JPS60105493A - 酸安定性α−アミラ−ゼ酵素調製品 - Google Patents
酸安定性α−アミラ−ゼ酵素調製品Info
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- JPS60105493A JPS60105493A JP59196940A JP19694084A JPS60105493A JP S60105493 A JPS60105493 A JP S60105493A JP 59196940 A JP59196940 A JP 59196940A JP 19694084 A JP19694084 A JP 19694084A JP S60105493 A JPS60105493 A JP S60105493A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
- C12N9/242—Fungal source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、アミロ−グルコシダーゼ又はトランスフニー
ラーゼ活性のいずれをも有しない酸安定性α−アミラー
ゼ酵素調製品に関する。
ラーゼ活性のいずれをも有しない酸安定性α−アミラー
ゼ酵素調製品に関する。
(発明の背景)
マルトース活性なしで、酸安定性でかつ酸不安定性α−
アミラーゼの双方を生産することは公知である。加えて
、アミログルコシダーゼ及びトランスフェラーゼ(トラ
ンスグリコシダーゼHIIX活性が得られる。
アミラーゼの双方を生産することは公知である。加えて
、アミログルコシダーゼ及びトランスフェラーゼ(トラ
ンスグリコシダーゼHIIX活性が得られる。
酸安定性α−アミラーゼは、カナダ特許663.274
及びAgr、Biol 、Chem、中のいくつかの文
献(Y、Mlnoda等、Agr、Biol、Chem
、Vol。
及びAgr、Biol 、Chem、中のいくつかの文
献(Y、Mlnoda等、Agr、Biol、Chem
、Vol。
27、屋11、p−806−811,1963、Vol
、32、A1、p、104−109.1968及びVo
l、32 、Al、p、 110−113,1968)
から公知である。
、32、A1、p、104−109.1968及びVo
l、32 、Al、p、 110−113,1968)
から公知である。
酸安定性α−アミラーゼは、最初は酸性条件(pH2,
5〜4.5)の下、次いで弱酸性条件(pH約養するこ
とによシ得られる。酸安定性α−アミラーゼに加えて、
酸不安定性α−アミラーゼ(中性アミラーゼ)及びグル
コアミラーゼ及びトランスフェラーゼ活性を有する酵素
が、微生物によシ生産され、培地中に現われる。
5〜4.5)の下、次いで弱酸性条件(pH約養するこ
とによシ得られる。酸安定性α−アミラーゼに加えて、
酸不安定性α−アミラーゼ(中性アミラーゼ)及びグル
コアミラーゼ及びトランスフェラーゼ活性を有する酵素
が、微生物によシ生産され、培地中に現われる。
先に掲げた従来技術に従い、グルコアミラーゼ及びトラ
ンスフェルラーゼ活性は、酵素生成物の精製によシ、た
とえば硫酸アンモニウム、リパノール及びアセトンを用
いて除去することができ、これにより酸安定性α−アミ
ラーゼを結晶形で得る。
ンスフェルラーゼ活性は、酵素生成物の精製によシ、た
とえば硫酸アンモニウム、リパノール及びアセトンを用
いて除去することができ、これにより酸安定性α−アミ
ラーゼを結晶形で得る。
しかるに、酵素技術において周知の如く、結晶形酵素は
特に安定でなく、その他産業によシ用いられるのに十分
適当でない。更に、精製を行う費用並びに培養ブロス中
に存する酵素レベルに関し得られる低収率のため、結晶
形酵素にとって値段体制を産業に適合させるのが困難で
ある。
特に安定でなく、その他産業によシ用いられるのに十分
適当でない。更に、精製を行う費用並びに培養ブロス中
に存する酵素レベルに関し得られる低収率のため、結晶
形酵素にとって値段体制を産業に適合させるのが困難で
ある。
本発明の目的は、アミログルコシダーゼ又はトランスフ
ェルラーゼ活性のいずれも有しない酸安定性α−アミラ
ーゼ酵素生成物を提供することにあシ、これは、培地か
ら直接得ることができ、これによシ上記精製工程を避け
ることができる。
ェルラーゼ活性のいずれも有しない酸安定性α−アミラ
ーゼ酵素生成物を提供することにあシ、これは、培地か
ら直接得ることができ、これによシ上記精製工程を避け
ることができる。
本発明の別の目的は、酸安定性(χ−アミラーゼ液体コ
ンセントレートの製造するための低コスト方法を提供す
るととにある。
ンセントレートの製造するための低コスト方法を提供す
るととにある。
避けねばならぬ副活性は、アミログルコシダーゼおよび
トランスフェルラーゼである。
トランスフェルラーゼである。
語句「トランスフェルラーゼ」はグルコシルトランスフ
ェ声ラーゼを言及するため用いられ、これはマルトース
に作用する場合、1.4−結合以外の結合を有する三糖
類および三糖類(例えばイソマルトース、パノース又は
ニゲロース)並びに遊離グルコースを生じる。
ェ声ラーゼを言及するため用いられ、これはマルトース
に作用する場合、1.4−結合以外の結合を有する三糖
類および三糖類(例えばイソマルトース、パノース又は
ニゲロース)並びに遊離グルコースを生じる。
従って、存在するトランスフェルラーゼ活性は、マルト
ース活性として検知できる。トランスフェルラーゼ活性
により生産されるこのような三糖類および三糖類は非発
酵性であシ、この性質はノ1イテキストロース、ハイマ
ルトースおよび高変換シロップの双方において最も好ま
しくなく、従って、トランスフ賓ラーゼ生成物はこのよ
うなシロップの製造に対し、酵素調製品において避けね
ばならない。
ース活性として検知できる。トランスフェルラーゼ活性
により生産されるこのような三糖類および三糖類は非発
酵性であシ、この性質はノ1イテキストロース、ハイマ
ルトースおよび高変換シロップの双方において最も好ま
しくなく、従って、トランスフ賓ラーゼ生成物はこのよ
うなシロップの製造に対し、酵素調製品において避けね
ばならない。
本発明は以下の事実を基礎にする。すなわち、本発明者
は、α−アミラーゼを生産する能力を保持しつつ、アミ
ログルコシダーゼおよびトランス(7) フェルラーゼを生産する能力を阻止できるα−アミラー
ゼ生産アスペルギルスニーガー(Agpergillu
aniger) 菌株を突然変異させることに成功した
事実である。
は、α−アミラーゼを生産する能力を保持しつつ、アミ
ログルコシダーゼおよびトランス(7) フェルラーゼを生産する能力を阻止できるα−アミラー
ゼ生産アスペルギルスニーガー(Agpergillu
aniger) 菌株を突然変異させることに成功した
事実である。
本発明に係る酸安定性α−アミラーゼ生成物は、ハイデ
キストロースおよびハイマルトースシロップもしくは他
の澱粉氷解物の製造において液化酵素として用いること
ができる。液化プロセスにおいて、α−アミラーゼ生成
物を用いる場合、糖化プロセスにおいて用いられると同
様の、低い−(約4.3)を用いることができ、液化お
よび糖化の工程間のpHR111節を不必要にする。更
にα−アミラーゼ生成物は液化酵素として用いるのに十
分熱安定性である。
キストロースおよびハイマルトースシロップもしくは他
の澱粉氷解物の製造において液化酵素として用いること
ができる。液化プロセスにおいて、α−アミラーゼ生成
物を用いる場合、糖化プロセスにおいて用いられると同
様の、低い−(約4.3)を用いることができ、液化お
よび糖化の工程間のpHR111節を不必要にする。更
にα−アミラーゼ生成物は液化酵素として用いるのに十
分熱安定性である。
更に、アミログルコシダーゼ活性を有しないアミラーゼ
は、ハイアルドースシロップの製造において必要である
。
は、ハイアルドースシロップの製造において必要である
。
(発明の概要)
本発明の第一の面によれば、ハイデキス)o−ス、ハイ
マルトース及び高変換シロップ生産に対(8) し適当な酸安定性α−アミロース調製品が得られ、これ
はアスペルギルス(Aspergillus)由来のα
−アミラーゼ液体コンセントレートからなシ、該α−ア
ミラーゼ液体コンセントレートはアミログルコシダーゼ
又はトランスフェルラーゼ活性のいずれも有しないこと
を特徴とする。
マルトース及び高変換シロップ生産に対(8) し適当な酸安定性α−アミロース調製品が得られ、これ
はアスペルギルス(Aspergillus)由来のα
−アミラーゼ液体コンセントレートからなシ、該α−ア
ミラーゼ液体コンセントレートはアミログルコシダーゼ
又はトランスフェルラーゼ活性のいずれも有しないこと
を特徴とする。
本発明の別の面によれば、アミログルコシダーゼ又はト
ランスフェかラーゼ活性のいずれも有しない酸安定性α
−アミラーゼコンセントレートの製造方法が提供されこ
れはアスペルギルス力を保持しつつ、アミログルコシダ
ーゼ及びトランスフェルラーゼを生産する能力を阻止す
る為突然変異されたアスペルギルス(Aspergil
lui)菌株を、炭素及び窒素の同化源並びに無機塩を
含有する中性栄養培地中で培養し、引き続きα−アミラ
ーゼ培地をコンセントレートに変換することを特徴とす
る。
ランスフェかラーゼ活性のいずれも有しない酸安定性α
−アミラーゼコンセントレートの製造方法が提供されこ
れはアスペルギルス力を保持しつつ、アミログルコシダ
ーゼ及びトランスフェルラーゼを生産する能力を阻止す
る為突然変異されたアスペルギルス(Aspergil
lui)菌株を、炭素及び窒素の同化源並びに無機塩を
含有する中性栄養培地中で培養し、引き続きα−アミラ
ーゼ培地をコンセントレートに変換することを特徴とす
る。
酵素の回収方法はそれ自身業・界において十分確立され
ておシ、通常培養ブロスの濾過、遠心分離又は他の清澄
化、引き続き液体の蒸発によるα−アミラーゼコンセン
トレートの製造を含む。
ておシ、通常培養ブロスの濾過、遠心分離又は他の清澄
化、引き続き液体の蒸発によるα−アミラーゼコンセン
トレートの製造を含む。
かくして本発明方法は、酸安定性α−アミラーゼ調製品
の製造に対し好都合でかつ定価な方法である。なぜなら
ば結晶形α−アミラーゼを得るためこれまで必要であっ
たわずられしい精製工程を省略できるからである。
の製造に対し好都合でかつ定価な方法である。なぜなら
ば結晶形α−アミラーゼを得るためこれまで必要であっ
たわずられしい精製工程を省略できるからである。
本発明は又、α−アミラーゼを合成する能力を保持しつ
つ、アミログルコシダーゼ及びトランスフェルラーゼ活
性を有する酵素の合成に関し、本質的に阻止されたアス
ペルギルス(Asperg目1旧0の突然変異菌株を提
供する。
つ、アミログルコシダーゼ及びトランスフェルラーゼ活
性を有する酵素の合成に関し、本質的に阻止されたアス
ペルギルス(Asperg目1旧0の突然変異菌株を提
供する。
本発明の好ましい態様によれば、α−アミラーゼ調製品
のアミラーゼ活性は、1ml当υ50〜1000 EA
Uの範囲内である。
のアミラーゼ活性は、1ml当υ50〜1000 EA
Uの範囲内である。
本発明の好ましい態様によれば、アスベルギルスニーガ
ー(Asperglllus niger)の菌株は、
α−アミラーゼを合成する能力を十分に保持しつつ、ア
ミノグルコシダーゼ及びトランスフェルラーゼ活性を有
する酵素の合成を阻止するため突然変異される。アスペ
ルギルスニーガ−(Aspsrgi llusnige
r)TSA−1のこの様な突然変異菌株培養物は、ジャ
ーマンコレクションオブマイクロオーガニズム(DSM
) (ダッチンダン、ドイツ国)に、1983年9月
2日に受託され、受託番号DSM2761を得た。
ー(Asperglllus niger)の菌株は、
α−アミラーゼを合成する能力を十分に保持しつつ、ア
ミノグルコシダーゼ及びトランスフェルラーゼ活性を有
する酵素の合成を阻止するため突然変異される。アスペ
ルギルスニーガ−(Aspsrgi llusnige
r)TSA−1のこの様な突然変異菌株培養物は、ジャ
ーマンコレクションオブマイクロオーガニズム(DSM
) (ダッチンダン、ドイツ国)に、1983年9月
2日に受託され、受託番号DSM2761を得た。
この菌株はもちろん、たとえば酸安定性α−アミラーゼ
を生産する能力を高めるため、更に突然変異あるいは又
他に形質変換せしめることができ、更に菌株の形質変換
は本発明の実施において意図されている。
を生産する能力を高めるため、更に突然変異あるいは又
他に形質変換せしめることができ、更に菌株の形質変換
は本発明の実施において意図されている。
以下の内容は公知である。すなわちグルコース含有培地
中で培養されるアスペルギルス(Aspergillu
s)菌株は糖アルコールを生ぜしめる(たとえばW、H
,Lee 、 Can、J、Microbiol、、1
6巻363〜367ページ、1970年参照)。
中で培養されるアスペルギルス(Aspergillu
s)菌株は糖アルコールを生ぜしめる(たとえばW、H
,Lee 、 Can、J、Microbiol、、1
6巻363〜367ページ、1970年参照)。
この様な糖アルコールは培養ブロス内で集積し更に培養
ブロスから得られた酵素溶液に対し安定した作用を示す
(R,D、8chrnid、Advances lnB
iochemical Engineering 、
12巻、59+v61ページ、1979年参照)。08
M2761 を培(11) 養すると、ブロス内で糖アルコールが生じ、次いで該糖
アルコールは酵素コンセントレート生成物に残る。
ブロスから得られた酵素溶液に対し安定した作用を示す
(R,D、8chrnid、Advances lnB
iochemical Engineering 、
12巻、59+v61ページ、1979年参照)。08
M2761 を培(11) 養すると、ブロス内で糖アルコールが生じ、次いで該糖
アルコールは酵素コンセントレート生成物に残る。
かくして、本発明の別の面によれば、培養ブロス由来の
糖アルコールを、好ましくは、少なくとも1重量係以上
の量を含有するための改良された安定性を有する酸安定
性α−アミラーゼ調製品が提供される。
糖アルコールを、好ましくは、少なくとも1重量係以上
の量を含有するための改良された安定性を有する酸安定
性α−アミラーゼ調製品が提供される。
本発明の別の面によれば、ハイデキストロース又はハイ
マルトースシロップもしくは他の澱粉氷解物に、澱粉を
変換する方法が提供され、この方法において澱粉の液化
もしくは部分加水分解は、新規な酸安定性α−アミラー
ゼ酵素調製品の有効量を含んで成る酵素系の存在下で行
なわれる。
マルトースシロップもしくは他の澱粉氷解物に、澱粉を
変換する方法が提供され、この方法において澱粉の液化
もしくは部分加水分解は、新規な酸安定性α−アミラー
ゼ酵素調製品の有効量を含んで成る酵素系の存在下で行
なわれる。
本発明は又、澱粉をハイマルトース又は高変換シロップ
に変換する方法を提供するものであシ、この方法におい
ては澱粉又は澱粉氷解物(好ましくは酵素又は酸液化澱
粉)の糖化け、新規な酸安定性α−アミラーゼ酵素調製
品の有効量を含む酵素系の存在下で行なわれる。ハイマ
ルトースシロ(12) ツブの製造において、糖化け、乾燥固体の30〜45重
量係の澱粉氷解物について、pH3〜5でかつ50〜7
5℃の範囲内の温度で好ましく行なわれる。
に変換する方法を提供するものであシ、この方法におい
ては澱粉又は澱粉氷解物(好ましくは酵素又は酸液化澱
粉)の糖化け、新規な酸安定性α−アミラーゼ酵素調製
品の有効量を含む酵素系の存在下で行なわれる。ハイマ
ルトースシロ(12) ツブの製造において、糖化け、乾燥固体の30〜45重
量係の澱粉氷解物について、pH3〜5でかつ50〜7
5℃の範囲内の温度で好ましく行なわれる。
(発明の詳細)
突然変異手順
アミログルコシダーゼ及びトランスフェルラーゼの合成
を阻止するため、アスイルギルスニーガーのアミラーゼ
生産菌株の突然変異は、以下の方法によ多連続的突然変
異手順に従い行なわれた。
を阻止するため、アスイルギルスニーガーのアミラーゼ
生産菌株の突然変異は、以下の方法によ多連続的突然変
異手順に従い行なわれた。
アミノグルコシダーゼ生産は、γ線突然変異によシ除去
された。外生胞子は、C−1寒天(脱イオン水中3係の
シュクロース、0.1係のKH2PO4,0,3%のN
aNOx 、0.05 %のMgSO4,7H20,0
,011のF e So 4.7H20、0,05%の
KCI及び2.5チ寒天)で増殖したA、=−ガー(A
、niger)菌株CB5263〜65から集めた。外
生胞子を、28ミクロンナイロンフィルターで濾過し、
遠心分離で集め、10チスキンミルクに懸濁させ次いで
ガラスアンプル内に凍結乾燥した。アンプルを、コパル
ト源からのγ線125ラドで照射した。残存率は1優で
あった。
された。外生胞子は、C−1寒天(脱イオン水中3係の
シュクロース、0.1係のKH2PO4,0,3%のN
aNOx 、0.05 %のMgSO4,7H20,0
,011のF e So 4.7H20、0,05%の
KCI及び2.5チ寒天)で増殖したA、=−ガー(A
、niger)菌株CB5263〜65から集めた。外
生胞子を、28ミクロンナイロンフィルターで濾過し、
遠心分離で集め、10チスキンミルクに懸濁させ次いで
ガラスアンプル内に凍結乾燥した。アンプルを、コパル
ト源からのγ線125ラドで照射した。残存率は1優で
あった。
トランスフェ午う−ゼ活性生産はN−メチル−N′−二
トローN−二トロングアニジン(NTG)突然変異によ
シ除去した。外生胞子を、先に述べたごとく集め濾過し
次いで遠心分離し更に塩の溶液(0,5ミリモルのKH
2PO4,0,5ミリモルのに2HPO4,0,5ミリ
モルの(NH4) 2HPO4,0,05ミリモルのC
a CL 2.0.05ミリモルのMgCl2、pH7
,2)に懸濁させ次いで34℃で2時間攪拌しながらイ
ンキュベートした。次いでNTGを添加しく250μ9
/哨、更に水中で外生胞子を数回洗浄することによシフ
5分後に突然変異を停止せしめた。
トローN−二トロングアニジン(NTG)突然変異によ
シ除去した。外生胞子を、先に述べたごとく集め濾過し
次いで遠心分離し更に塩の溶液(0,5ミリモルのKH
2PO4,0,5ミリモルのに2HPO4,0,5ミリ
モルの(NH4) 2HPO4,0,05ミリモルのC
a CL 2.0.05ミリモルのMgCl2、pH7
,2)に懸濁させ次いで34℃で2時間攪拌しながらイ
ンキュベートした。次いでNTGを添加しく250μ9
/哨、更に水中で外生胞子を数回洗浄することによシフ
5分後に突然変異を停止せしめた。
突然変異株の選択
アミログルコシダーゼ又はトランスフェ左ラーゼ活性の
いずれも存在しない菌株のスクリーニングは、同様の手
順に従って行なうことができる:外生胞子(γ線処理又
はNTG−処理からの)を、YPG寒天(酵母抽出物4
g/L、グルコース15g/l、K2HPO41み’
l s Mg SO4,7H200,5みq及び寒天2
011/11 )上に散布した。34℃で4日又は5日
間インキ慕ベージ、ンした後、各々コロニーからの菌糸
を有する寒天薄片を切断し次いでガラス板上で六角形に
並べ、次いで1%アがロースダル(pH7,2、ト!J
スー緩衝剤)内に埋める。各六角形の中央にもうけた穴
に、たとえばアミログルコシダーゼに対する抗血清を装
入した。
いずれも存在しない菌株のスクリーニングは、同様の手
順に従って行なうことができる:外生胞子(γ線処理又
はNTG−処理からの)を、YPG寒天(酵母抽出物4
g/L、グルコース15g/l、K2HPO41み’
l s Mg SO4,7H200,5みq及び寒天2
011/11 )上に散布した。34℃で4日又は5日
間インキ慕ベージ、ンした後、各々コロニーからの菌糸
を有する寒天薄片を切断し次いでガラス板上で六角形に
並べ、次いで1%アがロースダル(pH7,2、ト!J
スー緩衝剤)内に埋める。各六角形の中央にもうけた穴
に、たとえばアミログルコシダーゼに対する抗血清を装
入した。
プレートを三日間4℃でインキユベートした。
沈殿線のない突然変異コロニーを集め、植継ぎによジ製
製し更に酵素活性の分析に対し振とうフラスコ内に接種
した。アミログルコシダーゼ及びトランスフェ奔ラーゼ
活性の両方を有しない突然変異株は、この手順を連続的
に用いて単離することができ、各々の酵素に対し単特異
性抗血清を用いる時−個の酵素活性を除外する。
製し更に酵素活性の分析に対し振とうフラスコ内に接種
した。アミログルコシダーゼ及びトランスフェ奔ラーゼ
活性の両方を有しない突然変異株は、この手順を連続的
に用いて単離することができ、各々の酵素に対し単特異
性抗血清を用いる時−個の酵素活性を除外する。
酵素活性の決定
1アミラ一ゼ単位(FAU )を標準条件(温度37℃
)、PH4,7(0,01Mの酢酸塩緩衝剤)及び反応
時間1時間)の下で5.25.9の澱粉(乾燥(15) 物質)(メルク)を加水分解する酵素の量として定義し
、従って加水分解された澱粉は、ヨウ素−ヨウ化カリウ
ム(4,04F、りKI及び0.022みqI2)の添
加によシわずかに着色し更にディライトコンノぐレータ
−イルミネーターを用い標準酵素と比較することによシ
標準化する。この手順によシ、酸安定性並びに中性(酸
不安定性)α−アミラーゼの両方を測定する。
)、PH4,7(0,01Mの酢酸塩緩衝剤)及び反応
時間1時間)の下で5.25.9の澱粉(乾燥(15) 物質)(メルク)を加水分解する酵素の量として定義し
、従って加水分解された澱粉は、ヨウ素−ヨウ化カリウ
ム(4,04F、りKI及び0.022みqI2)の添
加によシわずかに着色し更にディライトコンノぐレータ
−イルミネーターを用い標準酵素と比較することによシ
標準化する。この手順によシ、酸安定性並びに中性(酸
不安定性)α−アミラーゼの両方を測定する。
酸安定性α−アミラーゼのみは中性アミラーゼを不活性
化した後、もし存在する場合pH2,5の0.1モル塩
酸を用い酸性インキユベーシヨンすることによシ決定す
ることができる。37℃で30分間インキエベーシ、ン
した後、−を水酸化ナトリウムを用いて4.7に調節す
る。この手順によ如酸安定性α−アミラーゼを100%
収率で得る。
化した後、もし存在する場合pH2,5の0.1モル塩
酸を用い酸性インキユベーシヨンすることによシ決定す
ることができる。37℃で30分間インキエベーシ、ン
した後、−を水酸化ナトリウムを用いて4.7に調節す
る。この手順によ如酸安定性α−アミラーゼを100%
収率で得る。
酵素の製造
本発明の酸安定性α−アミラーゼの製造方法を、以下に
詳細に説明する。
詳細に説明する。
アスペルギルスニーガー(AspergilluI!n
igor)突然変異TSA−1胞子を、寒天平板から滅
菌水に移(16) し、次いで炭素及び窒素の同化源並びに無機塩を含有す
る適当な発酵培地を含有する接種タンクに無菌的に移す
。攪拌及び通気を開始し次いで発酵は、タンク内で良好
な増殖が得られるまで(又は約48時間)約30〜36
℃で行なう。
igor)突然変異TSA−1胞子を、寒天平板から滅
菌水に移(16) し、次いで炭素及び窒素の同化源並びに無機塩を含有す
る適当な発酵培地を含有する接種タンクに無菌的に移す
。攪拌及び通気を開始し次いで発酵は、タンク内で良好
な増殖が得られるまで(又は約48時間)約30〜36
℃で行なう。
タンクの内容物の一部を、同化炭素及び窒素源並びに無
機塩を含有する適当な発酵培地を含有する主発酵タンク
(2000Aりに移す。声は約5.0〜6.5であり更
に通気及び攪拌を開始する。
機塩を含有する適当な発酵培地を含有する主発酵タンク
(2000Aりに移す。声は約5.0〜6.5であり更
に通気及び攪拌を開始する。
発酵を30〜36℃で行ない、次いで約24時間の発酵
後の−は約3.2〜5.0に調節される。全発酵時間は
約100〜200時間である。
後の−は約3.2〜5.0に調節される。全発酵時間は
約100〜200時間である。
次いで液体培養物を濾過及び遠心分離によシ真菌の菌糸
体から除く。液体ブロスをたとえば蒸発により濃縮し次
いで保存剤が添加できる。
体から除く。液体ブロスをたとえば蒸発により濃縮し次
いで保存剤が添加できる。
典型的には、得られた液体酵素コンセントレートは約5
0〜1000 FAU /mlの範囲の活性度を示す。
0〜1000 FAU /mlの範囲の活性度を示す。
酵素の化学的性質
以下の例1で説明するごとくして得られる本発明に係る
酸安定性α−アミラーゼコンセントレートの活性度に関
する温度及び−を、あらかじめ定められた値に調節され
た反応混合物を用い、共に説明した方法により測定した
。添付の第1図を参照されたい。第1図はp)(4,5
で温度に対しプロットされた相対活性を示し更に第2図
及び第3図はそれぞれ37°及び60℃でpH(酢酸塩
及びクエン酸塩緩衝剤によ、!7調整)に対しプロット
された相対活性を示す。
酸安定性α−アミラーゼコンセントレートの活性度に関
する温度及び−を、あらかじめ定められた値に調節され
た反応混合物を用い、共に説明した方法により測定した
。添付の第1図を参照されたい。第1図はp)(4,5
で温度に対しプロットされた相対活性を示し更に第2図
及び第3図はそれぞれ37°及び60℃でpH(酢酸塩
及びクエン酸塩緩衝剤によ、!7調整)に対しプロット
された相対活性を示す。
酵素コンセントレートはpH4,5で約75℃の最適活
性を示し更に3〜5の範囲内で最適−を示す。
性を示し更に3〜5の範囲内で最適−を示す。
例1で説明するごとく、製造された本発明に係るα−ア
ミラーゼの熱安定性を、コンセントレート11当、jl
) Ca++100m9の添加並びにpH5,0の調節
後に、測定した。残留アミラーゼ活性を、先に説明した
方法によシ測定した。結果を次の表に示す: 第1表 酵素コンセントレートはマルトース活性を有しない(マ
ルトース1.g当り酵素0.32 FAUを有する約2
5%DSマルトースを70℃で700時間インキュベー
ションた後グルコース形成ナシ)。
ミラーゼの熱安定性を、コンセントレート11当、jl
) Ca++100m9の添加並びにpH5,0の調節
後に、測定した。残留アミラーゼ活性を、先に説明した
方法によシ測定した。結果を次の表に示す: 第1表 酵素コンセントレートはマルトース活性を有しない(マ
ルトース1.g当り酵素0.32 FAUを有する約2
5%DSマルトースを70℃で700時間インキュベー
ションた後グルコース形成ナシ)。
以下に本発明の実施例を更に詳細に説明する。
例1
接種タンク内で、次の培地3001容量を調製した:
コーンスティープリカー: 7.2k17グルコース:
7.2kl? Ca Co s : 0.9 kg ゾルロニックL61: 3QmAt 水を加えて3001とする。
7.2kl? Ca Co s : 0.9 kg ゾルロニックL61: 3QmAt 水を加えて3001とする。
炭酸カルシウムの添加及び殺菌前にPI−1’15.5
に調節した。混合物t130℃で約7日間すでにインキ
ュベートされたC−1寒天を含有するフェルンパッハフ
ラスコから菌株TSA−1の胞子で接種した。攪拌(3
00rpm)及び通気(30ONt/分)を開始し、次
いで発酵を34℃で約51時間行なったO 次いでタンクの内容物150dを、次の組成を有する主
発酵タンクに移したニ ゲルコース: 340kg 大豆ミル: 85kg KH2PO4: 5.1kg Na2HPO412H20: 6.8kl?プルロニッ
ク’L61: 150ゴ 水: 17007まで。
に調節した。混合物t130℃で約7日間すでにインキ
ュベートされたC−1寒天を含有するフェルンパッハフ
ラスコから菌株TSA−1の胞子で接種した。攪拌(3
00rpm)及び通気(30ONt/分)を開始し、次
いで発酵を34℃で約51時間行なったO 次いでタンクの内容物150dを、次の組成を有する主
発酵タンクに移したニ ゲルコース: 340kg 大豆ミル: 85kg KH2PO4: 5.1kg Na2HPO412H20: 6.8kl?プルロニッ
ク’L61: 150ゴ 水: 17007まで。
発酵の最初の18時間の間は、通気なゆりく夛500−
170ONt1分に増加せしめ、更に通気は0〜250
rpmに増加させた。発酵は34℃で行なった。接種
前の声は6.2でちゃ、更に24時間の発酵後は、亜燐
酸を添加しゆっ(t)3.2〜35に低下させた。−を
残りの発酵中32〜3.5に保持した。全発酵時間は1
40〜160時間であった。
170ONt1分に増加せしめ、更に通気は0〜250
rpmに増加させた。発酵は34℃で行なった。接種
前の声は6.2でちゃ、更に24時間の発酵後は、亜燐
酸を添加しゆっ(t)3.2〜35に低下させた。−を
残りの発酵中32〜3.5に保持した。全発酵時間は1
40〜160時間であった。
1、31AU/mlを含有する液体培養物を、pl(4
,0で3%クラリット(C1ar i t ) BWl
oo (Bentoni t)を用いて予備処理し、次
いでプレコートとしてHEIC(John Manvi
lle市販のH8C珪藻土を有するプレコート真空ドラ
ムフィルターを用いてドラムフィルトレートした。ドラ
ム濾液をザイツ(Seitz)グレート上で濾過し、次
いでロミコンPM−I Qメンブレンを用いて限外/ダ
イアフィルトレートした。
,0で3%クラリット(C1ar i t ) BWl
oo (Bentoni t)を用いて予備処理し、次
いでプレコートとしてHEIC(John Manvi
lle市販のH8C珪藻土を有するプレコート真空ドラ
ムフィルターを用いてドラムフィルトレートした。ドラ
ム濾液をザイツ(Seitz)グレート上で濾過し、次
いでロミコンPM−I Qメンブレンを用いて限外/ダ
イアフィルトレートした。
限外濾過後部液を濾過助剤としてH2O及びCBL/
3 (CECA市販の珪藻土)を用いてフレームフィル
ターブレス(5ahule)上で濾過した。最後に濾液
を38%RD(屈折計による乾燥固体)まで蒸発せしめ
、次いで安息香酸ナトリウム(0,1%)及びソルビン
酸カリウム(0,1%)を用いて保存した。
3 (CECA市販の珪藻土)を用いてフレームフィル
ターブレス(5ahule)上で濾過した。最後に濾液
を38%RD(屈折計による乾燥固体)まで蒸発せしめ
、次いで安息香酸ナトリウム(0,1%)及びソルビン
酸カリウム(0,1%)を用いて保存した。
この様にして得られた酵素コンセントレートは、酵素活
性度67FAU/Tnlを有していた。糖アルコールの
含量は1.3重量%であり;コンセントレートはマルト
ース活性を示さなかった。
性度67FAU/Tnlを有していた。糖アルコールの
含量は1.3重量%であり;コンセントレートはマルト
ース活性を示さなかった。
pH2,5でかつ37℃で0,5時間インキュベーショ
ンした後、100%の残留アミラーゼ活性が見い出され
、中性α−アミラーゼが発酵プロセスの終了時には存在
しないことが示された。
ンした後、100%の残留アミラーゼ活性が見い出され
、中性α−アミラーゼが発酵プロセスの終了時には存在
しないことが示された。
例2
7DEマルトデキストリンを、標準手法に従いターマミ
ル(T・rmamyl■)141いトーモロコシ澱粉を
液化し次いで噴霧乾燥することにより調製した。
ル(T・rmamyl■)141いトーモロコシ澱粉を
液化し次いで噴霧乾燥することにより調製した。
次いで、該物質から、適尚量を脱イオン水に再溶解し次
いで乾燥物質(DS)を30%、35チ及び40%(W
/W)に調節することにより、糖化用基質を調製した。
いで乾燥物質(DS)を30%、35チ及び40%(W
/W)に調節することにより、糖化用基質を調製した。
−を4,5に調節し次いで0.16 FAU/# D
8に相当する酵素の量を添加した。糖化を、標準実験室
用反応器内で定速攪拌しながら、70℃で行なった。結
果を次表に示す。
8に相当する酵素の量を添加した。糖化を、標準実験室
用反応器内で定速攪拌しながら、70℃で行なった。結
果を次表に示す。
表 ■
DS=30%
2 0.7 14.0 23.0 62.34 1.6
28.0 44.9 25.522 6.1 48.
9 25.4 19.6 4.1348 9.1 52
.8 19.9 18.2 4.1872 12.0
54.4 16.2 17.4 3.7896 13.
8 55.3 13.9 17.0 3.80DS=3
5チ 2 0.6 13.3 21.0 65.14 1.5
25.3 45.4 27.822 6.3 48.
7 25.1 19.8 4.1448 9.2 51
.5 19.9 19.4 4.0672 13.6
52.8 15.4 17.8 3.7496 15.
4 54.6 13.1 17.0 3.74DS=4
0% 2 0.6 12.1 19.1 68.14 1.4
23,4 44.5 30.722 7.0 48.
5 24.7 19.8 4.0848 10.6 5
0.6 19.4 1B、9 4.0572 14.6
52.6 15.3 17.5 3.7196 17
.4 53.0 12.9 16.7 3.73これら
の結果から明らかな様に、マルトース(DE2)は加水
分解の主生成物であシ更に発酵性糖(DP1+DP2+
DP、)の量は高い。グルコース含量(DP 、)はD
Sの増加と共に増加する。
28.0 44.9 25.522 6.1 48.
9 25.4 19.6 4.1348 9.1 52
.8 19.9 18.2 4.1872 12.0
54.4 16.2 17.4 3.7896 13.
8 55.3 13.9 17.0 3.80DS=3
5チ 2 0.6 13.3 21.0 65.14 1.5
25.3 45.4 27.822 6.3 48.
7 25.1 19.8 4.1448 9.2 51
.5 19.9 19.4 4.0672 13.6
52.8 15.4 17.8 3.7496 15.
4 54.6 13.1 17.0 3.74DS=4
0% 2 0.6 12.1 19.1 68.14 1.4
23,4 44.5 30.722 7.0 48.
5 24.7 19.8 4.0848 10.6 5
0.6 19.4 1B、9 4.0572 14.6
52.6 15.3 17.5 3.7196 17
.4 53.0 12.9 16.7 3.73これら
の結果から明らかな様に、マルトース(DE2)は加水
分解の主生成物であシ更に発酵性糖(DP1+DP2+
DP、)の量は高い。グルコース含量(DP 、)はD
Sの増加と共に増加する。
例3
の使用
低初期DEが要求される場合、高マルトースシロップ生
産に対し酸安定性α−アミラーゼZ後−液化酵素として
試験した。
産に対し酸安定性α−アミラーゼZ後−液化酵素として
試験した。
32%DS澱粉スラリーを、次の条件の下でターマミル
(Tarmamyl■)を用いて液化した:澱粉スラI
J−:)−モロコシ澱粉、32%DSカルシウムニア0
ppm pH: 6.0−6.2 ターマミル(To rmamy 1■) 12OL :
11i/lon DS又は0.12 KNU/I D
S ジェットクツカー:110−112℃ 流 速: 350 t/h 保持時間=5分 液化澱粉馨90℃にフラッシュ冷却し、次いで−が5.
2に調節された中間保持タンク内に集めた。
(Tarmamyl■)を用いて液化した:澱粉スラI
J−:)−モロコシ澱粉、32%DSカルシウムニア0
ppm pH: 6.0−6.2 ターマミル(To rmamy 1■) 12OL :
11i/lon DS又は0.12 KNU/I D
S ジェットクツカー:110−112℃ 流 速: 350 t/h 保持時間=5分 液化澱粉馨90℃にフラッシュ冷却し、次いで−が5.
2に調節された中間保持タンク内に集めた。
酸安定性α−アミラーゼを、0.08 FAU/ II
D Sに対応する容量を与える速度で保持タンク内に連
続的に計量装入した。
D Sに対応する容量を与える速度で保持タンク内に連
続的に計量装入した。
次いで液化澱粉を、残留時間が20〜25分であるミキ
サコ(Mixao)コンバーターにポンプで導入した。
サコ(Mixao)コンバーターにポンプで導入した。
液化後、DEは3.0であることが見い出された。
液化澱粉基質を、60℃に冷却し次いで糖化タンクに集
めた。
めた。
0.4 PUN/、F DSプル2ナーセ(pROMo
zym■20OL)及び0.045βU/、9DS大麦
β−アミラーゼを糖化の最初に各タンクに添加した。
zym■20OL)及び0.045βU/、9DS大麦
β−アミラーゼを糖化の最初に各タンクに添加した。
糖化されたシロップの濾過能力を、標準C8T法を用い
24時間後に測定した。炭水化物の組成を20時間及び
48時間後にHPLCによシ測定した。
24時間後に測定した。炭水化物の組成を20時間及び
48時間後にHPLCによシ測定した。
20時間後にヨウ素試験を行なった。結果を次の表に示
す。
す。
20 0.5 70.7 17.1 11.748 0
.8 71.9 18.5 8.8コン・トロづし48
0.2 70.7 5.7 23.4中3.5DKタ
ーマミル(Termamyl■)マルトデキストリン最
終シロップは、良効な濾過能力性を示し更に澱粉を有さ
ず、一方対照物は澱粉陽性反応を示し更に非濾過性シロ
ップを与える。
.8 71.9 18.5 8.8コン・トロづし48
0.2 70.7 5.7 23.4中3.5DKタ
ーマミル(Termamyl■)マルトデキストリン最
終シロップは、良効な濾過能力性を示し更に澱粉を有さ
ず、一方対照物は澱粉陽性反応を示し更に非濾過性シロ
ップを与える。
最終シロップは91チ以上の発酵性糖を含有し、一方酸
安定性α−アミラーゼを用いないで生産された対照シロ
ップは、わずかに約77チの発酵性糖を含有するのみで
あった。
安定性α−アミラーゼを用いないで生産された対照シロ
ップは、わずかに約77チの発酵性糖を含有するのみで
あった。
従って、本発明の酸安定性α−アミラーゼは次の糖化工
程中で、高含量の発酵性糖を有する澱粉非含有シロップ
に変換されうる、低DEマルトデキストリンを与える後
−液化酵素として十分適合する。この様なシロップは製
菓産業において使用に対し理想的なシロップであるのみ
ならず、潜在的によシ高いマルトースレベルまで更に液
化することに対し良好な基質でもある。
程中で、高含量の発酵性糖を有する澱粉非含有シロップ
に変換されうる、低DEマルトデキストリンを与える後
−液化酵素として十分適合する。この様なシロップは製
菓産業において使用に対し理想的なシロップであるのみ
ならず、潜在的によシ高いマルトースレベルまで更に液
化することに対し良好な基質でもある。
例4
酸安定性α−アミラーゼの2図は伝統的な細菌α−アミ
ラーゼよシも、蒸留所のマツシュの普通の−に対しよシ
良好に適合せしめる。液化試験を加熱用電気コイル及び
攪拌器としてFLIOスピンドル(ハーク粘度計VT1
80)を備えた400m/ビーカー中で行なった。ひき
割、9)−モロコシの20チスラリ−(15%澱粉)火
、脱イオン水(70Iのひき割シトーモロコシ及び28
0Iiの水中で作製した。Ca C12・2H20(5
0■カルシウムセη)及びα−アミラーゼ(70,5F
AU/、9 )を添加した。−を4.0〜5.0に調節
した後、温度を75℃に上昇せしめ(1C7分)、次い
で1時間保持した。粘度を加熱及び保持時間中しばしば
測定し更に温度を75℃に上昇せしめた時粘度は約20
0aPから500〜700ePに増加したが温度な75
℃に保持した時該粘度は約300aPに降下した。これ
は酸安定性アミラーゼの液化性による。(粘度はFLI
Oスピンドルを有するハーク粘度計VT180で測定し
た)。粘度のノ臂ターンは、アルコール産業において使
用するための新規なα−アミラーゼについて十分に長幼
な液化活性を示す。
ラーゼよシも、蒸留所のマツシュの普通の−に対しよシ
良好に適合せしめる。液化試験を加熱用電気コイル及び
攪拌器としてFLIOスピンドル(ハーク粘度計VT1
80)を備えた400m/ビーカー中で行なった。ひき
割、9)−モロコシの20チスラリ−(15%澱粉)火
、脱イオン水(70Iのひき割シトーモロコシ及び28
0Iiの水中で作製した。Ca C12・2H20(5
0■カルシウムセη)及びα−アミラーゼ(70,5F
AU/、9 )を添加した。−を4.0〜5.0に調節
した後、温度を75℃に上昇せしめ(1C7分)、次い
で1時間保持した。粘度を加熱及び保持時間中しばしば
測定し更に温度を75℃に上昇せしめた時粘度は約20
0aPから500〜700ePに増加したが温度な75
℃に保持した時該粘度は約300aPに降下した。これ
は酸安定性アミラーゼの液化性による。(粘度はFLI
Oスピンドルを有するハーク粘度計VT180で測定し
た)。粘度のノ臂ターンは、アルコール産業において使
用するための新規なα−アミラーゼについて十分に長幼
な液化活性を示す。
第1図は本発明の一実施例を示す酸安定性α−アミラー
ゼコンセントレートに関する、pH4,5での温度に対
する相対活性の関係を示すグラフであシ、第2図は37
℃で−に対する相対活性を示す(27) グラフであシ、第3図は60℃で−に対する相対活性を
示すグラフである。 特許出願人 ノボ インダストリ アクテイーゼルスカブ特許出願代
理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士内田幸男 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 (28)
ゼコンセントレートに関する、pH4,5での温度に対
する相対活性の関係を示すグラフであシ、第2図は37
℃で−に対する相対活性を示す(27) グラフであシ、第3図は60℃で−に対する相対活性を
示すグラフである。 特許出願人 ノボ インダストリ アクテイーゼルスカブ特許出願代
理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士内田幸男 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 (28)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 アミラーゼコンセントレートを含んでなる、酸安定性α
−アミラーゼ調製品であって、該コンセントレートが培
養ブロスから得られ、該α−アミラーゼが培養によシア
ミログルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活性を有
しないで生産される、前記α−アミラーゼ調製品。 2、前記コンセントレートを、α−アミラーゼを生産す
る能力を保持しつつ、アミログルコシダーゼおよびトラ
ンスフェラーゼ活性を生じる能力を阻止するため突然変
異した、α−アミラーゼ生産アスペルギルス(Aspe
rgillua )菌株から得る、特許請求の範囲第1
項記載の調製品。 の範囲第2項記載の調製品。 4、前記突然変異アスペルギルス As ergill
us)ニーガー菌株が、DSM2761 として受託さ
れた菌株である、特許請求の範囲第3項記載の調製品。 5、前記コンセントレートが、少なくとも1重量%の培
養ブロス由来の糖アルコールを含んでなる特許請求の範
囲第1〜第3項のいずれかに記載の調製品。 6、前記コンセントレートが50〜1000FAU/m
lの範囲内のα−アミラーゼ活性を有する、特許請求の
範囲第1〜第3項のいずれかに記載の調製品。 7、7ミログルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活
性を有しない酸安定性α−アミラーゼ液体コンセントレ
ートの製造方法であって、炭素および窒素の同化源並び
に無機塩を含有する栄養培地中でα−アミラーゼを生産
する能力を保持しつつ、アミログルコシダーゼおよびト
ランスフェラーゼを生産する能力を阻止するため、突然
変異したα−アミラーゼ生産アスペルギルス (Aspergi 11us)菌株を培養し、しかる後
回収し次いでα−アミラーゼ培養培地を濃縮することを
含んでなる、前記方法。 菌株である、特許請求の範囲第7項記載の方法。 9、前記アスペルギルスニーガー(Aspergill
uaniger)菌株が菌株DSM2761又はその突
然変異株又は変異株である、特許請求の範囲第8項記載
の方法。 10、α−アミラーゼを合成する能力を保持しつつ、ア
ミログルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活性能力
を本質的に阻止するために突然変異されたアスペルギル
ス(Aspergillus)菌株。 11、 DSM2761又はその突然変異株もしくは変
異株である、特許請求の範囲第10項記載のアスペルギ
ルス(Aspergillua) 菌株。 12、澱粉を、ハイデキストロース又はノ蔦イアルトー
スシロップもしくは他の澱粉氷解物に変換す由来α−ア
ミラーゼコンセントレートを含んでなる、酸安定性α−
アミラニゼに周製品であって、該コンセントレートが培
養ブロスから得られ、該α−アミラーゼが培養によシア
ミログルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活性を有
しないで生産される、前記α−アミラーゼ調製品の有効
量を含んでなる酵素系の存在下、澱粉の液化もしくは部
分加水分解を行うことを含んでなる、前記方法。 13澱粉を、ノ・イマルトース又は高変換シロツレート
を含んでなる、酸安定性α−アミラーゼ調H品であって
、該コンセントレートが培養ブロスから得られ、該α−
アミラーゼが培養によシアミログルコシダーゼおよびト
ランスフェラーゼ活性を有しないで生産される、前記α
−アミラーゼ調品の有効量および所望により、グルコア
ミラーゼおよびβ−アミラーゼおよび/又は枝切υ酵素
からなる群から選ばれる糖化酵素を含有する酵素系の存
在下、澱粉又は澱粉加水分解の糖化を行うことを含んで
なる前記方法、 14、前記澱粉氷解物が酵素又は酸性液化澱粉のいずれ
かである、特許請求の範囲第13項記載の方法・ 15、澱粉ヲノ・イマルトースシロップに変換するため
、乾物の30〜45重量%の澱粉氷解物の糖化を更に含
んでなる、特許請求の範囲第13項記載の方法。 16、前記糖化工程を、pl(3〜5でかつ50〜75
℃の範囲内の温度で行う、特許請求の範囲第15項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK4382/83A DK438283D0 (da) | 1983-09-26 | 1983-09-26 | Syrestabilt alpha-amylaseenzymprodukt og fremstilling deraf |
DK4382/83 | 1983-09-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60105493A true JPS60105493A (ja) | 1985-06-10 |
Family
ID=8133033
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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