖的工艺：40-80h，流加5-10g/L·h；80-140h，流加10-20g/L·h；补入植物油的工艺：50-90h，流加2-5g/L·h；90-140h，流加4-7g/L·h。
进一步优选地，补入葡萄糖的工艺：40-80h，流加10g/L·h；80-140h，流加20g/L·h；补入植物油的工艺：50-90h，流加5g/L·h；90-140h，流加6g/L·h。
进一步优选地，补入葡萄糖的工艺：40-80h，流加9g/L·h；80-140h，流加18g/L·h；补入植物油的工艺：50-90h，流加2g/L·h；90-140h，流加4g/L·h。
前述植物油为大豆油或者玉米油。
本发明的发酵方法制备得到的头孢菌素C的效价达到了28700~41200U/mL，显著高于现有技术制备得到的头孢菌素C，可以大幅降低生产成本，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明效价按照刘雪惠等，“利用HPLC方法快速测定发酵液中头孢菌素C效价”，黑龙江医药1996年第9期第138-139页记载的方法测定。
实施例1 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为25%（mg/ml）的菌液按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、27℃培养50h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照8%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、27℃培养50h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照18%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24℃，pH为5.6。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为100g/L）的工艺为：40-80h，流加10g/L·h；80-140h，流加20g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加5g/L·h；90-140h，流加6g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表1：
表1 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例2 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆30g、葡萄糖20g、蔗糖20g、植物油50ml、碳酸钙1.5g、消沫剂1.0ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为26%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、29℃培养65h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆25g、花生粉7g、黄豆粉7g、硫酸钙10g、葡萄糖10g、植物油50ml、碳酸钙7g、消沫剂1g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0、29℃培养65h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照22%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.8。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为120g/L）的工艺为：40-80h，流加5g/L·h；80-140h，流加10g/L·h。
补入玉米油的工艺为：50-90h，流加3g/L·h；90-140h，流加5g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表2：
表2 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例3 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆25g、葡萄糖15g、蔗糖15g、植物油40ml、碳酸钙1.2g、消沫剂0.8ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为27%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养55h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、28℃培养55h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照19%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.5。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为80g/L）的工艺为：40-80h，流加8g/L·h；80-140h，流加19g/L·h。
补入玉米油的工艺为：50-90h，流加4g/L·h；90-140h，流加7g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表3：
表3 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例4 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为28%（mg/ml）的菌液，按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.5、27℃培养60h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆20g、花生粉5g、黄豆粉5g、硫酸钙8g、葡萄糖8g、植物油45ml、碳酸钙5g、消沫剂0.8g。
取一级种子，按照8%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、27℃培养60h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照21%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24℃，pH为5.6。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为90g/L）的工艺为：40-80h，流加10g/L·h；80-140h，流加15g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加3g/L·h；90-140h，流加6g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表4：
表4 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例5 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
种子培养基：玉米浆30g、葡萄糖20g、蔗糖20g、植物油50ml、碳酸钙1.5g、消沫剂1.0ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为29%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、29℃培养50h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0、29℃培养50h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照20%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.8。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为110g/L）的工艺为：40-80h，流加9g/L·h；80-140h，流加18g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加2g/L·h；90-140h，流加4g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表5：
表5 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例6 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
种子培养基：玉米浆25g、葡萄糖15g、蔗糖15g、植物油40ml、碳酸钙1.2g、消沫剂0.8ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为30%（mg/ml）的菌液，按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.5、28℃培养55h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆25g、花生粉7g、黄豆粉7g、硫酸钙10g、葡萄糖10g、植物油50ml、碳酸钙7g、消沫剂1g。
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、27-29℃培养55h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照19%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.6。
期间，补入葡萄糖和植物油：
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为120g/L）的工艺为：40-80h，流加6g/L·h；80-140h，流加13g/L·h。
补入玉米油的工艺为：50-90h，流加5g/L·h；90-140h，流加5g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表6：
表6 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例7 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为31%（mg/ml）的菌液，按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、27℃培养60h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照8%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养60h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照18~22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.6。
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为100g/L）的工艺为：40-80h，流加4g/L·h；80-140h，流加9g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加5g/L·h；90-140h，流加6g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表7：
表7 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例8 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为32%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、29℃培养65h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、27℃培养60h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照18~22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24℃，pH为5.6。
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为100g/L）的工艺为：40-80h，流加11g/L·h；80-140h，流加21g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加5g/L·h；90-140h，流加6g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表8：
表8 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例9 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为33%（mg/ml）的菌液，按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、28℃培养50h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照8%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养65h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照18~22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.6。
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为100g/L）的工艺为：40-80h，流加10g/L·h；80-140h，流加20g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加1g/L·h；90-140h，流加3g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表9：
表9 菌浓度与头孢菌素C的效价
实施例10 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、植物油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为34%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、29℃培养55h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、植物油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、29℃培养50h。
（3）发酵
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉26g、甲硫氨酸4g、大豆油55ml、消沫剂2ml、MgSO4 4g、(NH4)2SO4 13g、FeSO4 0.09g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 6g。
取步骤（2）制备的二级种子，按照18~22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.6。
补入葡萄糖（葡萄糖的浓度为100g/L）的工艺为：40-80h，流加10g/L·h；80-140h，流加20g/L·h。
补入大豆油的工艺为：50-90h，流加6g/L·h；90-140h，流加8g/L·h。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
检测结果见表10：
表10 菌浓度与头孢菌素C的效价
综合实施例1~10的检测结果，见表11：
表11 本发明葡萄糖以及植物油的补料工艺与效价的关系
由表11可以看出：
在本发明葡萄糖以及植物油的补加方式和使用剂量范围内，头孢菌素C的效价均在28700U/mL之上，远高于现有方法制备的头孢菌素C的效价；在优选范围内（实施例1~6记载的工艺范围），制备的头孢菌素C效价更高，均在39100U/mL之上；在最佳工艺参数下，头孢菌素C高达41200U/mL，是现有头孢菌素C效价的2.28倍。
通过实施例1与实施例8、以及实施例5与实施例6的比较发现，头孢菌素C的效价并非与葡萄糖和植物油用量呈简单的线性关系，其与葡萄糖以及植物油的补入量和流加方式均有关联。
因此，综合考虑效价和生产成本，实施例2的各工艺参数取值更适于工业生产。
综上，本发明的发酵方法中，同时补加葡萄糖和植物油两种碳源，并对补加时间和补料量进行特殊选择，可以显著提高头孢菌素C的效价，降低生产成本，工业应用前景良好。
Claims (1)
1.一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；
（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖和植物油，工艺如下：
葡萄糖：40-80 h，流加4-11 g/L·h；80-140 h，流加9-21 g/L·h；
植物油：50-90 h，流加1-6g/ L·h；90-140 h，流加3-8 g/ L·h；
（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C；
步骤（2）所述发酵培养基包含如下成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO4 0.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份；
所述重量份：体积份为g/ml。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述顶头孢霉是保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中：
补入葡萄糖的工艺：40-80 h，流加5-10 g/L·h；80-140 h，流加10-20 g/L·h；
补入植物油的工艺：50-90 h，流加2-5 g/ L·h；90-140 h，流加4-7 g/ L·h。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述补入葡萄糖的工艺：40-80 h，流加10 g/L·h；80-140 h，流加20 g/L·h；
所述补入植物油的工艺：50-90 h，流加5 g/ L·h；90-140 h，流加6 g/ L·h。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述补入葡萄糖的工艺：40-80 h，流加9 g/L·h；80-140 h，流加18 g/L·h；
所述补入植物油的工艺：50-90 h，流加2 g/ L·h；90-140 h，流加4 g/ L·h。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述植物油为大豆油或者玉米油。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵的条件是：发酵时间：140h；发酵温度：0-40 h为28℃，40-140 h为24-25℃；发酵pH为5.5-5.8。
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