CN108796024A - 一种青霉素发酵液连续培养方法 - Google Patents

一种青霉素发酵液连续培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种青霉素发酵液连续培养方法，包括以下步骤：（a）设置一级、二级、三级和四级发酵罐；（b）将正常发酵罐中多余的2万—5万μ/mL的发酵液无菌带放至一级发酵罐中培养；（c）将正常发酵罐中多余的和一级发酵罐中5万—8万μ/mL的发酵液无菌带放至二级发酵罐中培养；（d）将正常发酵罐中多余的和二级发酵罐中8万—11万μ/mL的发酵液无菌带放至三级发酵罐中培养；（e）将正常发酵罐中多余的和三级发酵罐中大于11万μ/mL的发酵液无菌带放至四级发酵罐中培养；（f）将四级发酵罐中的发酵液培养后过滤。本发明使青霉素带放发酵液的发酵单位大幅提高，发酵废水中的COD浓度明显下降，降低了环保费用。

Description

一种青霉素发酵液连续培养方法
技术领域
本发明属于抗生素发酵领域，具体涉及一种青霉素发酵液连续培养方法。
背景技术
青霉素（Penicillin）是人类发现的第一个抗生素，青霉素是由产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）在发酵过程中通过次级代谢而合成的。由于青霉素发酵工艺的特殊性，需要连续补入大量原材料，包括液糖、苯乙酸、硫酸铵和氨水，补入这些原材料后发酵罐中发酵液的体积会快速增加，发酵罐不能运转过多发酵液，所以发酵罐在一个运行周期内需要每天向外放出一定体积的发酵液，这个过程称之为带放，放出的发酵液称之为带放发酵液或带放料液。
早期处理带放发酵液的方法是：直接将带放发酵液带放至过滤岗位，这样处理带放发酵液的缺点是带放发酵液没有经过充分培养，其发酵单位低，发酵液中的营养物质没有被很好利用就被排放掉。后来经过改进后处理带放发酵液的方法是：将青霉素发酵前期的带放发酵液用培养罐收集在一起，经过培养罐短时间培养，前期带放发酵液的发酵单位有一定幅度升高，带放发酵液中营养物质部分被利用。但是培养罐的运行与发酵罐的运行存在同样的问题，即连续补入液糖、苯乙酸、硫酸铵和氨水这些原材料后培养罐中发酵液的体积同样会快速增加，培养罐中发酵液体积增加到一定程度后需要不断向外带放发酵液或停止培养罐运行并将内部发酵液全部带放至过滤岗位。这样简单增加培养罐的措施无法根本解决带放发酵液发酵单位低、带放发酵液中营养物质含量高以及发酵废水处理成本高的问题。
发明内容
本发明的目的就是提供一种青霉素发酵液连续培养方法，以解决现有方法带放发酵液发酵单位低、带放发酵液中营养物质含量高以及发酵废水处理成本高的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种青霉素发酵液连续培养方法，包括以下步骤：
（a）设置青霉素带放料液发酵罐，所述带放料液发酵罐包括一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐；
（b）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为2万—5万μ/mL的发酵液无菌带放至一级发酵罐中培养；
（c）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为5万—8万μ/mL的发酵液以及一级发酵罐中培养至效价为5万—8万μ/mL的发酵液无菌带放至二级发酵罐中培养；
（d）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为8万—11万μ/mL的发酵液以及二级发酵罐中培养至效价为8万—11万μ/mL的发酵液无菌带放至三级发酵罐中培养；
（e）将青霉素正常发酵罐中多余的效价大于11万μ/mL的发酵液以及三级发酵罐中培养至效价大于11万μ/mL的发酵液无菌带放至四级发酵罐中培养；
（f）将四级发酵罐中培养至效价大于12万μ/mL的发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
本发明技术方案的进一步改进在于：一级发酵罐体积为30m3—100 m3，一级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为1.5—2.0kg/m3·h，发酵液氨氮含量为0.2—0.3mg/mL，搅拌转速为60—80r/min，一级发酵罐数量为2—5个。一级发酵罐中发酵液效价为2万—8万μ/mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：二级发酵罐体积为50m3—120 m3，二级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为3.0—4.0kg/m3•h，发酵液氨氮含量为0.3—0.4 mg/mL，搅拌转速为80—100 r/min，二级发酵罐数量为2—6个。二级发酵罐中发酵液效价为5万—11万μ/mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：三级发酵罐体积为75m3—150 m3，三级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为3.5—4.5kg/m3•h，发酵液氨氮含量为0.3—0.4 mg/mL，搅拌转速为100—110 r/min，三级发酵罐数量为2—7个。三级发酵罐中发酵液效价为8万—12万μ/mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：四级发酵罐体积为100m3—200 m3，四级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为1.0—1.5kg/m3·h，发酵液氨氮含量为0.1—0.15 mg/mL，搅拌转速为70—80 r/min，四级发酵罐数量为2—5个。四级发酵罐中发酵液效价为11万—13万μ/mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：带放料液发酵罐温度控制在23℃—28℃。
本发明技术方案的进一步改进在于：带放料液发酵罐中发酵液pH控制在6.0—7.0。
本发明技术方案的进一步改进在于：一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐通过外径为5cm—20cm的不锈钢管连接，所述不锈钢管与正常发酵罐连通，在一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐外各自设置有不锈钢手动阀门或自动阀门。
本发明取得的技术进步和有益效果是：
本发明通过设置多级带放料液发酵罐以及每级发酵罐特定的工艺控制条件，能够使青霉素带放发酵液的发酵单位显著提高；使带放发酵液中的各种营养成分被充分利用，节约了原材料成本；使发酵废水中的COD浓度明显下降，降低了环保处理费用，有利于保护环境。
本发明的一级发酵罐用于收集发酵早期低单位的青霉素发酵液，该发酵液中菌丝的菌龄比较年轻且一致，通过对一级发酵罐发酵参数进行恰当控制，罐内菌丝分化良好，发酵单位稳定增加。当发酵液在一级发酵罐中运转9h—42h后，其发酵单位达到5万—8万μ/mL，可无菌带放至二级发酵罐，解决了补入大量原材料后发酵罐中发酵液的体积快速增加造成发酵罐不能正常运转的问题。
本发明的二级发酵罐用于收集发酵中期较低单位的青霉素发酵液和一级发酵罐运转后的发酵液，虽然收集各种不同发酵罐的发酵液，但收集的发酵液中菌丝的菌龄比较一致，而且发酵单位也大致相同，加上特殊的发酵条件控制，二级发酵罐的发酵单位增长迅速。当发酵液在二级发酵罐中运转9h—48h后，其发酵单位达到8万—11万μ/mL，可无菌带放至三级发酵罐继续运转，解决了现有技术中发酵单位较高的发酵液直接去过滤岗位的问题。
本发明的三级发酵罐用于收集发酵后期较高单位的青霉素发酵液和二级发酵罐运转后的发酵液，尽管发酵单位已经很高，菌丝的菌龄已经偏老，但是本发明通过特殊的发酵条件控制，三级发酵罐中发酵液的发酵单位增长也较为快速，当发酵液在三级发酵罐中运转12h—24h后，其发酵单位大于11万μ/mL，可无菌带放至四级发酵罐继续运转。
本发明的四级发酵罐用于收集发酵后期大于11万μ/mL的青霉素发酵液和三级发酵罐运转后的发酵液，虽然四级发酵罐中发酵液的发酵单位增长趋缓，但是发酵单位增加的总量也相当可观，经过试验得出，通过减少补料量，罐内菌丝可以把发酵液中的各种营养物质充分消耗，本环节不仅能提高发酵单位，且对降低发酵废水中COD的含量具有重要意义。
本发明提供的青霉素发酵液连续培养方法，彻底改变了以往青霉素发酵车间的运转模式，不仅解决了带放发酵液发酵单位低和营养物质含量高的问题，且更加便于管理，根据带放发酵液的效价不同直接带放至对应的发酵罐即可，大大提高了生产的连续性、灵活性，尤其适宜青霉素的大规模发酵生产。该方法涉及的各级发酵罐可以长时间保持无菌状态，与正常发酵罐相比，生产同样产量的青霉素，各级发酵罐降低了蒸汽消毒的消耗，节约了蒸汽成本。
具体实施方式
实施例1
（a）将1号发酵罐中效价为28650μ/mL的12m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将2号发酵罐中效价为35230μ/mL的10m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将3号发酵罐中效价为41330μ/mL的11m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将收集到的33m3发酵液在一级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速80 r/min，通气比1:1.1，加入液糖量为每小时2kg/m3发酵液，氨氮含量0.3mg/mL，pH值6.4±0.2，培养30小时，发酵液效价增长至61940μ/mL。
（b）将3号发酵罐中效价为64650μ/mL的10m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将4号发酵罐中效价为73850μ/mL的12m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将一级发酵罐中效价为61940μ/mL的39m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将收集到的61m3发酵液在二级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速100 r/min，通气比1:1.2，加入液糖量为每小时4.0kg/m3发酵液，氨氮含量0.4mg/mL，pH值6.4±0.2，培养32小时，发酵液效价增长至95360μ/mL。
（c）将4号发酵罐中效价为97850μ/mL的11m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将5号发酵罐中效价为103780μ/mL的10m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将二级发酵罐中效价为95360μ/mL的75m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将收集到的96m3发酵液在三级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速110 r/min，通气比1:1.25，加入液糖量为每小时4.5kg/m3发酵液，氨氮含量0.4mg/mL，pH值6.4±0.2，培养18小时，发酵液效价增长至114360μ/mL。
（d）将5号发酵罐中效价为116950μ/mL的9m3发酵液无菌带放至四级发酵罐中，将三级发酵罐中效价为114360μ/mL的109m3发酵液无菌带放至四级发酵罐中，将收集到的118m3发酵液在四级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速80 r/min，通气比1:1.1，加入液糖量为每小时1.5kg/m3发酵液，氨氮含量0.15mg/mL，pH值6.4±0.2，培养12小时，发酵液效价增长至123870μ/mL。
（e）将四级发酵罐中效价为123870μ/mL的124m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
本实施例中经统计从1号至5号发酵罐中带放出的发酵液总体积为85 m3，发酵液平均效价为68825μ/mL，带放发酵液滤液平均COD浓度为29450mg/L；经过本发明的各级发酵罐连续培养92h后，最终的发酵液体积增加至124 m3，发酵液效价增加至123870μ/mL，发酵液滤液COD浓度降低至24890 mg/L；发酵液总体积增加了45.88%，发酵液效价增加了79.98%，发酵液滤液COD降低了15.48%。
本实施例运转过程消耗蒸汽约16吨：包括罐体消毒平摊1吨，补料消毒13吨，公共系统消毒2吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽2.69吨。正常发酵罐运转一批所消耗蒸汽约60吨：包括：罐体消毒消耗30吨，补料消耗25吨，公共系统消耗5吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽4.17吨。所以带放料液各级发酵罐生产同样产量的青霉素比正常发酵罐降低蒸汽消耗35.49%。将本实施例结果汇总列于表1中。
实施例2
（a）将4号发酵罐中效价为42460μ/mL的16m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将5号发酵罐中效价为49320μ/mL的15m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将收集到的31m3发酵液在一级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速60r/min，通气比1:1.0，加入液糖量为每小时1.5kg/m3发酵液，氨氮含量0.2mg/mL，pH值6.4±0.2，培养25小时，发酵液效价增长至67680μ/mL。
（b）将5号发酵罐中效价为72650μ/mL的11m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将1号发酵罐中效价为77350μ/mL的10m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将一级发酵罐中效价为67680μ/mL的37m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将收集到的58m3发酵液在二级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速80r/min，通气比1:1.1，加入液糖量为每小时3.0kg/m3发酵液，氨氮含量0.3mg/mL，pH值6.4±0.2，培养30小时，发酵液效价增长至100460μ/mL。
（c）将1号发酵罐中效价为107250μ/mL的12m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将3号发酵罐中效价为97980μ/mL的11m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将二级发酵罐中效价为100460μ/mL的72m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将收集到的95m3发酵液在三级发酵罐中培养，培养条件为：在25±0.5℃，搅拌转速100 r/min，通气比1:1.15，加入液糖量为每小时3.5kg/m3发酵液，氨氮含量0.3mg/mL，pH值6.4±0.2，培养15小时，发酵液效价增长至112870μ/mL。
（d）将2号发酵罐中效价为117270μ/mL的11m3发酵液无菌带放至四级发1酵罐中，将三级发酵罐中效价为112870μ/mL的106m3发酵液无菌带放至四级发酵罐中，将收集到的117m3发酵液在四级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速70 r/min，通气比1:1.05，加入液糖量为每小时1.0kg/m3发酵液，氨氮含量0.1mg/mL，pH值6.4±0.2，培养16小时，发酵液效价增长至124310μ/mL。
（e）将四级发酵罐中效价为124310μ/mL的125m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
本实施例中经统计从1号至5号发酵罐中带放出的发酵液总体积为86 m3，发酵液平均效价为77294μ/mL，带放发酵液滤液平均COD浓度为28340mg/L；经过本发明的各级发酵罐连续培养86h后，最终的发酵液体积增加至125 m3，发酵液效价增加至124310μ/mL，发酵液滤液COD浓度降低至25130 mg/L；发酵液总体积增加了45.35%，发酵液效价增加了60.84%，发酵液滤液COD降低了11.33%。
本实施例运转过程消耗蒸汽约15吨：包括罐体消毒平摊1吨，补料消毒12吨，公共系统消毒2吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽2.70吨。正常发酵罐运转一批所消耗蒸汽约60吨：包括：罐体消毒消耗30吨，补料消耗25吨，公共系统消耗5吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽4.17吨。所以带放料液各级发酵罐生产同样产量的青霉素比正常发酵罐降低蒸汽消耗35.25%。将本实施例结果汇总列于表1中。
实施例3
（a）将2号发酵罐中效价为32550μ/mL的14m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将3号发酵罐中效价为43630μ/mL的15m3发酵液无菌带放至一级发酵罐中，将收集到的29m3发酵液在一级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速70 r/min，通气比1:1.05，加入液糖量为每小时1.8kg/m3发酵液，氨氮含量0.25mg/mL，pH值6.4±0.2，培养36小时，发酵液效价增长至67870μ/mL。
（b）将1号发酵罐中效价为60650μ/mL的16m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将一级发酵罐中效价为67870μ/mL的33m3发酵液无菌带放至二级发酵罐中，将收集到的49m3发酵液在二级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速90r/min，通气比1:1.15，加入液糖量为每小时3.5kg/m3发酵液，氨氮含量0.35mg/mL，pH值6.4±0.2，培养40小时，发酵液效价增长至95360μ/mL。
（c）将5号发酵罐中效价为96780μ/mL的17m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将二级发酵罐中效价为105110μ/mL的65m3发酵液无菌带放至三级发酵罐中，将收集到的82m3发酵液在三级发酵罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速105 r/min，通气比1:1.2，加入液糖量为每小时4.0kg/m3发酵液，氨氮含量0.35mg/mL，pH值6.4±0.2，培养24小时，发酵液效价增长至118220μ/mL。
（d）将4号发酵罐中效价为113950μ/mL的15m3发酵液无菌带放至四级发酵罐中，将三级发酵罐中效价为118220μ/mL的98m3发酵液无菌带放至四级发酵罐中，将收集到的113m3发酵液在四级发酵罐中培养，培养条件为：在25±0.5℃，搅拌转速75r/min，通气比1:1.05，加入液糖量为每小时1.3kg/m3发酵液，氨氮含量0.1mg/mL，pH值6.4±0.2，培养15小时，发酵液效价增长至125320μ/mL。
（e）将四级发酵罐中效价为125320μ/mL的120m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
本实施例中经统计从1号至5号发酵罐中带放出的发酵液总体积为77 m3，发酵液平均效价为70585μ/mL，带放发酵液滤液平均COD浓度为28150mg/L；经过本发明的各级发酵罐连续培养115h后，最终的发酵液体积增加至120 m3，发酵液效价增加至123870μ/mL，发酵液滤液COD浓度降低至23620 mg/L；发酵液总体积增加了55.84%，发酵液效价增加了75.49%，发酵液滤液COD降低了16.09%。
本实施例运转过程消耗蒸汽约17吨：包括罐体消毒平摊1吨，补料消毒14吨，公共系统消毒2吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽2.88吨。正常发酵罐运转一批所消耗蒸汽约60吨：包括：罐体消毒消耗30吨，补料消耗25吨，公共系统消耗5吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽4.17吨。所以带放料液各级发酵罐生产同样产量的青霉素比正常发酵罐降低蒸汽消耗30.94%。将本实施例结果汇总列于表1中。
对比例1（现行方法）
（a）将1号发酵罐中效价为27340μ/mL的13m3发酵液无菌带放至培养罐中，将2号发酵罐中效价为36810μ/mL的11m3发酵液无菌带放至培养罐中，将3号发酵罐中效价为43230μ/mL的12m3发酵液无菌带放至培养罐中，将收集到的36m3发酵液在培养罐中培养，培养条件为：25±0.5℃，搅拌转速80r/min，通气比1:1.1，加入液糖量为每小时2kg/m3发酵液，氨氮含量0.3mg/mL，pH值6.4±0.2，培养36小时，发酵液效价增长至65910μ/mL。
（b）将培养罐中效价为65910μ/mL的43m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
（c）将2号发酵罐中效价为61070μ/mL的15m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
（d）将4号酵罐中效价为93520μ/mL的12m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
（e）将5号发酵罐中效价为112350μ/mL的13m3发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
本实施例中经统计从1号至5号发酵罐中带放出的发酵液总体积为76m3，发酵液平均效价为62868μ/mL，带放发酵液滤液平均COD浓度为29320mg/L；1-3号发酵罐前期发酵液经过培养罐培养36h后加上2、4、5号发酵罐后期带放发酵液的最终体积增加至83 m3，发酵液效价增加至76301μ/mL，发酵液滤液COD浓度降低至28250 mg/L；发酵液总体积增加了9.21%，发酵液效价增加了21.37%，发酵液滤液COD降低了3.65%。
本实施例运转过程消耗蒸汽约10.5吨：包括罐体消毒5.5吨，补料消毒4吨，公共系统消毒1吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽3.89吨。正常发酵罐运转一批所消耗蒸汽约60吨：包括：罐体消毒消耗30吨，补料消耗25吨，公共系统消耗5吨，折合生产一吨青霉素消耗蒸汽4.17吨。所以本实施例生产同样产量的青霉素比正常发酵罐降低蒸汽消耗6.71%。将本实施例结果汇总列于表1中。
表1：

Claims (8)

1.一种青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）设置青霉素带放料液发酵罐，所述带放料液发酵罐包括一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐；
（b）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为2万—5万μ/mL的发酵液无菌带放至一级发酵罐中培养；
（c）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为5万—8万μ/mL的发酵液以及一级发酵罐中培养至效价为5万—8万μ/mL的发酵液无菌带放至二级发酵罐中培养；
（d）将青霉素正常发酵罐中多余的效价为8万—11万μ/mL的发酵液以及二级发酵罐中培养至效价为8万—11万μ/mL的发酵液无菌带放至三级发酵罐中培养；
（e）将青霉素正常发酵罐中多余的效价大于11万μ/mL的发酵液以及三级发酵罐中培养至效价大于11万μ/mL的发酵液无菌带放至四级发酵罐中培养；
（f）将四级发酵罐中培养至效价大于12万μ/mL的发酵液无菌带放至过滤岗位过滤。
2.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，一级发酵罐体积为30m3—100 m3，一级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为1.5—2.0kg/m3·h，发酵液氨氮含量为0.2—0.3mg/mL，搅拌转速为60—80r/min，一级发酵罐数量为2—5个。
3.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，二级发酵罐体积为50m3—120 m3，二级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为3.0—4.0kg/ m3·h，发酵液氨氮含量为0.3—0.4 mg/mL，搅拌转速为80—100 r/min，二级发酵罐数量为2—6个。
4.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，三级发酵罐体积为75m3—150 m3，三级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为3.5—4.5kg/m3·h，发酵液氨氮含量为0.3—0.4 mg/mL，搅拌转速为100—110 r/min，三级发酵罐数量为2—7个。
5.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，四级发酵罐体积为100m3—200 m3，四级发酵罐加入葡萄糖或液糖量为1.0—1.5kg/m3·h，发酵液氨氮含量为0.1—0.15 mg/mL，搅拌转速为70—80 r/min，四级发酵罐数量为2—5个。
6.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，带放料液发酵罐温度控制在23℃—28℃。
7.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，带放料液发酵罐中发酵液pH控制在6.0—7.0。
8.根据权利要求1所述的青霉素发酵液连续培养方法，其特征在于，一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐通过外径为5cm—20cm的不锈钢管连接，所述不锈钢管与正常发酵罐连通，在一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐和四级发酵罐外各自设置有不锈钢手动阀门或自动阀门。
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