CN106191192A - 一种发酵生产头孢菌素c的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵生产头孢菌素C的方法，它包括如下步骤：a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵50～115h后进行带放，并将带放料液进行再培养；c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C。本发明的发酵方法，可使头孢菌素C单批产量显著提高，大幅度降低成本，工业应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产头孢菌素C的方法。
背景技术
头孢菌素C(英文全称为Cephalosporin C，缩写为CPC)，是由顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)产生的一类β-内酰胺抗生素，分子式为：C16H21N3O8S，分子量为415.4，结构式为：
头孢菌素C的结构与青霉素的结构相似，不同的是头孢菌素C的母核是7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，而青霉素的母核则是6-氨基青霉烷酸，正是由于这种结构上的差异，使得头孢菌素C有着更强的稳定性。头孢菌素类C因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物，也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
目前国内头孢菌素C的发酵生产行业竞争激烈，如何提高头孢菌素C发酵产量,降低发酵成本，对提高企业效益、增强企业竞争力至关重要。头孢菌素C发酵生产多是在采取分批补料半连续发酵工艺的基础上，改良发酵菌种或调整发酵培养基，以期能够提高头孢菌素C产量。由于头孢菌素C发酵是一个受多种代谢调控反应控制的复杂的生物合成过程，对发酵工艺进行优化较为困难，目前报道较少。
带放再培养工艺目前多见于青霉素发酵生产，针对头孢菌素C的带放再培养见甄成业的报道(甄成业等，头孢发酵带放再培养工艺的研究，煤炭与化工，2014,37:104-108)，该文献未提及何时带放，而且带放的料液再培养需要补充新鲜的基础料，得到的带放产量也较低，仍有待进一步改进。
现有文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的产量较低，难以很好满足的满足工业化应用的要求。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的在于提供一种发酵生产头孢菌素C的方法。
本发明提供了一种发酵生产头孢菌素C的方法，它包括如下步骤：
a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵50～115h后进行带放，并将带放料液进行再培养；
c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C。
其中：步骤a所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。
其中：步骤b所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39～76重量份、花生粉9～21重量份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、植物油49～71体积份、消泡剂1.4～4体积份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.1重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份、碳酸钙4～11重量份；
步骤b所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。
其中：步骤b所述带放的次数为3-4次。
进一步地，首次带放的体积为发酵液总量的2-25％；首次带放后，每隔4-20h再次带放，再次带放的体积为发酵液总量的8-16％。
其中，首次带放是在发酵50-100h后进行，带放体积为发酵液总量的2-15％；首次带放后，每隔8-20h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-16％；
优选地，首次带放是在发酵80-95h后进行，带放体积为发酵液总量的8-12％；首次带放后，每隔10-14h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-14％。
其中，首次带放是在发酵90h后进行，带放体积为发酵液总量的10％；首次带放后，每隔12h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12％。
其中：步骤b中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/L·h；80～130h，连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h，连续流加1～6g/L·h；90～130h，连续流加3～8g/L·h；
其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。
其中：步骤b所述将带放料液进行再培养的培养温度为25℃，pH为5.6；
培养时间为30～70h；优选时间为45～55h，进一步优选时间为50h。
其中：步骤b中，在带放料液再培养过程中，全程补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：连续流加4～11g/L·h；植物油：连续流加1～6g/L·h；
其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。
带放是指补料发酵中，间歇放掉部分发酵液的操作过程。
带放料液再培养是指对发酵中的带放料液收集，并在带放罐中进行二次发酵培养。
本发明在特定的时间在头孢菌素C生产过程中进行带放，同时对带放发酵液再培养。本发明发酵生产头孢菌素C的方法，可使头孢菌素C单批产量显著提高，大幅度降低成本，工业应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养115h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的25％，以后每隔4h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的8％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为30h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～30h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～30h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵结束后，取发酵罐发酵液和带放罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。
十亿为头孢菌素C的产量单位。
十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000
发酵实验结果见表1：
表1发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 115 | 4 | 30 | 2026 | 9800 | 11826 |
实施例2本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养110h后进行带放，初次带放体积为发酵液总量的20％，以后每隔6h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的10％；共带放3次，放罐前8h停止带放；
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为35h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～35h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～35h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表2：
表2发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 110 | 6 | 35 | 2200 | 9850 | 12050 |
实施例3本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养100h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的15％，以后每隔8h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为40h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～40h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～40h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表3：
表3发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放总十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 100 | 8 | 40 | 2374 | 9880 | 12254 |
实施例4本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，PH5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养95h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的12％，以后每隔10h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的14％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为45h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～45h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～45h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表4：
表4发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 95 | 10 | 45 | 2729 | 9920 | 12649 |
实施例5本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，PH5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养90h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的10％，以后每隔12h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为50h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～50h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～50h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表5：
表5发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 90 | 12 | 50 | 3200 | 9950 | 13150 |
实施例6本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养80h后进行带放，共带放3次；其中，初次带放体积为发酵液总量的8％，以后每隔14h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的14％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为55h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～55h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～55h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表6：
表6发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 80 | 14 | 55 | 2880 | 9965 | 12845 |
实施例7本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养70h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的6％，以后每隔16h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的16％；放罐前12h停止带放。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为60h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～60h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～60h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表7：
表7发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 70 | 16 | 60 | 2535 | 9952 | 12487 |
实施例8本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养60h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的4％，以后每隔18h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的10％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为65h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～65h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～65h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表8：
表8发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 60 | 18 | 65 | 2425 | 9932 | 12357 |
实施例9本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
发酵培养50h后进行带放，共带放4次；其中，初次带放体积为发酵液总量的2％，以后每隔20h带放一次，每次带放体积为发酵液总量的12％。
带放料液带放至带放罐中继续培养，培养周期为70h，培养温度为25℃，pH为5.6。
其中发酵罐容积为500m3，带放罐容积为156m3；
培养期间，发酵罐和带放罐均分别进行补料：
发酵罐是在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
带放罐是在培养全程补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：0～70h连续流加4～11g/L·h；
植物油：0～70h连续流加1～6g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表9：
表9发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 50 | 20 | 70 | 2300 | 9900 | 12200 |
对比例1现有方法制备头孢菌素C
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)，按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(4)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。
培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。
2、实验结果
发酵实验结果见表10：
表10发酵实验结果
| 带放时间(h) | 带放量 | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放十亿 | 主罐总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10000 | 10000 |
将本发明方法(实施例1～9)及现有方法(对比例1)的参数及发酵结果进行归纳，见表11。
表11发酵结果比较
| 实施例 | 带放时间(h) | 初次带放量 | 带放间隔(h) | 带放培养周期(h) | 带放总十亿 | 罐批产量(十亿) |
| 1 | 115 | 25％ | 4 | 30 | 2026 | 11826 |
| 2 | 110 | 20％ | 6 | 35 | 2200 | 12050 |
| 3 | 100 | 15％ | 8 | 40 | 2374 | 12254 |
| 4 | 95 | 12％ | 10 | 45 | 2729 | 12712 |
| 5 | 90 | 10％ | 12 | 50 | 3200 | 13150 |
| 6 | 80 | 8％ | 14 | 55 | 2880 | 12845 |
| 7 | 70 | 6％ | 16 | 60 | 2535 | 12487 |
| 8 | 60 | 4％ | 18 | 65 | 2425 | 12357 |
| 9 | 50 | 2％ | 20 | 70 | 2300 | 12200 |
| 现有方法 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10000 |
由表11可以看出：与现有方法相比，使用本发明方法发酵头孢菌素C时，可使单罐头孢菌素C的产量提高1826个十亿之上，产量提高18％以上，头孢菌素C产量大大增加。
在优选范围内(实施例4～6记载的工艺范围)，单罐头孢菌素C的产量更高，均在12712个十亿之上；在最佳工艺参数下(实施例5的工艺参数)，单罐头孢菌素C的产量高达13150个十亿，比现有方法的产量提高达31.5％。
目前公司头孢菌素C发酵罐容积为500m3，通过带放工艺可以显著提高头孢菌素C的产量，单罐产量提高达31.5％，单罐批直接多为公司创造50万经济效益。
因此，综合考虑生产时间及发酵收益，实施例5的工艺更适合于工业化生产，工业应用前景良好。
综上，本发明方法通过特定的带放工艺，可使头孢菌素C单罐批产量显著提高，大幅度降低生产成本，具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种发酵生产头孢菌素C的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；
b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵50～115h后进行带放，并将带放料液进行再培养；
c、取步骤b所得发酵液及带放培养液，分离纯化，即得头孢菌素C。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤a所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：
步骤b所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39～76重量份、花生粉9～21重量份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、植物油49～71体积份、消泡剂1.4～4体积份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.1重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份、碳酸钙4～11重量份；
步骤b所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤b所述带放的次数为3-4次。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于：
首次带放的体积为发酵液总量的2-25％；首次带放后，每隔4-20h再次带放，再次带放的体积为发酵液总量的8-16％。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：
首次带放是在发酵50-100h后进行，带放体积为发酵液总量的2-15％；首次带放后，每隔8-20h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-16％；
优选地，首次带放是在发酵80-95h后进行，带放体积为发酵液总量的8-12％；首次带放后，每隔10-14h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12-14％。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
首次带放是在发酵90h后进行，带放体积为发酵液总量的10％；首次带放后，每隔12h再次带放；再次带放的体积为发酵液总量的12％。
8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤b中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/L·h；80～130h，连续流加9～21g/L·h；
植物油：50～90h，连续流加1～6g/L·h；90～130h，连续流加3～8g/L·h；
其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。
9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤b所述将带放料液进行再培养的培养温度为25℃，pH为5.6；
培养时间为30～70h；优选时间为45～55h，进一步优选时间为50h。
10.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤b中，在带放料液再培养过程中，全程补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：
葡萄糖溶液：连续流加4～11g/L·h；植物油：连续流加1～6g/L·h；
其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。
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