CN108048519A - 一种头孢菌素c菌渣处理方法、水解液及其应用 - Google Patents

一种头孢菌素c菌渣处理方法、水解液及其应用 Download PDF

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CN108048519A CN201711424821.8A CN201711424821A CN108048519A CN 108048519 A CN108048519 A CN 108048519A CN 201711424821 A CN201711424821 A CN 201711424821A CN 108048519 A CN108048519 A CN 108048519A
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Abstract

本发明提供了一种头孢菌素C菌渣处理方法，它包括如下步骤：a、取头孢菌素C菌渣，调节含水量为20～60％；b、加入4～8mol/L硫酸溶液，在70～90℃下保持10～20h，然后调pH至7.0～8.0，即可。本发明还提供了处理得到的水解液，另外，本发明还提供了一种头孢菌素C培养基及发酵方法。本发明菌渣处理方法，不仅可以解决废弃菌渣排放引起的环境污染问题，而且为头孢菌素C生产提供了良好的营养物质，可大大降低头孢菌素C的生产成本，工业应用前景良好。

Description

一种头孢菌素C菌渣处理方法、水解液及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种头孢菌素C菌渣处理方法、水解液及其应用。
背景技术
抗生素菌渣是指抗生素发酵生产过程中产生的菌丝废渣，属于工业废弃物，主要成分为菌丝体、发酵过程中产生的代谢产物、培养基的降解物、残留有机溶剂以及残留抗生素等。新鲜菌渣性质不稳定，极易腐败并散发恶臭，此外菌渣中的抗生素及其代谢产物残留和抗性基因一旦进入环境，就可能会引发致病菌耐药性的产生和传播，从而使抗菌药失去原有的治疗效果，并最终威胁人类健康。如何经济、安全地处理并资源化抗生素菌渣是已成为制约行业面临的一大挑战。
头孢菌素C(英文全称为Cephalosporin C，缩写为CPC)，是由顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)产生的一类β-内酰胺抗生素，分子式为：分子式为C16H21N3O8S，头孢菌素类C因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物，也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。正是由于其工业用途广、需求量大，头孢菌素C菌渣的处理更是制药企业目前亟待解决的主要问题。
另外，由于国内头孢菌素C的发酵生产行业竞争激烈，提高头孢菌素C发酵产量,降低发酵成本，对提高企业效益、增强企业竞争力至关重要。
如果能将头孢菌素C产生的菌渣作为发酵所需氮源进行处理，形成闭环式绿色发展模式，既降低企业生产成本又避免污染环境，开发潜力巨大。
公开号为CN101935682A的专利申请公开了一种对头孢菌素C菌渣循环利用的方法，是将头孢菌C菌渣直接加入头孢菌素发酵培养基中使用，该方法将菌渣处理后用于发酵头孢菌素，使用的菌渣量较少，而且仅能起到替代其中部分营养物质的作用，难以满足大规模工业化应用的要求。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的在于提供一种更有效的头孢菌素C菌渣处理方法、处理得到的水解液及其应用。
本发明提供了一种头孢菌素C菌渣处理方法，它包括如下步骤：
a、取头孢菌素C菌渣，调节含水量为20～60％；
b、加入4～8mol/L硫酸溶液，在70～90℃下保持10～20h，然后调pH至7.0～8.0，即可。
所述的菌渣可以是经板框处理的菌渣、经喷雾干燥处理的菌渣、经圆盘干燥处理的菌渣或陶瓷膜过滤后的菌渣。
其中，步骤a中，调节含水量为30～50％。
其中，步骤b中，加入3～7mol/L硫酸溶液，在60～80℃下保持9～19h，然后调pH。
其中，步骤a中，调节含水量为40％；
和/或，步骤b中，加入6mol/L硫酸溶液，在80℃下保持15h，然后调pH至7.0。
本发明还提供了上述方法获得的菌渣水解液。
本发明还提供了一种头孢菌素C发酵培养基，它含有权利要求5所述的菌渣水解液。
其中，它包括如下成分：
头孢菌素菌渣水解液9～21重量份、玉米浆39～76重量份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、植物油49～71体积份、消泡剂1.4～4体积份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.2重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份、碳酸钙4～11重量份；
其中，所述头孢菌素菌渣水解液的重量按照干燥品计；
优选地，发酵培养基包括如下成分：
头孢菌素菌渣水解液15重量份、玉米浆50重量份、葡萄糖8重量份、水解淀粉26重量份、甲硫氨酸4重量份、豆油55体积份、消泡剂2体积份、硫酸镁4重量份、硫酸铵13重量份、硫酸亚铁0.09重量份、硫酸锰0.03重量份、硫酸锌0.025重量份、硫酸铜0.025重量份、碳酸钙6重量份。
所述重量份和体积份的关系为：重量份每g对应体积份每ml。
本发明还提供了一种头孢菌素C发酵方法，它是通过头孢菌素C菌渣循环利用来实现的，步骤如下：
取顶头孢霉菌种子，接种于上述发酵培养基中，发酵，发酵液分离纯化，即得头孢菌素C。
其中，所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。
其中，所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。
本发明方法对头孢菌素C菌渣进行处理后，可作为头孢菌素C的发酵培养基原料，显著增加头孢菌素C的产量。本发明菌渣处理方法，不仅可以解决废弃菌渣排放引起的环境污染问题，而且可以为头孢菌素C生产提供了良好的营养物质，从而降低头孢菌素C的生产成本，适合大规模工业化应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明菌渣处理方法：
1.菌渣预处理方法：
收集头孢菌素C菌渣，加水搅拌稀释至含水量为40％后进行水解，水解条件为，水解温度为80℃，终浓度为6mol/L的硫酸溶液，水解时间为15h，水解后用氨水调节pH至7.0，得菌渣水解液。
2、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
将步骤1预处理后的菌渣按照以下比例配置发酵培养基：
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，头孢菌素菌渣水解液15g(以干基计)，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g。硫酸铜0.025g。
在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40-80h，连续流加4-11g/L.h；80-130h，连续流加9-21g/L.h；植物油：50-90h，连续流加1-6g/L.h；90-130h，连续流加3-8g/L.h；
其中葡萄糖溶液浓度为600-700g/L。
2、实验结果
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL。
发酵实验结果见表1：
表1发酵实验结果
实施例2本发明头孢菌素C发酵方法
1.菌渣预处理方法：
收集头孢菌素C菌渣，加水搅拌稀释至含水量为35％后进行水解，水解条件为，水解温度为75℃，5mol/L硫酸溶液，水解时间为18h，水解后用氨水调节pH至7.5，得菌渣水解液。
2、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
将步骤1预处理后的菌渣按照以下比例配置发酵培养基：
发酵培养基：玉米浆40g，豆油50mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，头孢菌素菌渣水解液17g(以干基计)，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g。硫酸铜0.025g。
在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40-80h，连续流加4-11g/L.h；80-130h，连续流加9-21g/L.h；植物油：50-90h，连续流加1-6g/L.h；90-130h，连续流加3-8g/L.h；
其中葡萄糖溶液浓度为600-700g/L。
2、实验结果
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL
发酵实验结果见表2：
表2发酵实验结果
实施例3本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1.菌渣预处理方法：
收集头孢菌素C菌渣，加水搅拌稀释至含水量为35％后进行水解，水解条件为，水解温度为75℃，6mol/L硫酸溶液，水解时间为16h，水解后用氨水调节pH至7.2，得菌渣水解液。
2、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
将步骤1预处理后的菌渣按照以下比例配置发酵培养基：
发酵培养基：玉米浆50g，豆油50mL，葡萄糖8g，水解淀粉22g，甲硫氨酸4g，头孢菌素菌渣水解液18g(以干基计)，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g。硫酸铜0.025g。
在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40-80h，连续流加4-11g/L.h；80-130h，连续流加9-21g/L.h；植物油：50-90h，连续流加1-6g/L.h；90-130h，连续流加3-8g/L.h；
其中葡萄糖溶液浓度为600-700g/L。
2、实验结果
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL
发酵实验结果见表3：
表3发酵实验结果
实施例4本发明发酵生产头孢菌素C的方法
1.菌渣预处理方法：
收集头孢菌素C菌渣，加水搅拌稀释至含水量为50％后进行水解，水解条件为，水解温度为90℃，8mol/L硫酸溶液，水解时间为20h，水解后用氨水调节pH至8.0，得菌渣水解液。
2、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
将步骤1预处理后的菌渣按照以下比例配置发酵培养基：
发酵培养基：玉米浆50g，豆油60mL，葡萄糖10g，水解淀粉22g，甲硫氨酸4g，头孢菌素菌渣水解液19g(以干基计)，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g。硫酸铜0.025g。
在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40-80h，连续流加4-11g/L.h；80-130h，连续流加9-21g/L.h；植物油：50-90h，连续流加1-6g/L.h；90-130h，连续流加3-8g/L.h；
其中葡萄糖溶液浓度为600-700g/L。
2、实验结果
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL
发酵实验结果见表4：
表4发酵实验结果
对比例1一种发酵生产头孢菌素C的方法
1、发酵方法
(1)制备一级种子
取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(mg/mL)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在PH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在PH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。
(3)发酵
取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h 28℃，40～130h 24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，蛋白粉20g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g。硫酸铜0.025g。
在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40-80h，连续流加4-11g/L.h；80-130h，连续流加9-21g/L.h；植物油：50-90h，连续流加1-6g/L.h；90-130h，连续流加3-8g/L.h；
其中葡萄糖溶液浓度为600-700g/L。
2、实验结果
发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。
效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。
色谱条件如下：色谱柱：Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1体积份/min，进样量：20uL
发酵实验结果见表5：
表5发酵实验结果
综合实施例1～4及对照例1的检测及结果，见表6：
表6发酵结果比较
由表6可以看出：
本发明通过将头孢菌素C菌渣将酸水解后套用至发酵培养基配方中，同样条件下发酵，与正常配方相比，放罐菌浓度、透光率、杂质DOCPC、DCPC含量、头孢菌素C含量均在同一水平，但头孢菌素C的效价大幅度提高，产量高，综合考虑生产成本及发酵收益，实施例1～4的各项工艺参数取值更适合于工业化生产。
其中，实施例1～4实施例中工艺最佳为实施例1，实施例1能大幅度提高发酵水平，且发酵后杂质含量DOCPC明显降低，CPC含量较高。
综上，本发明特定的菌渣处理方法，不仅可以解决废弃菌渣排放引起的环境污染问题，而且为头孢菌素C生产提供了良好的营养物质，对头孢菌素C的生产成本及收益均具显著优势，工艺应用前景佳。

Claims (10)

1.一种头孢菌素C菌渣处理方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取头孢菌素C菌渣，调节含水量为20～60％；
b、加入4～8mol/L硫酸溶液，在70～90℃下保持10～20h，然后调pH至7.0～8.0，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，调节含水量为30～50％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，加入3～7mol/L硫酸溶液，在60～80℃下保持9～19h，然后调pH。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：
步骤a中，调节含水量为40％；
和/或，步骤b中，加入6mol/L硫酸溶液，在80℃下保持15h，然后调pH至7.0。
5.权利要求1-4任意一项所述方法获得的菌渣水解液。
6.一种头孢菌素C发酵培养基，其特征在于：它含有权利要求5所述的菌渣水解液。
7.根据权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于：它包括如下成分：：
头孢菌素菌渣水解液9～21重量份、玉米浆39～76重量份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、植物油49～71体积份、消泡剂1.4～4体积份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.2重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份、碳酸钙4～11重量份；
其中，所述头孢菌素菌渣水解液的重量按照干燥品计；
优选地，发酵培养基包括如下成分：
头孢菌素菌渣水解液15重量份、玉米浆50重量份、葡萄糖8重量份、水解淀粉26重量份、甲硫氨酸4重量份、豆油55体积份、消泡剂2体积份、硫酸镁4重量份、硫酸铵13重量份、硫酸亚铁0.09重量份、硫酸锰0.03重量份、硫酸锌0.025重量份、硫酸铜0.025重量份、碳酸钙6重量份。
8.一种头孢菌素C发酵方法，其特征在于：它是通过头孢菌素C菌渣循环利用来实现的，步骤如下：
取顶头孢霉菌种子，接种于权利要求6或7所述的发酵培养基中，发酵，发酵液分离纯化，即得头孢菌素C。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于：所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。
10.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。
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