JP2002515250A - タンパク質の精製をするための新規ペプチド断片 - Google Patents
タンパク質の精製をするための新規ペプチド断片Info
- Publication number
- JP2002515250A JP2002515250A JP2000549740A JP2000549740A JP2002515250A JP 2002515250 A JP2002515250 A JP 2002515250A JP 2000549740 A JP2000549740 A JP 2000549740A JP 2000549740 A JP2000549740 A JP 2000549740A JP 2002515250 A JP2002515250 A JP 2002515250A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- arg
- asn
- trp
- cys
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 title claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 128
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 109
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 claims description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- -1 His Chemical compound 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 3
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 2
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 101000579218 Homo sapiens Renin Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 1
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241001122315 Polites Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 101001062854 Rattus norvegicus Fatty acid-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100434411 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150102866 adc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGHXQPQKQPSBB-BOXHHOBZSA-N bepotastine besylate Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1.C1CN(CCCC(=O)O)CCC1O[C@H](C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 UDGHXQPQKQPSBB-BOXHHOBZSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010327 methods by industry Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規のペプチド断片、前記ペプチド断片を含有する融合タンパク質、その製法ならびにペプチド断片の使用に関する。本発明は、融合タンパク質の精製法およびタンパク質の検出法にも関する。さらに、本発明は、ペプチド断片または融合タンパク質をコードする核酸および前記核酸を含有するベクターに関する。
Description
【０００１】 本発明は、新規のペプチド断片、前記ペプチド断片を含有する融合タンパク質
、その製法ならびに前記ペプチド断片の使用に関する。本発明は、融合タンパク
質の精製方法およびタンパク質の検出法にも関する。
、その製法ならびに前記ペプチド断片の使用に関する。本発明は、融合タンパク
質の精製方法およびタンパク質の検出法にも関する。
【０００２】 さらに、本発明は、ペプチド断片または融合タンパク質をコードする核酸およ
び該核酸を含有するベクターに関する。
び該核酸を含有するベクターに関する。
【０００３】 現代の分子生物学により、殆どの任意のタンパク質、ペプチドまたはそれらの
誘導体を事実上無制限な量で製造することが可能になった。タンパク質精製は、
頻繁に限定的かつ非能率的なことが多く、従って最終的にコストを決定する要因
であることは明白である。
誘導体を事実上無制限な量で製造することが可能になった。タンパク質精製は、
頻繁に限定的かつ非能率的なことが多く、従って最終的にコストを決定する要因
であることは明白である。
【０００４】 従って、タンパク質を精製する多様な技術が発展した。細胞上澄み液、細胞の
未処理抽出物または細胞からのタンパク質を精製するために、通常の技術、例え
ば、塩析出または有機溶剤を用いる析出、超濾過、透析、ゲル電気泳動、等電集
束法、クロマト集束法、イオン交換またはゲルクロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、免疫沈降またはIMAC（＝固定化金属アフィニティークロマトグ
ラフィー）を使用する。精製のために単独の方法を使用することができるが、し
かし通常は、組合わされた種々の技術が必要である。概要は、常用の精製方法、
例えば、テキストブックProtein Purification Process Engineering (Ed. R. G
. Harrison, 1994, Marcel Dekker, Inc., New York, 209-316ページ、ISBN 0-8
247-9009-X)、Protein Purification (Ed. R.K. Scopes, 1994, Springer Verla
g New York, 第4-7章、ISBN 0-387-94072-3)およびMethods for Protein Analys
is (Ed. R.A. Copeland, 1994 Chapman & Hall, 59-112ページ、ISBN 0-412-037
41-6)に記載されている。タンパク質を精製するために、できるだけ丁寧で、か
つできるだけ選択的であり、かつできるだけ迅速である条件下で行われることが
重要である。その際、タンパク質の損失ができるだけ少なくなるように維持され
るべきである。タンパク質精製法の多くは、十分に選択的ではなく、単に僅かな
タンパク質量に適当なだけであり、かつ／または非常に高価である。
未処理抽出物または細胞からのタンパク質を精製するために、通常の技術、例え
ば、塩析出または有機溶剤を用いる析出、超濾過、透析、ゲル電気泳動、等電集
束法、クロマト集束法、イオン交換またはゲルクロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、免疫沈降またはIMAC（＝固定化金属アフィニティークロマトグ
ラフィー）を使用する。精製のために単独の方法を使用することができるが、し
かし通常は、組合わされた種々の技術が必要である。概要は、常用の精製方法、
例えば、テキストブックProtein Purification Process Engineering (Ed. R. G
. Harrison, 1994, Marcel Dekker, Inc., New York, 209-316ページ、ISBN 0-8
247-9009-X)、Protein Purification (Ed. R.K. Scopes, 1994, Springer Verla
g New York, 第4-7章、ISBN 0-387-94072-3)およびMethods for Protein Analys
is (Ed. R.A. Copeland, 1994 Chapman & Hall, 59-112ページ、ISBN 0-412-037
41-6)に記載されている。タンパク質を精製するために、できるだけ丁寧で、か
つできるだけ選択的であり、かつできるだけ迅速である条件下で行われることが
重要である。その際、タンパク質の損失ができるだけ少なくなるように維持され
るべきである。タンパク質精製法の多くは、十分に選択的ではなく、単に僅かな
タンパク質量に適当なだけであり、かつ／または非常に高価である。
【０００５】 ポレース等[Porath et al. (Nature, 第258巻、1975: 598-599ページ)]により
記載されたIMAC（＝固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）を用いるタ
ンパク質精製法は、記載された要求の間で最適な精製に良好な妥協ある。しかし
、この方法は、なお幾つか欠点を有する。従って、例えば全ての金属イオンは、
一様に良好に担体材料に結合されず、その結果イオンは部分的に流されしまい、
従って所望の生成物は汚染される。多くのタンパク質は、クロマトグラフィー材
料に全く結合されず、その結果、精製できないかまたはカラム材料を洗浄するた
めに必要な工程の間に既に溶出される程度に弱くしか結合することができない。
これは、不所望なタンパク質の損失を生じる。通常、選択性は、例えば抗体によ
る精製とは対照的に“１工程の精製”に不適当であるために、さらに精製工程が
必要である。
記載されたIMAC（＝固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）を用いるタ
ンパク質精製法は、記載された要求の間で最適な精製に良好な妥協ある。しかし
、この方法は、なお幾つか欠点を有する。従って、例えば全ての金属イオンは、
一様に良好に担体材料に結合されず、その結果イオンは部分的に流されしまい、
従って所望の生成物は汚染される。多くのタンパク質は、クロマトグラフィー材
料に全く結合されず、その結果、精製できないかまたはカラム材料を洗浄するた
めに必要な工程の間に既に溶出される程度に弱くしか結合することができない。
これは、不所望なタンパク質の損失を生じる。通常、選択性は、例えば抗体によ
る精製とは対照的に“１工程の精製”に不適当であるために、さらに精製工程が
必要である。
【０００６】 この方法を用いて広範囲のタンパク質の精製を可能にするために、いわゆる種
々のタグ、例えばポリヒスチジン、His-Trp、His-Tyrまたは（His-Asp）ｎ
が発展した[スポレノ等（Sporeno et al., J. Biol. Chem. 269(15), 1994: 109
91-10995)、レ グリス等（Le Grice et al., Eur. J. Biochem., 187(2), 1990
: 307-314）、リース等（Reece et al., Gene, 126(1), 1993: 105-107）、デ
ボス等（De Vos et al., Nucl. Acid. Res., 22(7), 1994: 1161-1166）、フェ
ング等（Feng et al., J. Biol. Chem. 269(3), 1994: 2342-2248）、ホチュリ
等（Hochuli et al., Biotechnology, 1988: 1321-1325）、パトワルダム等（Pa
twardhan et al., J. Chromatography A, 787, 1997: 91-100）、ハッチェンス
等（Hutchens et al., J. Chromatography, 604, 1992: 133-141）参照]。これ
らのタグは、核酸レベルで分子生物により精製されるべきタンパク質に結合する
。これらのタグにより、幾つかの分野でさらにタンパク質の精製を改善すること
ができた。しかし、この方法でもなお幾つかの欠点を有する。この方法を用いて
タンパク質が精製されたのか否かという予想が確実にできない（Immobilized Me
tal Ion Affinity Chromatography, L. Kagedal, 227-251ページ、in Protein P
urification, Eds. J. C. Janson, L. Ryden, 1989, VCH出版、Inc., New Yor
k, ISBN 0-89573-122-3参照）、すなわちこの方法は、それぞれのタンパク質に
使用可能でないことを意味する。ここで再び、金属イオンは洗い流されてしまう
か、または洗浄工程の間に部分的に損失する程度にしか弱く結合されない。選択
性は、なお望ましくない。さらに、精製されるべきタンパク質で負荷するカラム
材料の容量は、部分的にまだ低く、その結果、精製に大量のカラム材料を使用し
なければならない。タンパク質収率は、なお十分ではない。これは不必要なコス
トとなる。
々のタグ、例えばポリヒスチジン、His-Trp、His-Tyrまたは（His-Asp）ｎ
が発展した[スポレノ等（Sporeno et al., J. Biol. Chem. 269(15), 1994: 109
91-10995)、レ グリス等（Le Grice et al., Eur. J. Biochem., 187(2), 1990
: 307-314）、リース等（Reece et al., Gene, 126(1), 1993: 105-107）、デ
ボス等（De Vos et al., Nucl. Acid. Res., 22(7), 1994: 1161-1166）、フェ
ング等（Feng et al., J. Biol. Chem. 269(3), 1994: 2342-2248）、ホチュリ
等（Hochuli et al., Biotechnology, 1988: 1321-1325）、パトワルダム等（Pa
twardhan et al., J. Chromatography A, 787, 1997: 91-100）、ハッチェンス
等（Hutchens et al., J. Chromatography, 604, 1992: 133-141）参照]。これ
らのタグは、核酸レベルで分子生物により精製されるべきタンパク質に結合する
。これらのタグにより、幾つかの分野でさらにタンパク質の精製を改善すること
ができた。しかし、この方法でもなお幾つかの欠点を有する。この方法を用いて
タンパク質が精製されたのか否かという予想が確実にできない（Immobilized Me
tal Ion Affinity Chromatography, L. Kagedal, 227-251ページ、in Protein P
urification, Eds. J. C. Janson, L. Ryden, 1989, VCH出版、Inc., New Yor
k, ISBN 0-89573-122-3参照）、すなわちこの方法は、それぞれのタンパク質に
使用可能でないことを意味する。ここで再び、金属イオンは洗い流されてしまう
か、または洗浄工程の間に部分的に損失する程度にしか弱く結合されない。選択
性は、なお望ましくない。さらに、精製されるべきタンパク質で負荷するカラム
材料の容量は、部分的にまだ低く、その結果、精製に大量のカラム材料を使用し
なければならない。タンパク質収率は、なお十分ではない。これは不必要なコス
トとなる。
【０００７】 ボルツ等（Voltz et al.）は、付加的にHis-タグ 配列を使用せずにヘリコバ
クターピロリからのATPアーゼの精製を記載した。このATPアーゼは、IMACによる
精製を可能にする天然の金属結合部位を含有している。我々の研究は、これらの
結合部位が所望のタンパク質を有効に精製するには低すぎる結合親和性しか有さ
ないことを示した。
クターピロリからのATPアーゼの精製を記載した。このATPアーゼは、IMACによる
精製を可能にする天然の金属結合部位を含有している。我々の研究は、これらの
結合部位が所望のタンパク質を有効に精製するには低すぎる結合親和性しか有さ
ないことを示した。
【０００８】 従って、本発明の課題は、IMACによりタンパク質の精製用の別のタグを提供す
ることであり、前記タグは、上記の欠点を有さず、それにより例えばタグのより
広範囲な使用および／またはより高いカラム材料の高い負荷密度が可能となる。
高い選択性が示され、従って精製が単純化される。
ることであり、前記タグは、上記の欠点を有さず、それにより例えばタグのより
広範囲な使用および／またはより高いカラム材料の高い負荷密度が可能となる。
高い選択性が示され、従って精製が単純化される。
【０００９】 前記の課題は、 一般配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ [式中、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、以下： Ｘ１＝Ala、Val、Phe、Ser、Met、Trp、Tyr、Asn、AspまたはLysの群から選択さ
れるアミノ酸、および可変の基Ｘ２〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hi
sの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArgの群から選択される
アミノ酸、および可変の基Ｘ１、Ｘ３〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe
、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの
群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、 Hisの群から選択されるアミノ酸および可変の基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ６は、Gly
、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、 Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHisの群から選択さ
れるアミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、 Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Ly
s 、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArgの群から選択される
アミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hi
sの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGlnの群から選択されるアミノ酸お
よび可変の基Ｘ１〜Ｘ５は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、C
ys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるア
ミノ酸の意味を有し、かつ その際、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも１つが、相互に独立にGlnま
たはAsnである] を有する本発明によるペプチド断片によって達成されることが見いだされた。
れるアミノ酸、および可変の基Ｘ２〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hi
sの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArgの群から選択される
アミノ酸、および可変の基Ｘ１、Ｘ３〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe
、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの
群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、 Hisの群から選択されるアミノ酸および可変の基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ６は、Gly
、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、 Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHisの群から選択さ
れるアミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、 Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Ly
s 、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArgの群から選択される
アミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hi
sの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGlnの群から選択されるアミノ酸お
よび可変の基Ｘ１〜Ｘ５は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、C
ys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるア
ミノ酸の意味を有し、かつ その際、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも１つが、相互に独立にGlnま
たはAsnである] を有する本発明によるペプチド断片によって達成されることが見いだされた。
【００１０】 有利には、配列中の少なくとも１つの可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、さらに相互に独
立にLysまたはArgである。さらに有利には、可変の基Ｘ１〜Ｘ６に含有されてい
るアミノ酸は、Glu、Lys、Arg、Tyr、Cys、Lys、His、AspまたはMetである。Cys
、Glu、Lys、TyrまたはArgを含有、特に有利にはCysを含有しているのが有利で
ある。これらのアミノ酸は、固定化金属イオンへのペプチド断片の有利な結合に
役立つ。さらに、４個以下、有利には３個のヒスチジン基が配列中に連続的に含
まれているのが有利である。
立にLysまたはArgである。さらに有利には、可変の基Ｘ１〜Ｘ６に含有されてい
るアミノ酸は、Glu、Lys、Arg、Tyr、Cys、Lys、His、AspまたはMetである。Cys
、Glu、Lys、TyrまたはArgを含有、特に有利にはCysを含有しているのが有利で
ある。これらのアミノ酸は、固定化金属イオンへのペプチド断片の有利な結合に
役立つ。さらに、４個以下、有利には３個のヒスチジン基が配列中に連続的に含
まれているのが有利である。
【００１１】 さらに、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、相互に独立に以下： Ｘ１＝Ala、Val、Phe、Ser、Met、Trp、Tyr、Asn、AspまたはLys、特に有利には
、Phe、Ser、Asn、AspまたはLys、殊には、Asnの群から選択されるアミノ酸； Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArg、特に有利には、Val
、Ile、Phe、Pro、Gln、GluまたはArg、殊に有利は、Gln、GluまたはArgの群か
ら選択されるアミノ酸； Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、ArgまたはHi
s、特に有利には、Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Asp、Glu、ArgまたはH
is、殊に有利には、Gly、ThrまたはTyrの群から選択されるアミノ酸； Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHis、特に有利には
、Val、Phe、Cys、Met、Trp、Asn、ArgまたはHis、殊に有利には、AsnまたはArg
の群から選択されるアミノ酸； Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArg、特に有利には、Gly
、Ser、Cys、Met、Asn、Glu、LysまたはArg、殊に有利には、GlyまたはLysの群
から選択されるアミノ酸； Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGln 、特に有利には、Phe、Ser、Cy
sまたはTyr、殊に有利には、Cysの群から選択されるアミノ酸 の有利な意味を有する。
、Phe、Ser、Asn、AspまたはLys、殊には、Asnの群から選択されるアミノ酸； Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArg、特に有利には、Val
、Ile、Phe、Pro、Gln、GluまたはArg、殊に有利は、Gln、GluまたはArgの群か
ら選択されるアミノ酸； Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、ArgまたはHi
s、特に有利には、Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Asp、Glu、ArgまたはH
is、殊に有利には、Gly、ThrまたはTyrの群から選択されるアミノ酸； Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHis、特に有利には
、Val、Phe、Cys、Met、Trp、Asn、ArgまたはHis、殊に有利には、AsnまたはArg
の群から選択されるアミノ酸； Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArg、特に有利には、Gly
、Ser、Cys、Met、Asn、Glu、LysまたはArg、殊に有利には、GlyまたはLysの群
から選択されるアミノ酸； Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGln 、特に有利には、Phe、Ser、Cy
sまたはTyr、殊に有利には、Cysの群から選択されるアミノ酸 の有利な意味を有する。
【００１２】 配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ中の可変
の基 Ｘ１〜Ｘ６は、相互に独立に種々の有利な意味を有することができ、その際、最
高で５個までの基の個々の可変の基は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、S
er、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選
択されるアミノ酸である。
の基 Ｘ１〜Ｘ６は、相互に独立に種々の有利な意味を有することができ、その際、最
高で５個までの基の個々の可変の基は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、S
er、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選
択されるアミノ酸である。
【００１３】 特に有利なペプチド断片は、以下：
【００１４】
【化２】
【００１５】 の配列を有する断片である。
【００１６】 上記のタンパク質断片配列は、本発明による核酸断片によりコード化されてい
る。この際に、縮重遺伝子コードを考慮しなければならない。本発明による核酸
断片は、原則的に任意の核酸を含有することができる。有利には、核酸断片は、
本発明による融合タンパク質をコードする相補の核酸配列（＝遺伝子構文）を製
造することを可能にするような方法でベクター中に挿入される。これらの遺伝子
構文は、発現するために、有利には融合タンパク質の最適な発現を可能にする適
当な宿主生物に調節される。適当なベクターは、当業者に非常に周知であり、か
つ本Cloning Vectors（Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam- New
York- Oxford, 1985, ISBN 0444904018）に記載されている。プラスミドとは別
に、ベクターとは、当業者に公知のその他全てのベクター、例えばファージ、ウ
イルス、トランスポゾン、ISエレメント、プラスミド、コスミド、線状または環
状DNAを意味する。これらのベクターは、宿主生物中で自律的複製または染色体
複製を行うことができる。
る。この際に、縮重遺伝子コードを考慮しなければならない。本発明による核酸
断片は、原則的に任意の核酸を含有することができる。有利には、核酸断片は、
本発明による融合タンパク質をコードする相補の核酸配列（＝遺伝子構文）を製
造することを可能にするような方法でベクター中に挿入される。これらの遺伝子
構文は、発現するために、有利には融合タンパク質の最適な発現を可能にする適
当な宿主生物に調節される。適当なベクターは、当業者に非常に周知であり、か
つ本Cloning Vectors（Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam- New
York- Oxford, 1985, ISBN 0444904018）に記載されている。プラスミドとは別
に、ベクターとは、当業者に公知のその他全てのベクター、例えばファージ、ウ
イルス、トランスポゾン、ISエレメント、プラスミド、コスミド、線状または環
状DNAを意味する。これらのベクターは、宿主生物中で自律的複製または染色体
複製を行うことができる。
【００１７】 本発明による核酸配列は、１種以上の調節シグナルに機能的に結合し、有利に
遺伝子発現を増加させる配列を意味する。これらの配列は、発現を促進する３’
および／または５’末端調節配列であってもよく、かつ最適に発現させるために
宿主生物および遺伝子に応じて選択される。例えば、これらの調節配列は、イン
デューサーまたはレプレッサーが結合している配列であり、従って核酸の発現を
制御する。さらに遺伝子構造は、プロモーターと機能的に結合しているいわゆる
エンハンサー配列を１つ以上含有し、核酸配列の高められた発現を可能にする。
このことは、例えばRNAポリメラーゼとDNAとの間の改善された相互作用によって
生じ得る。DNA配列の３’末端に、さらに有利な配列、例えば他の調節エレメン
トまたはターミネーターを挿入することもできる。本発明による核酸断片は、融
合タンパク質のＮ末端領域を形成することができるようにベクター中に有利に挿
入される。しかし、それらは、Ｃ末端で局在化されるかまたはタンパク質内に存
在するが、しかしその際に、タンパク質の機能は影響されてはならず、かつ融合
タンパク質の切り出しは、もはや不可能である。
遺伝子発現を増加させる配列を意味する。これらの配列は、発現を促進する３’
および／または５’末端調節配列であってもよく、かつ最適に発現させるために
宿主生物および遺伝子に応じて選択される。例えば、これらの調節配列は、イン
デューサーまたはレプレッサーが結合している配列であり、従って核酸の発現を
制御する。さらに遺伝子構造は、プロモーターと機能的に結合しているいわゆる
エンハンサー配列を１つ以上含有し、核酸配列の高められた発現を可能にする。
このことは、例えばRNAポリメラーゼとDNAとの間の改善された相互作用によって
生じ得る。DNA配列の３’末端に、さらに有利な配列、例えば他の調節エレメン
トまたはターミネーターを挿入することもできる。本発明による核酸断片は、融
合タンパク質のＮ末端領域を形成することができるようにベクター中に有利に挿
入される。しかし、それらは、Ｃ末端で局在化されるかまたはタンパク質内に存
在するが、しかしその際に、タンパク質の機能は影響されてはならず、かつ融合
タンパク質の切り出しは、もはや不可能である。
【００１８】 これらの調節配列は、遺伝子の特定の発現およびタンパク質発現を可能にすべ
きである。このことは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子が導入の後にはじめて
発現されるかまたは過剰発現されるか、または即座に発現および／または過剰発
現されることを意味する。
きである。このことは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子が導入の後にはじめて
発現されるかまたは過剰発現されるか、または即座に発現および／または過剰発
現されることを意味する。
【００１９】 有利な調節配列は、例えばプロモーター中、例えばcos−、tac−、trp−、tet
−、trp-tet−、lpp−、lac−、lpp-lac−、lacIｑ−、T7−、Ｔ5−、T3−、gal
−、trc−、ara−、SP6−、λ-PＲまたはλ-PＬ−プロモーター中に含有され、
有利にはグラム陰性細菌中で使用される。さらに有利な調節配列は、例えばグラ
ム陽性プロモーターamyおよびSPO2中、酵母−または真菌プロモーターADC1、MF
α、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中または植物プロモーターCaMV/35
S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos中、またはユビキチンプロモーター
中またはファゼオリンプロモーター中に含有されている。これに関連して、例え
ばハンゼヌラ（Hansenula）からのピルビン酸デカルボキシラーゼおよびメタノ
ールオキシダーゼ形のプロモーターも有利である。人工的なプロモーターを調節
に使用することもできる。
−、trp-tet−、lpp−、lac−、lpp-lac−、lacIｑ−、T7−、Ｔ5−、T3−、gal
−、trc−、ara−、SP6−、λ-PＲまたはλ-PＬ−プロモーター中に含有され、
有利にはグラム陰性細菌中で使用される。さらに有利な調節配列は、例えばグラ
ム陽性プロモーターamyおよびSPO2中、酵母−または真菌プロモーターADC1、MF
α、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中または植物プロモーターCaMV/35
S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos中、またはユビキチンプロモーター
中またはファゼオリンプロモーター中に含有されている。これに関連して、例え
ばハンゼヌラ（Hansenula）からのピルビン酸デカルボキシラーゼおよびメタノ
ールオキシダーゼ形のプロモーターも有利である。人工的なプロモーターを調節
に使用することもできる。
【００２０】 その際に、調節配列もしくはファクターは、有利に導入された遺伝子の遺伝子
発現において有利に影響しかつそれにより高められる。従って、調節エレメント
の強化は、上記のプロモーターおよび／または“エンハンサー”のような強い転
写シグナルを用いることにより転写レベルで有利に使用することができる。しか
し、さらに、例えばmRNAの安定性を改善することにより、翻訳の強化が可能であ
る。
発現において有利に影響しかつそれにより高められる。従って、調節エレメント
の強化は、上記のプロモーターおよび／または“エンハンサー”のような強い転
写シグナルを用いることにより転写レベルで有利に使用することができる。しか
し、さらに、例えばmRNAの安定性を改善することにより、翻訳の強化が可能であ
る。
【００２１】 有利には、本発明による核酸配列は、媒体中または細胞コンパートメント中へ
の分泌を可能にするシグナルを含有する。このタイプの配列の例として、一般的
なシグナル配列、例えばompAからのシグナル配列（E.Coli 膜タンパク質）を挙
げることができる。この他に、例えばα−ファクターの配列を含有するようなさ
らに有利な配列、またはYACs（＝酵母人工染色体）を使用することができる。
の分泌を可能にするシグナルを含有する。このタイプの配列の例として、一般的
なシグナル配列、例えばompAからのシグナル配列（E.Coli 膜タンパク質）を挙
げることができる。この他に、例えばα−ファクターの配列を含有するようなさ
らに有利な配列、またはYACs（＝酵母人工染色体）を使用することができる。
【００２２】 本発明による遺伝子構造（＝核酸配列）は、有利にはさらに、融合タンパク質
のＮ末端またはＣ末端から、有利にはＮ末端からの上記の配列を有する本発明に
よるタンパク質断片の除去を可能にする配列を含有する。これらの配列は、例え
ば、多様なプロテアーゼ、例えば、ファクターXa、aエンテロキナーゼ、ヒトレ
ニン、カルボキシペプチターゼA、トロンビン、トリプシン、ジペプチジルペプ
チダーゼ、パパイン、プラスミン、ペプシンまたはその他のプロテアーゼの切断
部位をコードする。有利には、ファクターXaの切断部位は、ヒトレニン、ジペプ
チジルペプチダーゼ、カルボキシペプチターゼAまたはエンテロキナーゼである
、それというのも、これらの酵素は高い特異性を有し、従って精製されるべきタ
ンパク質の不所望な消化を回避することができるからである。他のプロテアーゼ
を使用する場合には、どの切断部位も精製すべきタンパク質の内側でないように
考慮すべきである。タンパク質断片もブロモシアン切断[例えば、２−（２−ニ
トロフェニルスルフェニル）−３−ブロモ−３’−メチルインドリニウム、ヒド
ロキシルアミンなど]により、ギ酸の存在下で削除することができる。しかし、
通常この際にタンパク質のリフォールディングが必要であり、このことは、この
方法があまり有利ではないという結果になる。エクソプロテアーゼ消化による タンパク質断片の除去（動力学的制御下）も可能である。しかし、この際に通常
プロダクト混合物が生じる。有利には、精製すべきタンパク質中でタンパク質断
片基を残すことなくタンパク質断片の削除を可能にする切断部位を使用する。融
合タンパク質中で本発明によるタンパク質断片をの機能の損失なしにまたは他の
欠点なしに許容することができる場合には、タンパク質断片を切り離すための特
定の部位は無くてよい。
のＮ末端またはＣ末端から、有利にはＮ末端からの上記の配列を有する本発明に
よるタンパク質断片の除去を可能にする配列を含有する。これらの配列は、例え
ば、多様なプロテアーゼ、例えば、ファクターXa、aエンテロキナーゼ、ヒトレ
ニン、カルボキシペプチターゼA、トロンビン、トリプシン、ジペプチジルペプ
チダーゼ、パパイン、プラスミン、ペプシンまたはその他のプロテアーゼの切断
部位をコードする。有利には、ファクターXaの切断部位は、ヒトレニン、ジペプ
チジルペプチダーゼ、カルボキシペプチターゼAまたはエンテロキナーゼである
、それというのも、これらの酵素は高い特異性を有し、従って精製されるべきタ
ンパク質の不所望な消化を回避することができるからである。他のプロテアーゼ
を使用する場合には、どの切断部位も精製すべきタンパク質の内側でないように
考慮すべきである。タンパク質断片もブロモシアン切断[例えば、２−（２−ニ
トロフェニルスルフェニル）−３−ブロモ−３’−メチルインドリニウム、ヒド
ロキシルアミンなど]により、ギ酸の存在下で削除することができる。しかし、
通常この際にタンパク質のリフォールディングが必要であり、このことは、この
方法があまり有利ではないという結果になる。エクソプロテアーゼ消化による タンパク質断片の除去（動力学的制御下）も可能である。しかし、この際に通常
プロダクト混合物が生じる。有利には、精製すべきタンパク質中でタンパク質断
片基を残すことなくタンパク質断片の削除を可能にする切断部位を使用する。融
合タンパク質中で本発明によるタンパク質断片をの機能の損失なしにまたは他の
欠点なしに許容することができる場合には、タンパク質断片を切り離すための特
定の部位は無くてよい。
【００２３】 ベクターとして原則的に原核生物または真核生物の細胞の発現が可能な全ての
ベクターが適当である。その際に、ただ１つの遺伝子中でまたは多くの遺伝子中
で複製される（＝いわゆるシャトルベクター）を使用することができる。有利な
ベクターは、例えばプラスミド、例えばE.Coli プラスミドpEGFP、pLG338、pACY
C184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRe4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pL
G200、pUR290、pIN-III１１３-B1、λgt11またはpBdcIであり、有利にはpEGFP、
ストレプトミセス中のpIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、バシラス中のpUB1
10、pc194またはpBD214、コリネバクテリウム中のpSA77またはpAJ667、菌類中の
pALS1、pIL2またはpBB116、酵母中の2μM、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23
または植物中のpLGV23、pGHlac＋、pBIN19、pAK2004またはpDH51である。上記の
プラスミドは、可能なプラスミドの少しの選択である。その他のプラスミドは、
当業者に非常に周知であり、かつ上記の本Cloning Vectors（Eds. Pouwels P. H
. et al. Elsevier, Amsterdam- New York- Oxford, 1985, ISBN 0444904018）
に記載されている。
ベクターが適当である。その際に、ただ１つの遺伝子中でまたは多くの遺伝子中
で複製される（＝いわゆるシャトルベクター）を使用することができる。有利な
ベクターは、例えばプラスミド、例えばE.Coli プラスミドpEGFP、pLG338、pACY
C184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRe4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pL
G200、pUR290、pIN-III１１３-B1、λgt11またはpBdcIであり、有利にはpEGFP、
ストレプトミセス中のpIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、バシラス中のpUB1
10、pc194またはpBD214、コリネバクテリウム中のpSA77またはpAJ667、菌類中の
pALS1、pIL2またはpBB116、酵母中の2μM、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23
または植物中のpLGV23、pGHlac＋、pBIN19、pAK2004またはpDH51である。上記の
プラスミドは、可能なプラスミドの少しの選択である。その他のプラスミドは、
当業者に非常に周知であり、かつ上記の本Cloning Vectors（Eds. Pouwels P. H
. et al. Elsevier, Amsterdam- New York- Oxford, 1985, ISBN 0444904018）
に記載されている。
【００２４】 他のベクターの実施態様において、本発明による核酸配列は、有利に線状DNA
の形で微生物中に導入することができ、かつ非相同的組換えまたは相同的組換え
により宿主生物のゲノム中で組込まれる。この線状DNAは、プラスミドのような
線状化されたベクターまたは単に核酸、すなわち核酸断片およびタンパク質の遺
伝子（＝融合タンパク質遺伝子）、ならびに場合により他の調節配列から成る。
の形で微生物中に導入することができ、かつ非相同的組換えまたは相同的組換え
により宿主生物のゲノム中で組込まれる。この線状DNAは、プラスミドのような
線状化されたベクターまたは単に核酸、すなわち核酸断片およびタンパク質の遺
伝子（＝融合タンパク質遺伝子）、ならびに場合により他の調節配列から成る。
【００２５】 本発明による遺伝子構造の宿主生物として、原則として全ての原核生物または
真核生物が該当する。有利には、宿主生物として微生物、例えばグラム陽性また
はグラム陰性細菌、古細菌、真菌類、酵母、動物または植物の細胞、例えばショ
ウジョウバエ、特に黄色ショウジョウバエ（D.melamogaster）、マウス、ゼブラ
フィッシュ（zebrafish）またはタバコが使用される。有利には、グラム陽性ま
たはグラム陰性細菌、真菌類または酵母、特に有利には大腸菌属、バシラス属、
ストレプトミセス属、コウジカビ属またはサッカロミセス属、殊に有利には大腸
菌が使用される。
真核生物が該当する。有利には、宿主生物として微生物、例えばグラム陽性また
はグラム陰性細菌、古細菌、真菌類、酵母、動物または植物の細胞、例えばショ
ウジョウバエ、特に黄色ショウジョウバエ（D.melamogaster）、マウス、ゼブラ
フィッシュ（zebrafish）またはタバコが使用される。有利には、グラム陽性ま
たはグラム陰性細菌、真菌類または酵母、特に有利には大腸菌属、バシラス属、
ストレプトミセス属、コウジカビ属またはサッカロミセス属、殊に有利には大腸
菌が使用される。
【００２６】 特に有利には、ベクターと宿主生物との以下の組合せ、例えば大腸菌およびそ
のプラスミドおよびファージおよびそれに属するプロモーター、ならびにバシラ
スおよびそのプラスミドおよびプロモーター、ストレプトミセスおよびそのプラ
スミドおよびプロモーター、アスペルギルスおよびそのプラスミドおよびプロモ
ーターまたはサッカロミセスおよびそのプラスミドおよびプロモーターを挙げる
ことができる。
のプラスミドおよびファージおよびそれに属するプロモーター、ならびにバシラ
スおよびそのプラスミドおよびプロモーター、ストレプトミセスおよびそのプラ
スミドおよびプロモーター、アスペルギルスおよびそのプラスミドおよびプロモ
ーターまたはサッカロミセスおよびそのプラスミドおよびプロモーターを挙げる
ことができる。
【００２７】 本発明による融合タンパク質は、上記のような１つの方法で製造することがで
き、その際、上記の配列を有するタンパク質断片をコードする本発明による核酸
断片は、精製すべきタンパク質をコードする遺伝子に融合され、および場合によ
りさらに有利な配列、例えばプロモーター配列および／またはエンハンサー配列
、プロテアーゼなどの切断部位に融合する。このために必要な場合には、適当な
制限酵素の切断部位は、核酸断片と精製すべきタンパク質の遺伝子との間に導入
され、かつこの構造は、適当な切り出し部位を介してベクター中に挿入される。
このタイプの方法は、当業者に公知であり、かつ例えばサンブルック、J. 等（S
ambrook, J.et al.）（1989）によるテキストブックMolecular cloning: A labo
ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F. M.アウスベル等（F
. M. Ausubel et al.）（1994）によるCurrent Protocols in molecular biolog
y、ジョンウィリー等（John Wiley and Sons or D. M. Glover et al.）によるD
NA cloning 第１巻、（1995）、IRL出版（ISBN 019-96347-9）に記載されている
。さらに有利なベクターは、ピキア属パストリス（Pichia pastoris）ベクター
ｐPicおよびpGapである。この酵母もまたタンパク質発現に適当な宿主生物であ
る。
き、その際、上記の配列を有するタンパク質断片をコードする本発明による核酸
断片は、精製すべきタンパク質をコードする遺伝子に融合され、および場合によ
りさらに有利な配列、例えばプロモーター配列および／またはエンハンサー配列
、プロテアーゼなどの切断部位に融合する。このために必要な場合には、適当な
制限酵素の切断部位は、核酸断片と精製すべきタンパク質の遺伝子との間に導入
され、かつこの構造は、適当な切り出し部位を介してベクター中に挿入される。
このタイプの方法は、当業者に公知であり、かつ例えばサンブルック、J. 等（S
ambrook, J.et al.）（1989）によるテキストブックMolecular cloning: A labo
ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F. M.アウスベル等（F
. M. Ausubel et al.）（1994）によるCurrent Protocols in molecular biolog
y、ジョンウィリー等（John Wiley and Sons or D. M. Glover et al.）によるD
NA cloning 第１巻、（1995）、IRL出版（ISBN 019-96347-9）に記載されている
。さらに有利なベクターは、ピキア属パストリス（Pichia pastoris）ベクター
ｐPicおよびpGapである。この酵母もまたタンパク質発現に適当な宿主生物であ
る。
【００２８】 本発明によるタンパク質断片は、タンパク質断片を用いて簡単に、低コストで
かつ効率的に精製できる融合タンパク質の製造に適当である。従って、本発明に
よるタンパク質断片および融合タンパク質は、有利に、非常に選択的に良好な収
率および高い純度で精製することができる。本発明によるタンパク質断片ひいて
はそれから製造される融合タンパク質は、ヘリコバクターピロリ ATPase-439配
列と比較して固定化金属イオンに少なくとも１．５倍だけ強く結合することで傑
出している。
かつ効率的に精製できる融合タンパク質の製造に適当である。従って、本発明に
よるタンパク質断片および融合タンパク質は、有利に、非常に選択的に良好な収
率および高い純度で精製することができる。本発明によるタンパク質断片ひいて
はそれから製造される融合タンパク質は、ヘリコバクターピロリ ATPase-439配
列と比較して固定化金属イオンに少なくとも１．５倍だけ強く結合することで傑
出している。
【００２９】 融合タンパク質の製造に原則として全てのタンパク質が適当である。有利には
、ヒト、動物または植物において生物学的作用を示すタンパク質または有機合成
に有利なものが使用される。この際に、例えば、酵素、ホルモン、貯蔵タンパク
質または結合タンパク質または輸送タンパク質のようなタンパク質である。例と
して、タンパク質、例えば加水分解酵素、例えばリパーゼ、エステラーゼ、アミ
ダーゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、化学伝達物質、例えばサイトカイン、例
えばリンフォカイン、例えばMIF、MAF、TNF、インターロイキン、例えばインタ
ーロイキン１、インターフェロン、例えばγ−インターフェロン、tPA、ホルモ
ン、例えばプロテオホルモン、グリコホルモン、オリゴ−またはポリペプチドホ
ルモン、例えばバソプレッシン、エンドルフィン、エンドスタチン、アンギオス
タチン、成長因子、エリスロポイエチン、転写因子、インテグリン、例えばGPII
b/IIIaまたはαｖβIII、レセプター、例えば種々のグルタメートレセプター、
脈管形成因子、例えばアンギオテンシンが挙げられる。
、ヒト、動物または植物において生物学的作用を示すタンパク質または有機合成
に有利なものが使用される。この際に、例えば、酵素、ホルモン、貯蔵タンパク
質または結合タンパク質または輸送タンパク質のようなタンパク質である。例と
して、タンパク質、例えば加水分解酵素、例えばリパーゼ、エステラーゼ、アミ
ダーゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、化学伝達物質、例えばサイトカイン、例
えばリンフォカイン、例えばMIF、MAF、TNF、インターロイキン、例えばインタ
ーロイキン１、インターフェロン、例えばγ−インターフェロン、tPA、ホルモ
ン、例えばプロテオホルモン、グリコホルモン、オリゴ−またはポリペプチドホ
ルモン、例えばバソプレッシン、エンドルフィン、エンドスタチン、アンギオス
タチン、成長因子、エリスロポイエチン、転写因子、インテグリン、例えばGPII
b/IIIaまたはαｖβIII、レセプター、例えば種々のグルタメートレセプター、
脈管形成因子、例えばアンギオテンシンが挙げられる。
【００３０】 融合タンパク質を精製する本発明による方法は、例えば、天然の原料、例えば
植物−または動物の抽出物、植物−または動物の細胞溶解物から、培地、発酵液
体培地からまたは合成液体培地からのタンパク質の精製を若干の例として挙げる
ことができる。
植物−または動物の抽出物、植物−または動物の細胞溶解物から、培地、発酵液
体培地からまたは合成液体培地からのタンパク質の精製を若干の例として挙げる
ことができる。
【００３１】 本発明による方法は、以下： ａ）融合タンパク質を含有している液体を金属イオンと融合タンパク質との間で
親和性結合を形成できるように、固定化金属イオンと接触させ、 ｂ）液体中に存在する結合していない物質を除去し、 ｃ）液体媒体を変更することにより親和性結合が解消された結合融合タンパク質
を溶出し、かつ ｄ）精製された融合タンパク質を収集する の反応工程を含む。
親和性結合を形成できるように、固定化金属イオンと接触させ、 ｂ）液体中に存在する結合していない物質を除去し、 ｃ）液体媒体を変更することにより親和性結合が解消された結合融合タンパク質
を溶出し、かつ ｄ）精製された融合タンパク質を収集する の反応工程を含む。
【００３２】 有利には、適当な宿主生物（上記参照）中の融合タンパク質は、融合タンパク
質の収率を高めるために精製の前に発現させる。宿主生物は、炭素源、窒素源お
よび場合により無機塩、ビタミンおよび微量元素含有する適当な合成または複合
培地中で、適当な温度および通気で培養される。
質の収率を高めるために精製の前に発現させる。宿主生物は、炭素源、窒素源お
よび場合により無機塩、ビタミンおよび微量元素含有する適当な合成または複合
培地中で、適当な温度および通気で培養される。
【００３３】 融合タンパク質が細胞から排出されたか否かにより、細胞をまず分解し、かつ
細胞または細胞破片を有利に除去する。細胞分解には、超音波、フレンチプレス
（French Press）、酵素分解、浸透圧衝撃およびその他のような当業者に公知の
方法を使用する。細胞または細胞破片の除去は、例えば、遠心分離または濾過に
より行うことができる。しかし、細胞または細胞破片の除去は必ずしも必要では
ない。
細胞または細胞破片を有利に除去する。細胞分解には、超音波、フレンチプレス
（French Press）、酵素分解、浸透圧衝撃およびその他のような当業者に公知の
方法を使用する。細胞または細胞破片の除去は、例えば、遠心分離または濾過に
より行うことができる。しかし、細胞または細胞破片の除去は必ずしも必要では
ない。
【００３４】 引き続き、液体を含有している融合タンパク質を、融合タンパク質と金属イオ
ンとの間で親和性結合を形成することができるように、固定化金属イオンと接触
させる。結合は、ｐＨ値７以上、例えば有利にはｐＨ７．０〜９．０、特に有利
にはｐＨ７．５と８．０の間で行われる。有利な緩衝液は、単独の緩衝液または
緩衝混合液、例えば５０〜１０００mM緩衝液、例えば５０mMトリス／H
Cl pH8.0＋１５０mMNaCl、１００mM酢酸ナトリウム pH7.7＋５００mM NaCl、２
０mM燐酸ナトリウム pH7.7＋５００mM NaClまたは５０mM トリス／HCl pH8.0＋
１５０mM NH４Clである。これらの緩衝液は、融合タンパク質を固定化金属イオ
ン上に負荷することを可能にする。最も簡単で特に有利な場合は、融合タンパク
質を分解に使用する緩衝液に直接に、またはインキュベート培地中で固定化金属
イオンと接触させる。有利には、液体および固定化金属イオンを常用のクロマト
グラフィーカラム中で相互に接触させる。このことは、カラムを適当な緩衝液で
洗浄することにより、結合していない物質、例えばタンパク質の除去を容易にす
る。適当な緩衝液は、本発明によるタンパク質断片の形成または金属イオンへの
融合タンパク質の形成を妨げないものであり、かつ不純物を除去することができ
るものである。このような緩衝液は、有利にはｐＨ値７以上、特に有利にはｐＨ
７．０と９．０の間、殊にはｐＨ７．５と８．０の間のｐＨ値を有する。固定化
金属イオンが容器中に装入され、次に液体が添加されているか、またはその逆で
あるバッチ混合物を精製することも可能である。このバッチ混合物に上記の緩衝
液を使用することができる。個々の洗浄工程の間で、混合物は有利に遠心分離ま
たは濾過される。
ンとの間で親和性結合を形成することができるように、固定化金属イオンと接触
させる。結合は、ｐＨ値７以上、例えば有利にはｐＨ７．０〜９．０、特に有利
にはｐＨ７．５と８．０の間で行われる。有利な緩衝液は、単独の緩衝液または
緩衝混合液、例えば５０〜１０００mM緩衝液、例えば５０mMトリス／H
Cl pH8.0＋１５０mMNaCl、１００mM酢酸ナトリウム pH7.7＋５００mM NaCl、２
０mM燐酸ナトリウム pH7.7＋５００mM NaClまたは５０mM トリス／HCl pH8.0＋
１５０mM NH４Clである。これらの緩衝液は、融合タンパク質を固定化金属イオ
ン上に負荷することを可能にする。最も簡単で特に有利な場合は、融合タンパク
質を分解に使用する緩衝液に直接に、またはインキュベート培地中で固定化金属
イオンと接触させる。有利には、液体および固定化金属イオンを常用のクロマト
グラフィーカラム中で相互に接触させる。このことは、カラムを適当な緩衝液で
洗浄することにより、結合していない物質、例えばタンパク質の除去を容易にす
る。適当な緩衝液は、本発明によるタンパク質断片の形成または金属イオンへの
融合タンパク質の形成を妨げないものであり、かつ不純物を除去することができ
るものである。このような緩衝液は、有利にはｐＨ値７以上、特に有利にはｐＨ
７．０と９．０の間、殊にはｐＨ７．５と８．０の間のｐＨ値を有する。固定化
金属イオンが容器中に装入され、次に液体が添加されているか、またはその逆で
あるバッチ混合物を精製することも可能である。このバッチ混合物に上記の緩衝
液を使用することができる。個々の洗浄工程の間で、混合物は有利に遠心分離ま
たは濾過される。
【００３５】 金属イオンを固定化するために、通常容易に誘導化でき、非特異的吸着を有さ
ないかまたは僅かにしか有さず、物理的、機械的、化学的安定性を有しかつ高い
外部表面積または内部面積を有する全ての担体材料が原則として適当である。適
当な材料は、例えばファルマシア LKB、スウェーデン（SepharoseＴＭ6BまたはS
uperoseＴＭ）、Pierce、USA（固定化されたイミノ二酢酸ＩまたはＩＩ、固定化
されたトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）、Sigma、USA（イミノ二
酢酸アガロース）、ベーリンガー マンハイム、ドイツ（亜鉛キレートアガロー
ス）または東京ソーダ、日本（TSKgel Chelate-5PW）から商業的に入手可能であ
る。欧州特許出願第0253303号明細書には、さらに適当な材料が記載されている
。さらに適当で有利な材料は、Ni−被覆したマイクロタイタプレート（nickel-c
helate coated Flashplate（Ｒ） 、Nen life science products）または磁石粒
子または特に金属イオンで処理された結合膜のような材料である。
ないかまたは僅かにしか有さず、物理的、機械的、化学的安定性を有しかつ高い
外部表面積または内部面積を有する全ての担体材料が原則として適当である。適
当な材料は、例えばファルマシア LKB、スウェーデン（SepharoseＴＭ6BまたはS
uperoseＴＭ）、Pierce、USA（固定化されたイミノ二酢酸ＩまたはＩＩ、固定化
されたトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）、Sigma、USA（イミノ二
酢酸アガロース）、ベーリンガー マンハイム、ドイツ（亜鉛キレートアガロー
ス）または東京ソーダ、日本（TSKgel Chelate-5PW）から商業的に入手可能であ
る。欧州特許出願第0253303号明細書には、さらに適当な材料が記載されている
。さらに適当で有利な材料は、Ni−被覆したマイクロタイタプレート（nickel-c
helate coated Flashplate（Ｒ） 、Nen life science products）または磁石粒
子または特に金属イオンで処理された結合膜のような材料である。
【００３６】 種々の金属イオンは、有利には、例えばIDA（＝イミノ二酢酸）、NTA（＝ニト
リロ三酢酸）またはTED（＝トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）の
ようなグループを介して適当な材料に結合する。適当な金属イオンは、Co、Ｃu
、Fe、Ca、Mg、Ni、Al、Cd、HgまたはZnであり、有利には、Fe、NiまたはCu、特
に有利には、NiまたはCu、殊に有利には、Niである。金属イオンとの材料の負荷
は、有利には、水性で非緩衝溶液中で０．１〜０．４Ｍ金属塩溶液を用いて行わ
れる。
リロ三酢酸）またはTED（＝トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）の
ようなグループを介して適当な材料に結合する。適当な金属イオンは、Co、Ｃu
、Fe、Ca、Mg、Ni、Al、Cd、HgまたはZnであり、有利には、Fe、NiまたはCu、特
に有利には、NiまたはCu、殊に有利には、Niである。金属イオンとの材料の負荷
は、有利には、水性で非緩衝溶液中で０．１〜０．４Ｍ金属塩溶液を用いて行わ
れる。
【００３７】 洗浄後に、融合タンパク質は、適当な緩衝液を用いて溶出される。この緩衝液
は、融合タンパク質と固定化金属イオンとの間の親和性結合を解消する。融合タ
ンパク質は、ｐＨ勾配（低いｐＨ値＜ｐＨ７．０溶出を生じる）、競合リガンド
、例えばイミダゾール、有機溶剤、例えばアセトンまたはエタノール、キレート
剤、例えばEDTAまたはNTAおよび／または洗浄剤、例えばTween 80により溶出さ
せることができる。競合リガンド、例えばイミダゾールおよび／または洗浄剤に
よる溶出が有利である。イミダゾールは、０．０５〜０．７Ｍ、有利には０．１
〜０．５Ｍの範囲内で溶出に使用される。競合リガンドおよび／または洗浄剤は
、有利には緩衝液中で使用されるが、しかし水中で使用することもできる。有利
な緩衝液は、使用される緩衝液が固定化金属イオン上に負荷するのに使用される
緩衝液に相当するものである。これは、カラム材料、結合タンパク質および緩衝
液の間で不所望の相互作用が生じないという利点を有する。有利な緩衝液は、有
利にはｐＨ値７以上、特に有利にはｐＨ７．０と９．０の間、殊に有利にはｐＨ
７．５と８．０の間のｐＨ値を有する。有利には、これらの緩衝液は、上昇勾配
により適用される。ｐＨ勾配を用いて溶出する場合には、ｐＨ７．０以下の緩衝
液および／または酸を使用することができる。溶出された融合タンパク質は収集
されかつ即座に使用することができるか、または必要かつ所望の場合にはさらに
処理することができる。適当な負荷−および溶離緩衝液は、例えばテキストブッ
クProtein Purification(Eds. J. C. Janson, L. Ryden, VCH出版社、1989、227
〜251ページ)に記載されている。
は、融合タンパク質と固定化金属イオンとの間の親和性結合を解消する。融合タ
ンパク質は、ｐＨ勾配（低いｐＨ値＜ｐＨ７．０溶出を生じる）、競合リガンド
、例えばイミダゾール、有機溶剤、例えばアセトンまたはエタノール、キレート
剤、例えばEDTAまたはNTAおよび／または洗浄剤、例えばTween 80により溶出さ
せることができる。競合リガンド、例えばイミダゾールおよび／または洗浄剤に
よる溶出が有利である。イミダゾールは、０．０５〜０．７Ｍ、有利には０．１
〜０．５Ｍの範囲内で溶出に使用される。競合リガンドおよび／または洗浄剤は
、有利には緩衝液中で使用されるが、しかし水中で使用することもできる。有利
な緩衝液は、使用される緩衝液が固定化金属イオン上に負荷するのに使用される
緩衝液に相当するものである。これは、カラム材料、結合タンパク質および緩衝
液の間で不所望の相互作用が生じないという利点を有する。有利な緩衝液は、有
利にはｐＨ値７以上、特に有利にはｐＨ７．０と９．０の間、殊に有利にはｐＨ
７．５と８．０の間のｐＨ値を有する。有利には、これらの緩衝液は、上昇勾配
により適用される。ｐＨ勾配を用いて溶出する場合には、ｐＨ７．０以下の緩衝
液および／または酸を使用することができる。溶出された融合タンパク質は収集
されかつ即座に使用することができるか、または必要かつ所望の場合にはさらに
処理することができる。適当な負荷−および溶離緩衝液は、例えばテキストブッ
クProtein Purification(Eds. J. C. Janson, L. Ryden, VCH出版社、1989、227
〜251ページ)に記載されている。
【００３８】 本発明によるタンパク質断片は、上記の方法、例えばブロモシアン切断または
プロテアーゼ切断を用いて削除することができる。その場合に、タンパク質断片
の残留物を分子中に保持するかまたは精製すべきタンパク質から完全に除去する
ことができる。
プロテアーゼ切断を用いて削除することができる。その場合に、タンパク質断片
の残留物を分子中に保持するかまたは精製すべきタンパク質から完全に除去する
ことができる。
【００３９】 有利には、タンパク質断片はタンパク質から完全に除去される。
【００４０】 融合タンパク質を製造するための適当かつ有利なタンパク質断片は、本発明に
よる以下の方法によりスクリーニングすることができる。本発明は、以下の： ａ）配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ [式中、配列のヒスチジン基およびシステイン基は、核酸ライブラリーにおいて
保存される]のタンパク質断片をコードする任意の核酸配列から出発する核酸ラ
イブラリーを作成し、 ｂ）固定化金属イオンへのその結合を介して、ライブラリーの核酸を得られた核
酸によりコード化された融合タンパク質の検出を可能するレポーター遺伝子に融
合し、かつ ｃ）天然のヘリコバクターピロリ ATPアーゼ-439の配列に対して少なくとも１．
５倍強い固定化金属イオンへの可逆的結合を有する核酸配列を選択する 工程を実施することを特徴とする、固定化金属イオンと可逆的親和性結合が可能
なタンパク質断片の製法に関する。
よる以下の方法によりスクリーニングすることができる。本発明は、以下の： ａ）配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ [式中、配列のヒスチジン基およびシステイン基は、核酸ライブラリーにおいて
保存される]のタンパク質断片をコードする任意の核酸配列から出発する核酸ラ
イブラリーを作成し、 ｂ）固定化金属イオンへのその結合を介して、ライブラリーの核酸を得られた核
酸によりコード化された融合タンパク質の検出を可能するレポーター遺伝子に融
合し、かつ ｃ）天然のヘリコバクターピロリ ATPアーゼ-439の配列に対して少なくとも１．
５倍強い固定化金属イオンへの可逆的結合を有する核酸配列を選択する 工程を実施することを特徴とする、固定化金属イオンと可逆的親和性結合が可能
なタンパク質断片の製法に関する。
【００４１】 上記の配列に基づく核酸ライブラリーは、当業者に公知の突然変異誘発法によ
り作成することができる。このために、配列は、例えば“site directed mutage
nesis”を行うことができ、これは、D. M. グローバー等（D.M. Glover et al.
）、DNA Cloning 第１巻、（1995）、IRL出版（ISBN 0199634769）、第６章、19
3ページ以降に記載されている。
り作成することができる。このために、配列は、例えば“site directed mutage
nesis”を行うことができ、これは、D. M. グローバー等（D.M. Glover et al.
）、DNA Cloning 第１巻、（1995）、IRL出版（ISBN 0199634769）、第６章、19
3ページ以降に記載されている。
【００４２】 スピー等（Spee et al.）（Nucleic Acids Research、第21巻、No.3、1993:77
7-778ページ）は、ランダムな突然変異誘発にdITPを用いるPCR法を記載している
。
7-778ページ）は、ランダムな突然変異誘発にdITPを用いるPCR法を記載している
。
【００４３】 分子進化のための“インビトロ”組換え技術の使用は、ステマー（Stemmer）
により記載されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、1994: 10747-10
751ページ）。
により記載されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、1994: 10747-10
751ページ）。
【００４４】 モール等（Moor et al.）（Nature Biotechnology 第14巻、1996: 458-467ペ
ージ）は、PCR法と組換え法との組合せを記載している。
ージ）は、PCR法と組換え法との組合せを記載している。
【００４５】 分子進化のための“インビトロ”組換え技術の使用は、ステマー（Stemmer）
により記載されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、1994: 10747-10
751ページ）。両方の方法の組合せを使用することもできる。
により記載されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、1994: 10747-10
751ページ）。両方の方法の組合せを使用することもできる。
【００４６】 DNA修正システムで欠陥を有する突然変異菌株の使用は、ボーンショイアー等
（Bornscheuer et al.）（Strategies、11、1998: 16-17ページ）に記載されて
いる。レロス等（Rellos et al.）は、当モル量ではないヌクレオチドを用いるP
CR法を記載している（Protein Expression and Purification、5、1994: 270-27
7ページ）。
（Bornscheuer et al.）（Strategies、11、1998: 16-17ページ）に記載されて
いる。レロス等（Rellos et al.）は、当モル量ではないヌクレオチドを用いるP
CR法を記載している（Protein Expression and Purification、5、1994: 270-27
7ページ）。
【００４７】 有利には、実施例中に記載されているような２つの相補的な縮重オリゴヌクレ
オチド（いわゆる、ゆらぎプライマー）を用いるPCR技術により、核酸ライブラ
リーを製造することができる。この配列中に含有されるヒスチジン基およびシス
テイン基が保存されていることが重要である。
オチド（いわゆる、ゆらぎプライマー）を用いるPCR技術により、核酸ライブラ
リーを製造することができる。この配列中に含有されるヒスチジン基およびシス
テイン基が保存されていることが重要である。
【００４８】 改善された金属結合親和性を有するタンパク質断片をスクリーニングするため
に、このタンパク質断片をコードする本発明による核酸断片は、レポーター遺伝
子に融合される。有利には、このレポーター遺伝子は、例えば、レポーター遺伝
子と結合する蛍光染料でラベルされた抗体の結合によるか、または自体が蛍光す
るタンパク質、例えばE. Coliからの有利でかつ好ましいegfタンパク質（＝グリ
ーン蛍光タンパク質、Prasher et al., Gene 111(2)、1992: 229-233ページ参照
）またはアエクオリア ヴイクトリア（Aequoria victoria）からの有利な生物
発光タンパク質または光発生タンパク質、例えばルシフェリン／ルシフェラーゼ
系により固定化金属イオンへの結合の容易な検出を可能にする。特に有利には、
２カ所の突然変異（６４位でLeuと引き換えにpheが、かつ６５位でThrと引き換
えにSerが交換されている）により生じる３５倍高い蛍光活性を有するgfpタンパ
ク質突然変異体（＝egfp＝enhanced green fluorescence protein）が使用され
る。これらのタンパク質突然変異体は、溶解性でありかついわゆる“封入対”を
形成しない利点を野生型のタンパク質に対して有する。egfpタンパク質の使用は
、精製に介入することなく、かつ他のコファクターまたは基質を使用することな
く、タンパク質精製のそれぞれのフェーズにおいて、タンパク質濃度の局在化お
よび定量化を可能にする（Poppenborg et al., J. Biotechnol., 58(2), 1997,
77-88ページ）。さらに、egfpタンパク質は、広いｐＨ範囲（pH5.5〜12）に対し
て、光酸化による漂白に対して、酸化および弱い還元剤、例えば２％メルカプト
エタノール対して高度に安定である点で傑出している。タンパク質は、３７℃以
上で蛍光の減少を示す。同様に、gfp-uvタンパク質（青色蛍光）およびeyfpタン
パク質（黄色蛍光）がレポータータンパク質として適当である。
に、このタンパク質断片をコードする本発明による核酸断片は、レポーター遺伝
子に融合される。有利には、このレポーター遺伝子は、例えば、レポーター遺伝
子と結合する蛍光染料でラベルされた抗体の結合によるか、または自体が蛍光す
るタンパク質、例えばE. Coliからの有利でかつ好ましいegfタンパク質（＝グリ
ーン蛍光タンパク質、Prasher et al., Gene 111(2)、1992: 229-233ページ参照
）またはアエクオリア ヴイクトリア（Aequoria victoria）からの有利な生物
発光タンパク質または光発生タンパク質、例えばルシフェリン／ルシフェラーゼ
系により固定化金属イオンへの結合の容易な検出を可能にする。特に有利には、
２カ所の突然変異（６４位でLeuと引き換えにpheが、かつ６５位でThrと引き換
えにSerが交換されている）により生じる３５倍高い蛍光活性を有するgfpタンパ
ク質突然変異体（＝egfp＝enhanced green fluorescence protein）が使用され
る。これらのタンパク質突然変異体は、溶解性でありかついわゆる“封入対”を
形成しない利点を野生型のタンパク質に対して有する。egfpタンパク質の使用は
、精製に介入することなく、かつ他のコファクターまたは基質を使用することな
く、タンパク質精製のそれぞれのフェーズにおいて、タンパク質濃度の局在化お
よび定量化を可能にする（Poppenborg et al., J. Biotechnol., 58(2), 1997,
77-88ページ）。さらに、egfpタンパク質は、広いｐＨ範囲（pH5.5〜12）に対し
て、光酸化による漂白に対して、酸化および弱い還元剤、例えば２％メルカプト
エタノール対して高度に安定である点で傑出している。タンパク質は、３７℃以
上で蛍光の減少を示す。同様に、gfp-uvタンパク質（青色蛍光）およびeyfpタン
パク質（黄色蛍光）がレポータータンパク質として適当である。
【００４９】 適当な配列の選択は、以下： His-Ile-His-Asn-Leu-Asp-Cys-Pro-Asp-Cys の天然のヘリコバクターピロリ ATPアーゼ-439配列の固定化金属イオンへの結合
親和性と比較して行われる。本発明によるタンパク質断片配列は、少なくとも１
．５倍有利には少なくとも２倍、特に有利には３倍強い固定化金属イオンへの可
逆的結合を有する。有利な配列は、精製後に、少なくとも２０％、有利には少な
くとも３０％、特に有利には少なくとも４０％、殊に有利には少なくとも５０％
のタンパク質収率を可能にする。
親和性と比較して行われる。本発明によるタンパク質断片配列は、少なくとも１
．５倍有利には少なくとも２倍、特に有利には３倍強い固定化金属イオンへの可
逆的結合を有する。有利な配列は、精製後に、少なくとも２０％、有利には少な
くとも３０％、特に有利には少なくとも４０％、殊に有利には少なくとも５０％
のタンパク質収率を可能にする。
【００５０】 核酸ライブラリーをスクリーニングするための本発明による方法は、有利には
オートメーションに適当である。この方法を用いることで、いわゆる“High-Thr
oughput-Screening”で、多数の核酸断片もしくはタンパク質断片のそれらの金
属イオン結合親和性における簡単な試験を可能にする。
オートメーションに適当である。この方法を用いることで、いわゆる“High-Thr
oughput-Screening”で、多数の核酸断片もしくはタンパク質断片のそれらの金
属イオン結合親和性における簡単な試験を可能にする。
【００５１】 本発明によるタンパク質断片を用いて、タンパク質は容易に検出される。タン
パク質を検出するための本発明による方法において、本発明による上記のタンパ
ク質断片を有するタンパク質断片を含有する個々のタンパク質が、タンパク質断
片と結合する抗体を用いて検出される。これらの融合タンパク質の検出は、タン
パク質断片（＝タグ）と結合するモノ−またはポリクローナル抗体により有利に
行われる。タンパク質混合物は、有利には検出の前にクロマトグラフィーまたは
電気泳動によりフラクションすることができ、引き続き適当な膜（例えば、PVDF
またはニトロセルロース）上に通常の方法（Sambrook et al.参照）で移される
（＝ブロッティング）。引き続き、タグと結合する抗体を有するこの膜をインキ
ュベートする。有利には、この膜を数回洗浄し、かつその後に、例えば酵素と複
合した（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）二次抗体（
一次抗体の定常領域と結合する）との特異的反応により、いわゆるウェスタンブ
ロットまたは免疫ブロットにおいて結合抗体が検出される。相応する抗体は市販
されている。磁粒を使用する場合には、洗浄を省略することができ、抗体で被覆
した磁粒は磁石で引き上げることにより精製することができる。
パク質を検出するための本発明による方法において、本発明による上記のタンパ
ク質断片を有するタンパク質断片を含有する個々のタンパク質が、タンパク質断
片と結合する抗体を用いて検出される。これらの融合タンパク質の検出は、タン
パク質断片（＝タグ）と結合するモノ−またはポリクローナル抗体により有利に
行われる。タンパク質混合物は、有利には検出の前にクロマトグラフィーまたは
電気泳動によりフラクションすることができ、引き続き適当な膜（例えば、PVDF
またはニトロセルロース）上に通常の方法（Sambrook et al.参照）で移される
（＝ブロッティング）。引き続き、タグと結合する抗体を有するこの膜をインキ
ュベートする。有利には、この膜を数回洗浄し、かつその後に、例えば酵素と複
合した（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）二次抗体（
一次抗体の定常領域と結合する）との特異的反応により、いわゆるウェスタンブ
ロットまたは免疫ブロットにおいて結合抗体が検出される。相応する抗体は市販
されている。磁粒を使用する場合には、洗浄を省略することができ、抗体で被覆
した磁粒は磁石で引き上げることにより精製することができる。
【００５２】 本発明によるタンパク質断片は、タンパク質検出の際に、通常のHis-タグに対
してより強い抗体作用を有し、従ってタグに対してより簡単に抗体を製造するの
に適当であるという利点を有する。
してより強い抗体作用を有し、従ってタグに対してより簡単に抗体を製造するの
に適当であるという利点を有する。
【００５３】 本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
【００５４】 実施例： 金属キレートカラム（＝固定化金属イオン）への結合試験のために、ファルマ
シアLKB、Uppsala、スウェーデンのいわゆる“Chelating Sepharose Fast-Flow
”を使用した。アンピシリン、イミダゾール、EDTAおよびその他の試薬は、Fluk
a社（Buchs、スイス）から購入した。使用したDNAゲルエクストラクションキッ
ト、Midi プラスミドキットおよび Prepspin プラスミドキットは、Quiagen社（
Hilden、ドイツ）から、制限酵素、DNA修飾酵素、T4-DNAリガーゼおよび Taqポ
リメラーゼは、MBI Fermentas社（St. Leon-Rot、ドイツ）からのものである。D
er Taq Dye Cycle シークエンシングキットは、Applied Biosystems社（Weiters
tadt、ドイツ）から購入した。
シアLKB、Uppsala、スウェーデンのいわゆる“Chelating Sepharose Fast-Flow
”を使用した。アンピシリン、イミダゾール、EDTAおよびその他の試薬は、Fluk
a社（Buchs、スイス）から購入した。使用したDNAゲルエクストラクションキッ
ト、Midi プラスミドキットおよび Prepspin プラスミドキットは、Quiagen社（
Hilden、ドイツ）から、制限酵素、DNA修飾酵素、T4-DNAリガーゼおよび Taqポ
リメラーゼは、MBI Fermentas社（St. Leon-Rot、ドイツ）からのものである。D
er Taq Dye Cycle シークエンシングキットは、Applied Biosystems社（Weiters
tadt、ドイツ）から購入した。
【００５５】 クローニング試験のために、E. Coli 菌株DH5α（F-endA1 hsdR17 [rk-, mk＋ ] supE44 thilλgyrA96 relA1Δ(argF laczya)U169）を使用した。egfタンパク
質の遺伝子を含有するプラスミドは、Clonetech USAから購入した。egfpベクタ
ーで形質転換するクローンを選択するために、E. Coli 菌株を１００μｇ／ｍｌ
アンピシリン含有のLuria-Bertani培地（＝LB）中で３７℃で培養した。溶菌緩
衝液は、５０mM燐酸ナトリウム緩衝液pH8.0、３００mM ＮａＣｌ、１mg/ml リソ
チームおよび１mM PMSF（＝フェニルメタンスルホニルフルオリド＝特殊なトリ
プシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビター）を含有した。
質の遺伝子を含有するプラスミドは、Clonetech USAから購入した。egfpベクタ
ーで形質転換するクローンを選択するために、E. Coli 菌株を１００μｇ／ｍｌ
アンピシリン含有のLuria-Bertani培地（＝LB）中で３７℃で培養した。溶菌緩
衝液は、５０mM燐酸ナトリウム緩衝液pH8.0、３００mM ＮａＣｌ、１mg/ml リソ
チームおよび１mM PMSF（＝フェニルメタンスルホニルフルオリド＝特殊なトリ
プシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビター）を含有した。
【００５６】 DNA法、例えばライゲーション、制限、ＰＣＲまたは形質転換などは、Sambroo
k、J. et al.(1989) Molecular cloning: 実験マニュアル、Cold Spring Harbor
Laboratory Press またはF. M. アウスベル等（F. M. Ausubel et al.）(1994)
Current protocols in molecular biology、John Wiley und Sonsに記載されて
いるように実施された。シークエンシングには、蛍光ラベルしたジデオキシDNA
シークエンシング法を使用した。DNAシークエンシングは、Taq Dye DeoxyＴＭ C
ycle シークエンシングキット（Applied Biosystem）および373A DNA シークエ
ンシングシステム（Applied Biosystem）を用いて製造者の指示に応じて実施し
た。
k、J. et al.(1989) Molecular cloning: 実験マニュアル、Cold Spring Harbor
Laboratory Press またはF. M. アウスベル等（F. M. Ausubel et al.）(1994)
Current protocols in molecular biology、John Wiley und Sonsに記載されて
いるように実施された。シークエンシングには、蛍光ラベルしたジデオキシDNA
シークエンシング法を使用した。DNAシークエンシングは、Taq Dye DeoxyＴＭ C
ycle シークエンシングキット（Applied Biosystem）および373A DNA シークエ
ンシングシステム（Applied Biosystem）を用いて製造者の指示に応じて実施し
た。
【００５７】 例１：egfp遺伝子に結合したランダムに突然変異をさせたＮ末端金属結合部位 およびhis6-egfpの製造 ＰＣＲ反応に、プラスミドegfpおよび以下：
【００５８】
【化３】
【００５９】 の２つの相補的オリゴヌクレオチドを使用した。
【００６０】 his6-egfpの場合には、以下：
【００６１】
【化４】
【００６２】 の２つの相補的プライマーを使用した。
【００６３】 PCR反応に使用された条件は、以下のものである： 混合物： dNTP mix(200μmol) 8μｌ 10 X ThermoPol緩衝液（New England Biolabs） 10μl プライマー１ 1μl（100pmol） プライマー２ 1μl（100pmol） egfpプラスミド 1μl（100ng） 水 79.5μl Deep Vent polymerase（New England Biolabs） 1μl ＰＣＲプログラム ９５℃ ７分 ９５℃ １分 ５６℃ １分 30X ７２℃ ３分 ７２℃ ７分 ＰＣＲ生成物をそれぞれNcoIおよびNotIを用いて消化させ、かつベクター中で
突然変異を除外するために同様の酵素で消化させておいたegfpベクター中にライ
ゲーションさせた（図１参照）。ＰＣＲ−ベクターのライゲーション物をE. Col
iの形質転換のために使用した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含
有のＬＢアガール上でプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした。
突然変異を除外するために同様の酵素で消化させておいたegfpベクター中にライ
ゲーションさせた（図１参照）。ＰＣＲ−ベクターのライゲーション物をE. Col
iの形質転換のために使用した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含
有のＬＢアガール上でプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした。
【００６４】 例２：培養条件および細胞溶解物の製造 蛍光を示した形質転換させたコロニー、および蛍光を示さなかった幾つかのも
のを選択し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ培地５０ｍｌ中で培養し
た。ハイ−スループット−スクリーニング（High-Throughput-Screening）のた
めに、蛍光を示すコロニーを選択し、かつ１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の
ＬＢ培地２５０μｌを含む滅菌マイクロタイタプレート中でインキュベートした
。インキュベート後に培養液を遠心分離した。ペレットを溶菌緩衝液２ｍｌ中で
再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートし次に超音波で分裂させた（２回、Br
anson Sonifier 250で５分間）。遠心分離（15分、４C、2000 x ｇ）後に、上澄
み液中で種々のegfp突然変異体が得られた。選択された全てのクローンを配列決
定した（表ＩおよびＩＩ参照）。蛍光を示さなかったクローンは、配列中に終止
コードを含有し、結果として機能的タンパク質が発現されなかった（表Ｉ、A8、
A13、M16a、Z4、Z11およびZ13参照）。全ての実験において結合タンパク質を定
量するために、広範囲でgfp濃度と相間のある蛍光測定を実施した（図２参照）
。
のを選択し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ培地５０ｍｌ中で培養し
た。ハイ−スループット−スクリーニング（High-Throughput-Screening）のた
めに、蛍光を示すコロニーを選択し、かつ１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有の
ＬＢ培地２５０μｌを含む滅菌マイクロタイタプレート中でインキュベートした
。インキュベート後に培養液を遠心分離した。ペレットを溶菌緩衝液２ｍｌ中で
再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートし次に超音波で分裂させた（２回、Br
anson Sonifier 250で５分間）。遠心分離（15分、４C、2000 x ｇ）後に、上澄
み液中で種々のegfp突然変異体が得られた。選択された全てのクローンを配列決
定した（表ＩおよびＩＩ参照）。蛍光を示さなかったクローンは、配列中に終止
コードを含有し、結果として機能的タンパク質が発現されなかった（表Ｉ、A8、
A13、M16a、Z4、Z11およびZ13参照）。全ての実験において結合タンパク質を定
量するために、広範囲でgfp濃度と相間のある蛍光測定を実施した（図２参照）
。
【００６５】 例３：Quiagen社のNi-NTA-カラムを用いたLow-Throughput-Screening 溶解した細胞６００μｌをNi-NTA-カラム上に負荷し、洗浄溶液（50mM燐酸ナ
トリウム緩衝液、pH8.0、250mM NaCl）６００μｌで２回洗浄し引き続き０．７
Ｍイミダゾール溶液で溶出した。
トリウム緩衝液、pH8.0、250mM NaCl）６００μｌで２回洗浄し引き続き０．７
Ｍイミダゾール溶液で溶出した。
【００６６】 例４：膜フィルタープレートを用いたHigh-Throughput-Screening High-Throughput-Screeningのために膜フィルターマイクロタイタプレート（M
ultiScreen 5μm; Millipore社、Molsheim、ドイツ）を使用した。撹拌したキレ
ートセファロース懸濁液２５０μlを膜フィルタープレートのそれぞれのウェル
中に３回加えた。それぞれの添加後に、セファロースを遠心分離した（2分間、2
3℃、350rpm）。さらに他の工程は、Beckmann Biomek 2000 Roboter中で実施さ
れた。ウェル中のミニカラムを水２５０μlで２回洗浄した。引き続きセファロ
ースを金属塩溶液２５０μlで負荷し、かつ緩衝液（50mM燐酸ナトリウム、pH8.0
、250mM NaCl）２００μlで３回平衡化した。種々の混合物（金属イオンで負荷
）に、それぞれ０．３Ｍ ＮｉＣｌ２溶液、０．３Ｍ ＣＵＳＯ４溶液または０．
３Ｍ ＺｎＣｌ２溶液を使用した。水性の非緩衝金属塩溶液を使用した。細胞溶
出物の上澄み液２００μlをそれぞれこれらのミニカラムに加えた。引き続きカ
ラムを平衡緩衝液２５０μlで２回洗浄した。結合タンパク質を平衡緩衝液中で
０．５Mイミダゾール１００μlで２回溶出した。フィルター中のキレートセファ
ロースは、５０mM ＥＤＴＡ２５０μｌ、水中１Ｍ ＮａＣｌで再生することが
でき、さらにスクリーニング実験に使用することができる。
ultiScreen 5μm; Millipore社、Molsheim、ドイツ）を使用した。撹拌したキレ
ートセファロース懸濁液２５０μlを膜フィルタープレートのそれぞれのウェル
中に３回加えた。それぞれの添加後に、セファロースを遠心分離した（2分間、2
3℃、350rpm）。さらに他の工程は、Beckmann Biomek 2000 Roboter中で実施さ
れた。ウェル中のミニカラムを水２５０μlで２回洗浄した。引き続きセファロ
ースを金属塩溶液２５０μlで負荷し、かつ緩衝液（50mM燐酸ナトリウム、pH8.0
、250mM NaCl）２００μlで３回平衡化した。種々の混合物（金属イオンで負荷
）に、それぞれ０．３Ｍ ＮｉＣｌ２溶液、０．３Ｍ ＣＵＳＯ４溶液または０．
３Ｍ ＺｎＣｌ２溶液を使用した。水性の非緩衝金属塩溶液を使用した。細胞溶
出物の上澄み液２００μlをそれぞれこれらのミニカラムに加えた。引き続きカ
ラムを平衡緩衝液２５０μlで２回洗浄した。結合タンパク質を平衡緩衝液中で
０．５Mイミダゾール１００μlで２回溶出した。フィルター中のキレートセファ
ロースは、５０mM ＥＤＴＡ２５０μｌ、水中１Ｍ ＮａＣｌで再生することが
でき、さらにスクリーニング実験に使用することができる。
【００６７】 例５：ＩＭＡＣ実験 実験のために、ガラスカラム、溶液を被覆するための２つの蠕動ポンプ、UV検
出器（LKB UV-MII）、プリンター （LKB RIC 102）およびフラクションコレクタ
ー（LKB FRAC-200）から成る通常のクロマトグラフィーシステムを選択した。全
ての装置は、ファルマシア社のものである。カラムをchelating Sepharose Fast
-Flow Gel（ファルマシア）を用いて充填し、脱イオン水７充填物容量で洗浄し
、０．３Ｍ ＮｉＣｌ２溶液と一緒に金属イオンを負荷した。引き続きカラムをI
MAC緩衝液７充填物容量で洗浄（50mM 燐酸ナトリウム、pH8.0、250mM NaCl）し
、かつ平衡化した。細胞溶解物の試料１ｍｌを流量１．５ml/minでカラムに負荷
し、かつＩＭＡＣ緩衝液１０充填物容量で洗浄した。結合タンパク質の溶出は、
溶離液１ｍｌ当たり０．５Mイミダゾール溶液の０．５％上昇する勾配で、最後
に０．５Mイミダゾール／水 5充填物容量で行った。タンパク質フラクションを
UV検出により同定しかつ収集した。完了後、カラムを洗浄しかつ５０mM EDTA/１
M NaCl溶液で再生した。この洗浄工程は、カラムからの金属、結合細胞残留物お
よびタンパク質を脱離する。溶出されたフラクションを光学および分光分析の両
方で試験した。試験したクローンの幾つかは、マトリックスに対して親和性を示
さなかった（表Ｉ、M15、M16参照）のに対して、他のものは良好な結合を示した
（表Ｉ、M13、Z5およびZ7参照）。溶出されたクローンM13およびZ5は、鋭いバン
ドの形でカラムから溶出されたのに倒して、クローンZ7は、カラム上で滲んだ。
出器（LKB UV-MII）、プリンター （LKB RIC 102）およびフラクションコレクタ
ー（LKB FRAC-200）から成る通常のクロマトグラフィーシステムを選択した。全
ての装置は、ファルマシア社のものである。カラムをchelating Sepharose Fast
-Flow Gel（ファルマシア）を用いて充填し、脱イオン水７充填物容量で洗浄し
、０．３Ｍ ＮｉＣｌ２溶液と一緒に金属イオンを負荷した。引き続きカラムをI
MAC緩衝液７充填物容量で洗浄（50mM 燐酸ナトリウム、pH8.0、250mM NaCl）し
、かつ平衡化した。細胞溶解物の試料１ｍｌを流量１．５ml/minでカラムに負荷
し、かつＩＭＡＣ緩衝液１０充填物容量で洗浄した。結合タンパク質の溶出は、
溶離液１ｍｌ当たり０．５Mイミダゾール溶液の０．５％上昇する勾配で、最後
に０．５Mイミダゾール／水 5充填物容量で行った。タンパク質フラクションを
UV検出により同定しかつ収集した。完了後、カラムを洗浄しかつ５０mM EDTA/１
M NaCl溶液で再生した。この洗浄工程は、カラムからの金属、結合細胞残留物お
よびタンパク質を脱離する。溶出されたフラクションを光学および分光分析の両
方で試験した。試験したクローンの幾つかは、マトリックスに対して親和性を示
さなかった（表Ｉ、M15、M16参照）のに対して、他のものは良好な結合を示した
（表Ｉ、M13、Z5およびZ7参照）。溶出されたクローンM13およびZ5は、鋭いバン
ドの形でカラムから溶出されたのに倒して、クローンZ7は、カラム上で滲んだ。
【００６８】 例６：egfp野生型およびhis-タグの比較試験 クローンM13を比較試験において、egfp野生型タンパク質と通常のhis-タグと
を比較した。egfp野生型タンパク質は、金属キレートカラムに結合しなかった。
カラムの洗浄後に、カラム上で蛍光はもはや検出できなかった。クローンM13は
、カラムに鋭いバンドの形で結合したのに対して、his-タグタンパク質は、カラ
ム全体にわたり結合した。これは、最終的にカラムの低い容量を導く低い親和性
の原因となる。タンパク質収率は、M13の場合は、５６％で、４８％のhis-タグ
よりも高かった。
を比較した。egfp野生型タンパク質は、金属キレートカラムに結合しなかった。
カラムの洗浄後に、カラム上で蛍光はもはや検出できなかった。クローンM13は
、カラムに鋭いバンドの形で結合したのに対して、his-タグタンパク質は、カラ
ム全体にわたり結合した。これは、最終的にカラムの低い容量を導く低い親和性
の原因となる。タンパク質収率は、M13の場合は、５６％で、４８％のhis-タグ
よりも高かった。
【００６９】
【表１】
【００７０】 クローンA6、A10、M13、Z5およびZ7は、金属キレートカラムに良好に結合した
のに対して、クローンM14、M15およびM16は、結合を示さなかった。
のに対して、クローンM14、M15およびM16は、結合を示さなかった。
【００７１】
【表２】
【００７２】 例７：金属結合親和性 クローンの多くは、Ｎｉ２＋またはＣｕ２＋に有利な結合を示した。M13の場
合は、Ｚｎ２＋への結合は観察されなかった。Ｎｉキレートカラムを使用する場
合には、クローンM13は、his-タグと比較して著しく良いタンパク質の精製を示
した。逆に言えば、これはＣｕキレートカラムを使用する場合には、M13と比較
してより純粋な物質を生じるが、しかしその際、両方の場合ともカラム物質への
結合が非常に強いため、Ｃｕイオンは徹底的な溶出条件により洗い流されてしま
う。このことは、生成物の汚染を導く。
合は、Ｚｎ２＋への結合は観察されなかった。Ｎｉキレートカラムを使用する場
合には、クローンM13は、his-タグと比較して著しく良いタンパク質の精製を示
した。逆に言えば、これはＣｕキレートカラムを使用する場合には、M13と比較
してより純粋な物質を生じるが、しかしその際、両方の場合ともカラム物質への
結合が非常に強いため、Ｃｕイオンは徹底的な溶出条件により洗い流されてしま
う。このことは、生成物の汚染を導く。
【００７３】 例８：ATPアーゼ-439と本発明によるタンパク質断片との比較試験 ATPアーゼ-439の比較クローンを例１〜６と同様に実施した。プライマーとし
て、以下：
て、以下：
【００７４】
【化５】
【００７５】 のプライマーを使用した。その他のプライマーおよびPCR条件は、例１に記載さ
れているものである。
れているものである。
【００７６】 実験は、Quiagen社のNi-NTA Spin キットを用いて、自然の条件下で実施し、
これらの条件下で記載されているように溶菌化した；すでに負荷を終えたカラム
を５０mM燐酸ナトリウム６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌを用いて平衡化
し、かつ２０００rpm（＝420 × g）で２分間遠心分離した。引き続き、溶解物
６００μlを負荷し、同様に２分間遠心分離した。５０mM燐酸ナトリウム緩衝液
６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌを用いて２回洗浄した。その後、５０mM
燐酸ナトリウム緩衝液６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌ、０．５M イミダ
ゾールを用いて、２回溶出した。クローンM13を用いた純粋なタンパク質の収率
は、ATPアーゼ439の比較クローンの金属結合部位よりも１．５倍高かった。従っ
て、クローンM13は、良好に結合しかつ良好に溶出することができた。
これらの条件下で記載されているように溶菌化した；すでに負荷を終えたカラム
を５０mM燐酸ナトリウム６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌを用いて平衡化
し、かつ２０００rpm（＝420 × g）で２分間遠心分離した。引き続き、溶解物
６００μlを負荷し、同様に２分間遠心分離した。５０mM燐酸ナトリウム緩衝液
６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌを用いて２回洗浄した。その後、５０mM
燐酸ナトリウム緩衝液６００μl、pH8.0、３００mM ＮａＣｌ、０．５M イミダ
ゾールを用いて、２回溶出した。クローンM13を用いた純粋なタンパク質の収率
は、ATPアーゼ439の比較クローンの金属結合部位よりも１．５倍高かった。従っ
て、クローンM13は、良好に結合しかつ良好に溶出することができた。
【図１】 NcoIおよびNotIを用いて消化させたＰＣＲ生成物のegfpベクター
中へのライゲーションを示す図
中へのライゲーションを示す図
【図２】 結合タンパク質の定量における蛍光測定結果を示す図
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月２１日（２０００．１１．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】 一般配列Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓは、
配列番号１に一致し、その際Ｘ１は、配列番号１中の２番目のXaaで示されるる
アミノ酸に一致し、かつＸ２は、４番目のXaaに一致し、Ｘ３は、５番目のXaaに
一致し、Ｘ４は、６番目のXaaに一致し、Ｘ５は、8番目のXaaに一致し、および
Ｘ６は、９番目のXaaに一致する。上記のアミノ酸Ｘ１〜Ｘ６は、配列番号１中
でXaaで示される相応のアミノ酸を表していてもよい。有利には、配列中の少な
くとも１つの可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、さらに相互に独立にLysまたはArgである。
さらに有利には、可変の基Ｘ１〜Ｘ６に含有されているアミノ酸は、Glu、Lys、
Arg、Tyr、Cys、Lys、His、AspまたはMetである。Cys、Glu、Lys、TyrまたはArg
を含有、特に有利にはCysを含有しているのが有利である。これらのアミノ酸は
、固定化金属イオンへのペプチド断片の有利な結合に役立つ。さらに、４個以下
、有利には３個のヒスチジン基が配列中に連続的に含まれているのが有利である
。
配列番号１に一致し、その際Ｘ１は、配列番号１中の２番目のXaaで示されるる
アミノ酸に一致し、かつＸ２は、４番目のXaaに一致し、Ｘ３は、５番目のXaaに
一致し、Ｘ４は、６番目のXaaに一致し、Ｘ５は、8番目のXaaに一致し、および
Ｘ６は、９番目のXaaに一致する。上記のアミノ酸Ｘ１〜Ｘ６は、配列番号１中
でXaaで示される相応のアミノ酸を表していてもよい。有利には、配列中の少な
くとも１つの可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、さらに相互に独立にLysまたはArgである。
さらに有利には、可変の基Ｘ１〜Ｘ６に含有されているアミノ酸は、Glu、Lys、
Arg、Tyr、Cys、Lys、His、AspまたはMetである。Cys、Glu、Lys、TyrまたはArg
を含有、特に有利にはCysを含有しているのが有利である。これらのアミノ酸は
、固定化金属イオンへのペプチド断片の有利な結合に役立つ。さらに、４個以下
、有利には３個のヒスチジン基が配列中に連続的に含まれているのが有利である
。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】 の配列を有する断片である。上記の配列は、それぞれの場合、配列番号２、配
列番号３、配列番号４および配列番号５に一致する。
列番号３、配列番号４および配列番号５に一致する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】 配列表
【外１】
【外２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＺＡ (72)発明者 マルクス エンツェルベルガー ドイツ連邦共和国 シュツットガルト ア ルマントリング 31 (72)発明者 シュテファン ミニング ドイツ連邦共和国 シュツットガルト ア ルマントリング 31 Ｆターム(参考） 4B024 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 CE12 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 FA72 FA74 GA26
Claims (18)
- 【請求項１】 一般配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ [式中、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６は、以下： Ｘ１＝Ala、Val、Phe、Ser、Met、Trp、Tyr、Asn、AspまたはLysの群から選択さ
れるアミノ酸、および可変の基Ｘ２〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、
Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、 Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArgの群から選択される
アミノ酸、および可変の基Ｘ１、Ｘ３〜Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe
、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、 Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、 Hisの群から選択されるアミノ酸および可変の基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ６は、Gly
、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、 Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHisの群から選択さ
れるアミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、 Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Ly
s 、Arg、Hisの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArgの群から選択される
アミノ酸および可変の基Ｘ１〜Ｘ４、Ｘ６は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hi
sの群から選択されるアミノ酸であるか、または Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGlnの群から選択されるアミノ酸お
よび可変の基Ｘ１〜Ｘ５は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、C
ys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisの群から選択されるア
ミノ酸 の意味を有し、かつ その際、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも１つが、相互に独立にGlnま
たはAsnである] を有するペプチド断片。 - 【請求項２】 可変の基Ｘ１〜Ｘ６が、請求項１に記載された意味を有し、
その際、配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６の少なくとも１つが、相互に独立にLysま
たはArgである、請求項１に記載のペプチド断片。 - 【請求項３】 配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６が、相互に独立に以下： Ｘ１＝Ala、Val、Phe、Ser、Met、Trp、Tyr、Asn、AspまたはLysの群から選択さ
れるアミノ酸； Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Trp、Tyr、Gln、GluまたはArgの群から選択される
アミノ酸； Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、ArgまたはHi
sの群から選択されるアミノ酸； Ｘ４＝Val、Phe、Pro、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、ArgまたはHisの群から選択さ
れるアミノ酸； Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Trp、Asn、Glu、LysまたはArgの群から選択される
アミノ酸； Ｘ６＝Phe、Pro、Ser、Cys、Trp、TyrまたはGlnの群から選択されるアミノ酸 の意味を有する、請求項１または２に記載のペプチド断片。 - 【請求項４】 配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６が、相互に独立に以下： Ｘ１＝Phe、Ser、Asn、AspまたはLysの群から選択されるアミノ酸； Ｘ２＝Val、Ile、Phe、Pro、Gln、GluまたはArgの群から選択されるアミノ酸； Ｘ３＝Gly、Ile、Thr、Met、Trp、Tyr、Asn、Asp、Glu、ArgまたはHisの群から
選択されるアミノ酸； Ｘ４＝Val、Phe、Cys、Met、Trp、Asn、ArgまたはHisの群から選択されるアミノ
酸； Ｘ５＝Gly、Ser、Cys、Met、Asn、Glu、LysまたはArgの群から選択されるアミノ
酸； Ｘ６＝Phe、Ser、CysまたはTyrの群から選択されるアミノ酸 の意味を有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載のペプチド断片。 - 【請求項５】 配列中の可変の基Ｘ１〜Ｘ６が、相互に独立に以下： Ｘ１＝Asn； Ｘ２＝Gln、GluまたはArg； Ｘ３＝Gly、ThrまたはTyr； Ｘ４＝AsnまたはArg； Ｘ５＝GlyまたはLys； Ｘ６＝Cys の意味を有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載のペプチド断片。
- 【請求項６】 配列 【化１】 を有するペプチド断片。
- 【請求項７】 請求項１から６までのいずれか１項に記載のタンパク質断片
を有する融合タンパク質。 - 【請求項８】 請求項１から６までのいずれか１項に記載のタンパク質断片
をコードする核酸断片。 - 【請求項９】 請求項８に記載の核酸断片を有する核酸。
- 【請求項１０】 請求項７に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 【請求項１１】 請求項８または１０に記載の核酸断片を有するベクター。
- 【請求項１２】 タンパク質をコードする遺伝子を有する請求項８に記載の
核酸断片を融合させることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質の製
法。 - 【請求項１３】 請求項７に記載の融合タンパク質を精製する方法において
、 ａ）融合タンパク質を含有している液体を金属イオンと融合タンパク質との間で
親和性結合を形成できるように、固定化金属イオンと接触させ、 ｂ）液体中に存在する結合していない物質を除去し、 ｃ）液体媒体を変更することにより親和性結合が解消された結合融合タンパク質
を溶出し、かつ ｄ）精製された融合タンパク質を収集する ことを特徴とする、融合タンパク質の精製法。 - 【請求項１４】 請求項１から６までのいずれか１項に記載のタンパク質断
片または請求項８に記載の核酸断片のタンパク質の精製のための使用。 - 【請求項１５】 固定化金属イオンと可逆的親和性結合が可能なタンパク質
断片の製法において、以下： ａ）配列 Ｈｉｓ-Ｘ１-Ｈｉｓ-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｃｙｓ-Ｘ５-Ｘ６-Ｃｙｓ [式中、配列のヒスチジン基およびシステイン基は、核酸ライブラリーにおいて
保存される]のタンパク質断片をコードする任意の核酸配列から出発する核酸ラ
イブラリーを作成し、 ｂ）固定化金属イオンへのその結合を介して、ライブラリーの核酸を得られた核
酸によりコード化された融合タンパク質の検出を可能にするレポーター遺伝子に
融合し、 ｃ）天然のヘリコバクターピロリのATPアーゼ-439の配列に対して少なくとも１
．５倍強い固定化金属イオンへの可逆的結合を有する核酸配列を選択する の工程を実施することを特徴とする、固定化金属イオンと可逆的親和性結合が可
能なタンパク質断片の製法。 - 【請求項１６】 レポーター遺伝子として、Aequoria victoriaからのegfタ
ンパク質を使用する、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 タンパク質を検出する方法において、タンパク質断片と結
合する抗体を介してタンパク質混合物から請求項１に記載のタンパク質断片を含
む個々のタンパク質を検出することを特徴とする、タンパク質を検出する方法。 - 【請求項１８】 請求項１から６までのいずれか１項に記載のタンパク質断
片または請求項８に記載の核酸断片のタンパク質精製のための使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19822823A DE19822823A1 (de) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | Neue Peptidfragmente zur Reinigung von Proteinen |
| DE19822823.6 | 1998-05-20 | ||
| PCT/EP1999/003469 WO1999060134A1 (de) | 1998-05-20 | 1999-05-20 | Neue peptidfragmente zur reinigung von proteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002515250A true JP2002515250A (ja) | 2002-05-28 |
| JP2002515250A5 JP2002515250A5 (ja) | 2006-04-20 |
Family
ID=7868528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000549740A Pending JP2002515250A (ja) | 1998-05-20 | 1999-05-20 | タンパク質の精製をするための新規ペプチド断片 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1078072B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002515250A (ja) |
| KR (1) | KR100577140B1 (ja) |
| CN (1) | CN1204257C (ja) |
| AT (1) | ATE351909T1 (ja) |
| AU (1) | AU758445B2 (ja) |
| BR (1) | BR9910624A (ja) |
| CA (1) | CA2329144C (ja) |
| DE (2) | DE19822823A1 (ja) |
| DK (1) | DK1078072T3 (ja) |
| HU (1) | HUP0102122A3 (ja) |
| IL (2) | IL139272A0 (ja) |
| NO (1) | NO326308B1 (ja) |
| TW (1) | TW555763B (ja) |
| WO (1) | WO1999060134A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA200007619B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006322858A (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-30 | Kyushu Univ | タンパク質蛍光標識方法 |
| JP2008539696A (ja) * | 2005-04-20 | 2008-11-20 | ビロメッド カンパニー， リミテッド | 融合タンパク質の分離のための組成物および方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140001257A (ko) | 2008-05-13 | 2014-01-06 | 유니버시티 오브 캔사스 | 금속 추출 펩타이드(ｍａｐ) 태그 및 관련된 방법 |
| US9187735B2 (en) | 2012-06-01 | 2015-11-17 | University Of Kansas | Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340522C (en) * | 1987-03-10 | 1999-05-04 | Heinz Dobeli | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification |
| US5115102A (en) * | 1989-07-21 | 1992-05-19 | Monsanto Company | Variant proteins and polypeptides possessing enhanced affinity for immobilized-metal affinity matrices |
-
1998
- 1998-05-20 DE DE19822823A patent/DE19822823A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-05-20 TW TW088108305A patent/TW555763B/zh not_active IP Right Cessation
- 1999-05-20 EP EP99925017A patent/EP1078072B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-20 CN CNB99808932XA patent/CN1204257C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-20 HU HU0102122A patent/HUP0102122A3/hu unknown
- 1999-05-20 AT AT99925017T patent/ATE351909T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-20 DK DK99925017T patent/DK1078072T3/da active
- 1999-05-20 WO PCT/EP1999/003469 patent/WO1999060134A1/de active IP Right Grant
- 1999-05-20 IL IL13927299A patent/IL139272A0/xx active IP Right Grant
- 1999-05-20 BR BR9910624-8A patent/BR9910624A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-20 AU AU41450/99A patent/AU758445B2/en not_active Ceased
- 1999-05-20 JP JP2000549740A patent/JP2002515250A/ja active Pending
- 1999-05-20 CA CA002329144A patent/CA2329144C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-20 DE DE59914155T patent/DE59914155D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-20 KR KR1020007012991A patent/KR100577140B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-10-25 IL IL139272A patent/IL139272A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-17 NO NO20005819A patent/NO326308B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-12-19 ZA ZA200007619A patent/ZA200007619B/xx unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6009014904, Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ， １９９８ Ｍａｒ， Ｖｏｌ． ８００， Ｎｏ． １， ｐ． ２９−３７ * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008539696A (ja) * | 2005-04-20 | 2008-11-20 | ビロメッド カンパニー， リミテッド | 融合タンパク質の分離のための組成物および方法 |
| JP4897792B2 (ja) * | 2005-04-20 | 2012-03-14 | ビロメッド カンパニー， リミテッド | 融合タンパク質の分離のための組成物および方法 |
| JP2006322858A (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-30 | Kyushu Univ | タンパク質蛍光標識方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20005819D0 (no) | 2000-11-17 |
| WO1999060134A1 (de) | 1999-11-25 |
| AU758445B2 (en) | 2003-03-20 |
| ATE351909T1 (de) | 2007-02-15 |
| HUP0102122A2 (hu) | 2001-10-28 |
| EP1078072A1 (de) | 2001-02-28 |
| DE19822823A1 (de) | 2000-02-10 |
| IL139272A0 (en) | 2001-11-25 |
| DE59914155D1 (de) | 2007-03-08 |
| NO326308B1 (no) | 2008-11-03 |
| DK1078072T3 (da) | 2007-05-14 |
| KR20010034872A (ko) | 2001-04-25 |
| NO20005819L (no) | 2001-01-15 |
| KR100577140B1 (ko) | 2006-05-09 |
| ZA200007619B (en) | 2001-12-19 |
| CN1310763A (zh) | 2001-08-29 |
| EP1078072B1 (de) | 2007-01-17 |
| TW555763B (en) | 2003-10-01 |
| CN1204257C (zh) | 2005-06-01 |
| AU4145099A (en) | 1999-12-06 |
| CA2329144C (en) | 2009-07-21 |
| HUP0102122A3 (en) | 2004-03-01 |
| CA2329144A1 (en) | 1999-11-25 |
| IL139272A (en) | 2008-08-07 |
| BR9910624A (pt) | 2001-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kasche et al. | Intramolecular autoproteolysis initiates the maturation of penicillin amidase from Escherichia coli | |
| JP4964284B2 (ja) | 組換えで発現されるカルボキシペプチダーゼｂおよびその精製 | |
| WO2018126470A1 (zh) | 重组dna聚合酶 | |
| Yu et al. | Tobacco etch virus protease mediating cleavage of the cellulose-binding module tagged colored proteins immobilized on the regenerated amorphous cellulose | |
| CA2648557C (en) | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity | |
| JP2002515250A (ja) | タンパク質の精製をするための新規ペプチド断片 | |
| CN106795542B (zh) | 通过cupin超家族的蛋白质催化的(R)-选择性cupin-硝基醛醇反应 | |
| Mokhonov et al. | SlyD-deficient Escherichia coli strains: A highway to contaminant-free protein extraction | |
| Daunert et al. | Calmodulin-mediated reversible immobilization of enzymes | |
| MXPA00011310A (en) | New peptide fragments for protein purification | |
| Sakiyama et al. | Use of a novel affinity tag selected with a bacterial random peptide library for improving activity retention of glutathione S-transferase adsorbed on a polystyrene surface | |
| CZ20004252A3 (cs) | Nové peptidové fragmenty pro čisticí proteiny | |
| EP1538203B1 (en) | Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof | |
| Kim et al. | One-step purification of poly-his tagged penicillin G acylase expressed in E. coli | |
| US20220282236A1 (en) | Creatinine deiminase and uses thereof | |
| Lin et al. | Microcalorimetric study of the effect of hexa-histidine tag and denaturant on the interaction mechanism between protein and metal-chelating gel | |
| Loughran et al. | Poly-Histidine-Tagged Protein Purification Using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) | |
| JP2004313033A (ja) | 新規なカルボニル還元酵素及びそれをコードする遺伝子並びにその用途 | |
| EP4259788A1 (fr) | Proteines multimeriques de la famille peroxyredoxine comme proteine d'echafaudage | |
| EP3774842A1 (en) | Process for producing a membrane protein | |
| Tiwari | Proteome based development of novel affinity tail for immobilized metal affinity chromatography and hydrophobic interaction chromatography | |
| JPH04179484A (ja) | グルタチオンｓ―トランスフェラーゼをコードする遺伝子 | |
| JP2001128684A (ja) | 蛋白質の精製方法 | |
| Unzueta et al. | Giulia Accardi, Rosa Mendoza, Verónica Toledo-Rubio, Maria Giuliani, Filomena Sannino, et al. | |
| JP2007167021A (ja) | 光学活性エステルの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060224 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060224 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090409 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090709 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090716 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100707 |