TW491893B - Production of multi-enzyme products and raw feed materials using grain seeds - Google Patents

Description

491893 A7 ______B7__ 五、發明說明（I ) 發明背景 發明領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明關於使用不同的種子作爲高活性酵素之生產。 更精確地說，本發明關於一種基於當榖類及油類種子在合 適的環境條件下發芽時的槪念，來大量生產高活性酵素的 方法，可由此方法獲得大量高活性酵素。 先前技藝描述 酵素爲一種蛋白質，其與基質鍵結而致使增加該基質 之利用。酵素爲必要物質，其對於保持及活化活體之生物 機制是必須的。基於了解其生化特性及在生命中的重要 性，酵素已被積極地利用於食物、醫學及藥物工業及生物 科技的領域內。此外，有許多硏究活動已可達到有效生產 酵素。然而，欲達到工業化生產酵素則面臨著許多阻礙。 另一個問題爲發展一種能保持在不同生長狀況（pH値，溫 度等）之酵素活性的方法。第三，必須發展大量生產之技 術方法。爲了有效地克服這些阻礙，有許多利用遺傳工程 技術生產酵素之嘗試，但由於在大規模生產時的缺點及缺 乏經濟競爭力，而妨礙該技術方法之實際用途，且該技術 之成功率亦不是很高。 發明槪述 、 本發明的一個目的爲提供一種大量生產高活性酵素的 方法。 本發明的另一目的爲意欲使用來自發芽種子的飼料原 料，作爲分類的（或混合的）飼料產物之原料來源，因而 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 491893 A7 ____B7 五、發明說明（V ) 助成增加家畜之生產力。 本發明更進一步目的爲意欲在對家畜餵食來自發芽種 子的酵素供給飼料後’藉由減少於排泄物中之有機磷的 量，以降低由動物的排泄物所導致之環境污染。 圖式簡單說明 圖1 A及1 B表示描述本發明方法之組織圖。 發明詳述 在本發明中，其目的意欲克服使用微生物生產酵素所 面臨的難題，及本發明是基於在不同的種子發芽階段的期 間，觀察到其具有最高酵素活性的事實。 本發明者發現在穀類及油類種子，例如，大麥、小 麥、玉蜀黍、大豆及Canola發芽階段期間，其具有最大活 性的澱粉酶、纖維素酶、果膠酶、羧甲基纖維素酶、/3 -聚葡萄糖酶木聚糖酶及蛋白酶。在這些種子發芽階段期 間，亦可觀察到肌醇六磷酸酶（phytase)活性的增加。 本發明提供使用發芽種子及在其酵素活性之最適階段收獲 該種子之酵素生產技術方法。穀類爲供給含有大量有機磷 之動物飼料之澱粉的原料來源。單胃的動物，例如，雞， 豬及狗，在牠們消化的路徑中，缺乏水解有機磷的酵素。 因此，有機磷不能夠被這些動物所消化。爲了彌補這個缺 點，無機隣被供給用來生產混合飼料。但由於過量使用無 機磷，而將導致飼料成本及環境污染的增加。既然這些動 物無法利用有機磷，因此在混合飼料中使用能水解有機磷 之肌醇六磷酸酶，將增加這些動物對飼料的利用度，及 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

.線 4 491893 A7 _____Β7 五、發明說明（> ) 達到最大的生產力且降低動物肉的生產成本，以及亦降低 由有機磷所造成之環境污染。 最近，基於這些邏輯觀念，有許多於不只是單胃動 物，亦包括反芻動物，例如，牛、鹿、綿羊及山羊之動物 飼料中供給肌醇六磷酸酶及其它酵素之嘗試。許多硏究已 經導引於美國、加拿大、日本、荷蘭、德國、英國及芬蘭 等區域之專門硏究工作中。在荷蘭，其規定在動物飼料中 需供給肌醇六磷酸酶。 在這些具有高密度人口及較小領土的國家中，因爲一 些動物不能消化有機磷，而由於在動物排泄物中之有機 磷，使得這些國家因而在河川及牧場中的劇烈環境污染問 題上’具有比例上較多數量的家畜經驗。本發明將貢獻於 提高動物飼料的利用度、降低環境污染、有效地降低飼料 成本及藉由使用來自發芽榖類種子的肌醇六磷酸酶和其他 酵素以增加動物的成長速率。此外，在本發明中，在不同 的植物種子發芽階段期間，利用酵素的生產機制，其提供 一種經濟且有效的酵素生產方法。直到目前爲止，並沒有 描述經由種子的發芽方法實際利用肌醇六磷酸酶的報告。 在本發明中’基於下列理論而發展出經由穀類種子之 發芽的酵素生產技術方法。一般而言，植物、爲了繁殖而產 生種子爲了有效地促進發牙種子的成長，特別是在發芽 的早期，在種子內之不同的累積營養素被水解及利用。種 子內包含如營養素、澱粉\油脂及蛋白質作爲能量來源， 及礦物質如磷酸鹽，其爲生長所必需。需要酵素用來有效 ______ 5 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公楚〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

491893 A7 B7 " 丨丨丨 丨_· —— I ———___ _ 五、發明說明（Ψ) 地利用於種子內之累積營養素。因此，當發芽之特定狀況 發生時，不同的酵素開始分泌。在特定環境條件下，種子 的芽苗於萌芽階段，不同的酵素水解在種子內的累積營養 素以提供成長的能量及礦物質，同時，在種子內產生更多 不同的酵素。特別地，三磷酸腺苦酸（A 丁 P )，其由磷 酸鹽所構成，爲能量代謝所必須。藉由肌醇六磷酸酶水解 有機磷的作用而供應三磷酸腺苷酸。此外，亦產生0 —葡 聚糖酵素、蛋白酶及其他酵素，其功能爲消化不同的累積 營養素。產生之酵素的量及其活性視種子的類別、發芽狀 況，例如，溫度、濕度、種子的濕含量及培養所持續的時 間而定。即使來自同種之種子，例如稻米種子，酵素的量 及其活性視蛋白質的量、激粉的結構差異、種子之培育及 栽培而不同。 在本發明中，我們鑑定出不同的種子之最適發芽條件 及選擇酵素生產之最好條件，爲了使家畜及飼料工業能有 效地利用此技術方法。在本發明中，優先生產肌醇六磷酸 酶及其他酵素則爲附加。 下列描述顯示一生產者能以圖丨作爲參考而容易地適 應其步驟’該步驟爲選擇種子、培養、乾燥、壓碎及包裝 的方法。在本發明中，飼料原料的生產在階段丄中處理， 高純度飼料的生產在階段2中處理，及酵素產物的生產在 階段3中處理。 第一方法：種子選擇的方法 儲存在榖庫（1)中之種子蓮送至篩子（u),且於 6 本紙張尺度適用巾國國家標準（CNS)A4七格（210 χ 297公爱)----—- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 491893 A7 B7 五、發明說明（f ) ：#· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第一次篩選時將破碎及毀傷的種子移除，且亦在第二次篩 選時將延遲萌芽及受到真菌感染之種子移除。這些通過第 一次篩選的種子被置於一鹽溶液中，且只有這些浸在溶液 中的種子被使用。在以一收集裝置（5)進行收集後，將漂 浮的種子丟棄。該經過第一次及第二次篩選的種子被浸沒 於一包含非離子性的親水性乳劑之容器（7)內，然後轉移 至裝有溫度計（9)及溼度計（10)之發芽培養箱（8) 中。 第二方法：發芽及培養的方法 將上述所選擇的種子均勻地撒開且培養在合適的濕度 及溫度下。當最大量的酵素產生時，中止培養且開始乾燥 方法。 木 第三方法··乾燥方法 在第二方法結束後，所獲得之發芽種子（其在這之後 .線 以 ''酵素產物〃一詞稱呼）使用一熱空氣乾燥產生器 (12)進行乾燥方法。 第四方法：壓碎及包裝方法 從第三方法所得之乾燥酵素產物被處理成如圖1所示 之三種產物。第一產物爲高純度酵素產物，其藉由一除殼 機（16)進行去殼處理，並壓碎至大小爲、01毫米之碎 片’使用一真空包裝機（18)進行包裝（路徑2)。生產 的第二產物作爲動物飼料之補充。該帶殼之酵素產物使用 一破碎機（H)將其壓碎及於包裝（15)進行包裝（路徑 1)。該第二產物爲液態酵素產物，其產生於藉由浸沒來自 _ 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4^ (21〇 X 297公爱)--------- 491893 A7 ^__B7 —_ 五、發明說明（jk ) 上述路徑1之高純度粉狀產物至緩衝液（20) (21)，及 使用酵素提取器（19)萃取酵素及在離心分離（20)進行 離心後所獲得之上淸液（路徑3)。這三種產物儲存於一 乾燥冷室中。如下列所述，我們將詳述酵素之實際操作例 及飼料生產方法。 實際操作例1 在篩選後，將大麥榖粒浸沒於1.5%氯化鈉溶液，然 後轉移至水中。在大麥之濕含量爲50%時，將大麥穀粒置 於攝氏15至30度及保持在溼度90至95%之培養箱內培 養30小時。當發芽長度達到2·〇公分時，中止發芽方法， 然後於攝氏40度熱乾燥36小時，該發芽且乾燥之大麥穀 粒的濕含量爲9%。 實際操作例2 除了欲加速發芽速率而將大麥浸沒於作爲非離子性之 親水性乳劑的0.05%聚山梨醇酯中12小時外，所有使用方 法與上述操作例1之方法完全相同。其縮短發芽的期間大 約12至24小時，該發芽且乾燥的大麥榖粒之濕含量爲12 %。 實際操作例3 除了使用稻米種子外，所有使用方法與上述操作例1 \ 之方法完全相同。該發芽且乾燥的稻米種子之濕含量爲9 % 〇 實際操作例4 除了使用小麥外，所有使用方法與上述操作例1之方 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

tj: -丨線· 491893 A7 ___ B7 _ 五、發明說明（7 ) 法完全相同。該發芽且乾燥的小麥種子之濕含量爲9%。 實際操作例5 大豆在篩選後，被浸沒於3.0%氯化鈉溶液中。在大 豆之溼含量爲60%時，將大豆置於攝氏30度及溼度範圍 在90至95%之培養箱內培養36小時。當發芽長度達到！ 公分時，中止培養，然後將大豆於攝氏80度之熱空氣乾燥 機內乾熱24小時，該產物的濕含量爲12%。 實際操作例6 除了使用canola種子外，所有使用方法與上述操作例 5之方法完全相同。該發芽且乾燥的canola之濕含量爲9 實際操作例7 除了欲加速發芽速率而將大豆浸沒於作爲非離子性之 親水性乳劑的10%聚山梨醇酯80中4小時外，所有使用 方法與上述操作例5之方法完全相同。其縮短發芽的期間 大約24至36小時，該最終產物之濕含量爲12%。 實際操作例8 除了使用玉蜀黍外，所有使用方法與上述操作例5之 方法完全相同。該玉蜀黍之發芽長度爲1.5公分且最終產 物之濕含量爲10%。 \ 爲了穩定獲得自壓碎酵素產物之酵素萃取物的酵素活 性，該液態酵素萃取物被濃度0.5 - 1.0M的氯化鎂吸收， 在這些酵素產物以5000xg離心後，而獲得液態酵素產 物。一種生物緩衝溶液被使用來萃取酵素。 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I 491893 A7 ___— _B7___ 五、發明說明（) 實施例1 爲了確保酵素活性的穩定度，液態酵素產物以0.5 -1.0M的氯化鎂、氯化鈣或氯化亞鈷處理。藉由氯化鎂處理 後之酵素穩定度將造成較大於氯化鈣200倍的效果，且可 使該液態酵素活性之儲存超過四個月以上。 實施例2 基於本發明，欲決定自發芽大麥種子萃取之澱粉酶的 活性，而進行玻管試驗。來自，例如，玉蜀黍、小麥及大 麥等基質所釋放的葡萄糖的量分別爲223.8 //M、288.8 /z Μ及318.9//Μ。在這些實施例中，作爲基質之未發芽的玉 蜀黍、小麥及大麥被壓碎成能通過0.5毫米篩孔的篩子之 小顆粒，於攝氏38度培養24小時。 實施例3 基於本發明，欲決定自發芽大麥種子萃取之肌醇六磷 酸酶的活性，而進行如上述實施例2之玻管試驗。來自上 述之基質，所釋放的磷酸鹽的量分別爲613.7// g、373.9 // g 及 1,573.8 // g。 實施例4 表1顯示根據本發明來自未發芽及發芽穀類及油類種 子之澱粉酶活性的比較數據。該增加的澱粉;酶活性範圍， 在小麥及大豆中之最大値爲210%且在玉蜀黍中之最大値 爲 1，300%。 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) > 訂i-------線， 491893 A7 _ B7 五、發明說明（^)) 表1:未發芽及發芽榖類及油類種子之澱粉酶活性 穀類 澱粉酶活性(單位/公斤） 相對增加(％) 未發芽 發芽 玉蜀黍 5,200 66,100 1，300 小麥 66,500 139,400 210 大麥 64,444 176,100 280 稻米 12,962 117,800 910 大豆 65,679 133,500 210 實施例5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 表2顯示根據本發明來自未發芽及發芽穀類及油類種 子之肌醇六磷酸酶活性的比較數據。所增加的肌醇六磷酸 酶活性範圍，其在大豆中之最大値爲120%且在玉蜀黍中 之最大値爲470%。 表2:未發芽及發芽穀類及油類種子之肌醇六磷酸酶 •線 活性_^_ 肌醇六磷酸酶活性 相對增加(％) (單位/公斤） 榖類 未發芽 發芽 玉蜀黍 13,900 64,600 470 小麥 112,400 227,600 、 210 大麥 119,400 305,600 260 稻米 5,200 31,900 630 大豆 39,000 43,900 120 實施例6 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 491893 A7 ____ __ 五、發明說明) 欲決定自發芽大麥種子萃取之不同的酵素活性，而進 行如上述實施例4之實驗而使用未發芽大麥作爲控制組。 與未發芽大麥比較，在發芽大麥內不同酵素的活性分別增 加，例如，纖維素酶300%、果膠酶、羧甲基纖維素 酶500%、半纖維素酶300%及蛋白質酵素。 實施例7 使用大豆，而進行如上述實施例6之實驗。與未發芽 大豆比較，在發芽大豆內不同酵素的活性分別增加，例 如，澱粉酶2,500%、纖維素酶400%、果膠酶600%、竣 甲基纖維素酶500%、半纖維素酶2〇〇%、蛋白質酵素6〇〇 %及肌醇六磷酸酶450%。 動物飼料實施例1:豬 豬餵食產生自上述操作例1作爲澱粉飼料原料％t% 之壓碎酵素產物，在餵食三個月後，與餵食〜般目的飼^ (general purpose feed)之控制組比較，觀察到其相對們 重增加20%。 ' " 飼料組成物： 澱粉飼料（來自本發明之飼料原料） 纖維素飼料 蛋白質飼料 塡充物質、藥物製劑及礦物質 動物飼料實施例2:適於燒烤的嫩雞 適於燒烤的嫩雞餵食除了使用作爲蛋白質飼米、、^ 大豆之壓碎酵素產物外，及產生自上述操作例，來源的 〇相同飼料 12 4〇,5〇% 、2〇% 1〇,2〇% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

I,訂： •線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 491893 A7 五、發明說明（）丨） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 組成物的大豆之壓碎酵素產物，在餵食八星期後，與觀食 一般目的飼料之控制組比較，觀察到其相對體重增加15 動物飼料實施例3 ·產蛋母雞 除了使用產蛋母雞外，進行如上述動物飼料實施例2 之鑑定實驗，與餵食一般目的飼料之控制組比較’相對產 蛋速率改善8-10%，初次產蛋時間縮短大約二星期。 動物飼料實施例4 :狗，貂及狐 -% 於狗、貂及狐進行如上述動物飼料實施例2之鑑定實 驗，觀察到於狗、貂及狐之相對體重分別增加15%、13% 及20%。屬於處理組之貂及狐比控制組明顯具有較光澤的 毛皮。來自發芽穀類種子之酵素產物包含大量之不同的高 活性酵素，因此，不同的基質被預期協同水解。我們確認 在動物藥物製劑中藉由供應0.5% (W/W)酵素產物比塡 充物質具有優良之取代效果。 本發明之效果 在本發明中，發展一種來自發芽榖類種子之酵素生產 技術方法。該技術方法使用自然法則，產生低成本之最大 量的酵素。既然該產物是產生於人類及動物所消費之榖類 中，因此該酵素產物對動物之使用具有安、全性且沒有毒 性。該酵素產物不只包含最大量之肌醇六磷酸酶亦^含^ 他大量之酵素，不同的基質被預期協同水解。既然以包含 不同的營養素之酵素產物作爲生產混合飼料的飼^原=3 因此與其他飼料原料相比，該酵素產物揭示〜優良之取 13 491893 A7 _B7_ 五、發明說明（丨〆） 效果。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該酵素產物，則不必要在飼料中供應肌醇六磷酸 酶以使反芻動物及具有單胃之動物消化有機磷。既然其用 途具有在經濟上可有效地降低飼料成本之優點，因此其證 明本發明在動物飼料及家畜工業是非常有效的。 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 491893 公告本.I I ( D8 , _ } 六、申請專利範圍 1、 一種經分離之包含肌醇六磷酸酶（phytase)之複 合酵素（multi-enzyme)產物，其係藉由包括下列步驟之 方法獲得： a、 將種子浸入氯化鈉溶液中且丟棄劣等的種子； b、 調整該種子的濕含量爲40至60% ; c、 將該種子於濕度90至95%，攝氏15至30度下培 養24至36小時以形成發芽種子； d、 以熱空氣乾燥該種子以降低該種子之濕含量至9至 12% ;及 e、 壓碎該經乾燥之發芽種子，藉以生產該包括具有比 未發芽種子大於120%之酵素活性之肌醇六磷酸酶之含複合 酵素產物； 其中該種子係選自大麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍、小 麥、稻米、大豆及canola所組成之族群中。 2、 一種生產包括具有增進酵素活性之肌醇六磷酸酶之 含複合酵素產物的方法，其包括： a、 將種子浸入氯化鈉溶液中且丟棄劣等的種子； b、 調整該種子的濕含量爲40至60% ; c、 將該種子於濕度90至95%，攝氏15至30度下培 養24至36小時以形成發芽種子； d、 以熱空氣乾燥該種子以降低該種子之濕含量至9至 12% ;及 e、 壓碎該經乾燥之發芽種子，藉以生產該包括具有比 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公愛） -------------------------:1Τ-卜 L------------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 491893 A8 B8 C8 D8 一丨丨 六、申请專利範圍 未發芽種子大於120%之酵素活性之肌醇六磷酸酶之含複合 酵素產物。 3、 如申請專利範圍第2項的方法，其進一步包括藉由 含0.5-1.0M氯化鎂之緩衝溶液自經壓碎之發芽種子萃取複 合酵素以維持該複合酵素之安定性。 4、 如申請專利範圍第2項的方法，其進一步包括將該 種子浸沒於〇·〇5至10.0%之作爲非離子性之親水性乳化劑 的聚山梨醇酯80內，以加速發芽的速度。 5、 一種補充家畜之飮食的方法，其包括對該家畜餵養 藉由申請專利範圍第2項的方法所生產之含複合酵素產 物。 6、 如申請專利範圍第3項的方法，其進一步包括將萃 取物離心以生產一種液態複合酵素產物。 ___2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) ’•TT·.