SU734264A1 - Штамм вкм-а591-продуцент холестериноксидазы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к области микробиологического синтеза ферментов и касаетс  получени  штаммов, продуцирующих холестериноксидазу. .Холестериноксилаза, катализирующа  превращение холестерина согласно уравнению: холестерин-Ю, - д 4 -холестенон-ьН О может быть применена в препаративной медицинской биохимии дл  количественного определени  холестерина в крови. Применение ферментного препарата в лаборатбрных клинических анализах позволит значительно ускорить проведение анализов крови на холестерин. Известно, что многие микроорганизмы способны использовать холесте рин в качестве единственного источника углерода. В р де случаев было показано превращение холестерина в холестенон с помощью ферментных пр паратов, J oлyчeнныx из различных микроорганизмов. В насто щее врем  дл  получени  холестериноксидазы используютс  преимущественно микроорганизмы рода Nocardia которые выращиваютс  на средах, содержащих холе терин . Наиболее б.лизким по своей тех ической сущности кизобретению  вл етс  штамм-продуцент холестериноксидазы, относ щийс  к виду ProQctinovnyceFerythropoCis 1 . Холестериноксидаэа  вл етс  внутриклеточным ферментом, поэтому дл  ее получени  клетки микроорганизма-продуцента должны быть разрушены. Клетки нокардий и проактиномицетов трудно разрушаютс , так как их клеточные стенки содержат большее количество носков и липидов по сравнению с другими микроорганизмами. Целью изобретени   вл етс  штамм актиномицетов AcVinomvce, avencJi)Pne ВКМ-А591, образующий внутриклеточную холестериноксидазу. При выращивании Actinomvces на простой среде в течение 20 - 22 ч образуетс  до 2 г/л сухой биомассы с удельной активностью 1,5 ед/г. Мицелий Aclinomyces eavencl(.)9ae разрушаетс  значительно легче, чем клетки нокардий и проактиномицетов. Кроме того, Actinomvces fovendDPoe обладает антибиотической активностью , что предотвращает.заражение культуры при выращивании в больших объемах.

Предлагаемый штамм был выделен из окультуренной почвы Подмосковь , ,селекционирован и идентифицирован как Aclinomvces tovencJu ae ВКМ-А591. Штамм хранитс  во Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов ИНМИ АН СССР,

Морфологи . Типичный актиномицет, имеющий разветвленный мицелий,около 1 мкм в поперечнике, Спороносцы с примитивными спирал ми около 0,5 витка , расположены одиночно. Споры овгшные с гладкой оболочкой. .

Культуральные признаки. На агаризованной глюкозоаспаргиновой среде, примен емой дл  получени  активной биомассы,при посеве на чашки Петри .образуют круглые выпуклые колонии с приподн тым центром.Окраска воздушного мицели  в центре колоний Сероваторозова  (цвет лаванды),по перифери сера . Субстратный мицелий темнобурого цвета. На картофельном агаре образуютс  выпуклые колонии до 100 мм в диаметре с воздушным мицелием светло-серого или белого цвета. Субстратный мицелий светло-бурый. Вокруг колоний на картофельном агаре часто образуютс  бурые зоны из выдел емых в среду меланоидных пигментов . На ломтиках картофел  коло-нии складчатые, воздушный мицелий скудный, серого цвета, Картофель буреет. На масло-пептонном бульоне образует на поверхности пристеночное кольцо, затем хлопь , выпадающие в осадок,

Хорошо растет на глюкозо-дрожжево среде, образу  колонии до 10 мм в диметре белого или сероватого цвета; воздушный мицелий хорошо развит на 5 сут. по всей поверхности колонийJ. образуетс  бурый пигмент, выдел емый в среду.

На среде СР-1 Красильникова растет очень хорошо, колонии крупные (до 13 мм в диаметре на 8-10 сут), воздушный мицелий серого или серовато-коричневого цвета хорошо развит по всей поверхности колоний, нижн   сторона колоний темно-бурого цвета.

На среде Чапека с глюкозой растет плохо, образует мелкие (до 5-7 мм в диаметре) полупрозрачные колонии, воздушный мицелий слабо развит, локализован по кра м колоний, пигмент не образуетс .

На сусло-агаре с 0,5% мела растет медленно,.колонии мелкие (до 5 мм), слабо развитый воздушный мицелий по вл етс  на 7 сут, пигмент не образуетс .

Физиологические признаки.Желатину не разжижает. Молоко подщелачи .вает и пептонизирует без коагул ции на 10-12 сут. при 28°С. Сероводород и индол не образует. Нитраты

не востанавливает. В качестве источника углерода потребл ет глюкозу, галактозу, мальтозу, глицерин, маннит , лимонную кислоту, хуже растет на, маннозе, фруктозе, рамнозе,  нтарной и пирдвиноградной кислотах. Не потреб- л ет ксилозу, инулин, сорбит, инозит, дульцит, эскулин, щавелевую и уксусную кислоты.

Оптимальна  температура роста 28 - 30°С. При 20с рост удовлетвори тельный, воздушный мицелий слабо развит. При 37°С рост очень слабый, без воздушного мицели , при роста нет.

5 Антимикробный спектр.Предлагаемый штамм Actinomvces PavendiuEoe подавл ет рост грам-положительных бактерий и слабо активен против грамотрицательных бактерий.

0 Пример. Получение холестериноксидазы из мицели  ActmomvceS, Pavenriluyac ВКМ-А591.

Посевным материалом служит жидка  односуточна  культура Aclmomvces tayenciutoe ВКМ-А591, выращенна  на среде следующего состава,%: глюкоза 0,5, аспарагин 0,05, дрожжевой экстракт 0,1, рН 7,0-7,2. Выращиваг ние биомассы провод т ферментерах

. объемом 100 л на вышеуказанной среде.

Количество посевного материала составл ет 7,0% от-объема среда. Длительность выращивани  22 ч. При таком культивировании получают 2,0 г сухой биомассы из 1л жидкой культуры.

Биомассу, дважды промытую сол шокислым трис-буфером рН 7,9 с добавлением ЭДТА {500 мг на 100 мл), разрушают в замороженном виде под давлением 4000 кг/см.Фермент экстра гируют тем же буфером в течение 24 ч при 5°С и разрушенные клетки удал ют центрифугированием при 20000g в

с течение 30 мин. Из полученного

центрифугата ферментный препарат получают высаливанием сульфатом аммони  при насыщении 0,7. Выход холестериноксидазы составл ет 1, Ь Е на 1 г сухой биомассы {удельна  активность препарата 0,04 Е/мг белка). При этом одна единица активности {1 Е) соответствует образованию 1 мкмол  холестенона в 1 мин при 37°С в следующей реакционной смеси:

5 2,80 мл 0,5 М фосфатного буфера,

рН 7,0; 0,15 мл раствора холестерина в этаноле (с 3,86 мкг/мл), 0,03 мл 2-ТВИН-20 {с г 0,5%), 0,02 мл экстракта мицели  актиномицета.

0 Сопоставление предлагаемого штаг- ма с продуцентом холестериноксидазы Proactinomvce& ervthropofki приведено в таблице.

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Штамм Actinomyces PavenaoPae ВКМ-А591 - продуцент холестеринокЬидазы. Хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов ИНМИ АН СССР.

   Морфологические признаки. Ак-тиномицет, имеющий разветвленный мицелий около 1 мкм в поперечнике. Спороносцы с примитивными .спиралями около 0,5 витка, одиночные. Споры овальные с гладкой оболочкой. Физиологические признаки. Рост на органической среде. На картофельном ^гаре рост хороший, колонии круглые, выпуклые, белого или сероватого цвета. В пробирках со скошенным картофельным агаром при посеве штрихом окцэаска воздушного мицелия серая с розрвым оттенком (цвет лаванды). На ломтиках картофеля воздушный мицелйй скудный,, серого цвета. Ломтики 20 картофеля приобретают бурую окраску. На мясо-пептонном бульоне рост в виде пристеночного кольца на поверхности, затем образуются хлопья, оседающие на дно.с образованием осадка. 25 Рост на синтетической среде. На агаризованной систетической среде Чапека с глюкозой рост слабый. Колонии до 5 мм в диаметре, воздушный мицелий слабо развит, появляется на 7-8 сут., локализован по краям коионий, пигмент не образуется.

   Молоко подщелачивает, пептонизирует без коагуляции на 10-12 сут. при 28°С.

   Желатину в течение 14сут. при 20°С не разжижает.

   35 Индол не образует. Сероводорода не образует.

   Нитраты не восстанавливает. Отношение к источникам углерода.

   Усваивает глюкозу,галактозу,мальтозу, 4Q глицерин,маннит,лимонно-кислый калйй.

   Слабый рост на маннозе,фруктозе,рамнозе, янтарнокислом натрии,пировинограднокислом натрии.Не ассимилирует ксилозу, арабинозу, сахарозу, лактоэу, раффинозу, крахмал, инулин, 464-, люлозу, сорбит, инозит, дульцит, эскулин, щавелевокислый натрий, уксуснокислый аммоний.

   Антимикробный спектр. iПодавляет рост грам-положительных бактерий и слабо активен против грам-отрицательных бактерий. .

   Ферментативные свойства.Является активным продуцентом холестеринокси- дазы.