NO128540B

NO128540B -

Info

Publication number: NO128540B
Application number: NO01412/70A
Authority: NO
Inventors: C Brownewell
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1969-04-16
Filing date: 1970-04-15
Publication date: 1973-12-03
Also published as: DE2018058A1; IL34186A0; DE2018058B2; CA920077A; US3625828A; JPS5538115B1; LU60734A1; DK128125B; IT1045522B; FR2043399A5; NL7005183A; BE748992A; IL34186A; GB1280396A; DE2018058C3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av glucoseisomerase som er nyttig ved overføring av glucose til fructose.

Søte siruper er vidt anvendt i bake-, konfekt- og leskedrikk-industrien for eksempel. Disse siruper består i alminnelighet av sucrose (rørsukker) eller dextroseholdige produkter erholdt ved stivelsehydrolyse som hovedsøtemiddel. Når der trenges en sirup som er søtere enn den som erholdes fra sucrose, anvendes en invert-sukkersirup. Denne fremstilles ved syrehydrolyse av sucrose for å frembringe en blanding av ca. 50% glucose (dextrose) og ca. 50% fructose (levulose). Skjønt glucose er noe mindre søt enn sucrose,

er fructose søtere enn sucrose slik at totalsøtheten økes sammenlignet med sucrose.

Det er vel kjent at dextrose kan overføres til fructose under alkaliske betingelser. Denne overføring har stor potensiell verdi ved fremstilling av søte siruper. Den alkaliske overføring har imidlertid ikke vært kommersielt vellykket på grunn av at den alkaliske reaksjon bevirker i den fremstilte sirup et uønsket høyt aske-innhold som det er uøkonomisk å fjerne. Sirupen er ikke godtagbar hvis ikke asken fjernes.

Teknikken vendte seg så til en enzymoverføring av glucose til fructose. Det viste seg at arter av Pseudomonas hydrophila, Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenes, Streptomyces albus og lignende kunne dyrkes i passende nær-ingsmedier for å danne enzymer med glucoseisomeraseegenskaper. Disse tidligere kjente fremgangsmåter er ikke blitt kommersielt vellykket fordi enten er utbyttene av enzym for lavt under enzymdannelses-prosessen, eller utbyttene av fructose er for lave når enzymet anvendes for å behandle glucose.

Det har nu vist seg at et bedre glucoseisomeraseenzym kan fremstilles ved dyrkning under aerobe betingelser av en kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583 i et medium inneholdende passende næringsmidler, med påfølgende utvinning av enzymet derfra. Dette enzym kan produseres i godt utbytte og det har forbedrede egenskaper ved overføring av glucose til fructose.

Organismen som anvendes ved foreliggende fremgangsmåte, er klassifisert som Streptomyces olivaceus ved kjente metoder. Den spesielle nye stamme av Streptomyces olivaceus som anvendes ved fremstilling av den nye glucoseisomerase, er deponert i Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, og har fått registreringsnummer NRRL 3583- Denne kultur

er offentlig tilgjengelig. Denne stamme har de samme karakteristika som angitt for Streptomyces olivaceus i Bergey's Manual of Determin-ative Bacteriology, 7. utgave (1957) side 792 og kan således ikke skilles fra andre stammer av Streptomyces olivaceus ved morfologiske og taxonomiske egenskaper. •

Det er således tidligere kjent at forskjellige stammer av Streptomyces kan danne glucoseisomerase. Sammenlignende forsøk ble utført med et representativt antall av tidligere kjente arter erholdt fra samlingen til Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois. Disse stammer er ikke de samme som har vært anvendt ved tidligere kjente forsøk, men de er representative for de spesifikke arter. De erholdte kulturer var:

B 2120 Streptomyces achromogenes

B 2208 Streptomyces albus

B 2685 Streptomyces flavovirehs

B 3559 Streptomyces phaeochromogenes

Dessuten fikk man en kulturprøve av den deponerte kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583.

Disse kulturer ble alle opprettholdt på agar ved værelsetem-peratur under anvendelse av velkjente betingelser inntil kulturene var vel sporulert . Kulturene ble så holdt i kjøleskap ved 4°C

Der ble fremstilt et første kondisjoneringsmedium bestående

av en vandig oppløsning av 1% xylose, 1% polypepton, 0,3% K2HP0^ og 0,1% MgSO^.7H20. Dette er identisk med et kjent dyrkningsmedium.

Et første fermenteringsmedium, som også er kjent, ble fremstilt og besto av en vandig oppløsning av 3% hvetekli, 4% maisstøpvæske, 0,1% MgS0^.7H20 og 0,025% CoCl2-6H20. pH ble innstilt på 6,5 med nat riumhydroxyd.

100 ml porsjoner av ovenstående kondisjoneringsmedium ble anbrakt i fem separate trippelskovlede 250 ml vidhalsede Erlenmeyer-kolber, og kolbene med innhold ble sterilisert ved 1,4 kg/cm damptrykk i 20 minutter. Porsjoner av de ovenstående kulturer ble så separat anbrakt i de separate kolber, og de inokulerte kolber ble inkubert ved 30°C på en roterende ryster ved 275 opm i 48 timer.

Separate lOO ml's porsjoner av ovenstående fermenteringsmedium ble anbrakt i fem separate trippelskovlede 250 ml vidhalsede Erlen-meyerkolber, og kolbene med innhold ble sterilisert ved 1,4 kg/cm<2 >damptrykk i 20 minutter. Porsjoner av de ovenfor inkuberte kondi-sjoner ingsmedier ble anbrakt i de separate kolber i 1 volum% mengder, og de erholdte inokulerte kolber ble inkubert ved 30°C på en roterende ryster ved 270 opm i 24 timer. Prøver av de erholdte kolbeinnhold ble så tatt for bestemmelse. Ovenstående fermenterings-betingelser ble så fortsatt i tilsammen 48 timer.

Glucoseisomeraseaktiviteten av hver porsjon av de erholdte bakterieceller ble målt ved glucoseisomerase-bestemmelsesmetode 2 beskrevet på side 4 i beskrivelsen, og resultatene var som følger:

Der ble fremstilt et annet fermenteringsmedium bestående av en vandig oppløsning av O,5% xylan, 1% polypepton, 0,3% ICjHPO^ og 0,1% MgS0^.7H20. Dette f ermenteringsmedium er også tidligere kjent.

Separate porsjoner av det ovenfor angitte første kondisjoneringsmedium ble inokulert med ovenstående fem kulturer og inkubert ved 30°C i 48 timer. Separate 100 ml's porsjoner av det annet ferment er ingsmedium ble anbrakt i separate kolber og inokulert med porsjoner av det inkuberte kondisjoneringsmedium og inkubert i 24 og 48 timer som beskrevet ovenfor. Prøver av de forskjellige kolber ble så analysert som beskrevet ovenfor på glucoseisomerase-aktivitet og ga følgende resultater:

Der ble fremstilt et annet kondisjoneringsmedium bestående av en vandig oppløsning av 1% xylose, 1% pepton, 0,5% kjøt tekst rakt, 0,25% gjær ekst rakt, 0,5% NaCl og 0,05% MgS0^.7H20. pH ble innstilt på 7,0 med NaOH. Dette medium er også tidligere kjent.

Der ble fremstilt et tredje fermenteringsmedium bestående av en vandig oppløsning av de samme materialer som ovenstående annet kondisjoneringsmedium unntatt at der istedenfor 1% xylose anvendes en blanding av 0,7% xylose og 0,3% maisstivelse. pH innstilles også

på 7,o.

Separate porsjoner av ovenstående annet kondisjoneringsmedium ble inokulert med de ovennevnte fem kulturer og inkubert ved 30°C

på en roterende ryster ved 275 opm i 24 timer. 100 ml porsjoner av ovenstående tredje fermenteringsmedium ble anbrakt i separate kolber og inokulert med 2 volum% porsjoner av det inkuberte kondisjoneringsmedium og inkubert i 24 og 48 timer som beskrevet ovenfor. Prøver fra de forskjellige kolber ble så analysert som beskrevet ovenfor på glucoseisomerase-aktivitet, og resultatene var som følger:

Der ble fremstilt et fjerde fermenteringsmedium bestående av en vandig oppløsning: av 0,7% xylose, 0,3% maisstivelse, 0,25% gjær-hydrolysat og 2% maisstøpvæske. pH ble innstilt på 7,2 med natrium-hydroxyd.

Separate porsjoner av ovenstående fjerde fermenteringsmedium ble inokulert med ovennevnte fem kulturer og inkubert ved 30°C på en roterende ryster ved 275 opm i 24 timer. Separate nye 100 ml porsjoner av samme fermenteringsmedium ble anbrakt i separate kolber og inokulert med 1 volum% porsjoner av det inkuberte medium og inkubert i 24 og 48 timer som beskrevet ovenfor. Prøver av de forskjellige kolber ble så analysert som beskrevet ovenfor på glucoseisomerase-aktivitet, og resultatene er vist nedenfor:

Ovenstående sammenlignende forsøk viser at Streptomyces olivaceus NRRL 3583 var, sammenlignet med andre Streptomyces-organismer av den tidligere kjente type, den eneste organisme som frembrakte glucoseisomerase-aktivitet i alle de anvendte medier innbefattende spesielle, tidligere kjente medier, og i praktisk talt alle tilfelle undersøkt ga den en høyere glucoseisomerase-aktivitet .

Et fermenteringsmedium ble fremstilt bestående av en vandig oppløsning av O,7% xylose, O,3% maisstivelse, 1% pepton,

0,5% kjøttekstrakt, 0,25% gjærekstrakt, 0,5% natriumklorid og 0,05% MgS0^.7H20. pH ble innstilt på 7,0 med natronlut.

Separate porsjoner av ovenstående medium ble inokulert med en tidligere kjent stamme, Streptomyces olivaceus NRRL 1224 og foreliggende stamme, Streptomyces olivaceus NRRL 3583, og ble så inkubert ved 30°C på en roterende ryster ved 275 opm i 24 timer. Den tidligere kjente stamme ga en fermenteringsvæske inneholdende bare 986 GIU/1, mens foreliggende stamme produserte 1600 GIU/1.

Separate porsjoner av ovenstående medium ble inokulert med en tidligere kjent stamme, Streptomyces olivaceus ATCC 3335»

og foreliggende stamme, NRRL 3583, og ble inkubert som beskrevet ovenfor. Den tidligere kjente stamme produserte bare 648 GIU/l, mens foreliggende stamme produserte 1650 GIU/l. Den nye stamme skiller seg således fra kjente stammer ved at den gir et høyere utbytte av det ønskede enzym.

Streptomyces olivaceus NRRL 3583 organismen opprettholdes på agar-skråkulturer og 'kan dyrkes i et medium inneholdende passende næringsmidler. Mediet inneholder fortrinnsvis xylose og en kilde til nitrogen. Fortrinnsvis inneholder også mediet andre carbohydrater og uorganiske salter. Eksempler på carbohydrater er maisstivelse, dextrose, lactose, melkefaststoffer, hvetekli og lignende. Eksempler på nitrogenkilder er pepton, gjærekst rakt, kjøttekstrakt, aminosyrer og lignende. Eksempler på uorganiske salter er natriumklorid, magnesiumsulfat og lignende. Disse carbohydrater, nitrogenkilder og uorganiske salter er vel kjent i faget. Xylosen anvendt i dyrkningsmediet kan være i en renset form eller den kan være i form av et ratt<: >xylosehbldig materiale.

Organismen dyrkes fortrinnsvis under submerse fermenterings-betingelser i ca. 20 til ca. 50 timer ved en temperatur fra ca. 15°C til ca. 35°C. Ved temperaturer under ca. 15°C og ved temperaturer over ca. 35°C blir utbyttet av det ønskede enzym ganske lavt. Den foretrukne dyrkningstemperatur er fra ca.

25°C til ca. 35°C. Atmosfæriske trykkbetingelser anvendes fortrinnsvis, men trykk over og under atmosfæretrykk kan anvendes om ønskes uten noen spesielle fordeler eller ulemper. Begynn-elses-pH av dyrkningsmediet bør være fra ca. 6,8 til ca. 7>1-Glucoseisomerasen ifølge foreliggende oppfinnelse dannes inne i bakteriecellene som vokser under dens produksjon. Cellene kan frafiltreres fra den fermenterte næringsvæske og anvendes direkte som en kilde til glucoseisomerase. Alternativt kan cellene fjernes ved filtrering og derpå sprenges ved velkjente metoder. De erholdte sprengte celler og det frigjorte innhold kan anvendes som en kilde til glucoseisomerase. Dessuten kan cellene sprenges, f.eks. ved ultralyd eller homogeniseringsanordninger, og avfallet kan fjernes ved sentrifugering. Den overstående væske kan anvendes direkte som en kilde til glucoseisomerase, eller den kan lyofiliseres til et fint pulver for senere anvendelse. Enzymet kan også utvinnes av den overstående væske med velkjente felningsmidler, som ethanol eller ammon-

iumsulf at.

Glucoseisomerasen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse

kan bestemmes med hensyn til sin fructoseproduserende aktivitet ved å følge to bestemmelsesmetoder.

Glucoseisomerase- best emmelsesmetode I

En 500 g/l vandig oppløsning av glucose inneholdende 0,005 molar konsentrasjon av ammoniumklorid, 0,1 molar konsentrasjon av magnesiumsulfat og 0,001 molar konsentrasjon av koboltklorid ble fremstilt. Denne oppløsning hadde en pH på 9,0. En 5 ml porsjon av ovenstående pufrede glucoseoppløsning ble blandet med en 5 ml porsjon av en glucoseisomeraseoppløsning. Sistnevnte oppløsning kan være en suspensjon av hele bakterieceller, en suspensjon av sprengte celler eller enzymoppløsningen utvunnet fra sprengte celler. Ovenstående blanding ble rystet godt og inkubert i 60 minutter ved 70°C. En 1 ml porsjon av den erholdte reaksjonsblanding ble så tatt ut og blandet med 9 ml 0,5N perklorsyre. Ytterligere fortynninger ble ut-ført med vann efter behov for å få en passende sluttfarveutvikling. Til 1 ml av den erholdte blanding ble tilsatt 0,2 ml av en 1,5 vekt%-ig oppløsning av cystein-hydroklorid. Til dette ble så tilsatt 6 ml av en blanding av 190 ml destillert vann og 450 ml konsentrert svovel-syre. Straks efter ble tilsatt 0,2 ml av en 0,12 vekt%-ig alko-holisk oppløsning av carbazol. Hele blandingen ble så rystet og fikk lov til å stå i 30 minutter ved 40°C. Den optiske tetthet av den dannede fiolette farve ble så målt under anvendelse av en lys-kilde med en bølgelengde på 560 nm. Den således erholdte optiske tetthetsmåling ble sammenlignet med verdier på en standardkurve for fructosekonsentrasjon mot optisk tetthet. Bestemmelsen angies som prosent glucose overført til fructose.

Glucoseisomerase- best emmelsesmetode 2

En 625 g/l vandig oppløsning av glucose ble fremstilt ved langsomt å tilsette under omrøring 625 g vannfri glucose til 300 ml varmt destillert vann. Oppløsningen ble avkjølt til værelsetempera-tur, og 125 ml 1 M vandig oppløsning av tris-(hydroxymethyl)-amino-methan ved pH 8,5, 125 ml 1 M vandig magnesiumsulfatoppløsning og 50 ml 0,025 M vandig koboltkloridoppløsning ble tilsatt. Den dannede blanding ble så fortynnet til 1 liter med destillert vann.

En 10 ml porsjon av ovenstående glucoseoppløsning ble innført

i en 25 ml målekolbe. Tilstrekkelig enzym til å bestemmes ble tilsatt for å frembringe en reduksjon av spesifikk dreining, som def-inert nedenfor, på ca. 2,9° til ca. 7,5°. Kolbeinnholdet ble så fortynnet til 25 ml med destillert vann, og den erholdte blanding ble inkubert ved 6o°C i 2 timer. Reaksjonen ble så stanset ved tilset-ning av 1 ml 0,5 M vandig oppløsning av perklorsyre. Blandingen ble så sentrifugert ved 15000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter, og den optiske dreining (i °) av den overstående væske ble målt ved velkjente metoder. En blindprøve ble utført ved den samme metode, men uten nærvær av enzymet. Den optiske dreining av blindprøven ble også målt. Den spesifikke dreining, [ct]D 2 5, av prøven eller blind-prøven var 2a eller to ganger den iakttatte optiske dreining. Den prosentvise overføring av glucose til fructose ble beregnet ved følgende formel:

Denne bestemmelsesmetode ble også anvendt til å måle aktiviteten i glucoseisomeraseenheter, hvor en glucoseisomeraseenhet er den mengde enzym som vil overføre et mikromolekyl glucose til fructose pr. minutt under bestemmelsesbetingelsene. Denne enzymaktivitet i glucoseisomeraseenheter av enzymprøven som undersøkes, ble beregnet ved følgende formel:

hvor (ig fructose dannet ble beregnet ved å multiplisere det ovenfor beregnede prosentvise glucoseoverføringstall med 6,25 x 10^.

Oppfinnelsen vil bli beskrevet mere detaljert i de efterfølg-ende eksempler.

Eksempel 1

En kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583 ble overført til en 250 ml kolbe inneholdende lOO ml av en vandig blanding inneholdende IO g/l xylose, 10 g/l pepton, 8 g/l kjøttekstrakt, 2,5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l natriumklorid og 0,5 g/l magnesiumsulfat, og med en pH på 6,8 - 7,0. Det inokulerte kolbeinnhold ble så rystet på en frem- og tilbakegående ryster med et 5o mm slag ved 176 slag pr. minutt i 24 timer ved 30°C Bakteriecellene ble frafiltrert fra den erholdte fermenterte væske og ble bestemt ved glucoseisomerase-bestemmelsesmetode 1 til å ha minst 40% overføring av glucose til

fructose.

Eksempel 2

En kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583 ble innført i en omrørt luftet fermentator inneholdende IO 1 av en vandig blanding inneholdende 7 g/l xylose, 3 g/l raffinert maisstivelse, 10 g/l pepton, 5 g/l kjøttekstrakt, 2,5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l natriumklorid og 5 g/l magnesiumsulfat, og med en pH på 7,0. Rysteren ble rotert med 400 omdreininger pr. minutt, og luft ble ført gjennom mediet med en hastighet på 3 volum luft pr. volum medium pr. minutt. Fermenteringen ble fortsatt i 24 timer ved 32°C . Ferment erings-væsken ble sentrifugert ved 40000 omdreininger pr. minutt for å skille fra bakteriecellene. Cellene ble så frosset og lyofilisert. Det dannede enzympulver ble bestemt ved glucoseisomerase-bestemmelsesmetode 2 til å ha en aktivitet på 42,6% overføring av glucose til fructose.

Eksempel 3

En kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583 ble overført til en fermentator utstyrt som i eksempel 2, og inneholdende 10 1 av mediet beskrevet i eksempel 2. Rysteren ble rotert ved 400 omdreininger pr. minutt, og luft ble ført gjennom mediet i en mengde på 2 liter pr. minutt. Fermenteringen ble fortsatt i 48 timer ved 21 - 31°C. Fermenteringscellene ble utvunnet, sprengt i en homogenisator, og avfallet ble fjernet ved sentrifugering. Den erholdte overstående væske ble lyofilisert, og pulveret ble bestemt ved glucoseisomerase-best emmelsesmetode 2 til å inneholde 320 GIE/g.

Glucoseisomeraseenzymet fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte er nyttig til å overføre glucose til fructose også under andre betingelser enn bestemmelsesbetingelsene. Dette fremgår av følgende eksempel.

Eksempel 4

En vandig glucoseoppløsning inneholdende 250 g/l glucose ble blandet med noen bakterieceller dyrket i henhold til fremgangsmåten

i eksempel 2. Bakteriecellene ble bestemt ved glucoseisomerase-best emmelsesmetode 2 og ble anvendt i en mengde på 1,5 GIE pr. gram glucose i glucoseoppløsningen. Den erholdte blanding med en pH på 8,0 ble omsatt ved 6o°C i 72 timer. Den dannede oppløsning ble bestemt ved glucoseisomerase-bestemmelsesmetode 2 og viste 40,7% over-føring av glucose til fructose.

Claims

Fremgangsmåte ved fremstilling av glucoseisomerase ved dyrkning av en mikroorganisme av arten Streptomyces olivaceus under aerobe betingelser i et næringsmedium, og utvinning av enzymet, karakterisert ved at der som mikroorganisme anvendes Streptomyces olivaceus NRRL 3583.