CN102808012B - 一种头孢菌素c的发酵方法以及顶头孢霉发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤：（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，得发酵液；（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。本发明还公开了一种顶头孢霉的发酵培养基。本发明头孢菌素C的发酵方法成本低廉，制备的头孢菌素C效价高，市场应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及头孢菌素C的发酵方法。
背景技术
头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)产生，是继青霉素之后又一重要的β-内酰胺抗生素，其结构与青霉素的结构相似，有一酰基侧链与一双环母核上的氨基相接，与青霉素一样都具有一个四元内酰胺环，但头孢菌素C具有六元二轻噻嗪环，代替了青霉素特征五元噻唑环。头孢菌素C的分子式C16H21O8N3S，分子量为415.4，结构式为：
头孢菌素类抗生素由于其抗菌谱广和过敏性弱的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物。头孢菌素C是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
发酵制备头孢菌素C的过程中，发酵培养基是影响头孢菌素C产量的重要因素。
任璐等，“头孢菌素C发酵过程中蛋氨酸加量对菌丝形态及效价的影响”，河北化工，2010，33(1)：56-57，利用头孢菌素C产生菌发酵，发酵培养基是以小麦面筋粉、花生饼粉、玉米粉、玉米浆、高温黄豆饼粉、豆油、葡萄糖、果葡萄浆、硫酸钙、蛋氨酸（即甲硫氨酸）为原料，蛋氨酸的加量为8‰，头孢菌素C的产量为32.55g/L，效价为32550U/mL。王娟等，“头孢菌素C发酵过程中硫酸铵加量对菌丝形态及效价的影响”，求医问药，2011，9:40公开了利用头孢菌素C产生菌-HC菌种，在玉米淀粉、糊精、玉米浆、蛋氨酸、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、蔗糖、葡萄糖组成的发酵培养基中发酵制备头孢菌素C的方法，硫酸铵加入量为4%，头孢菌素C的产量为28.39g/L，效价为2839U/mL。
现有文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的效价低，难以很好的满足工业化应用的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的头孢菌素C的发酵方法以及定头孢霉的发酵培养基。
本发明头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤：
（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；
（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，得发酵液，所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、甲硫氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份、MgSO4 1-6重量份、(NH4)2SO4 7-16重量份、FeSO4 0.04-0.2重量份、MnSO4 0.01-0.05重量份、ZnSO4 0.01-0.05重量份、CuSO4 0.01-0.05重量份、CaCO3 4-11重量份；
（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。
其中，步骤（1）所述顶头孢霉是保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉。
其中，步骤（1）中一级种子和二级种子按照本领域常规方法即可制备得到，其中，活化后用于制备一级种子的顶头孢霉菌液浓度应不小于25%（mg/ml）。其余步骤可以按照冀志霞等，“头孢菌素C发酵过程代谢特征”，华东理工大学学报（自然科学报2006-11第32卷1275-1279）第1.2.6三级发酵记载的方法制备；也可按如下方法制备：a、一级种子：取顶头孢霉，按照1-2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5-7.5、27-29℃培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分：玉米浆20-30重量份、葡萄糖13-20重量份、蔗糖10-20重量份、植物油35-50体积、碳酸钙1-1.5重量份、消沫剂0.5-1.0体积份；b、二级种子：取一级种子，按照8-10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0-7.0、27-29℃培养50-65h，所述种子培养基含有如下成分为：玉米浆16-25重量份、花生粉4-7重量份、黄豆粉4-7重量份、硫酸钙5-10重量份、葡萄糖6-10重量份、植物油40-50体积份、碳酸钙4-7重量份、消沫剂0.5-1重量份。
其中，步骤（2）所述发酵的条件是：发酵时间为140h，0-40h的温度为28℃，40-140h温度为24-25℃，pH为5.5-5.8。
优选地，步骤（2）所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO40.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份。
进一步优选地，玉米浆40重量份、花生粉10重量份、葡萄糖5重量份、水解淀粉20重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油50体积份、消沫剂1.5体积份、MgSO4 2重量份、(NH4)2SO4 8重量份、FeSO4 0.05重量份、MnSO4 0.01重量份、ZnSO4 0.01重量份、CuSO4 0.01重量份、CaCO3 5重量份。
本发明顶头孢霉的发酵培养基，它包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、甲硫氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份、MgSO4 1-6重量份、(NH4)2SO4 7-16重量份、FeSO4 0.04-0.2重量份、MnSO4 0.01-0.05重量份、ZnSO4 0.01-0.05重量份、CuSO4 0.01-0.05重量份、CaCO3 4-11重量份。
优选地，所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO4 0.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份。
进一步优选地，所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40重量份、花生粉10重量份、葡萄糖5重量份、水解淀粉20重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油50体积份、消沫剂1.5体积份、MgSO42重量份、(NH4)2SO48重量份、FeSO4 0.05重量份、MnSO4 0.01重量份、ZnSO4 0.01重量份、CuSO40.01重量份、CaCO3 5重量份。
前述植物油为调和油、花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油、玉米油、亚麻油、米糠油中的任意一种。
前述重量份与体积份的比值为g/mL。
本发明发酵方法制备得到的头孢菌素C的效价达到了35200~418000U/mL，显著高于现有技术制备的头孢菌素C的效价，并且，其原料利用率高，营养物残留量少，生产成本低，环境污染小，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明效价检测按照刘雪惠等，“利用HPLC方法快速测定发酵液中头孢菌素C效价”，黑龙江医药1996年第9期第138-139页记载的方法测定。
实施例1 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为25%（mg/ml）的菌液，按照1%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、27℃培养50h。
一级种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、调和油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
（2）制备二级种子
取步骤（1）制备的一级种子，按照8%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、27℃培养50h。
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、花生油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照18%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆50g、花生粉15g、葡萄糖8g、水解淀粉25g、甲硫氨酸5g、调和油60ml、消沫剂2ml、MgSO4 3.5g、(NH4)2SO4 12g、FeSO4 0.07g、MnSO4 0.025g、ZnSO4 0.025g、CuSO4 0.025g、CaCO3 7.5g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.5，121℃灭菌20min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
经检测，结果见表1：
表1 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例2 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆30g、葡萄糖20g、蔗糖20g、菜籽油50ml、碳酸钙1.5g、消沫剂1.0ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为26%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、29℃培养65h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆25g、花生粉7g、黄豆粉7g、硫酸钙10g、葡萄糖10g、菜籽油50ml、碳酸钙7g、消沫剂1g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0、29℃培养65h。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.8。
发酵培养基：
玉米浆40g、花生粉10g、葡萄糖5g、水解淀粉20g、甲硫氨酸3g、大豆油50ml、消沫剂1.5ml、MgSO4 2g、(NH4)2SO4 8g、FeSO4 0.05g、MnSO4 0.01g、ZnSO4 0.01g、CuSO4 0.01g、CaCO3 5g。所有原料按比例用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.4，118℃灭菌25min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表2：
表2 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例3 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为27%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养55h。
一级种子培养基：玉米浆25g、葡萄糖15g、蔗糖15g、棉籽油40ml、碳酸钙1.2g、消沫剂0.8ml。
（2）制备二级种子
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、28℃培养55h。
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、葵花籽油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照19%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.5。
发酵培养基：
玉米浆75g、花生粉20g、葡萄糖12g、水解淀粉30g、甲硫氨酸8g、米糠油70ml、消沫剂3ml、MgSO4 5g、(NH4)2SO4 15g、FeSO4 0.1g、MnSO4 0.04g、ZnSO4 0.04g、CuSO4 0.04g、CaCO3 10g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.5，125℃灭菌20min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表3：
表3 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例4 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为28%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.5、28℃培养60h。
种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、橄榄油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。
（2）制备二级种子
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养60h。
二级种子培养基：玉米浆20g、花生粉5g、黄豆粉5g、硫酸钙8g、葡萄糖8g、芝麻油45ml、碳酸钙5g、消沫剂0.8g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照20%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.6。
发酵培养基：
玉米浆45g、花生粉13g、葡萄糖7g、水解淀粉24g、甲硫氨酸4g、玉米油55ml、消沫剂1.9ml、MgSO4 3g、(NH4)2SO4 10g、FeSO4 0.07g、MnSO40.02g、ZnSO4 0.03g、CuSO4 0.02g、CaCO3 7g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.0，118℃灭菌30min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表4：
表4 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例5 本发明头孢菌素C的发酵方法
（1）制备一级种子
一级种子培养基：玉米浆30g、葡萄糖20g、蔗糖20g、亚麻油50ml、碳酸钙1.5g、消沫剂1.0ml。
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为29%（mg/ml）的菌液，按照2%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、29℃培养65h。
（2）制备二级种子
二级种子培养基：玉米浆25g、花生粉7g、黄豆粉7g、硫酸钙10g、葡萄糖10g、米糠油50ml、碳酸钙7g、消沫剂1g。
取一级种子，按照10%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.0、29℃培养65h。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照22%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为25℃，pH为5.8。
发酵培养基：
玉米浆50g、花生粉17g、葡萄糖10g、水解淀粉23g、甲硫氨酸5g、橄榄油50ml、消沫剂2ml、MgSO4 3.5g、(NH4)2SO4 12g、FeSO4 0.07g、MnSO40.025g、ZnSO4 0.02g、CuSO4 0.03g、CaCO3 7.5g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.2，120℃灭菌23min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表5：
表5 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例6 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为30%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养55h。
一级种子培养基：玉米浆25g、葡萄糖15g、蔗糖15g、菜籽油40ml、碳酸钙1.2g、消沫剂0.8ml。
（2）制备二级种子
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、28℃培养55h。
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、米糠油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照19%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.5。
发酵培养基：
玉米浆70g、花生粉20g、葡萄糖12g、水解淀粉20g、甲硫氨酸8g、菜籽油65ml、消沫剂3ml、MgSO4 5g、(NH4)2SO4 15g、FeSO4 0.1g、MnSO4 0.03g、ZnSO4 0.04g、CuSO4 0.04g、CaCO3 10g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.4，125℃灭菌30min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表6：
表6 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例7 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为31%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养55h。
一级种子培养基：玉米浆25g、葡萄糖15g、蔗糖15g、亚麻油40ml、碳酸钙1.2g、消沫剂0.8ml。
（2）制备二级种子
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.0、28℃培养55h。
二级种子培养基：玉米浆16g、花生粉4g、黄豆粉4g、硫酸钙5g、葡萄糖6g、芝麻油40ml、碳酸钙4g、消沫剂0.5g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照19%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆76g、花生粉21g、葡萄糖13g、水解淀粉31g、甲硫氨酸9g、植物油71g、消沫剂4ml、MgSO4 6g、(NH4)2SO4 16g、FeSO4 0.2g、MnSO4 0.05g、ZnSO4 0.05g、CuSO4 0.05g、CaCO3 11g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.4，125℃灭菌30min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表7：
表7 头孢菌素C的效价与营养物残留量
实施例8 本发明头孢菌素C的发酵方法
1、发酵方法
（1）制备一级种子
取保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉，活化，取浓度为32%（mg/ml）的菌液，按照1.5%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为7.5、28℃培养60h。
种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖13g、蔗糖10g、大豆油35ml、碳酸钙1g、消沫剂0.5ml。（2）制备二级种子
取一级种子，按照9%（v/v）接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养60h。
二级种子培养基：玉米浆20g、花生粉5g、黄豆粉5g、硫酸钙8g、葡萄糖8g、橄榄油45ml、碳酸钙5g、消沫剂0.8g。
（3）发酵
取步骤（2）制备的二级种子，按照20%的（v/v）接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵140h，0-40h为28℃，40-140h为24.5℃，pH为5.6。
发酵培养基：玉米浆39g、花生粉9g、葡萄糖4g、水解淀粉19g、甲硫氨酸2g、植物油49g、消沫剂1.4ml、MgSO4 1g、(NH4)2SO4 7g、FeSO4 0.04g、MnSO4 0.01g、ZnSO4 0.01g、CuSO4 0.01g、CaCO3 4g。所有原料按比例混匀用水溶解并定容于发酵罐中，用氢氧化钠溶液将培养基pH值调至7.4，125℃灭菌30min。
（4）发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测其效价；
（5）分离纯化：将步骤（4）的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯（或丙酮）溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C锌盐。
2、结果
结果见表8：
表8 头孢菌素C的效价与营养物残留量
综合实施例1~8的培养基和效价，结果见表9：
表9 培养基和效价
由表9可以看出：
在本发明发酵培养基的成分和配比范围内，头孢菌素C的效价均在35200U/mL之上，远高于现有方法得到制备的头孢菌素C效价；在优选范围内，制备的头孢菌素C的效价均在40000U/mL之上；在最佳工艺条件下，头孢菌素C高达41800U/mL，是现有方法制备得到的头孢菌素C效价的1.47倍。
通过实施例2与实施例1、3~7比较发现，头孢菌素C的效价并非与培养基各成分用量呈简单的线性关系，其与各成分之间的配比也有关联。
综合考虑效价和生产成本，发明人认为表9所示的最佳工艺条件更适合工业应用。
综上，本发明通过对培养基的改进，显著提高了头孢菌素C的效价，并且，其原料的利用率高，营养物残留量少，废水污染少，工业应用前景良好。
Claims (10)
1.一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取顶头孢霉，制备一级种子、二级种子；
（2）取步骤（1）制备的二级种子，接种至顶头孢霉发酵培养基中发酵，得发酵液，所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、甲硫氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份、MgSO4 1-6重量份、(NH4)2SO4 7-16重量份、FeSO4 0.04-0.2重量份、MnSO4 0.01-0.05重量份、ZnSO4 0.01-0.05重量份、CuSO4 0.01-0.05重量份、CaCO3 4-11重量份；所述重量份：体积份是g/ml；
（3）将步骤（2）所得发酵液过滤，得上清，分离纯化，即得头孢菌素C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述顶头孢霉是保藏号为ATCC 36225的顶头孢霉。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO4 0.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40重量份、花生粉10重量份、葡萄糖5重量份、水解淀粉20重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油50体积份、消沫剂1.5体积份、MgSO4 2重量份、(NH4)2SO4 8重量份、FeSO4 0.05重量份、MnSO4 0.01重量份、ZnSO4 0.01重量份、CuSO4 0.01重量份、CaCO3 5重量份。
5.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于：步骤（2）所述植物油为调和油、花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油、玉米油、亚麻油、米糠油中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵的条件是：发酵时间为140h；0-40 h的温度为28℃，40-140 h温度为24-25℃；pH为5.5-5.8。
7.一种顶头孢霉的发酵培养基，其特征在于：它包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、甲硫氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份、MgSO4 1-6重量份、(NH4)2SO4 7-16重量份、FeSO4 0.04-0.2重量份、MnSO4 0.01-0.05重量份、ZnSO4 0.01-0.05重量份、CuSO4 0.01-0.05重量份、CaCO3 4-11重量份；所述重量份：体积份是g/ml。
8.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40-75重量份、花生粉10-20重量份、葡萄糖5-12重量份、水解淀粉20-30重量份、甲硫氨酸3-8重量份、植物油50-70体积份、消沫剂1.5-3体积份、MgSO4 2-5重量份、(NH4)2SO4 8-15重量份、FeSO4 0.05-0.1重量份、MnSO4 0.01-0.04重量份、ZnSO4 0.01-0.04重量份、CuSO4 0.01-0.04重量份、CaCO3 5-10重量份。
9.根据权利要求8所述的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基包括如下重量配比的成分：玉米浆40重量份、花生粉10重量份、葡萄糖5重量份、水解淀粉20重量份、甲硫氨酸3重量份、植物油50体积份、消沫剂1.5体积份、MgSO4 2重量份、(NH4)2SO4 8重量份、FeSO4 0.05重量份、MnSO4 0.01重量份、ZnSO4 0.01重量份、CuSO4 0.01重量份、CaCO3 5重量份。
10.根据权利要求7~9任意一项所述的发酵培养基，其特征在于：所述植物油为调和油、花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、芝麻油、玉米油、亚麻油、米糠油中的任意一种。
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