NO326308B1 - Peptidfragmenter og anvendelse derav, samt fusjonsprotein, nukleinsyrefragment, vektor og fremgangsmate for fremstilling, rensing og detektering av proteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye peptidfragmenter, fusjonsproteiner omfattende peptidfragmentene, fremgangsmåter for fremstilling av disse og anvendelse av peptidfragmentene. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for rensing av fusjonsproteiner og en fremgangsmåte for detektering av proteiner.

Oppfinnelsen vedrører videre nukleinsyrer som koder for peptidfragmenter eller for fusjonsproteiner og vektorer som omfatter nukleinsyrene.

Det er blitt mulig gjennom moderne molekylær biologi å fremstille nesten hvilke som helst proteiner, peptider eller derivater derav i nesten ubegrensede mengder. I denne sammenhengen har rensing av proteiner ofte vist seg å være begrensende og som oftest ineffektivt og er dermed generelt den kostnadsbestemmende faktoren.

Dette er grunnen til at et antall teknikker for rensing av proteiner er blitt utviklet. Teknikken normalt anvendt for å rense proteiner fra cellesupernatanter, rå celleekstrakter eller celler utgjør for eksempel saltpresipitering eller presipitering med organiske løsningsmidler, ultrafiltrering, dialysering, gelelektroforese, isoelektrisk fokusering, kromatofokusering, ionebytte eller gelkromatografi, hydrofobisk kromatografi, immunopresipitering eller IMAC (= Immobilized Metal Affinity Chromatography).

Enkle metoder kan bli anvendt for rensing, med en kombinasjon av forskjellige teknikker er vanligvis nødvendig. Konvensjonelle rensningsmetoder er for eksempel beskrevet i lærebøkene Protein Purification Process Engineering (Ed. R.G. Harrison, 1994, Marcel Dekker, Inc., New York, page 209 - 316, ISBN 0-8247-9009-X), Protein Purification (Ed. R.K. Scopes, 1994, Springer Verlag New York, chapter 4 - 7, ISBN 0-387-94072-3) og Methods for Protein Analysis (Ed. R.A. Copelog, 1994 Chapman & Hall, page 59-112, ISBN 0-412-03741 -6). Det er viktig for rensing av proteinene at rensingen foregår under betingelser som er så svake som mulig, og som er så selektive som mulig og så hurtige som mulig. Videre bør proteintapene bli holdt så små som mulig. Mange av metodene for proteinrensing er ikke tilstrekkelig selektive og bare egnede for små mengder protein og/eller meget dyre.

Metoder for rensing av proteiner ved IMAC (= Immobilized Metal Affinity Chromatography) beskrevet avPorath et al. (Nature, Vol.258,1975: 598 - 599) er et kompromiss mellom angitte krav som skal bli oppfylt ved optimal rensing. Denne metoden har derimot fortsatt noen ulemper. Ikke alle metallioner bindes like godt til bærematerialet slik at noen ioner blir vasket ut og dermed kontaminerer det nødvendige produktet. Mange proteiner bindes ikke i det hele tatt til kromatografimaterialet og kan derfor ikke bli renset, eller bindes for svakt slik at de til og med blir eluert i løpet av de nødvendige trinnene for vasking av kolonnematerialer. Dette resulterer i uønskede tap av produkt. På grunn av at selektiviteten vanligvis er utilstrekkelig for en ett-trinns rensning, i kontrast til rensinger ved biospesifikke affinitetsrensningsmetoder så som for eksempel rensing med antistoffer, er ytterligere rensningstrinn nødvendige.

For å kunne rense en rekke proteiner ved anvendelse av denne metoden er forskjellige såkalte tagger blitt utviklet, så som polyhistidine, His-Trp, His-Tyr or (His-Asp)n (see Sporeno et al., J. Biol. Chem. 269 (15), 1994:10991 -10995, Le Grice et al., Eur. J. Biochem., 187 (2), 1990: 307 - 314, Reece et al., Gene, 126 (1), 1993:105 -107, De Vos et al., Nucl. Acid. Res., 22 (7), 1994:1161 -1166, Feng et al., J. Biol. Chem. 269 (3), 1994: 2342 - 2348, Hochuli et al., Biotechnology, 1988:1321 -1325, Patwardhan et al., J. Chromatography A, 787,1997: 91 -100, Hutchens et al., J. Chromatography, 604,1992:133-141). Disse taggene blir koblet til proteinet som skal bli renset ved hjelp av molekylær biologi på nukleinsyrenivået. Det har vært mulig gjennom disse taggene å forbedre proteinrensningen ytterligere i noen områder selv om denne metoden fortsatt har noen ulemper. Det er fortsatt ikke mulig å forutsi påliteligheten når det gjelder om et protein kan bli renset ifølge denne metoden (se Immobilized Metal lon Affinity Chromatography, L. Kågedal, side 227 - 251 in Protein Purification, Eds. J.C. Janson, L. Rydén, 1989, VCH Publishers, Inc., New York, ISBN 0-89573-122-3), som betyr at denne metoden ikke kan anvendes selv ikke på hvert protein. Metallionet kan bli vasket ut eller proteiner kan bli bundet så svakt at de delvis blir borte i løpet av vasketrinnene. Selektiviteten er i tillegg fortsatt utilfredsstillende. I tillegg er kapasiteten til kolonnematerialet for belastning med proteinene som skal bli renset i noen tilfeller for lav slik at en stor mengde kolonnemateriale må bli anvendt i en rensning. Proteinutbyttet er fortsatt utilfredsstillende. Dette fører til unødvendige kostnader.

EP 282042 beskriver rekombinante fusjonsproteiner med peptider inneholdende His- og Asp-residier som har en høy affinitet for immobiliserte metallioner.

J. Volz et al., Journal of Chromatography A, vol. 800,1998, s. 29-37 beskriver polypeptider inneholdende spesifikke peptider av His- og Cys-residier som har en høy affinitet for Ni og Cu-ioner.

Volz et al. har beskrevet rensing av ATPaser fra Helicobacter pylori uten anvendelse av en ytterligere His-tag sekvens. Disse ATPasene inneholder naturlige metallbindingsseter som gjør rensing ved IMAC mulig. Våre egne studier har vist at disse bindingsstudiene utviser en bindingsaffinitet som er for lav for effektiv rensing av alle ønskede proteiner.

Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe ytterligere tagger for proteinrensing ved IMAC som ikke har ovennevnte ulemper og som følgelig gjør det mulig for eksempel å anvende taggene i mer utstrakt grad og/eller applisere kolonnematerialet med høyere tetthet, og som utviser en høyere selektivitet og som dermed forenkler rensingen. Vi har oppdaget at den hensikten blir oppnådd av peptidfragment, kjennetegnet ved at det har den generelle sekvensen His-X<1->His-X<2->X<3->X<4->Cys-X<5->X<6->Cys hvor variablene X<1> til X<6> i sekvensen har følgende betydninger uavhengig av hverandre: X<1> = Asn;

X<2>=Gln, Glu eller Arg;

X3 = Gly, Thr eller Tyr;

X<4>= Asn eller Arg;

X<5>=Gly eller Lys;

X<6>=Cys.

Den generelle sekvensen His-X<1->His-X2-X<3->X<4->Cys-X<5->X<6->Cys korresponderer med SEQ ID No:1 hvori X<1> korresponderer med aminosyrene betegnet Xaa i posisjon i SEQ ID No: 1, og X<2> korresponderer med Xaa i posisjon 4, X<3> korresponderer med Xaa i posisjon 5, X<4> korresponderer med Xaa i posisjon 6, X<5> korresponderer med Xaa i posisjon 8 og X<6> korresponderer med Xaa i posisjon 9. Aminosyrene nevnt ovenfor for X<1> til X<6> kan representere korresponderende aminosyrer betegnet Xaa i SEQ ID No: 1.

Spesielt foretrukne peptidfragmenter er fragmenter med sekvensen

Angitte sekvenser tilsvarer i hvert tilfelle sekvensene SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, og SEQ ID NO:5.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det omfatter et proteinfragment ifølge krav 1.

Det er videre beskrevet nukleinsyrefragment, kjennetegnet ved at det koder for et proteinf ragment ifølge krav 1.

Nukleinsyren ifølge oppfinnelsen omfatter et nukleinsyrefragment ifølge krav 4.

Ifølge oppfinnelsen koder nukleinsyren for et fusjonsprotein ifølge krav 3. Oppfinnelsen vedrører videre vektor, kjennetegnet ved at den omfatter et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 eller 6.

Ovennevnte proteinfragmentsekvens blir kodet av nukleinsyrefragmentene ifølge oppfinnelsen. Det må tas hensyn til den degenererte genetiske koden i denne sammenhengen. Nukleinsyref ragmentene ifølge oppfinnelsen kan i prinsippet være tilstede i en hvilken som helst egnet nukleinsyre. Nukleinsyref ragmenter blir fortrinnsvis skutt inn i vektorer på en slik måte at det er mulig å danne komposittnukleinsyre-sekvenser (= genkonstruksjoner) som koder for fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen. Disse gen-konstruksjonene kan for ekspresjon fordelaktig bli huset i en egnet vertsorganisme som gjør optimal ekpressjon av fusjonsproteinet mulig. Egnede vektorer er velkjente for fagfolk og kan for eksempel finnes i boken Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Bortsett fra plasmider betyr vektorer alle andre vektorer kjent for fagfolk, så som for eksempel, fag, vimser, transposoner, IS elementer, plasmider, kosmider, lineært eller sirkulært DNA. Disse vektorene kan gjennomgå autonom replikasjon eller kromosomal replikasjon i vertsorganismene.

Nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen betyr sekvenser som er blitt funksjonelt koblet til en eller flere regulatoriske signaler, fortrinnsvis for å øke gen-ekspresjonen. Disse kan være 3' og/eller 5' terminale regulatoriske sekvenser for å forsterke ekspresjonen og er valgt for optimal ekspresjon avhengig av valgt vertsorganisme og gen. Disse regulatoriske sekvensene er for eksempel sekvenser hvortil indusere eller repressorer bindes og som dermed regulerer ekspresjonen av nukleinsyrene. Genkonstruksjonen kan i tillegg fortrinnsvis inneholde en eller flere såkalte enhancersekvenser funksjonelt koblet til promoteren og disse gjør øket ekspresjon av nukleinsyresekvensen mulig. Dette kan for eksempel foregå ved en godkjent interaksjon mellom RNA polymerase og DNA. Det er også mulig å sette inn ytterligere fordelaktige sekvenser i 3' enden av DNA sekvensene så som andre regulatoriske elementer eller termineringsmidler. Nukleinsyrefragmenter fra oppfinnelsen blir fortrinnsvis skutt inn i vektoren på en slik måte at de danner den N-terminale regionen av fusjonsproteinet. Det kan derimot også være lokalisert i den C-terminale enden, eller være lokalisert innenfor proteinet, men i dette tilfellet må funksjonen til proteinet ikke være påvirket, og utspaltning fra fusjonsproteinet er ikke lenger mulig.

Regulatoriske sekvenser er ment å danne spesifikk ekspresjon av genene og proteinekspresjon mulig. Dette kan for eksempel bety, avhengig av vertsorganismen, at genet blir uttrykt eller overuttrykt kun etter induksjon,.eller at det blir øyeblikkelig uttrykt og/eller overuttrykt.

Fordelaktige regulatoriske sekvenser er for eksempel tilstede i promotere så som cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, lacl<q*> T7, T5, T3, gal, tre, ara, SP6, I-Pr promotere eller i I-Pl promoter, som fortrinnsvis blir anvendt i gram-negative bakterier. Ytterligere fordelaktige regulatoriske sekvenser er for eksempel tilstede i gram-positive promotere amy og SP02, i gjær eller sopp promotere ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH eller i plantepromoterene CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos eller i ubiquitin or faseolin promoteren. Også fordelaktig i denne sammenhengen er promotere av pyruvat dekarboksylase og metanoloksydase fra for eksempel Hansenula. Det er også mulig å anvende kunstige promotere for regulering.

Regulatoriske sekvenser eller faktorer kan videre fortrinnsvis ha en fordelaktig effekt på ekspresjonen av det introduserte genet og dermed øke det. Forsterkning av regulatoriske elementer kan fordelaktig foregå på transkripsjonsnivå ved anvendelse av sterke transkripsjonssignaler så som nevnte promotere og/eller enhancere. Forsterkning av translasjon er derimot også mulig ved for eksempel å forbedre stabiliteten til mRNA.

Nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen inneholder også fortrinnsvis signaler som gjør det mulig at proteinene blir utskilt i mediet eller inn i cellerommene. Eksempler på sekvenser av denne typen som kan bli nevnt er typiske signalsekvenser så som for eksempel signalsekvensen til ompA (E. colimembranprotein). Det er i tillegg mulig at andre fordelaktige sekvenser er tilstede, så som sekvensen til a faktoren eller for YAC (= gjærkunstig) [sic] kromosomer.

Genkonstruksjoner (=nukleinsyresekvenser) ifølge oppfinnelsen inneholder i tillegg fortrinnsvis sekvenser som gjør det mulig å eliminere proteinfragmenter som har ovennevnte sekvens ifølge oppfinnelsen fra N eller C terminal av fusjonsproteinet, fortrinnsvis fra den N-terminale enden. Disse sekvensene koder for eksempel for spaltningsseter for en rekke proteaser for eksempel for faktor Xa, enterokinase, humanrenin, karboksypeptidase A, trombin, trypsin, dipeptidyl peptidaser, papain, plasmin, pepsin eller andre proteaser. Foretrukne spaltningsseter er for eksempel Xa, human renin, dipeptidyl peptidases, carboxypeptidase A eller entero- kinase, på grunn av at disse enzymene har en høy spesifisitet og dermed kan uønsket spaltning av proteinet som skal bli renset bli unngått. Dersom andre proteaser blir anvendt må man være forsiktig slik at ingen av spaltningssetene er inne i proteinet som skal bli renset. Proteinfragmentet kan også bli deletert ved spaltning med cyanogenbromid [for eksempel 2-(2-nitrophenylsulfenyl)-3-bromo-3'-metylindolinium, hydroksyl- amine etc] i nærvær av maursyre. I dette tilfellet er derimot refolding av proteinet vanligvis nødvendig og dette resulterer i at denne metoden er mindre foretrukket. Eliminering av proteinfragmentet ved eksoproteasespaltning (under kinetisk kontroll) er også mulig. Dette resulterer derimot vanligvis i produktblandinger. Spaltningsseter som fortrinnsvis blir anvendt er de som gjør det mulig å deletere proteinf ragmenter uten å etterlate residier av proteinfragmenter i proteinet som skal bli renset. Dersom proteinfragmentene ifølge oppfinnelsen kan bli tolerert i fusjonsproteinet uten tap av funksjon og uten andre ulemper, kan et spesifikt sete for løsning av proteinfragmentet kan bli unngått.

Egnede vektorer er i prinsippet alle vektorer som gjør ekspresjon i pro- eller eukaryote celler mulig. Det er mulig i denne sammenhengen å anvende vektorer som replikerer i bare en slekt eller de som replikerer i flere slekter (betegnet skyttelvektorer). Eksempler på fordelaktige vektorer er plasmider så som E.coli plasmidene pEGFP, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pl_G200, pUR290, plN-lll<113->B1, Igt11 eller pBdCI, fortrinnsvis pEGFP, i Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 eller plJ361, i Bacillus pUB110, pC194 eller pBD214, i Corynebacterium pSA77 eller pAJ667, i fungi pALS1, pll_2 or pBB116, i gjærorganismer 2um, pAG-1, YEp6, YEp13 eller pEMBLYe23 eller i planter pLGV23, pGHlac"1", pBIN19, pAC2004 or pDH51. Nevnte plasmider representerer et lite utvalg av mulige plasmider. Ytterligere plasmider er velkjente for fagfolk og kan for eksempel finnes i ovennevnte bok Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018).

I en annen utførelsesform av vektoren kan nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen også fordelaktig bli innført i form av et lineært DNA inn i mikroorganismene og bli integrert ved heterolog eller homolog rekombinasjon inn i genomet til vertsorganismen. Dette lineære DNA kan bestå av en lineærisert vektor så som et plasmid eller bare av nukleinsyren, dvs. nukleinsyrefragmentet og genet for proteinet (= fusjons-proteingenet) og, når hensiktsmessig, andre regulatoriske sekvenser.

Vertsorganismer egnede for genkonstruksjon er i prinsippet alle prokaryote eller eukaryote organismer. Vertsorganismer som fortrinnsvis blir anvendt er mikroorganismer så som gram positive eller gram negative bakterier, archaebakterier, sopp, gjær, dyr eller planteceller så som Drosophila, spesielt D.melanogaster, mus, zebra fisk eller tobakk. Det som fortrinnsvis blir anvendt er gram positive eller gram negative bakterier, sopp eller gjær, spesielt foretrukket er slekten Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Aspergillus or Saccharomyces, meget spesielt foretrukket er E. coli.

Spesielt foretrukket er følgende kombinasjoner av vektor og vertsorganismer så som Escherichia coli og dets plasmider og fag og promotere som hører dertil, og Bacillus og plasmider og promotere derav, Streptomyces og plasmider og promotere derav, Aspergillus og plasmider og promotere derav eller Saccharomyces og plasmider og promotere derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner i krav 3, kjennetegnet ved at den omfatter fusjonering av et nukleinsyrefragment som krevd i krav 6 til et gen som koder for et protein.

Den beskriver videre fremgangsmåte for rensing av fusjonsproteiner ifølge krav 3, kjennetegnet ved at den omfatter

a) å bringe væsker som inneholder fusjonsproteinet i kontakt med immobiliserte metallioner på en slik måte at en affinitetsbinding kan bli dannet mellom

metallionene av fusjonsproteinet,

b) fjerning av ubundede forbindelser tilstede i væsken,

c) eluering av bundet fusjonsprotein hvori affinitetsbindingen blir unngått ved forandring av det flytende mediet og

d) samling av renset fusjonsprotein.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et proteinfragment ifølge krav 1 eller

et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 for rensing av proteiner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av proteinfragmenter som har evne til å gå inn i en reversibel affinitetsbinding med immobiliserte metallioner, kjennetegnet ved at den omfatter å utføre følgende trinn:

a) fremstilling av et nukleinsyrebibliotek begynnende fra en hvilken som helst egnet nukleinsyresekvens som koder for et proteinfragment med sekvensen

hvor histidin og cysteinresidiene til sekvensen er konserverte i nukleinsyrebiblioteket.

b) fusjonering av nukleinsyrene fra biblioteket til et reseptorgen som gjør det mulig å detektere fusjonsproteinet som blir kodet av den resulterende nukleinsyren via

dets binding til immobiliserte metallioner og

c) selektering av nukleinsyresekvenser som utviser en reversibel binding til immobiliserte metalloiner som er minst 1,5 ganger sterkere enn sekvensen i naturlig

Helicobacter pylori ATPase-439.

Det er også beskrevet fremgangsmåte for detektering av proteiner,

kjennetegnet ved at at den omfatter detektering av individuelle proteiner som omfatter et proteinfragment som krevd i krav 1 i en proteinblanding via antistoffer som er rettet mot proteinf ragmentet.

Oppfinnelsen beskriver også anvendelse av et proteinfragment ifølge krav 1 eller et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 for rensing av proteiner.

Fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt som beskrevet ovenfor i en fremgangsmåte hvori nukleinsyrefragmenter ifølge oppfinnelsen, som koder for proteinfragmenter som har ovennevnte sekvens, blir fusjonert til et gen som koder for proteinene som skal bli renset, og, hvor hensiktsmessig, andre fordelaktige sekvenser så som promoter og/eller enhancersekvenser, spaltningsseter for proteaser osv. Dersom det er nødvendig for dette formålet blir et egnet restriksjonsenxym-spaltningssete introdusert mellom nukleinsyref ragmentet og genet til proteinet som skal bli renset, og denne konstruksjonen blir skutt inn via egnede spaltningsseter inn i en vektor. Metoder av denne typen er kjent for fagfolk og kan for eksempel finnes i bøker av Sambrook, J. et al. (1989) Molecular doning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, by F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley og Sons or D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9). Ytterligere fordelaktige vektorer er Pichia pastoris vektorene pPic og pGap. Denne gjærorganismen er også en egnet vertsorganisme for proteinekspresjon.

Proteinf ragmenter ifølge oppfinnelsen er egnede for fremstilling av fusjonsproteiner som lett kan bli renset, billig og effektivt ved hjelp av proteinf ragmenter. Proteinfragmenter og fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen kan dermed med hell bli renset, meget selektivt og i høye utbytter og med høy renhet. Proteinfragmenter ifølge oppfinnelsen og dermed fusjonsproteiner fremstilt fra disse blir fortrinnsvis skjelnet ved binding til immobiliserte metallioner minst 1,5 ganger sterkere enn Helicobacter pylori ATPase-439 sekvensen.

Alle proteiner er egnede i prinsippet for fremstilling av fusjonsproteiner. Proteiner som fortrinnsvis blir anvendt er de som har en biologisk effekt i mennesker, dyr eller planter eller de som er av interesse for organisk syntese. Eksempler der på er proteiner så som enzymer, hormoner eller lagring eller binding eller transportproteiner. Eksempler som kan bli nevnt er proteiner så som hydrolaser så som lipaser, esteraser, amidaser, nitrilaser, proteaser, mediatorer så som cytokiner for eksempel lymphokiner så som MIF, MAF, TNF, interleukiner så som interleukin 1, interferoner så som y-interferon, tPA, hormoner så som proteohormoner, glycohormoner, oligo- eller polypeptid hormoner så som vasopressin [sic], endorphiner, endostatin, angiostatin, vekstfaktorer, erythropoietin, transcripsjonsfaktorer, integriner så som GPIIb/llla eller avblll, reseptorer så som forskjellige glutamatreseptorer, angiogenesfaktorer så som angiotensin.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for rensing av fusjonsproteiner gjør det for eksempel mulig å rense proteiner fra de naturlige kildene så som plante eller dyre-ekstrakter, plante eller dyrecellelysater, fra kulturmediet, fermenteringskraft eller fra syntesekraft, for bare å nevne noen få som eksempel.

Fusjonsproteinet blir hensiktsmessig uttrykt i en egnet vertsorganisme (se ovenfor) før rensingen for å øke utbyttet av fusjonsproteinet. Vertsorganismen blir dyrket i et egnet syntetisk eller kompleks medium som inneholder en karbonkilde, en nitrogen-kilde, og, hvor hensiktsmessig, uorganiske salter, vitaminer og sporelementer, ved en egnet temperatur og med egnet utluftning.

Avhengig av om fusjonsproteinet blir utskilt fra cellene eller ikke blir cellene først brutt opp og cellene eller celledetritus blir fordelaktig fjernet. Metoder anvendt for celle-oppbrudd er de som er kjente for fagfolk, så som ultralyd, French press, enzymspaltning, osmotisk sjokk og mange andre. Celler eller celledetritus kan bli fjernet, for eksempel, ved sentrifugering eller filtrering. Fjerning av cellene eller celledetritus er absolutt nødvendig.

Væsken inneholdende fusjonsproteinene blir deretter brakt i kontakt med immobiliserte metallioner slik at en affinitetsbinding mellom fusjonsproteinet og metallionene kan bli dannet. Bindingen foregår ved pH verdier høyere enn 7, fortrinnsvis for eksempel ved pH 7,0 til 9,0, fortrinnsvis mellom pH 7,5 til 8,0. Fordelaktige buffere er enkeltbuffere eller bufferbloginger så som for eksempel 50 til 1000 mm buffere så som 50 mM Tris/HCI pH 8.0 + 150 mM NaCI, 100 mM natriumacetat pH 7.7 + 500 mM NaCI, 20 mM natriumfosfat pH 7.7 + 500 mM NaCI eller 50 mM Tris/HCI pH 8.0 + 150 mM NH4CI. Disse bufferane gjør det mulig å applisere fusjonsproteinene på immobiliserte metallioner. I det enkleste og spesielt fordelaktige tilfellet blir fusjonsproteinene brakt i kontakt med immobiliserte metallioner direkte i bufferen anvendt for oppbrudd eller i inkubasjonsmediet. Det er fordelaktig at væskene og de immobiliserte metallionene blir brakt i kontakt med hverandre på en konvensjonell kromatografikolonne. Dette letter fjerning av ubundede forbindelser, for eksempel proteiner, ved vasking av kolonnen med en egnet buffer. Egnede buffere er buffere som ikke reduserer binding av proteinfragmentene ifølge oppfinnelsen eller av fusjonsproteinene i metallinonene, eller som har evne til å fjerne urenheter. Buffere av denne typen har fortrinnsvis en pH på over 7, fortrinnsvis en pH på mellom 7,0 til 9,0, fortrinnsvis mellom pH 7,5 til 8,0. Det er også mulig å rense vertsbloginger, hvori immobiliserte metallioner er plasserte i en beholder og deretter blir væskene tilsatt eller vice versa på denne måten. Nevnte buffere kan bli anvendt i disse vertsblogingene. Bloginger blir fortrinnsvis sentrifugerte eller filtrert mellom de individuelle vasketrinnene.

Bærermaterialer egnede i prinsippet for immobilisering av metallionene er alle konvensjonelle og kan lett bli derivatisert, viser ingen eller bare en viss uspesifikk adsorpsjon, viser gode fysiske, mekaniske og kjemisk stabilitet, og har et høyt ytre og indre overflateareal. Egnede materialer kan bli oppnådd kommersielt, for eksempel fra Pharmacia LKB, Sverige (Sepharose™6B eller Superose™), Pierce, USA (immobilisert iminodieddiksyre I eller II, immobilisert tris(carboksymetyl)- etylenediamin), Sigma, USA (immobilisert iminodieddiksyre-agarose), Boehringer Mannheim, Tysklog (zinc chelat-agarose) eller Toyo Soda, Japan (TSKgel Chelate-5PW). EP-B-0 253 303 beskriver ytterligere egnede materialer. Ytterligere egnede og fordelaktige materialer er materialer så som Ni-belagte mikrotiter plater (nikkel-chelatbelagte Flashplate®, NEN life science products) eller magnetiske partikler eller spesifikke metallione-behoglede og bindingsmembraner.

Forskjellige metallioner er bundet i egnede materialer fortrinnsvis via grupper så som IDA (= iminodieddiksyre), NTA (= nitrilotrieddiksyre) eller TED (= tris(karboksy-metyl)- etylenediamin). Egnede metallioner er Co, Cu, Fe, Ca, Mg, Ni, Al, Cd, Hg or Zn, fortrinnsvis Fe, Ni eller Cu, spesielt foretrukket er Ni eller Cu, meget spesielt foretrukket er Ni. Belastning av materialene med metallioner foregår fortrinnsvis med 0.1 til 0.4 M løsninger av metallsaltne i vogig, ubufferet løsning.

Etter vasking blir fusjonsproteinet eluert med en egnet buffer. Denne bufferen unngår affinitetsbinding mellom fusjonsproteinet og immobiliserte metallioner. Fusjonsproteinene kan bli eluert via en pH gradient (lave pH verdier < pH 7.0 eluerer), konkurrerende ligoger så som imidazol, organiske løsningsmidler så som aceton eller etanol, chelateringsmidler så som EDTA eller NTA og/eller detergenter så som Tween 80. Eluering via konkurrerende ligoger så som imidazol og/eller detergenter er foretrukket. Imidazol blir anvendt for eluering i et området fra 0.05 til 0.7 M, fortrinnsvis fra 0.1 til 0.5 M. Konkurrerende ligoger og/eller detergenter blir fortrinnsvis anvendt i en buffer, men kan også bli anvendt i vann. Fordelaktige buffere er buffere som tilsvarer bufferene anvendt for å bli belastet på immobiliserte metallioner. Dette har den fordelen at ingen uønskede interaksjoner mellom kolonnematerialet, bundede proteiner og buffer oppstår. Fordelaktige buffere har fortrinnsvis en pH som er høyere enn pH 7, fortrinnsvis en pH mellom 7,0 til 9,1, fortrinnsvis mellom pH 7,5 til 8,0. Disse bufferene blir fortrinnsvis applisert via en økende gradient. I det tilfellet hvor en pH gradient blir anvendt for eluering er det mulig å anvende buffere med en pH under pH 7,0 og/eller syrer. Eluert fusjonsprotein blir samlet og kan bli anvendt øyeblikkelig eller ellers, om nødvendig og om ønskelig, behoglet ytterligere. Egnede applisering- og elueringsbuffere finnes for eksempel i boken Protein Purification (Eds. J.C. Janson, L. Rydén, VCH Publisher Inc., 1989, s. 227 to 251).

Proteinfragmenter ifølge oppfinnelsen kan bli deletert ved anvendelse av metodene beskrevet ovenfor, så som cyanogenbromid eller proteasespaltning. Det er i dette tilfellet mulig at residiene til proteinfragmentet forblir i molekylet eller blir fullstendig eliminert fra proteinet som skal bli renset. Proteinfragmentet blir fortrinnsvis fullstendig fjernet fra proteinet.

Nukleinsyrebiblioteket basert på ovennevnte sekvens kan bli konstruert ifølge metoder for mutagenese kjent for fagfolk. For dette formålet kan sekvensen bli utsatt for for eksempel en seterettet mutagenese som beskrevet i D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), kap. 6, s. 193 et seq.

Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3,1993: 777 - 778) beskriver en PCR metode ved anvendelse av dITP for tilfeldig mutagenese.

Anvendelse av en in vitro rekombinasjonsteknikk for molekylær utvikling er beskrevet av Stemmer (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 91,1994:10747 -10751).

Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14,1996:458 - 467) beskriver kombinasjon av PCR metoden og rekombinasjonsmetoden.

Anvendelse av en in vitro rekombinasjonsteknikk for molekylær utvikling er beskrevet av Stemmer (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 91,1994:10747 -10751). Det er også mulig å anvende en kombinasjon av de to metodene.

Anvendelse av muterte stammer med defekter i DNA repareringssystemet er beskrevet av Bornscheuer et al. (Strategies, 11,1998:16-17). Rellos et al. beskriver en PCR metode ved anvendelse av ikke-equimolare mengder av nukleotider (Protein Expression og Purification, 5,1994: 270 - 277).

Nukleinsyrebiblioteket kan fordelaktig bli produsert ifølge en PCR teknikk ved anvendelse av to komplementære, degenererte oligonukleotider (betegnet wobble primere), som beskrevet i eksemplene. Det er viktig at histidin og cysteinresidiene tilstede i denne sekvensen er konserverte.

For sekvensering for proteinfragmenter som har forbedret metall-bindende affinitet blir nukleinsyrefragmentet ifølge oppfinnelsen som koder for proteinfragmentet fusjonert til et reportergen. Fordelaktige reportergener gjør det enkelt å detektere bindingen til immobiliserte metallioner via for eksempel, binding av antistoffer som er merket med et fluorescensfargestoff og er rettet mot reportergenet, eller via selv-fluorescerende proteiner så som fordelaktig og foretrukket egf protein fra E.coli (= grønt fluorescensprotein, se Prasher et al., Gene 111 (2), 1992: 229 - 233) eller foretrukket bioluminescencprotein fra Aequoria Victoria eller via lys-dannende proteiner så som luciferin/luciferase system. Spesielt foretrukket blir det anvendt en gfp protein mutant (= egfp = forsterket grønt fluorescencprotein) med en 35-ganger høyere fluorescens-aktivitet forårsaket av to punkts mutasjoner i posisjon 64, erstatning av Phe by Leu, og posisjon 65, erstattet av Ser med Thr. Denne proteinmutanten har den fordelen i forhold til vill-type proteinet at det er oppløselig og ikke danner noen inklusjonslegemer. Anvendelse av egfo proteinet gjør det mulig å lokalisere og kvantifisere protein-konsentrasjonen i hver fase av rensingen av proteinene uten å interferere med rensingen og uten å anvende andre kofaktorer eller substrater (Poppenborg et al.,

J. Biotechnol., 58 (2), 1997, 77 - 88). egfp proteinet blir også skjelnet med en høy stabilitet overfor et vidt pH område (pH 5,5 til 12), bleking med fotooksidasjon, oksiderings- og svakt reduserende midler så som 2% mercaptoetanol. Proteinet viser en reduksjon i fluorescens over 37°C. Likeledes er gfp-uv (blå fluorescens) og eyfp (gule fluorescens) proteiner likeledes egnede som reportergen.

Egnede sekvenser blir valgt ved sammenligning med bindingsaffiniteten til immobiliserte metallioner fra følgende naturlige Helicobacter pylori ATPase-439 sekvens His-lle-His-Asn-Leu-Asp- Cys-Pro-Asp-Cys. Proteinfragmentsekvenser ifølge oppfinnelsen viser en reversibel binding til immobiliserte metallioner som er minst 1,5 ganger sterkere, fortrinnsvis misnt 2 ganger og spesielt foretrukket minst 3 ganger sterkere. Fordelaktige sekvenser gjør det mulig at proteinutbyttet etter rensingen er minst 20%, fortrinnsvis minst 30%, spesielt foretrukket er minst 40% og meget foretrukket er minst 50%.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for screening av nukleinsyrebiblioteket er spesielt fordelaktig for automatisering. Denne fremgangsmåten kan lett bli anvendt for testing av et stort antall nukleinsyref ragmenter og proteinfragmenter for deres metallionbindende affinitet i såkalt høy-gjennomkjøringsscreening.

Proteiner kan lett bli detektert ved anvendelse av proteinfragmentene ifølge oppfinnelsen. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for detektering av proteiner blir individuelle proteiner som omfatter et proteinfragment som har ovennevnte proteinfragmenter ifølge oppfinnelsen i en proteinbloging detektert via antistoffer som er rettet mot proteinskjelettet. Deteksjon av disse fusjonsproteinene foregår fortrinnsvis via mono- eller polyklonale antistoffer rettet mot proteinfragmentet (= tag). Proteinblogingen kan fortrinnsvis bli fraksjonert ved kromatografi eller elektroforese før deteksjon og deretter bli overført (= blottet) til en egnet membran (for eksempel PVDF eller nitro-cellulose) ved konvensjonelle metoder (se Sambrook et al.). Denne membranen blir deretter inkubert med et antistoff rettet mot tag. Det er foretrukket å vaske membranen flere ganger og deretter å detektere bundede antistoffer via en spesifikk reaksjon med et andre antistoff som for eksempel er enzym-konjugert (for eksempel alkalisk fosfatase, peroksidase osv.) og er rettet mot en konstant region til den første, i et Western blot eller immuno blot. Tilsvarende antistoffer er kommersielt tilgjengelige. Når magnetiske partikler blir anvendt kan vaskingen bli utelatt og antistoff- belagte magnetiske partikler kan bli renset ved utviskning med magneter.

Proteinfragmentet ifølge oppfinnelsen har den fordelen i forhold til konvensjonelle His tager for proteindeteksjon at de har en sterk antigen effekt og dermed er mer egnede for produsering av antistoffer mot tågen.

Oppfinnelsen er ytterligere illustrert i følgende eksempler.

Eksempler:

Chelaterende sefarose Fast-Flow fa Pharmacia LKB, Uppsala, Sverige, ble anvendt for testing av bindingen til metallchelatkolonner (= immobiliserte metallioner). Ampicillin, imidazole, EDTA og alle andre reagenser ble oppnådd fra Fluka (Buchs, Switzerlog). DNA gel ekstraheringssett, Midi Plasmid-Kit og Prepspin Plasmid Kit med opprinnelse fra Qiagen (Hilden, Tysklog), restriksjonsenzymer, DNA-modifiserende enzymer, T4-DNA ligase og Taq polymerase hadde opphav fra MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Tysklog). Taq Dye Cycle Sequencing Kit ble oppnådd fra Applied Biosystems (Weiterstadt, Tysklog).

E. coli stammen DH5a (F" endA1 hsdR17 [rk', mk<+>] supE44 thil XgyrA96 relA1 A (argF laczya) U169) ble anvendt i kloningseksperimentene. Plasmider som inneholdt genet for egf proteinet ble oppnådd fra Clonetech USA. E. coli stammene ble dyrket i Luria-Bertani medium (= LB) med 100 ug/ml Ampicillin ved 37 °C for å selektere kloner for transformasjon med egfp vektoren. Lyseringsbufferen inneholdt 50 mM natriumfosfatbuffer pH 8.0, 300 mM NaCI, 1 mg/ml Lysozym og 1 mM PMSF (= fenylmetan-sulfonylfluorid = spesifikk trypsin og chymotrypsininhibitor).

DNA metoder, så som legeringer, restriksjoner, PCR eller transformasjoner osv. ble utført som beskrevet i Sambrook, J. et al. (1989) Molecular doning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley og Sons. Fluorescens-merket dideoksy-DNA sekvenseringsmetode ble anvendt for sekvenseringen. DNA sekvensering ble utført ved anvendelse av Taq Dye Deoxy™ Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) og 373A DNA Sequencing System (Applied Biosystems) i henholdt til forhoglerens instruksjoner.

Eksempel 1: Fremstilling av tilfeldig mutageniserte N-terminale metallbindende seter som ble bundet til egfp genet og his6-egfp

For PCR reaksjonen ble plasmid egfp og de to følgende komplementære oligonukleotidene anvendt.

Når det gjelder his6-egfp ble følgende to komplementære primere anvendt.

Betingelser anvendt for PCR reaksjonen var som følger:

Blanding:

PCR program 95°C 7min

95°C 1min

56°C 1min 30x

72°C 3min

72°C 7min

PCR produktene ble hver og en spaltet med Ncol og Noti og ligert inn i egfp vektoren som var blitt spaltet med samme enzymet, for å utelukke mutasjoner i vektoren (se figur 1). PCR-vektor ligeringer ble anvendt for å transformere E. coli. Transformanter ble sådd ut på LB agar med 100 ug/ml Ampicillin og inkubert ved 37°C.

Eksempel 2: Dyrkningsbetingelser og preparering av cellelysater.

Transformerte kolonier som viser fluorescens og noen som ikke viser fluorescens ble valgt og dyrket i 50 ml LB medium som inneholdt 100 u.g ampicillin. Kolonier som viser fluorescens ble valgt for høy-gjennomkjøringsscreening og ble inkubert i sterile mikrotiterskåler som inneholdt 250 u.l LB medium med 100 ug/ml Ampicillin. Etter inkubasjon ble kulturene sentrifugert. Pelletene ble resuspendert i 2 ml lyseringsbuffer, inkubert på is i 20 minutter og deretter oppbrutt med ultralyd (2 ganger, 5 minutter med en Branson Sonifier 250). Etter sentrifugering (15 min, 4°C, 20000 x g) ble de forskjellige egfp mutantene oppnådd i supernatanten. Alle selketerte kloner ble sekvensert (se tabellene I og II). Kloner som ikke viste fluorescens inneholdt stopp-kodoner i sekvensen slik at ingen funksjonelle proteiner ble uttrykt (se tabell I, A8, A13, M16a, Z4, Z11 og Z13). For å kvantifisere bundede proteiner ble en fluorescensmåling utført i alle eksperimentene og korrelert i stort omfang med gfp konsentrasjonen (se figur 2).

Eksempel 3: Lav-gjennomkjøringsscreening med Ni-NTA kolonner fra Qiagen

600 ul lyserte celler ble applisert på en Ni-NTA kolonne, vasket to ganger med 600 ul av en vaskeløsning (50 mM natriumfosphatbuffer, pH 8.0, 250 mM NaCI) og deretter eluert med en 0.7 M imidazolløsning.

Eksempel 4: Høy-gjennomkjøringsscreening med membranfiltetskåler

Membranfilter microtiterskåler (MultiScreen 5 um; tilført av Millipore, Molsheim, Tysklog) ble anvendt for høy-gjennomkjøringsscreening. 250 ul av en omrørt chelat Sepharose suspensjon ble plassert i hver brønn av membranfilterskålene tre ganger. Etter hver tilsetning ble Sepharosen sentrifugert ned (2 min, 23°C, 350 rpm). Alle ytterligere trinn ble utført i en Beckmann Biomek 2000 robot. Minikolonner i brønnene ble vasket to ganger med 250 ul vann. Sepharose ble deretter applisert med 250 ul av en metall-saltløsning og ekvilibrert tre ganger med 200 ul buffer (50 mM natriumfosfat, pH 8.0, 250 mM NaCI). 0.3 M NiCI2, 0.3 M CuS04 eller 0.3 M ZnCI2 løsninger ble anvendt i hver av de forskjellige blogingene (applisert med metallioner). Vogige ikke-bufferede metall-saltløsninge ble anvendt. 250 ul cellelysatsupernatanter ble plassert på hver av disse minikolonnne. Kolonnene ble deretter vasket to ganger med 250 ul ekvilibreringsbuffer. Bundede proteiner ble eluert med 2 x 100 ul 0.5 M imidazol i ekvilibreringsbuffer. Chelat-Sepharose i filtrene kan bli regenerert med 250 ul 50 mM EDTA, 1 M NaCI i vann og anvendt i ytterligere screeningseksperimenter.

Eksempel 5: IMAC eksperimenter

Et konvensjonelt kromatografisystem bestående av en glasskolonne, to peristaltiske pumper for påføring av løsningene, en UV detektor (LKB UV-MII), en printer (LKB

RIC 102) og en fraksjonsoppsamler (LKB FRAC-200) ble valgt i eksperimentet. All apparatur var fra Pharmacia. Kolonnen ble pakket med chelaterende Sepharose Fast-Flow Gel (Pharmacia),vasket med 7 sjiktvolumer deionisert vann og tilført metallioner med 7 sjiktvolum 0.3 M NiCI2 løsning. Kolonnen ble deretter vasket og ekvilibrert med 7 sjiktvolum IMAC buffer (50 mM natriumfosfat, pH 8.0, 250 mM NaCI). 1 ml prøver av cellelysatene ble applisert på kolonnen ved en strømningsrate på 1.5 ml/min og vasket med 10 sjiktvolum IMAC buffer. Bundede proteiner blir eluert via en økende gradient med 0.5% av en 0.5 M imidazolløsning per ml elueringsløsning og til slutt 5 sjiktvolum av en 5 M imidazol/vannløsning. Proteinfraksjonene ble identifisert ved UV deteksjon og samlet. Når fullført ble kolonnen vasket og regenerert med 50 mM EDTA/1 M NaCI løsning. Dette vasketrinnet frakoblet metall, bundede celleresidier og proteiner fra kolonnen. Eluerte fraksjoner ble undersøkt både optisk og spektroskopisk. Noen av de undersøkte klonene viste ingen affinitet for matriksen (se tab. I, M15, M16), mens andre viste god binding (se tab. I, M13, Z5 og Z7). Klonene M13 og Z5 eluerte fra kolonnen i et skarpt bånd, mens det var utsmøring av klone Z7 på kolonnen.

Eksempel 6: Eksperiment som sammenligner egfp-type og his-tag

Klone M13 ble sammenlignet med egfp vill-type protein og vanlige his tager i et sammenlignbart eksperiment. Egfp vill-type proteinet blir ikke bundet til metallchelatkolonner. Fluorescensen var ikke lenger detekterbar på kolonnen etter vasking av kolonnen. Klon M13 bindes til kolonnen i et skarpt bånd, men his tag proteinene bindes over hele kolonnen. Dette skyldes den lavere affinitet som til slutt fører til en lavere kapasitet i kolonnen. Proteinutbyttet når det gjelder M13 er 56%, som er høyere enn 48% med his tågene.

Klonene A6, A10, M13, Z5 og Z7 bindes godt til metallchelatekolonnen, mens klonene M14, M15 og M16 ikke viser noen binding.

Eksempel 7: Metallbindende affinitet

Mange av klonene viste en foretrukket binding til Ni<2+> eller Cu<2+>. Når det gjelder M13 ble ingen binding til Zn<2+> observert. Ved anvendelse av Ni chelatkolonner viste klon M13 tydelig bedre rensing av proteinene sammenlignet med his tågene. Likeledes resulterte sistnevnte i et renere produkt ved sammenligning med M13 ved anvendelse av Cu chelatkolonner, men, på grunn av at bindingen til kolonnematerialet er meget sterk i begge tilfellene ble Cu ionene vasket ut ved drastiske elueringsbetingelser. Dette fører til kontaminering av produktene.

Eksempel 8: Eksperiment som sammenligner ATPase-439 sekvens og

proteinfragmenter ifølge oppfinnelsen

ATPase-439 sammenlignende klon ble utført analogt med eksempel 1 og 6. Primeren som ble anvendt var følgende:

De andre primerene og PCR betingelsene var som beskrevet i eksempel 1.

Eksperimentet ble utført med et Qiagen Ni-NTA Spin sett under native betingelser, lyseringen ble utført som beskrevet under disse betingelsene; kolonnene som allerede var blitt belastede ble ekvilibrert med 600 pl 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8.0, 300 mM NaCI og sentrifugert ved 2000 rpm (= 420 x g) i 2 min. Deretter ble 600 ul av lysatet påført og sentrifugert i 2 min. To vaskinger ble utført med 600 ul av en 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8.0, 300 mM NaCI hver gang. Deretter ble 600 ul 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 8.0, 300 mM NaCI, 0.5 M imidazol anvendt i to elueringer. Utbyttet av rent protein var 1,5 ganger høyere med klon M13 enn metall-bindende sete til ATPase-439 sammenlignende klon. Klon M13 bindes derfor bedre og kan også bli bedre eluert.

Claims (14)

1. Peptidfragment, karakterisert ved at det har den generelle sekvensen His-X<1->His-X<2>-X3-X<4->Cys-X<5->X<6->Cys hvor variablene X<1> til X<6> i sekvensen har følgende betydninger uavhengig av hverandre: X<1> = Asn;X<2>= Gin, Glu eller Arg; X3=Gly, Thr eller Tyr;X<4>= Asn eller Arg;X<5>=Gly eller Lys; X<6>=Cys.

2. Peptidfragment, karakterisert ved at det har sekvensen

3. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter et proteinfragment ifølge krav 1.

4. Nukleinsyrefragment, karakterisert ved at det koder for et proteinfragment ifølge krav 1.

5. Nukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter et nukleinsyrefragment ifølge krav 4.

6. Nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein ifølge krav 3.

7. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 eller 6.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner i krav 3, karakterisert ved at den omfatter fusjonering av et nukleinsyrefragment som krevd i krav 6 til et gen som koder for et protein.

9. Fremgangsmåte for rensing av fusjonsproteiner ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter a) å bringe væsker som inneholder fusjonsproteinet i kontakt med immobiliserte metallioner på en slik måte at en affinitetsbinding kan bli dannet mellom metallionene av fusjonsproteinet, b) fjerning av ubundede forbindelser tilstede i væsken, c) eluering av bundet fusjonsprotein hvori affinitetsbindingen blir unngått ved forandring av det flytende mediet og d) samling av renset fusjonsprotein.

10. Anvendelse av et proteinfragment ifølge krav 1 eller et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 for rensing av proteiner.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av proteinfragmenter som har evne til å gå inn i en reversibel affinitetsbinding med immobiliserte metallioner, karakterisert ved at den omfatter å utføre følgende trinn: a) fremstilling av et nukleinsyrebibliotek begynnende fra en hvilken som helst egnet nukleinsyresekvens som koder for et proteinfragment med sekvensen hvor histidin og cysteinresidiene til sekvensen er konserverte i nukleinsyrebiblioteket. b) fusjonering av nukleinsyrene fra biblioteket til et reseptorgen som gjør det mulig å detektere fusjonsproteinet som blir kodet av den resulterende nukleinsyren via dets binding til immobiliserte metallioner og c) selektering av nukleinsyresekvenser som utviser en reversibel binding til immobiliserte metalloiner som er minst 1,5 ganger sterkere enn sekvensen i naturlig Helicobacter pylori ATPase-439.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert ved ategf proteinet fra Aequoria Victoria blir anvendt som reportergen.

13. Fremgangsmåte for detektering av proteiner, karakterisert ved at den omfatter detektering av individuelle proteiner som omfatter et proteinfragment som krevd i krav 1 i en proteinblanding via antistoffer som er rettet mot proteinfragmentet.

14. Anvendelse av et proteinfragment ifølge krav 1 eller et nukleinsyrefragment ifølge krav 4 for rensing av proteiner.