CN1310763A - 用于纯化蛋白质的新颖的肽片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新颖的肽片段、含有这些肽片段的融合蛋白、它们的制备方法、以及这些肽片段的应用。本发明同时还涉及一种用于纯化融合蛋白的方法以及一种用于检测蛋白的方法。本发明进一步涉及编码这些肽片段或者融合蛋白的核酸,以及含有这些核酸的载体。
Description
本发明涉及新颖的肽片段、含有这些肽片段的融合蛋白、它们的制备方法、以及这些肽片段的应用。本发明同时还涉及一种用于纯化融合蛋白的方法以及一种用于检测蛋白的方法。
本发明进一步涉及编码这些肽片段或者融合蛋白的核酸,以及包含有这些核酸的载体。
通过现代分子生物学已经有可能以实质上是无限的数量制备几乎任何蛋白质、肽段或它们的衍生物。与这相关联的是,蛋白的纯化经常证明是有限的,而且也不是普遍有效,因此最终是一个决定成本的因素。
这就是为什么已经发展了许多用于纯化蛋白的技术的原因。正常用于从细胞上清、细胞粗提物或细胞中纯化蛋白的技术有,例如,盐沉淀或者用有机溶剂沉淀、超滤、透析、凝胶电泳、等点聚焦、层析聚焦、离子交换或者凝胶层析、疏水层析、免疫沉淀或者IMAC(即固定化金属亲合层析)。可以用单一的方法进行纯化,但是通常需要结合不同的技术来纯化。传统的纯化方法的综述可见,例如,教科书《蛋白质纯化方法工程学(Protein Purification ProcessEngineering)》(由R.G.Harrison编辑,1994,Marcel Dekker,Inc.,New York,第209-316页,ISBN 0-8247-9009-X)),《蛋白质纯化(Protein Purification)》(由R.K.Scopes编辑,1994,SpringerVerlag New York,第4-7章,ISBN 0-387-94072-3)以及《蛋白质分析方法(Methods for Protein Analysis)》(由R.A.Copeland编辑,1994 Chapman & Hall,第59-112页,ISBN 0-412-03741-6)。对于蛋白质的纯化,重要的是应该让纯化在尽可能温和的条件下进行,而且选择性要尽可能地高,速度要尽可能地快。另外,蛋白质的损失要保持尽可能的少。许多蛋白质纯化方法的选择性不够,仅适合少量的蛋白质,而且/或者费用非常高。
由Porath等(Nature,第258卷,1975:598-599)描述的IMAC(即固定化金属亲合层析)蛋白质纯化方法是在实现最优纯化和符合所述要求之间的一个良好的折中方案。然而,这一方法仍然存在一些缺点。因此,例如,并不是所有的金属离子都一样好地结合到支持介质上,以致有一些离子被洗脱下来并因此污染了所需的产物。许多蛋白质根本就不与层析材料结合,因此也无法被纯化,或者它们结合的能力太弱以致在对柱材料进行必需的清洗时甚至就被洗脱下来。这导致所不希望的产物的损失。对于单步纯化,由于选择性通常是不充分的,因此不同于通过生物特异性亲合纯化方法(如通过抗体进行纯化),必需进行进一步的纯化。
为了能够用这一方法来纯化范围广泛的蛋白质,已经发展了各种各样的所谓的标记(tag),例如聚组氨酸、His-Trp、His-Tyr或(His-Asp)n(见Sporeno等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269(15),1994:10991-10995,Le Grice等,欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),187(2),1990:307-314,Reece等,基因(Gene),126(1),1993:105-107,De Vos等,核酸研究(Nucl.Acid.Res.),22(7),1994:1161-1166,Feng等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269(3),1994:2342-2348,Hochuli等,生物技术学(Biotechnology),1988:1321-1325,Patwardhan等,层析杂志(J.Chromatography)A,787,1997:91-100,Hutchens等,层析杂志(J.Chromatography),604,1992:133-141)。这些标记是通过分子生物学手段在核酸水平上被连接到蛋白质上的。已经有可能通过这些标记来进一步改善一些领域中的蛋白质的纯化。然而,即使这一方法也仍然存在一些缺点。仍然不可能可靠地预知一种蛋白质是否可以用这一方法来纯化(见“固定化金属离子亲合层析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)”,L.Kagedal,第227-251页,于蛋白质纯化(Protein Purification)中,由J.C.Janson,L.Ryden编辑,1989,VCH Publi shers,Inc.,New York,ISBN 0-89573-122-3),这意味着这一方法也同样不是适用于每种蛋白质。同样的,金属离子被清洗下来或蛋白结合很差以致它们在清洗步骤中就损失掉一部分。选择性仍然是不令人满意的。另外,柱介质装载待纯化蛋白质的能力在一些情形下仍然太低,以致在一个纯化中必需使用大量的柱介质。蛋白质的产量也仍然不足。这导致不必要的费用。
Volz等已经描述了不使用任何另加的His-tag序列从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中纯化ATP酶的方法。这些ATP酶含有天然的金属结合位点,这使得可以用IMAC进行纯化。我们自己的研究已经显示这些结合位点所具有的结合亲和力太小,不能有效地纯化所有的所需的蛋白质。
本发明的一个目标是为通过纯化IMAC蛋白提供进一步的标记,这些标记不具有上述的缺点,从而使得可以,例如,更广泛地使用这些标记以及/或者以更大的密度装载柱材料,而且这些标记的选择性更高,从而简化了纯化。
我们已经发现这一目标可以通过根据本发明的具有以下一般序列的肽片段来实现:
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys,
其中序列中的变量X1至X6含有以下含义:X1=选自以下集合的一种氨基酸:Ala,Val,Phe,Ser,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp或者Lys,此时变量X2至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者X2=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Ile,Phe,Pro,Trp,Tyr,Gln,Glu或者Arg,此时变量X1、X3至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者X3=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His,此时变量X1、X2、X4至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者X4=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Phe,Pro,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Arg或者His,此时变量X1至X3、X5、X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者X5=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ser,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Lys或者Arg,此时变量X1至X4、X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者X6=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Pro,Ser,Cys,Trp,Tyr或者Gln,此时变量X1至X5代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His,而且其中序列中的变量X1至X6中的至少一个变量相互独立地是Gln或者Asn。
序列中的变量X1至X6中的至少一个变量另外相互独立地是Lys或者Arg是有利的。在变量X1至X6中存在Glu,Lys,Arg,Tyr,Cys,Lys,His,Asp或者Met也是有利的。优选存在的氨基酸是Cys,Glu,Lys,Tyr或者Arg,特别优选的是Cys。这些氨基酸促成肽片段有利地结合到固定化的金属离子上。另外,在序列中不存在连续的四个以上,优选的三个以上,的组氨酸残基是有利的。
序列中的变量X1至X6中具有以下的更为有利和优选的含义,这些含义都是相互独立的:X1=选自以下集合的一种氨基酸:Ala,Val,Phe,Ser,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp或者Lys,特别优选的是Phe,Ser,Asn,Asp或者Lys,非常优选的是Asn;X2=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Ile,Phe,Pro,Trp,Tyr,Gln,Glu或者Arg,特别优选的是Val,Ile,Phe,Pro,Gln,Glu或者Arg,非常优选的是Gln,Glu或者Arg;X3=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg或者His,特别优选的是Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp,Glu,Arg或者His,非常优选的是Gly,Thr或者Tyr;X4=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Phe,Pro,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Arg或者His,特别优选的是Val,Phe,Cys,Met,Trp,Asn,Arg或者His,非常优选的是Asn或者Arg;X5=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ser,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Lys或者Arg,特别优选的是Gly,Ser,Cys,Met,Asn,Glu,Lys或者Arg,非常优选的是Gly或者Lys;X6=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Pro,Ser,Cys,Trp,Tyr或者Gln,特别优选的是Phe,Ser,Cys或者Tyr,非常优选的是Cys。
序列His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys中的变量X1至X6可以含有各种不同的优选的含义,这些含义都是相互独立的,其中一个变量到其中最多有5个变量是选自以下集合的一种氨基酸:
Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His.特别优选的肽片段是含有以下序列的片段:
His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys
His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys
His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys
His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys
上述的蛋白片段序列是由根据本发明的核酸片段编码的。在这一点上,必须注意简并性遗传密码。根据本发明的核酸片段原则上可以存在于任何合适的核酸中。该核酸片段被有利地以某种方式插入到载体中以便制备编码根据本发明的融合蛋白的构建核酸序列(=基因构造物)。这些基因构造物为了表达可以被有利地转入一种合适的宿主生物体中,从而使该融合蛋白的最优表达称为可能。合适的载体对于熟练的技术人员是熟知的,而且可以参照,例如,《克隆载体(CloningVectors)》(Pouwels P.H.等编辑,Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444904018)中的描述。除了质粒之外,载体还指为熟练技术人员所知道的所有其它的载体,象,例如,噬菌体、病毒、转座子、IS元件、质粒、粘粒、线性或者环状DNA。这些载体可以在宿主有机体中进行自主复制或者染色体复制。
根据本发明的核酸序列指的是已经功能性地与一个或多个调控信号连接的序列,对于增强基因表达有利。这些序列可以是3’以及/或者5’端用于增强表达的调控序列,而且是为了最优表达根据所选择的宿主生物体和基因进行挑选的。这些调控序列是,例如,与诱导子或者抑制子结合并从而调控核酸表达的序列。这些基因构造物可以另外有利地含有一个或多个与启动子功能性连接的所谓的增强子序列,这使得核酸序列表达的提高称为可能。这可以,例如,通过RNA聚合酶和DNA之间被许可的相互作用来实现。也可以在+DNA序列的3’端插入另加的有利的序列,如其它的调控元件或者终止子。根据本发明的核酸片段被以某种方式有利地插入到载体中以使它们形成融合蛋白的N-末端区域。然而,它们也可以位于C末端,或者位于蛋白之中,但是在这种情况下蛋白的功能必须不受影响,而且融合蛋白不可能再被切除。
调控序列的目的是使基因和蛋白能够进行特异性的表达。这可能意表示,例如,依赖与宿主有机体,该基因只有在诱导之后才被表达或者过量表达,或者它可以立即被表达和/或过量表达。
有利的调控序列存在于,例如,启动子,例如,cos,tac,trp,tet,trp-tet,lpp,lac,lpp-lac,lacIq,T7,T5,T3,gal,trc,ara,SP6,λ-PR启动子中,或者存在于λ-PL启动子中,上述的λ-PL被有利地用于格兰氏阴性细菌中。进一步有利的调控序列存在于,例如,格兰氏阳性启动子amy和SP02中、在酵母或者真菌启动子ADC1,MFa,AC,P-60,CYCL,GAPDH,TEF,rp28,ADH中,或者在植物启动子CaMV/35S,SSU,OCS,lib4,usp,STLS1,B33,nos中、或者在遍在蛋白或菜豆球蛋白启动子中。在这一点上,同样有利的还有丙酮酸脱羧酶以及来源于,例如,汉森酵母属(Hansenula)的甲醇氧化酶的启动子。也可以用人造的启动子来进行调控。
调控序列或者因子此外还可以优选地对被导入的基因的表达具有正面影响,并从而增加其表达。因此,通过使用强的转录信号,如上述的启动子以及/或者增强子,调控元件的增强作用可以有利地发生于转录的水平。然而,通过,例如,改善mRNA的稳定性,也可以对翻译进行增强。
根据本发明的核酸序列有利地还含有一些能够使蛋白质被分泌到介质或者细胞隔室中的信号。这种类型的序列的例子值得一提的是典型的信号序列,如ompA(大肠杆菌膜蛋白)的信号序列。另外也可以存在其它的有利的序列,例如α因子的序列,或者也可以使用YAC(酵母人工染色体)。
根据本发明的基因构造物(=核酸序列)有利地另外含有一些序列,它们使得可以从融合蛋白的N端或者C端,优选地从N端,切除具有根据本发明的上述序列的蛋白片段。这些序列编码,例如,范围广泛的蛋白酶,例如,因子Xa、肠激酶、人肾素、羧肽酶A、凝血酶、胰蛋白酶、二肽基肽酶(dipeptidyl pepdidase)、木瓜蛋白酶、纤溶酶、胃蛋白酶或者其它的蛋白酶,的酶切位点。优选的酶切位点是因子Xa、人肾素、二肽酶、羧肽酶A、或者肠激酶的酶切位点,因为这些酶具有高度的特异性,从而避免了对所要纯化的蛋白产生不需要的酶解。如果使用其它的蛋白酶,应该注意在待纯化的蛋白中不应该存在酶切位点。蛋白片段也可以通过溴化氰[例如,2-(2-硝苯氧硫基)-3-溴-3’甲基吲哚(2-(2-nitrophenylsulfenyl)-3-bromo-3’-methylindolinium)、羟胺等]在甲酸的存在下的剪切来删除。然而,在这一情形中,蛋白质通常需要进行重新折叠,这使得这一方法的优选性较差。也可以通过外切蛋白酶的酶解(在动力学控制下)来除去蛋白片段。然而,通常产生混合产物。优选使用的酶切位点是那些使得可以在切除蛋白片段的同时不在待纯化的蛋白上残留有残余的蛋白片段的位点。如果根据本发明的蛋白片段在融合蛋白中可以被接受,而且同时又不丧失功能,也不具有其它的缺点,那么可以免除一个用于分离该蛋白片段的特异的位点。
合适的载体原则上是所有的可以使表达在原核或者真核细胞中进行的载体。在这一点上,可以使用那些仅在一个种属种复制的质粒或者那些可以在好几个种属中复制的质粒(称为穿梭质粒)。有利的载体的例子有,例如:大肠杆菌质粒PEGFP,pLG338,pACYC184,pBR322,pUC18,pUC19,pKC30,pRep4,pHS1,pHS2,pPLc236,pMBL24,pLG200,pUR290,pIN-Ⅲ113-B1,λgt11或者pBdCI,优选的是PEGFP;链霉属中的pIJ101,pIJ364,pIJ702或者pIJ361;棒状杆菌中的pUB110,pC194或者pBD214;棒状杆菌中的pSA77或者pAJ667;真菌中的pALS1,pIL2或者pBB116;酵母中的2μM,pAG-1,YEp6,YEp13或者pEMBLYe23;或者植物中的pLGV23,pGHlac+,pBIN19,pAC2004或pDH51。上述的质粒代表了可能的质粒的一个小的选集。另外的质粒是熟练技术人员熟知的,而且可以参照,例如,上述的书本《克隆载体(Cloning vectors)》(由Pouwels P.H.等编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-oxford,1985,ISBN0444904018)。
在载体的另外一个实施例中,根据本发明的核酸片段也可以被有利地以线性DNA的形式导入到微生物中而且通过异源或者同源重组被整合到宿主生物体的基因组中。这一线性DNA可以含有一个线性化的载体,如一个质粒,或者仅含有核酸,即核酸片段和蛋白质基因(=融合蛋白基因),以及,如果合适的话,其它的调控序列。
适合根据本发明的基因构造物的宿主生物体原则上可以是所有的原核或者真核的生物体。被有利地使用的宿主生物体是诸如以下的细菌:格兰氏阳性或者格兰氏阴性细菌、古细菌、真菌、酵母、动物或者植物细胞,例如果蝇,特别是果蝇D.melanogaster、小鼠、斑马鱼或者烟草。优选使用的是格兰氏阳性或者格兰氏阴性细菌、真菌或者酵母,特别优选的是大肠杆菌、棒状杆菌、链霉菌、曲霉菌、或者酵母菌属,非常优选的是大肠杆菌。
特别优选的是以下载体和宿主生物体的组合:例如大肠杆菌及其质粒和噬菌体以及它们的启动子,杆菌及其质粒和启动子、链霉菌及其质粒和启动子、曲霉菌及其质粒和启动子、或者酵母菌及其质粒和启动子。
根据本发明的融合蛋白可以如上所述进行制备,在这一步骤中,根据本发明的编码具有上述序列的蛋白片段的核酸片段被融合到一个编码待纯化蛋白、以及在合适的时候,其它的有利的序列,例如启动子以及/或者增强子序列、蛋白酶酶切位点等的基因上。为了这一目的,如果需要的话,可以在核酸片段以及待纯化蛋白的基因之间导入一个合适的限制性酶切位点并将这一构造物通过合适的酶切位点插入到一个载体中。这类方法是熟练技术人员所公知的而且可以参考,例如,以下教科书:Sambrook,J.等(1989)的教科书《分子克隆:实验室手册》(Cold Spring Harbor Laboratory Press);F.M.Ausubel等(1994)的《当前分子生物学协议(Current protocols inmolecular biology)》;John Wiley and Sons或者D.M.Glover等的《DNA克隆(DNA Cloning)》第一卷(1995),IRL Press(ISBN019-963476-9)。有利的载体还有Pichia pastoris(毕赤酵母属)载体ppic以及pGap。这种酵母同时也是蛋白表达的一种合适的宿主生物体。
根据本发明的蛋白片段适合用于制备在这些蛋白片段的帮助下可以被容易地、低费用地纯化的融合蛋白。根据本发明的蛋白片段和融合蛋白可以因此被有利地以非常好的选择性、良好的产率和高纯度被纯化。根据本发明的蛋白片段以及用它们制备的融合蛋白结合固定化金属离子的能力比幽门螺杆菌(Helicobacter pilori)ATP酶-439序列至少强1.5倍,这使得它们可以被有利地区别开来。
原则上所有的蛋白都适合用于制备融合蛋白。优选使用的蛋白是那些在人、动物、或者植物或者对其有机合成感兴趣的生物体中具有生物学作用的蛋白。这种蛋白的例子包括,例如,酶、激素、或者贮存或者结合或者转运蛋白。值得一提的例子是诸如水解酶,例如脂肪分解酶、酯酶、酰胺酶、腈水解酶、蛋白水解酶、调节因子(mediator),如细胞因子,例如淋巴因子(例如MIF,MAF,TNF)、白细胞介素(如白细胞介素1)、干扰素(如γ-干扰素)、tPA、激素(如蛋白质激素)、糖激素(glykohormone)、寡聚肽或者多肽激素(如抗利尿素)、内啡肽、endostatin、angiostatin、生长因子、红细胞生成素、转录因子、整联蛋白(例如GPⅡb/Ⅲa或者αvβⅢ)、受体(例如各种不同的谷氨酸盐受体)、血管生成因子(如血管收缩素)。
根据本发明的用于纯化蛋白的方法使得可以例如从天然的来源,例如植物或者动物提取物、植物或者动物细胞裂解物;从培养基、发酵肉汤;或者从合成肉汤等等中纯化蛋白质。
根据本发明的步骤含有以下的反应步骤:a)将含有融合蛋白的液体与固定化的金属离子以某种方式接触使得在金属离子和融合蛋白之间形成一个亲和联接,b) 将溶液中没有结合的物质除去,c) 通过改变液体介质消除亲和联接来将结合的融合蛋白洗脱下来,以及d) 收集经过纯化的融合蛋白。
融合蛋白在纯化之前被有利地在合适的宿主生物体(见上)中表达以便增加融合蛋白的产量。将宿主生物体在合适的温度和合适的通气下培养在一种合适的合成的或者复合的介质中,上述的介质含有一种碳源、一种氮源、以及,当合适时,无机盐、维生素和微量元素。
根据融合蛋白是否是从细胞分泌出来的,首先将细胞破裂并将细胞或者细胞碎片有利地除去。用于细胞破裂的方法都是熟练技术人员所知道的,例如超声、French press、酶解、渗透压震动等等。细胞或者细胞碎片可以通过,例如,离心或者过滤来除去。然而,细胞和细胞碎片的去除并不是绝对必须的。
随后让含有融合蛋白的液体与固定化的金属离子接触以便在融合蛋白和金属离子之间形成一个亲和联接。结合在大于7的pH值下、有利地是在例如7.0至9.0的pH值下、优选的是在pH7.5至8.0下发生。有利的缓冲液是单一的缓冲液或者缓冲液混合物,例如,50至1000 mM的缓冲液,例如50mM Tris/HCl pH 8.0+150 mM NaCl,100 mM乙酸钠pH7.7+500 mM NaCl,20mM磷酸钠pH7.7+500 mM NaCl或者50 mM Tris/HCl pH 8.0+.150 mM NH4Cl。
这些缓冲液使得可以将融合蛋白装载到固定化的金属离子上。在最简单和特别有利的实施例中,让在用于破碎的缓冲液中或者保温介质中的融合蛋白直接与固定化的金属离子接触。让液体和固定化的金属离子在传统的层析柱中进行相互的接触是有利的。这便利了通过用一种合适的缓冲液清洗层析柱来除去没有结合的物质,例如蛋白质。合适的缓冲液是那些不减弱根据本发明的蛋白片段或者融合蛋白结合到金属离子上,而且能够除去杂质的缓冲液。这一类型的缓冲液的pH值优选地为大约pH 7,有利的介于pH 7.0和9.0之间,优选的在pH7.5至8.0之间。也可以纯化批量的混合物,其中将固定化的金属离子放置在一个容器中,然后再加入液体,也可以反之进行。上面已经提及的缓冲液可以被用于这些批量混合物中。这些混合物在单个的清洗步骤之间被有利地离心或者过滤。
原则上适于固定金属离子的支持介质是所有传统的容易被衍生、不具有或仅具有轻微的非特异性吸附、表现出良好的物理、机械和化学稳定性、且具有大的外部及内部表面积的介质。合适的介质可以从商业途径获得,例如,从瑞典Pharmacia LKB公司(SepharoseTM 6B或SuperoseTM)、美国Pierce公司(固定的亚氨基二乙酸Ⅰ或Ⅱ,固定的三(羧甲基)-乙二胺)、美国Sigma公司(固定的亚胺二乙酸-琼脂糖),德国Boehringer Mannheim公司(锌螯合琼脂糖)或日本ToyoSoda公司(TSKgel Chelate-5PW)获得。EP-B-0253303描述了其它合适的介质。其它合适及有利的介质如含Ni微滴定板(镍螯合包裹的Flashplate,Nen生命科学产品)或磁性颗粒或特异性的金属离子处理并结合的膜。
各种金属离子通过基团如IDA(=亚胺二乙酸)、NTA(=次氮基三乙酸)或TED(=三(羧甲基)乙二胺)方便地结合到合适的介质上。合适的金属离子为Co、Cu、Fe、Ca、Mg、Ni、Al、Cd、Hg或Zn,优选的是Fe、Ni或Cu,特别优选的是Ni或Cu,非常优选的是Ni。金属离子装载入介质可以简便地用0.1到0.4M的金属盐的水溶液,非缓冲溶液。
清洗之后,用一种合适的缓冲液洗脱融合蛋白。该缓冲液消除了融合蛋白和固定化的金属离子之间的亲和连接。融合蛋白可以通过pH梯度(洗脱用低pH值<pH7.0)、竞争性配基如咪唑、有机溶剂如丙酮或乙醇、螯合试剂如EDTA或NTA和/或去垢剂如Tween 80被洗脱下来。通过竞争性配基如咪唑和/或去垢剂洗脱是优选的。用于洗脱的咪唑的范围为0.05到0.7M,优选的是从0.1到0.5M。竞争性配基和/或去垢剂有利地被制备在缓冲液中使用,但也可以制备在水中使用。有利的缓冲液是与用于装载固定化的金属离子的缓冲液相对应的缓冲液。其优点是在柱床介质、结合蛋白和缓冲液之间不会发生意想不到的相互作用。有利的缓冲液的pH值优选地大于pH7,有利地其pH值介于pH7.0至9.0之间,优选地介于pH7.5至8.0之间。这些缓冲液优选地通过一个递增的梯度被施用。在使用pH梯度进行洗脱的情况下,有可能使用pH低于7.0的缓冲液和/或酸。收集被洗脱下来的融合蛋白并可将其立即使用,或者如果有必要和如果需要的话,将其进一步进行处理。合适的装载和洗脱缓冲液可见,例如,教科书《蛋白纯化》(由J.C.Janson编辑,L.Rydén,VCH PublisherInc.,1989,第227至251页)。
根据本发明的蛋白片段可以使用以上所描述的方法,如溴化氰或蛋白酶切割,来删除。在这种情况下有可能将该蛋白片段的残基保留在分子中,或者将其从该蛋白中完全剔除。有利的是将该蛋白片段从该蛋白中完全去除。
用于制备融合蛋白的合适和有利的蛋白片段可以通过根据本发明的以下程序进行筛选。本发明涉及一种用于制备可以进入与固定金属离子的可逆亲和连接的蛋白片段的程序,其包括采用以下步骤:a) 从任何一种编码具有以下序列的蛋白片段的合适的核酸序列开
始,制备一个核酸文库:
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys
其中该序列的组氨酸和半胱氨酸残基在该核酸文库中是保守的,b)将该文库的核酸融合到一个报告基因中,这使得可以通过由如此获得的核酸编码的融合蛋白对固定金属离子的结合来对该融合蛋白进行检测,以及c)选择与经过固定化的金属离子的可逆结合能力至少比天然的幽门螺杆菌ATP酶-439中的序列强1.5倍的核酸序列。
基于上述序列的核酸文库可以用熟练技术人员所了解的突变方法进行构建。为达到这一目的,可以对该序列进行如D.M.Glover等所著的《DNA克隆》第1卷(1995),IRL Press(ISBN 019-963476-9)第6节第193页中及其它文献中所描述的定点突变。
Spee等(核酸研究(Nucleic Acids Research),卷号21(3),1993:777-778)描述了一种使用dITP进行随机突变的PCR方法。
体外重组技术在分子进化中的应用见Stemmer(美国科学院院刊(Proc.Natl.acad.Sci.USA),第91卷,1994:10747-10751)的描述。
Moore等(Nature Biotechnology第14卷,1996:458-467)描述了PCR方法和重组方法的结合。
体外重组技术在分子进化中的应用见Stemmer(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第91卷,1994:10747-10751)的描述。也可以将这两种方法组合使用。
存在缺陷的突变菌株在DNA修复系统中的应用见Bornscheuer等(Strategies,11,1998:16-17)的所描述。Rellos等描述了一种使用非等克分子量核苷的PCR方法(蛋白表达和纯化(ProteinExpression and Purification),5,1994:270-277)。
核酸文库可以方便地通过一种PCR技术来构建,上述的PCR技术使用两种互补的、简并的寡核苷酸(称为游移引物),如实施例中所描述。重要的是存在于该序列中的组氨酸和半胱氨酸残疾是保守的。
为了筛选具有改良的结合金属的亲和性的蛋白片段,编码该蛋白片段的根据本发明的核酸片段被融合到一个报告基因中。通过,例如结合用荧光染料标记且针对该报告基因的抗体,或通过自身发荧光的蛋白,例如来源于大肠杆菌的有利的并优选的egf蛋白(=绿色荧光蛋白,见Prasher等,Gene lll(2),1992:229-233)或来自Aequoriavictoria的优选的生物荧光蛋白,或通过发光蛋白如虫荧光素/荧光素酶系统,有利的报告基因简化了对固定金属离子的结合的检测。特别优选使用的是一种其荧光活性提高35倍的gfp蛋白突变体(=egfp=增强的绿色荧光蛋白),其活性的提高是由在64位Leu取代Phe、在65位Thr取代Ser这两个点突变引起的。该蛋白突变体比野生型蛋白优越之处在于它是可溶的而且不形成包涵体。该egfp蛋白的使用使得在该蛋白纯化的每一个步骤中可以对蛋白浓度进行定位和定量、同时又不干扰纯化而且也不使用其他的协同因子或底物(Poppenborg等,生物工程学(J.Biotechnol.),58(2),1997,77-88)。egfp蛋白的特点还在于它在广泛的pH范围(pH5.5至12)内、在光氧化、氧化以及弱还原剂(如2%巯基乙醇)的漂白作用下具有高度的稳定性高于37℃时,该蛋白质荧光减弱,类似合适的报道基因是gfp-uv(蓝色荧光)和egfp(黄色荧光)蛋白。
合适的序列是通过将其对固定化的金属离子的结合亲和力与以下天然的幽门螺杆菌ATP酶-439序列His-Ile-His-Asn-Leu-Asp-Cys-Pro-Asp-Cys进行比较来确定的。根据本发明的蛋白片段序列对固定金属离子的可逆结合至少应增强1.5倍,优选地至少两倍,特别优选地至少三倍。有利的序列使得纯化之后的蛋白得率至少为20%,优选的为至少30%,特别优选的为至少40%,非常优选的为至少50%。
根据本发明的用于筛选核酸文库的方法有利地是适合自动化的。该方法可以在所谓的高效普筛的被简便地用于测试大量的核酸片段和蛋白片段对金属离子的结合亲和力。
利用根据本发明的蛋白片段可以容易地对蛋白进行检测。在根据本发明的蛋白检测方法中,蛋白混合物中的含有具上述的本发明的蛋白片段的个体蛋白可以通过针对蛋白结构的抗体被检测出来。通过针对该蛋白片段(=tag)的单克隆或多克隆抗体,可以方便地对这些融合蛋白进行检测。在检测之前可以通过层析或电泳方便地对蛋白混合物进行分段,然后通过常规的方法(见Sambrook等)将其转移(=印迹)到合适的膜上(如PVDF或硝化纤维素膜)。然后将该膜与针对tag的抗体一起保温。有利的是将膜清洗几次,然后用一种第二抗体通过一种特定的反应来检测结合的抗体,该第二抗体是,如酶缀合物(如碱性磷酸酯酶、过氧化物酶等)而且在蛋白印迹或免疫印迹中针对一级抗体的恒定区。应答抗体是商业上可供的。当使用磁性颗粒时,清洗可以省略,包裹着抗体的磁性颗粒可以通过用磁体将其钓出来纯化。
根据本发明的蛋白片段在蛋白检测上比常规的组氨酸标记优越之处在于它们具有较强的抗原效应,因此更适于产生抗tag的抗体。
本发明进一步通过以下实施例进行说明。
实施例:
使用来自Pharmacia LKB,Uppsala,Schweden的ChelatingSepharose Fast-Flow测定对金属螯合柱(=固定化的金属离子)的结合。氨苄青霉素、咪唑、EDTA和所有其它的试剂均购自Fluka(Buchs,瑞士)。DNA凝胶抽提试剂盒、Midi Plasmid-Kit和Prepspin PlasmidKit来源于Qiagen(Hildent,德国),限制性内切酶、DNA-修饰酶、T4-DNA连接酶和Taq聚合酶来源于MBI Fermentas(St.Leon-Rot,德国)。Der Taq Dye循环测序试剂盒购自Applied Biosystems(Weiterstadt,德国)。
采用大肠杆菌菌株DH5α(F-endAl hsdR17[rk-,mk+]supE44thil λgyrA96 relAlΔ(argF laczya)U169)进行克隆实验。含有编码egf蛋白基因的质粒购自美国的Clonetech。大肠杆菌菌株在含有100微克/毫升氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基(=LB)中于37℃培养,以选择被egfp载体转化的克隆。裂解缓冲液含有50mM磷酸钠缓冲液,pH8.0,300mM NaCl,1mg/ml溶菌酶和1mM PMSF(=苯甲基磺酰氟)=特异性胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制剂)。
DNA方法(如连接、限制性酶切、PCR或转化等)的进行如Sambrook,J.等(1989)《分子克隆:实验室手册Cold Spring HarborLaboratory Press中、或F.M.Ausubel等(1994)《当前分子生物学协议》,John Wiley和Sons中所描述。使用荧光标记的双脱氧-DNA测序方法进行测序。采用Taq Dye DeoxyTM循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和373A DNA测序系统(AppliedBiosystems),根据厂商的使用说明进行DNA测序。实施例1:随机突变的结合egfp基因的N-末端金属结合位点以及his6-egfp的制备为进行PCR反应,使用了质粒egfp和以下两段互补的寡核苷酸
5’-GCAATACCATGGGGCATNNNCATNNNNNNNNNTGTNNNNNNTGTGTGAGGAAGGGCGAG-3’
5’-CAGTTGGAATTCTAGAG-3’对于his6-egfp,使用以下互补的引物
5’-GCAATACCATGGGGCATCATCATCATCATCATGTGAGGAAGGGCGAG-3’
5’-CAGTTGGAATTCTAGAG-3’PCR反应的条件如下:混合物:8微升dNTP混合物(200微摩尔)
10微升10×ThermoPol缓冲液(New England
Biolabs)
1微升(100皮摩尔)引物1
1微升(100皮摩尔)引物2
79.5微升水
1微升Deep Vent聚合酶(New England Biolabs)PCR程序95℃ 7分钟
95℃ 1分钟
56℃ 1分30秒
72℃ 3分钟
72℃ 7分钟
分别用NcoⅠ和NotⅠ酶切PCR产物并连接入已用相同的酶进行消化的egfp载体中,以便排除载体中的突变体(见表1)。用PCR-载体连接体对大肠杆菌进行转化。将转化产物涂布到含100微克/毫升的LB琼脂平板上并在37℃保温。实施例2:培养条件及细胞裂解物的制备
选择表现荧光及一些不表现荧光的转化克隆,并将它们在含有100微克/毫升氨苄青霉素的50毫升LB培养基中培养。选择表现荧光的克隆用于高处理量筛选并将它们在装有250微升含100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基的无菌微量滴定培养皿中保温。保温之后,离心培养物。将沉淀重悬于2毫升裂解缓冲液中,冰上保温20分钟,然后超声破碎(两次,用Branson Sonifier 250破碎5分钟)。离心(15分钟,4℃,2000×g)之后,在上清中得到不同的egfp突变体。将所有选中的克隆测序(见表Ⅰ和Ⅱ)。不表现出荧光的克隆在序列中含有终止密码子,因此表达出没有功能的蛋白(见表Ⅰ,A8、A13、M16a、Z4、Z11和Z13)。为了对结合蛋白进行定量,在所有的实验中采用荧光测定并在广范围内将其与gfP的浓度相关联(见图2)。实施例3:从Quagen中通过Ni-NTA柱进行低处理量筛选
在一根Ni-NTA柱中上样600微升裂解的细胞,用清洗缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液,pH8.0,250mM NaCl)清洗柱子两次,然后用0.7M咪唑溶液洗脱。实施例4:通过膜过滤板的高处理量筛选
膜过滤板(MultiScreen 5μm;由德国Molsheim的Millipore提供)被用于高处理量筛选。在膜过滤板的每个孔中加入三次250微升经过搅动的螯合琼脂糖凝胶悬浊液。每次加入之后,将琼脂糖凝胶离心下来(2min,23℃,350rpm)。所有进一步的步骤均在一台Beckmann Biomek 2000机器人中进行。以250微升水清洗孔洞中的微柱两次。然后用250微升金属盐溶液装载琼脂糖凝胶并用200微升缓冲液(50mM磷酸钠、pH8.0、250mN NaCl)平衡三次,在上述的各种不同的混合物(装载有金属离子)中分别使用0.3M NiCl2、0.3M NiCl2、0.3M CuSO4或0.3M ZnCl2溶液。使用非缓冲的金属盐的水溶液。每个微柱中加入250微升细胞裂解物上清。然后用250微升平衡缓冲液清洗孔径两次。结合蛋白的洗脱是通过2×100微升含有0.5M咪唑的平衡缓冲液。过滤板中的螯合琼脂糖凝胶可以用250微升50mM EDTA、1M NaCl的水溶液再生并被用于进一步的筛选实验。
实施例5:ZMAC-研究
选择一个常规的层析系统(包括一根玻璃柱、两台用于溶液的蠕动移液泵、一台紫外检测器(LKB UV-MII)、一台打印机和一台分段收集器(LKB FRAC-200))用于本实验。所有的设备均来自Pharmacia,用去离子水洗7倍柱体积并用0.3M NiCl2溶液洗7倍柱体积装载金属离子。然后用7倍柱体积的IMAC缓冲液(50mM磷酸钠,pH8.0,250mM NaCl)清洗并平衡柱子。以1.5毫升/分钟的流速上样1毫升细胞裂解物并用10倍柱体积的IMAC缓冲液清洗柱子。结合蛋白的洗脱是通过在每毫升洗脱溶液中递增0.5%的0.5M咪唑溶液,最后为5倍柱体积的0.5M咪唑/水溶液。蛋白片段通过紫外检测器进行鉴定并收集。完成以后,用50mM EDTA/1M NaCl溶液清洗并再生柱子。该清洗步骤将该金属、结合的细胞残余物和蛋白从柱子上去除。洗脱片段通过肉眼及光谱学方法进行检测。一些被研究的克隆没有表现出对该基质的亲和(见表Ⅰ,M15,M16),而其它克隆表现出良好的结合(见表Ⅰ,M13,Z5和Z7)。克隆M13和Z5以一个尖锐的峰从柱子上洗脱下来,而柱中的克隆z7存在脱尾现象。实施例6:比较egfp野生型和his-tag的实验
在一个比较性实验中将克隆M13和egfp野生型蛋白及通常的组氨酸标记进行比较。egfp野生型蛋白不结合该金属螯合柱。清洗柱子之后在柱子中不再检测到荧光。克隆M13以一个尖锐的峰结合于柱子上,然而组氨酸标记蛋白结合在整个柱子上。这可归因于较低的亲和,它最终导致柱子较低的亲和力。在M13的例子中蛋白的得率为56%,高于组氨酸标记的48%。
表Ⅰ:Ni金属螯合柱的结合实验
克隆A6、A10、M13、Z5和Z7对金属螯合柱的结合良好,而克隆M14、M15和M16不表现出结合。
克隆 | 氨基酸序列 | ||||||||||
A6 | His | Gin | His | Glu | G1y | Arg | Cys | Lys | Glu | Cys | gfp |
A8 | His | Cys | His | Pro | Glu | Leu | Cys | Stop | Leu | Cys | gfp |
A13 | His | Leu | His | Ser | Ile | Gly | Cys | Pro | Stop | Cys | gfp |
M13 | His | Asn | His | Arg | Tyr | Gly | Cys | Gly | Cys | Cys | gfp |
M14 | His | Ser | His | Ser | Val | Gly | Cys | Phe | Phe | Cys | gfp |
M15 | His | Gly | His | Thr | Leu | Ser | Cys | Gly | Leu | Cys | gfp |
M16 | His | Ser | His | Thr | Leu | Arg | Cys | Lys | Gly | Cys | gfp |
M16a | His | Ser | His | Stop | Leu | Arg | Cys | Lys | Gly | Cys | gfp |
Z4 | His | Stop | His | Asn | stop | Val | Cys | Ala | Thr | Cys | gfp |
Z5 | His | Arg | His | Gly | Thr | Asn | Cys | Leu | Lys | Cys | gfp |
Z7 | His | Ile | His | Gln | Ser | asn | Cys | Gin | Val | Cys | gfp |
Z11 | His | Thr | His | ala | Ser | Gly | Cys | Stop | Stop | Cys | gfp |
Z13 | His | Cys | His | Thr | Trp | Cys | Cys | Asn | stop | Cys | gfp |
表Ⅱ:在高处理量筛选中通过荧光检测的其它已测序的克隆
实施例7:结合金属的亲和
克隆 | 氨基酸序列 | ||||||||||
A1 | His | Gly | His | Met | Glu | Arg | Cys | Leu | Val | Cys | gfp |
A2 | His | Lys | His | Ala | Arg | Ser | Cys | Met | Gly | Cys | gfp |
A3 | His | Phe | His | Thr | Val | Phe | Cys | Phe | Ser | Cys | gfp |
A4 | His | arg | His | Arg | Gly | Met | Cys | Thr | Ala | Cys | gfp |
A12 | His | Asp | His | Arg | Gly | Val | Cys | Gly | Leu | Cys | gfp |
A14 | His | Asp | His | Glu | Arg | Leu | Cys | His | Asn | Cys | gfp |
X8 | His | Gly | His | Gly | Asn | Arg | Cys | Cys | Gly | Cys | gfp |
X9 | His | Arg | His | Gly | Thr | Ala | Cys | Met | Asp | CyS | gfp |
X11 | His | Ile | His | Ile | Met | Thr | Cys | Leu | Ser | Cys | gfp |
X12 | His | Thr | His | Pro | Arg | Ser | Cys | Ala | Glu | cys | gfp |
X15 | His | Gly | His | Asp | Arg | Thr | Cys | Arg | Gly | Cys | gfp |
X16 | His | Arg | His | Ala | Ile | Ser | Cys | Ile | Gly | Cys | gfp |
X17 | His | Ile | His | Arg | Gly | Asp | Cys | Tyr | Glu | Cys | gfp |
X18 | His | His | His | Gly | Ser | Thr | Cys | Pro | Thr | Cys | gfp |
X19 | His | His | His | Phe | His | Ser | Cys | Phe | Tyr | Cys | gfp |
Z8 | His | Lys | His | Val | Asp | His | Cys | Gly | Arg | Cys | gfp |
Z9 | His | Ser | His | Leu | Thr | Leu | Cys | Leu | Gly | Cys | gfp |
Z10 | His | Thr | His | Gln | Ser | Gln | Cys | Gly | Arg | Cys | gfp |
Z14 | His | Arg | His | Leu | Phe | Trp | Cys | Ser | Glu | Cys | gfp |
许多克隆表现出对Ni2+和Cu2+的优选结合。在M13的例子中,没有观察到对Zn2+的结合。在使用Ni螯合柱时,通过与组氨酸标记的比较,克隆M13表现出特别优越的蛋白纯化,相反地,在使用Cu螯合柱时,后者通过与M13的比较产生较纯的产物,但是,由于两者对柱子材料的结合都是十分强的,Cu离子须通过剧烈的洗脱条件清洗下来。这导致了产物的污染。实施例8:ATP酶-439序列和根据本发明的蛋白片段之间的比较的实验
ATP酶-439的对照克隆和实施例1和6中的类似。所使用的引物如下:5’-GCAATACCATGGGGCATATTCATAATCTTGATTGTCCTGATTGT-3’。其它的引物和PCR条件如实施例1中所描述。
实验是在天然状态下使用一种Quiagen Ni-NTA Spin Kit进行,溶菌如所描述的在这些条件下进行:用600微升50mM磷酸钠、pH8.0、300mM NaCl并在2000rpm(=420×g)离心2分钟的缓冲液平衡已经被装载的柱子。然后施用600微升的裂解物并离心,例如,2分钟。每次用600微升50mM磷酸钠、pH8.0、300mM NaCl的缓冲液清洗柱子两次。然后使用600微升50mM磷酸钠、pH8.0、300mMNaCl、0.5M咪唑的缓冲液进行两次洗脱。克隆M13的纯蛋白得率比ATP酶-439对照克隆的金属结合位点高1.5倍。因此克隆M13结合得较好并且也可以被更好地洗脱。
Claims (18)
1.一种含有以下通式序列的肽片段:
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys,
其中序列中的变量X1至X6含有以下含义:
X1=选自以下集合的一种氨基酸:Ala,Val,Phe,Ser,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp或者Lys,此时变量X2至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者
X2=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Ile,Phe,Pro,Trp,Tyr,Gln,Glu或者Arg,此时变量X1、X3至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者
X3=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His,此时变量X1、X2、X4至X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者
X4=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Phe,Pro,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Arg或者His,此时变量X1至X3、X5、X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者
X5=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ser,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Lys或者Arg,此时变量X1至X4、X6代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His或者
X6=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Pro,Ser,Cys,Trp,Tyr或者Gln,此时变量X1至X5代表一种选自以下集合的氨基酸:Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro,Ser,Thr,Cys,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His,而且
其中序列中的变量X1至X6中的至少一个变量相互独立地是Gln或者Asn。
2.一种如权利要求1中所述的肽片段,其中变量X1至X6的含义如权利要求1中所述,其中序列中变量X1至X6的至少其中之一相互独立地是Lys或者Arg。
3.一种如权利要求2中所述的肽片段,其中序列中的变量X1至X6相互独立地具有以下含义:
X1=选自以下集合的一种氨基酸:Ala,Val,Phe,Ser,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp或者Lys;
X2=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Ile,Phe,Pro,Trp,Tyr,Gln,Glu或者Arg;
X3=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg或者His;
X4=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Phe,Pro,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Arg或者His;
X5=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ser,Cys,Met,Trp,Asn,Glu,Lys或者Arg;
X6=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Pro,Ser,Cys,Trp,Tyr或者Gln。
4.一种如权利要求1或3任一中所述的肽片段,其中序列中的变量X1至X6含有下面相互独立的含义:
X1=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Ser,Asn,Asp或者Lys;
X2=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Ile,Phe,Pro,Gln,Glu或者Arg;
X3=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ile,Thr,Met,Trp,Tyr,Asn,Asp,Glu,Arg或者His;
X4=选自以下集合的一种氨基酸:Val,Phe,Cys,Met,Trp,Asn,Arg或者His;
X5=选自以下集合的一种氨基酸:Gly,Ser,Cys,Met,Asn,Glu,Lys或者Arg;
X6=选自以下集合的一种氨基酸:Phe,Ser,Cys,或者Tyr。
5.一种如权利要求1或4任一中所述的肽片段,其中序列中的变量X1至X6含有下面相互独立的含义:
X1=Asn;
X2=Gln,Glu或者Arg;
X3=Gly,Thr或者Tyr;
X4=Asn或者Arg;
X5=Gly或者Lys;
X6=CyS。
6.一种具有以下序列的肽片段:
His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys
His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys
His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys
His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys。
7.一种包含一种如权利要求1至6任一中所述的蛋白片段的融合蛋白。
8.一种编码一种如权利要求1至6任一中所述的蛋白片段的核酸片段。
9.一种含有如权利要求8中所述的核酸片段的核酸。
10.一种编码如权利要求7中所述的融合蛋白的核酸。
11.一种含有如权利要求8或10中所述的核酸片段的载体。
12.一种用于制备如权利要求7中所述的融合蛋白的方法,包括将一个如权利要求8中所述的核酸片段与一个编码一种蛋白质的基因融合。
13.一种用于纯化如权利要求7中所述的融合蛋白的方法,包括:
a)让含有融合蛋白的液体与经过固定化的金属离子接触,使得在金属离子和融合蛋白之间形成一个亲和连接,
b)除去液体中没有结合的物质,
c)通过变换液体介质来消除亲和连接而将结合的融合蛋白洗脱下来,以及
d)收集经过纯化的融合蛋白。
14.权利要求1至6中所述的蛋白片段或者权利要求8中所述的核酸片段在纯化蛋白质中的应用。
15.一种用于制备能够与经过固定化的金属离子产生可逆亲和连接的蛋白片段的方法,包括以下步骤:
a)从任何一种编码具有以下序列的蛋白片段的合适的核酸序列开始,制备一个核酸文库:
His-X1-His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys,
其中在这个核酸文库中,序列中的组氨酸和半胱氨酸残基是保守的,
b)将文库的核酸融合到一个报告基因上,这使得可以通过由如此获得的核酸编码的融合蛋白与经过固定化的金属离子的结合来检测这一融合蛋白,以及
c)选择与经过固定化的金属离子的可逆结合能力至少比天然的幽门螺杆菌ATP酶-439中的序列强1.5倍的核酸序列。
16.一种如权利要求15中所述的方法,其中将来源于Aequoriavictoria的egf蛋白用作报告基因。
17.一种用于检测蛋白质的方法,包含抗体在蛋白质的混合物中检测含有如权利要求1中所述的蛋白片段的蛋白质,其中上述的抗体是抗上述的蛋白片段的抗体。
18.如权利要求1至6任一中所述的蛋白片段或者如权利要求8中所述的核酸片段在蛋白质的纯化中的应用。
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