TW555763B

TW555763B - Novel peptide fragments for purifying proteins

Info

Publication number: TW555763B
Application number: TW088108305A
Authority: TW
Inventors: Bernhard Hauer; Rolf D Schmid; Markus Enzelberger; Stephan Minning
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2003-10-01
Also published as: JP2002515250A; NO20005819D0; WO1999060134A1; AU758445B2; ATE351909T1; HUP0102122A2; EP1078072A1; DE19822823A1; IL139272A0; DE59914155D1; NO326308B1; DK1078072T3; KR20010034872A; NO20005819L; KR100577140B1; ZA200007619B; CN1310763A; EP1078072B1; CN1204257C; AU4145099A

Description

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（3) 親和層析術，Ι^·Κά#1，227-251頁於蛋白質純化，編輯了 C. J獅on，L. Ryd6n，1989, VCH出版公司，紐約，is拙〜 89573-122-3 )，表示此種方法無法應用於每一種蛋白質。再度金屬離子可能被洗掉或蛋白質的結合力可能太微弱而在洗滌過程部分損失。選擇性仍未臻滿意。此外裝载純化蛋白質之管柱材料容量於某些案例仍然過低，故須使用大量管材來純化。蛋白質產量仍嫌不足。結果導致不必要的成分。 Volz等人敘述由幽門螺旋桿菌（Hdic〇bacter pyi〇ri)純化 ATPases而未使用額外His標籤序列。ATPases含有天然金屬結合位置因而可藉IMAC純化。發明人本身研究顯示此等結合位置顯示結合親和力過低而無法有效純化全部預定蛋白質。本發明之目的係提供其它藉IMAC進行蛋白質純化之標籤，其不具有如述缺點因而例如可更廣泛使用該等標籤及 /或以更焉密度填裝管材，其顯示較高選擇性如此簡化純化過程。發明人發現此項目的可藉根據本發明之肽片斷達成，具如下通式序列 His-X'-His-X^X^X^Cys-X^X^Cys ^ 此處序列之變數X1至X6定義如後·· x1=胺基酸選自包括 Ala，Val ，Phe，Sei，Met， Trp，Tyr，Asn，Asp或Lys及變數X2至x6爲胺基酸選自包括 Gly，Ala，Val，Leu，Ile，phe， (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

裝---- 訂 #· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X ‘297公f ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 555763 A7 B7 五、發明說明（4)

Pro，Ser，Thr，Cys，Met，Trp，Tyr，Asn， Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His 或 X2=胺基酸選自包括 Val ，lie ，Phe ，Pro ，Ti*p ，

Tyr，Gin，Glu或Arg及變數X1，X3至X6爲胺基酸選自包括 Gly，Ala，Val，Leu，lie，Phe， Pro，Ser，Thr，Cys，Met，Trp，Tyr，Asn , Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His 或 X3=胺基酸選自包括 Gly ，lie ，Thr，Met ，Trp ，

Tyr，Asn，Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His 及變數X1 ，X2，X4至X6胺基酸選自包括Gly ， Ala，Val ，Leu，lie ，Phe，Pro ，Ser，Thr， Cys，Met，Trp，Tyr，Asn，Gin，Asp，Glu， Lys，Arg，His 或 X4=胺基酸選自包括 Val ，Phe，Pro ，Cys ，Met， Trp，Asn，Glu，Arg 或 His 及變數 X1 至 X3， x5，X6胺基酸選自包括Gly，Ala，Val，Leu， lie，Phe，Pro，Ser，Thr，Cys，Met，Trp， Tyr，Asn，Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His 或 X5=胺基酸選自包括 Gly ，Ser，Cys，Met，Trp ， Asn，Glu，Lys或Arg及變數X1至X4，X6胺基酸選自包括 Gly ，Ala ，Val ，Leu ，lie ，Phe ， Pro，Ser，Thr , Cys , Met，Trp，Tyr，Asn， Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His 或 X6=胺基酸選自包括 Phe，Pro，Ser，Cys，Trp，Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------IT--------- 555763 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农五、發明說明（Ο X4=胺基酸選自包括 Val ，Phe，Pro ，Cys ，Met， Trp，Asn，Glu，Arg 或 His，特佳 Val，Phe， Cys，Met，Trp，Asn，Arg 或 His，極特佳 Asn 或 Arg ; X5=胺基酸選自包括 Gly，Ser，Cys，Met，Trp ， Asn，Glu，Lys 或 Arg，特佳 Gly，Ser，Cys， Met，Asn，Glu，Lys 或 Arg，極特佳 Gly 或 Lys ; X6=胺基酸選自包括 Phe，Pro，Ser，Cys，Trp，Tyr 或 Gin，特佳 Phe，Ser，Cys 或 Tyr，極特佳 Cys。序歹J His-X^HisO^-XS-XtCys-X^X^Cys 之變數 X1 至 X6 具有多種彼此無關的較佳定義，多達至多五個變數中個別變數爲一種胺基酸選自包括Gly ，Ala ，Val ，Leu ， He，Phe，Pro，Ser，Thr，Cys，Met，Trp，Tyr， Asn，Gin，Asp，Glu，Lys，Arg，His o 特佳肽片斷爲具有下列序列之片斷 His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys. 前述蛋白質片斷序列係由根據本發明之核酸片斷編碼。就此方面而言需要考慮簡併性遺傳編碼。根據本發明之核酸片斷原則上可存在於任何適當核酸。核酸片斷較佳係以可製備複合核酸序列（=基因構成體）之方式插入載體，該序列編碼根據本發明之融合蛋白質。此等基因構成體爲了 -9- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝---- 訂--- Φ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公f ) 555763 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7) 表現較佳配合容納於可獲得融合蛋白質之儘可能最佳表現的適當寄王生物體内。適當載體爲業界人士眾所周知可參考例如書籍轉殖載體（編輯P〇Uwels ρ· H•等人Elsevier，阿姆斯特丹_紐約·牛津，i%5 ，ISNB 〇 444 9〇4〇18 )。除了貝外，載體表示業界人士已知之全部其它質體例如噬菌組、病毒、轉胞體（transposons)、IS元體、質體、黏接質 '、泉〖生或環形DNA。此等載體可於寄主有機體進行自發複製或染色體複製。根據本發明〈核酸序列表示功能上已經聯結至一或多個調節訊號，較佳可提高基因表現之序列。此等序列可爲3· 及/或5,端調節序列俾促進表現，且係依據選用的寄主有機m及基因選擇俾便獲得最佳表現。此等調節序列例如爲謗導子或阻遏子結合序列，因此可調節核酸的表現。基因構成體額外較佳含有一或多個所謂的促進基因序列以功能万式聯結至啓動基因，如此可儘可能提高核酸序列的表見例如可藉由已經證實的RNA聚合酶與·A間之交互作用進仃。也可額外插入較佳序列於dna序列之3，端，例如其它調節^體或終結子。根據本發明之核酸片斷較佳，入載體因而形成融合蛋白質之N端區。但也可位於c 端’或者位於蛋白質内_，但於此等情況下蛋白質功能不受影響而不再切斷融合蛋白質。調節序列意圖使基因之特異性表現及蛋白質表現變成可 =如此表示例如依據寄主有機體而定，該基因僅於後表現或過度表現，或該基因爲立即表現及/或 " .............. . 10 _ 本紙張尺度適用？準―規格⑵〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

555763 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8) 現0 較佳調節序列例如存在於啓動基因如cos，tac，trp， tet ’ trp-tet，Ιρρ，lac，lpp-lac，laclq，T7，T5， T3，gal，trc，ara，SP6，λ_Ρκ 啓動基因或於λ-PL 啓動基因，其較佳用於革蘭氏陰性菌。又較佳調節序列例如存在於革蘭氏陽性啓動基因amy及SP02 ，於酵母或眞菌啓動基因 ADC1 ’ MFa ，AC，P-60，CYC1 ，GAPDH， TEF，rp28 ，ADH，或於植物啓動基因caMV/35S ， SSU，OCS，lib4，USp，STLS1，B33，nos 或於優昆丁（ubiquitin)或費索林（phaseolin)啓動基因。又較佳就此方面而言爲得自例如Hansenula之丙酮酸脱羧酶以及甲醇氧化酶之啓動基因。可使用人工啓動基因供調節。此外調節序列或因子較佳對引進基因的表現具有有利效果，因而提高其表現。如此調節元體的促進可經由使用強力轉錄訊號如該啓動基因及/或促進基因而於轉錄層面進行。但轉譯的促進例如也可藉由改良mRNA之穩定性達成。根據本發明之核酸序列較佳也含訊號，因此蛋白質可分泌於培養基或分泌入細胞腔室内。値得一提之此類型序列 <例有典型訊號序列例如〇mpA (大腸桿菌膜蛋白）之訊號序列。此外可存在有其它較佳序列例如從因子序列或使用葉可（=酵母人造染色體）。根據本發明之基因構成體（=核酸序列）較佳額外含有序列，該等序列可由融合蛋白質之Ν或c端較佳由Ν端去 •11· 本紙張尺度適用中圃圇茇標準（CNS)A4賴槐mn dew八粒 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製除根據本發明之具有冑述序列之蛋 … 碼例如宽廣多種|占綠、片斷。此等序列編酶，人腎素，幾肤酶A，凝血酶，=白因二&，腸激酶，木瓜酶，胞質素，胃 ^ 一肽基肽位置爲因子Xa、人瞥去 ^ 〇| ^ 仪住d衣酶之割裂尸晋、一肽酶、羧肽酶A或腸激 ° a，原因爲此等酶具有高度特異性，因此可避免非期望地消化待純化的蛋白質。若使用其它蛋白酶，則須小心並無任何割裂位置係於待純化之蛋白質内部。蛋白質片仕斷也可於甲酸存在下使用漠化氰[例如2·(2._基苯基亞續醯基）3U -甲基’朵琳鏘，輕胺等]割裂。但於此種情=下通常需要再摺叠蛋白質，結果導致此種方法較不佳。藉外切蛋白酶消化（於動態控制之下）去除蛋白質片斷亦屬可旎。但如此通常導致產物混合物。較佳使用此等割 I位置馬可刪除蛋白質片斷而未留下蛋白質片斷殘基於待，化蛋白質又割裂位置。若根據本發明之蛋白質片斷可於融合蛋白質忍受而未喪失功能且無其它缺點，則可免除脱離蛋白質片斷之特定位置。適當載體原則上爲全部可於可能的原核細胞或眞核細胞表現的載體。就此方面而言可使用僅於一種屬複製載體，或可於數種複製的載體（稱作穿梭載體）。較佳載體實例爲質體如大腸桿菌質體pEGFP ，pLG338 ，pACYCIM ， pBR322，puci8，pUC19，pKC30，pRep4，pHSl， pHS2，pplc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pm_ IIlU3-Bl，Xgtll 或 pBdCI，較佳 pEGFP ;鏈絲菌 pIJl〇l， 12· 本紙張尺/艾適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]〇x 297公釐）裝--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

癱 555763 A7 B7 五、發明說明（10) pIJ364 ， pIJ702 或 pIJ361 ;桿菌 pUBllO ， pC194 或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) pBD214 ;細梭菌 pSA77 或 pAJ667 ;眞菌 pALSl，pIL2 或 pBB116 ;酵母菌 2μηι ，pAG-1 ，YEp6 ，YEpl3 或 pEMBLYe23 ，或植物 pLGV23 ，pGHlac+，pBIN19 ， pAC2004或pDH51 。該等質體表示少數可選用的質體。又其它質體爲業界人士眾所周知可參考前述書籍轉殖載體 (編輯Pouwels Ρ· H·等人Elsevier ，阿姆斯特丹紐約牛津，1985, ISBN 0 444 904018)。載體之另一具體例中，根據本發明之核酸序列也可優異地以線性DNA形式引進微生物，可藉非同源或同源重組整合於寄主有機體基因組。此種線性DNA係由直線化載體組成例如質體或僅由核酸組成，亦即核酸片斷及蛋白質基因（=融合蛋白質基因），及若屬適當其它調節序列組經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣適用於根據本發明之基因構成體之寄主有機體原則上皆爲原核有機體或眞核有機體。較佳使用之寄主有機體爲微生物例如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌，原囊菌，眞菌，酵母菌，動物或植物細胞如果蠅特別黃猩果蠅（D. melanogaster)，小鼠，斑馬魚或菸草。較佳使用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌、眞菌或酵母菌，特較佳爲埃希氏样菌 (Escherichia)，桿菌（Bacillus)，鏈絲菌（Streptomyces)，麴菌 (Aspergillus)或釀母菌（SaccharGmyces)種屬，特佳爲大腸桿菌。特佳使用下列載體與寄主有機體的組合，例如大腸样菌 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 555763 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ______ _ - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（2】〇 X 297公f ) 五、發明說明（1S) =η)高度穩定’可藉光氧化漂白，以及可藉氧化及弱還劑如2%親乙醇漂白。蛋白質於高於37。(：時螢光下降。同樣適合作爲通報子基因者爲gfp_uv(藍榮光）及响光）蛋白。適當序列之選擇方式係經由比較下列天然幽門螺旋捍菌 ATPase-4% 序列 His_ne_His如·Leu Asp Cy^_〜p_cys 對制動金屬離子之結合親和力而選用。根據本發明之蛋片斷序列顯示對制動金屬離子之可逆性結合至少強Η 倍，較佳至少兩倍及特佳至少3倍。較佳序列於純化後可獲件蛋白質產量至少、20%，較佳至少3〇%，特佳 40%，極特佳至少5〇%。 a本發明之筛檢核酸存庫之方法適用於自動化。此種方法容易於所謂之高產量篩檢試驗大量核酸片斷及蛋白質之金屬離子結合親和力。蛋白質易使用本發明之蛋白質片斷檢測。本發明之蛋白質檢測方法中’包含具有前述本發明之蛋白質片斷之蛋白質片斷於蛋白質混合物的個別蛋白質可透過針對該蛋白質架構之抗體檢測。融合蛋白質之檢測較佳係透過針對蛋白質片斷(標籤)之單株或多株抗體進行。蛋白質混合物較佳係於檢測前藉層析術或電泳分選及随後藉習知方法（參考 Sambrook等人）移轉（打墨點）至適當膜（例如pvDF或確基纖維素）。然後此膜以針對標籤之抗體培育。較佳將膜洗數次，然後透過與第二抗體之特異性反應㈣結合㈣'，例如酶接合（例如驗㈣酸酶，過氧化酶等），且係針對西 -21- ，裝--------訂---------^11^· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

555763 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（l9) 方墨點法或免疫墨點法之第一當 ^ 、 $數E。對應抗體爲市面可件。於使用磁性粒子時可冊1 一吁了删除洗滌，抗體塗覆磁性粒子可猎磁鐵純化。外本發明之蛋白質片斷具有優於習知蛋白質檢測用Hls棒，之優點，前者具有強力抗原效果，如此更適合產生抗標戴之抗體。本發明將藉下列實例進一步舉例説明。實例：得自瑞典烏普蘇拉法瑪西亞公司之螯合西法羅斯快速流用於試驗與金屬螯合管柱（制動金屬離子）之結合。安比西林（Ampicillin)，咪唑，EDTA及所有其它試劑係購自Fiuka (% 士伯克）。DNA凝膠萃取套件組，迷你質體套件組及布雷賓（Prepspin)質體套件組得自Qiagen公司（德國希藍），限剪酶，DNA改質酶，T4-DNA接合酶及Taq聚合酶得自MBI Fennentas (德國聖里筇羅特）。Der標籤染料循環疋序列套件組係講自應用生物系統公司（德國懷特斯塔）。大腸桿菌種系 DH5a (F endAl hsdR17 [rk\ mk+] supE44 thil λ gyrA96 relAl Δ (argF laczya) U169)用於轉殖實驗。含於 egf蛋白質之質體係購自Clonetech美國公司。大腸样菌種系於羅力伯大尼（Luria-Bertani)培養基（LB)含100微克/毫升安比西林於37 °C培養用於選擇可使用egfp載體轉形的純系。溶解緩衝液含有50 mM磷酸鈉緩衝液pH 8.0 ，300 mM氯化納，1毫克/毫升溶解酶（Lysozym)及1 mM PMSF (苯基甲烷磺醯氟爲特異性胰蛋白酶及乳糜胰蛋白酶抑制 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

555763 A7 B7 五、發明說明（21) 聚合酶連鎖反應之條件如下·· 混合物： 8 微升dNTP混合物(200微莫耳） 10 微升l〇x色莫波(ThermoPol)緩衝液(新英格蘭生物實驗室) 1 微升（100微微莫耳)引子1 1 微升（100微微莫耳)引子2 1 微升（1〇〇毫微克)egfy質體 79.5微升水 1 微升深部通風(Deep Vent)聚合酶(新英格蘭生物實驗室） PCR計劃 95°C7分鐘 95 °C 1分鐘 56°C 1 分鐘 30x 72°C3分鐘 72°C7分鐘 PCR產物各自以Ncol與Notl消化，並接合至已經使用相同酶消化的egfp載體俾便排除載體的突變（參考圖1 )。 PCR載體接合用於轉形大腸桿菌。轉形株接種於含100微克/毫升安比西林之LB瓊脂並於37 °C培育。實例2 :細胞溶解產物之培養條件及製備顯示螢光之轉形菌落及若干未顯示螢光之菌落經選擇並於50毫升含100微克/毫升安比西林之LB培養基培養。選用可顯示螢光的菌落作爲高產量篩檢，且於無菌微力價平板培養，該平板含有250微升含100微克/毫升安比西林 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

--------訂·-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 555763 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 —_________Β7 ___ 五、發明說明（22) 之LB培養基。培養後培養醪經離心。丸粒再度懸浮於2 晕升溶解缓衝液，於冰上培育2〇分鐘然後以超音波崩解 (兩次5分鐘’使用布蘭森（Brans〇n)超音波機25〇)。離心 (I5分鐘，4°C，20000 xg)後各egfp突變株於上清液獲得。全邵選用之純株皆決定序列（參考表I及π)。未顯示榮光之純株於序列中含有中止字碼子，故未表現功能蛋白 % (參考表 I ’ Α8，Α13，M16a，Ζ4，Ζ11 及 Ζ13)。爲了定量結合蛋白質，全部實驗中進行螢光測量且於寬廣範圍與gfp濃度求出交互關聯（參考圖2 )。實例3 :使用得自Qiagen公司之Ni_NTA管柱進行低產量篩檢 600微升溶解細胞載於Νί·ΝΤΑ管柱，以600微升洗滌溶液（50 mM磷酸鈉緩衝液，ρΗ 8.0，250 mM氯化鈉）洗兩次然後以0·7 Μ咪唑溶液溶離。實例4 :使用過濾膜平板作高產量篩檢過濾、膜微力價平板（Multiscreen 5微米；德國莫斯漢， Millipore公司供給）用於高產量篩檢。25〇微升經過授拌之螯合西法維斯懸浮液置於過濾、膜平板之各孔三次。各次添加後離心西法羅斯（2分鐘，23。(：，350 rpm)。進一步步驟係於Beckmann Biomek 2000機械人進行。孔内之迷你管柱使用250微升水洗兩次。然後西法羅斯裝填25〇微升金屬鹽溶液且使用200微升緩衝液（50 mM磷酸鈉，pH 8·〇，250 mM氣化鈉）平衡三次。〇.3]^氯化鎳，〇.3撾硫酸銅或0·3 Μ氣化鋅溶液用於各混合物（裝填金屬離子）。適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Gx 297公餐） "----— (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) ▼裝--------訂--- Φ 555763 A7 Β7 五、發明說明（23) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 使用水性未經緩衝之金屬鹽溶液。250微升細胞溶解產物上清液置於各迷你管柱上。然後管柱以250微升平衡緩衝液洗兩次。結合蛋白質以2 X 100微升〇·5 Μ咪唑於平衡緩衝液溶離。過濾膜之螯合物西法羅斯可以250微升50 mM EDTA ，1Μ氯化鈉於水再生以及用於進一步篩檢實驗0 實例5 : IMAC實驗習知由玻璃管柱’二脈動泵供給溶液，紫外光偵測器

(LKB UV-MII)，印表機（LKB RIC 102)及溶離分收集器（LKB 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 FRAC-200)組成的層析系統選用於實驗。全部裝置皆來自法瑪西亞公司。管柱裝填螯合西法羅斯快速流凝膠（法瑪西亞）使用7床容積去離子水洗滌及對金屬離子裝填7床容積〇·3 Μ氣化鎳溶液。然後管柱經洗滌及以7床容積 IMAC緩衝液（50 mM磷酸鈉，pH 8.0，250 mM氯化鈉）平衡。1毫升細胞溶解產物樣本以L5毫升/分鐘裝載於管柱及以1〇床容積IMAC緩衝液洗滌。透過梯度增高溶離結合蛋白質，使用0.5% 0.5 Μ咪唑溶液/毫升溶離溶液及最終爲5床容積〇·5 Μ咪唑/水溶液。蛋白質溶離分藉紫外光偵測識別及收集。完成後管柱經洗滌及以5〇 mM EDTA/1 Μ 氣化鈉溶液再生。此種洗滌步驟可由管柱脱離金屬、結合細胞殘餘物及蛋白質。溶離分接受光學及光譜術檢驗。若干研究之純株未顯示與母質結合（參考表1 ， M15 ， M16)，而其它純株顯示結合良好（參考表I ，M13 ，Z5 及Z7)。純株Ml3及Z5係以鮮明帶由管柱溶離，而純株 •26- 本紙張尺/艾過用甲國國冢枞準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公釐 555763 A7

B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（24) Z7於管柱有玷染。實例6 : egfp野生型與His標籤之比較實驗純株M13與egfp野生型蛋白質及尋常His標籤於比較例實驗比較。egfp野生型蛋白質未結合至金屬螯合柱。洗滌柱後柱上不再檢測得螢光。純株M13於鮮明帶結合至管柱，而His標籤蛋白質結合於全柱。此乃歸咎於親和力較低，最終導致柱容量較低。M13之例之蛋白質產率爲 56%，高於His標籤之48%。表I :與鎳金屬螯合物柱之結合純株胺基酸序列 A6 His Gly His Glu Gly Arg Cys Lys Glu Cys gfp A8 His Cys His Pro Glu Leu Cys Stop Leu Cys gfp A13 His Leu His Ser lie Gly Cys Pro Stop Cys gfp Ml 3 His Asn His Arg Tyr Gly Cys Gly Cys Cys gfp M14 His Ser His Ser Val Gly Cys Phe Phe Cys gfp Ml 5 His Gly His Thr Leu Ser Cys Gly Leu Cys gfp M16 His Ser His Thr Leu Arg Cys Lys Gly Cys gfp Ml 6a His Ser His Stop Leu Arg Cys Lys Gly Cys gfp Z4 His Stop His Asn Stop Val Cys Ala Thr Cys gfp Z5 His Arg His Gly Thr Asn Cys Leu Lys Cys gfp Z7 His He His Gin Ser Asn Cys Gin Val Cys gfp Zll His Thr His Ala Ser Gly Cys Stop Stop Cys gfp Z13 His Cys His Thr Trp Cys Cys Asn Stop Cys gfp 純株A6，A10，M13，Z5及Z7良好結合至金屬螯合物 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 555763 A7

B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（25) 柱，而純株M14，M15及M16未顯示結合。表II :於高產量篩檢進一步藉螢光偵測決定序列之純株純株胺基酸序列 A1 His Gly His Met Glu Arg Cys Leu Val Cys gfp A2 His Lys His Ala Arg Ser Cys Met Gly Cys gfp A3 His Phe His Thr Val Phe Cys Phe Ser Cys gfp A4 His Arg His Arg Gly Met Cys Thr Ala Cys gfp A12 His Asp His Arg Gly Val Cys Gly Leu Cys gfp A14 His Asp His Glu Arg Leu Cys His Asn Cys gfp X8 His Gly His Gly Asn Arg Cys Cys Gly Cys gfp X9 His Arg His Gly Thr Ala Cys Met Asp Cys gfp XII His He His He Met Thr Cys Leu Ser Cys gfp X12 His Thr His Pro Arg Ser Cys Ala Glu Cys gfp X15 His Gly His Asp Arg Thr Cys Arg Gly Cys gfp X16 His Arg His Ala lie Ser Cys He Gly Cys gfp X17 His lie His Arg Gly Asp Cys Tyr Glu Cys gfp XI8 His His His Gly Ser Thr Cys Pro Thr Cys gfp X19 His His His Phe His Ser Cys Phe Tyr Cys gfp Z8 His Lys His Val Asp His Cys Gly Arg Cys gfp Z9 His Ser His Leu Thr Leu Cys Leu Gly Cys gfp Z10 His Thr His Gin Ser Gin Cys Gly Arg Cys gfp Z14 His Arg His Leu Phe Trp Cys Ser Glu Cys gfp -28- -----------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 555763 A7 B7 五、發明說明（26) 實例7 :金屬結合親和力 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 多種純株顯示偏好結合至Ni2+或Cu2+。於M13之例未見與Zn2+之任何結合。使用鎳螯合物柱，純株M13經由與 His標籤比較顯示更佳的蛋白質純化效果。相反地，後者與M13於銅螯合物柱比較可獲得較純產物，原因爲二例中與柱材料之結合極爲強力，銅離子可藉激烈溶離條件洗出。結果導致產物污染。實例8 ·· ATPase-439序列與本發明之蛋白質片斷之比較實驗 ATPase-439比較用純株係以類似實例1及6之方式進行。使用的引子爲如下引子 5,-GCAATACCATGGGGCATATTCATAATCTTGATTGTCCTGATTGT-3, 。其它引子及P C R條件述於實例1。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實驗係使用Qiagen Ni-NTA離心套件組於自然條件下進行，溶離係如此等條件所述進行；已經裝填的管柱使用 600微升50 mM磷酸鈉緩衝液，pH 8.0，300 mM氯化鈉平衡及於2000 rpm (420 X g)離心2分鐘。然後施加600微升溶離產物並離心2分鐘。使用600微升50 mM磷酸鈉緩衝液，pH 8.0，300 mM氯化鈉洗滌兩次。然後兩次溶離使用600微升50 mM磷酸鈉緩衝液，pH 8.0，300 mM氯化鈉，〇·5 Μ咪唑。使用純株M13之純蛋白質產量比 ATPase-439比較純株之金屬結合位置高1.5倍。如此純株 M13之結合較佳且溶離情況較佳。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公釐）

Claims

B8 年用曰 C8 D8 修止蝻充 555763 第088108305號專利申請案中文申請專利範圍替換本(92年8月）

六、申請專利範圍 1. 一種具如下通式序列之肽片斷， His-X^His-X^X^X^Cys-X^X^Cys 其中序列中變數X1至X6各分別具有如下定義： X1=選自下列胺基酸 Ala，Val，Phe，S er，Met，Trp， Tyr，Asn，Asp 或 Lys ; X2=選自下列胺基酸 Val，lie，Phe，Pro，Trp，Tyr， Gin，Glu 或 Arg ; X3=選自下列胺基酸 Gly，lie，Thr，Met，Trp，Tyr， Asn，Gin，Asp，Glu，Lys，Arg 或 His ; X4=選自下列胺基酸 Val，Phe，Pro，Cys，Met，Trp， Asn，Glu，Arg 或 His ; X5=選自下列胺基酸 Gly，Ser，Cys，Met，Trp，Asn， Glu，Lys 或 Arg ; X6=選自下列胺基酸 Phe，Pro，Ser，Cys，Trp，Tyr 或 Gin ；其中序列中之至少一變數X1至X6各分別為Gin或 Asn 〇 2·如申請專利範圍第1項之肽片斷，其中於序列之變數 X1至X6各分別具下列定義： X1==選自下列胺基酸Phe，Ser，Asn，Asp或Lys ; X2=選自下列胺基酸 Val，lie，Phe，Pro，Gin，Glu 或 Arg ; X3=選自下列胺基酸 Gly，lie，Thr，Met，Trp，Tyr， Asn，Asp，Glu，Arg 或 His ; 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 555763 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 X4=選自下列胺基酸 Val，Phe，Cys，Met，Trp，Asn， Arg 或 His ; X5=選自下列胺基酸 Gly，Ser，Cys，Met，Asn，Glu， Lys 或 Arg ; X6=選自下列胺基酸Phe，Ser，Cys或Tyr。 3.如申請專利範圍第1項之肽片斷，其中序列之變數X1 至X6各分別具下列定義： X1= Asn ； X2= Gin，Glu 或 Arg ; X3=:Gly，Thr 或 Tyr ; X4= Asn 或 Arg ; X5= Gly 或 Lys ; X6= Cys 〇 4·如申請專利範圍第1項之肽片斷，具有如下序列 His-Gln-His-Glu-Gly-Arg-Cys-Lys-Glu-Cys His-Asn-His-Arg-Tyr-Gly-Cys-Gly-Cys-Cys His-Arg-His-Gly-Thr-Asn-Cys-Leu-Lys-Cys His-Ile-His-Gln-Ser-Asn-Cys-Gln-Val-Cys 〇 5· —種融合蛋白質，其係由如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽片斷與其它蛋白質所組成。 6· —種核酸片段，編碼如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽片斷。 I 7. 一種核酸，其.編碼如申請專利範圍第5項之融合蛋白 !質。 I -2-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) C8 D8 六、申請專利範圍 & —種製備如申請專利範圍帛5項之融合蛋白質之方法’包含融合如中請專利範圍第6項之核酸片段至編碼蛋白質之基因。種純化如申請專利範圍第5項之融合蛋白質之方法，包含 ^使含有融合蛋白質之液體接觸固定化金屬離子，使金屬離子與融合蛋白質間可形成親和鍵聯， b)去除於液體中之未結合物質， C)藉由改變液體介質破壞親和鍵聯而溶離出結合的融合蛋白質及 A 收集經純化的融合蛋白質。 p如中請專利範圍第i項之肽片斷，用於純化蛋白質。 U如申請專利範圍第6項之核酸片斷，用於純化蛋白質。 12 — 種製備肽片斷之方法，該蛋白質片斷可與固定化金屬離子進入可逆性親和聯結，該方法包含下列步驟： a) 由任何編碼下述序列肽片斷之合適核酸序列開始，製備一核酸存庫， His_X、His-X2-X3-X4-Cys-X5-X6-Cys 其中該序列之組胺酸及半胱胺酸殘基係保留於該核酸存庫中， b) 將該存庫之核酸融合至通報子基因，因此透過其結合至固定化金屬離子而可檢測由該所得核酸編碼的融合蛋白質及 L尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210X297公釐) 555763 8 8 8 8 A BCD 々、申請專利範圍 C) 選擇與固定化金屬離子具有可逆性結合之核酸序列，其結合至少比天然幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori) ATPase-439 之序列強 1.5 倍0 其中X1、X2、X3、X4、X5及X6係如申請專利範圍第1項所定義。 13·如申請專利範圍第1 2項之方法，其中使用得自 Aequoria victoria之egf蛋白質作為通報子基因。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 χ 297公釐)