JPS62195298A - 尿素の酵素的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に診断用測定法、さらに詳しくは液体１％
に血液及び尿中の尿素を定量的に測定する方法に関する
。

（従来の技術） 尿素はヒト及び他の哺乳動物における蛋白質代謝の主な
最終生成物である。この生成物は肝臓中で形成され、血
液中に入り、腎臓を通って尿中に排泄され、尿中で存在
する有機物質の主成分の−２である。窒素血症と言われ
る血中尿素が過剰に存在する状態はほとんど常に１＃臓
機能を損なう。血中尿素測定は最も普通に行われる臨床
化学試験の一つである。尿素「クリアランス」又は腎臓
による血液からの尿素の除去率は尿中の尿素濃度によっ
て測定され、糸球体−過速度の尺度として使用される。

生物学的液体中の尿素濃度を測定するため使用される常
用の臨床化学的方法は測定しうる色原体を形成しうる適
当な試薬と尿素との縮合による直接法、又は尿素に対し
てウレアーゼを作用させて生じる生成物としてのアンモ
ニアの測定による間接法として分類される。

ジアセチルモノオキシムを使用する直接法は人為操作及
び自動操作により通常の臨床化学に広く適用されてきた
。しかし、シトルリン、アラントイン及び他の体液成分
との妨害反応により特異性に問題があること、又、感光
性により色が急速に消失することなど多くの欠点を有す
る。

間接法は下記の式によるウレアーゼ（尿素アミドヒドロ
ラーゼ、　ＥＣ３，５，１，５）による尿素のアンモニ
アへの酵素変換に基づくものである。その中で最も普及
している方法はアンモニアイオンがアルカリ性媒体中で
フェノール及び次組塩素酸と反応して青色染料であるイ
ンドフェノールを生成するベルテロ−）　（Ｂｅｒｔｈ
ｅｌｏｔ　）反応に基づくものである。

一方、紫外部にて測定する方法グルタメートデヒドロゲ
ナーゼ法も使用されている。その方法では式： により、ウレアーゼとの酵素反応から誘導されるアンモ
ニアイオンを酵素であるグルタメートデヒドロゲナーゼ
（ＵｔＤＨと略する）で測定し、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）Ｉと略する）の吸光
度の低下を３４０鴎付近の波長で測定する方法である。

最近、特開昭６０−５４６９９号公報では尿素アミドリ
アーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ
を用いる尿素の測定法が報告されている。該方法は式： ビン酸塩＋ＡＴＰ 、スフエート＋ＣＯ□＋１（２０□ ペルオキシダーゼ （４）発色指示薬十Ｈ，０２□色素 により、尿素を測定する方法である。この方法は尿素ア
ミドリアーゼ中のＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰアーゼと略す
る）の除去が問題となり臨床検査薬の分野で実施に到っ
ていない。

尿素アミドリアーゼは（ＥＣ３，５，１，４５）のこと
であり、さらに前段酵素、ウレアー二酸化炭素リガーゼ
（Ｅ　Ｃ６，３，４，６，）と後段ｆｈ素素子アロファ
ネートアミドハイドロラーゼ分けられる。

しかしながら、尿素アミドリアーゼは副反応として、Ａ
ＴＰアーゼ活性も有しており、上述の組成系では呈色が
安定せず、自然増色する結果となる。つまり、尿素アミ
ドリアーゼの副反応であるＡＴＰアーゼによりＡＴＰが
ＡＤＰに非共扼的に分解され、さらに生成したＡＤＰが
ホスホエノールピルベートの存在下ピルビン酸キナーゼ
によりピルビン酸に変換する。さらに生成したピルビン
酸はピルビン酸オキシダーゼにより過酸化水素を生成し
、発色指示薬を呈色させることになる。反応式で示すと
下記の通りである。

２ＣＯ２＋Ａｉ）Ｐ ビン酸＋ＡＴＰ フェー）＋ＣＯ，＋Ｍ、０゜ つまり、（１）の反応は（１）°の副反応を伴なうので
。

徐々に増色する現象が起こり実際上試薬ブランクが増色
し、正確な測定値を得ることが出来ない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはこの副反応を如何にしたら防止、又は軽減
させることが出来るか種々検討した結果、本発明に到達
することが出来た。

すなわち本発明は液体試料にアデノシン−３−リン酸、
重炭酸塩、２価陽イオン、１価陽イオン及びアルコール
類の存在下、尿素アミドリアーゼする尿素を酵素的に測
定する方法である。

生成するアデノシン−２−リン酸を測定する系において
は、更にホスホエノールピルベート、チアミンピロリン
酸及び発色指示薬の存在下、ピルビン酸キナーゼ及びピ
ルビン酸オキシダーゼを作用させることにより発色させ
光学的に測定する方法である。又、生成するアデノシン
−２−リン酸を測定する系は、ホスホエノールピルベー
ト、ニコチンアミドアｆニンジホスフェ−）　（Ｎ　Ａ
　Ｌ）　）の存在下、ピルビン酸キナーゼ及び孔はデヒ
ドロゲナーゼを作用させ、遣元型二コナンアミドアデニ
ンジホス７エート（ＮＡｉ）Ｈ）の生成全光学的に測駕
する方法もある。

生成した無機リンを測定する系においては更にピルビン
酸、チアミンピロリン酸及び発色指示薬の存在下、ピル
ビン酸オキシダーゼを作用させることにより発色させ光
学的に測定する方法である。

尿素アミドリアーゼは種々の微生物から得られる。調製
法はジャーナルオプバイオロジヵルヶミス　　ト　　リ
　　−　　（Ｊｏｕｒｎａｌ　　　ｏｆ　　　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）出、４１０７
−４１１３．（１９７２）引≠陣ｉ＃含を参考にした。

尿素アミドリアーゼの使用電は０．０１〜１０−で好ま
しくｒｉｏ、１〜０．３．匂である。他の酵素類は市販
品を使用出来、る。

Ｒｂ　又は（、ｓ　　の群から選択される。Ｋが好まし
い。

重炭酸イオン源として任意の適切に可溶性の重炭酸塩、
例えばアルカリ金属塩又はアルカ介ｉ金属塩を使用する
ことが出来る。重炭酸ナトリウム又はカリウムが好まし
い。濃度は０．１〜１００ｍＭ好ましくは１〜５０　ｍ
Ｍ。

発色指示薬系は過酸化水素とペルオキシダーゼを介して
発色する物質を言い、例えば０−ジアニシジン、ロイコ
染料、４−アミノアンチピリン、３−メチルベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン１ＶＩＢＴＨ）及びフェノール又は
その誘導体を言う。

アルコール類の添加は尿素アミドリアーゼと高濃度に接
触させたのち、すぐに利用する方法が一番有効であるが
、添加順序は問わない。

本発明で使用するアルコール類とは脂肪族低級−価アル
コールテアリ、メチルアルコール、エチルアルコール％
ｎ−プロピルアルコール、ｎ−７”チルアルコール、ア
リルアルコール、アミルアルコールなどやそれらの誘導
体？いう。添加濃度は％（′Ｖ／）である。

（発明の効果） 上記測定系にアルコール類を含有させることにより、意
外にも副反応のＡＴＰアーゼのみが抑制され、尿素アミ
ドリアーゼの活性には殆んど影響がなかった。

これは、実際の利用面で非常に有効な手段となる。つま
り、試薬の混合液の自然発色が抑制されることにより、
用手法においても、自動分析機への適用においても経時
的変化を苦慮する必要がなく、尿素の正確な測定が出来
る様になる。

（実施例） 以下、実施例を用いて本発明を説明する。

実施例　１ 下記の組成の反応混液を調製した。

トリス塩酸緩衝液（ｐｉ４７．５　）　　５０ｍＭＫＨ
ＣＯ３１０ｍＭ ＭｆＳＯ４□ＯｍＭ ホスホエノールピルベート　　１．５ｍＭチアミンピロ
リン酸　　　　　０．５ｍＭ４−アミノアンチピリン　
　　０．０１％フェノール　　　　　　　０．０２％ リ　　　ン　　酸　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
Ｆ　Ａ　１）　　　　　１０μＭ ＡＴＰ　　　　　０．２ｍＭ ペルオキシダーゼ　　　　５ｕ／− 、ピルベートキナーゼ　　　３ｕ／− ピルベートオキシダーゼ　３ｕ／− 上記反応混液２．５−に尿素浴液０．２　ｍｌ！　（ｆ
ｉ終０．１７ｍＭ）を加えた後、３７℃、５・分間予備
加温した。なおブランク（盲検）は尿素溶液の代りに蒸
留水とした。

次いで尿素アミドリアーゼ溶液（１５％エチルアルコー
ル添加又は無添加）０．３ｄ（ｉＩｋ終０．１ｕ／−）
を加え、３７℃、３０分間反応させ、分光光度計の５０
０ｎｍの波長で吸光度を経時的に記録した。その結果を
第１図に示す。尿素アミドリアーゼ浴液に１５％エチル
アルコールを加えている方が呈色安定性は無添加に比べ
著しく優れていた。

実施例　２ 実施例１の反応溶液ｚ５−にエチルアルコールを０．３
　ｍ　（＃終１０％）を加え、引き続き尿素溶液０．１
　ｔｄ　（最終０．１７ｍＭ）を加えた後、３７℃、５
分間予備加温した。なお、ブランクは尿素溶液の代りに
蒸留水とした。尿素アミドリアーゼ溶液０、１　ｓｄ　
（最終０．１／、）を加え、３７℃、３０分間反応させ
、その間分光光度計の５００ｎｍの波長で吸光度を経時
的に記録した。その結果を第２図に示す。呈色安定性は
エチルアルコール無添加に比べ添加した方が著しく優れ
ていた。

実施例　３ 下記の組成の反応混液を調製した。

トリス塩酸緩衝液　ｐＨ７，５５０ｍＭＫｆ（ＣＯｓ　
　　　　　　　　　　１０ｍＭＭｙＳ０４１０　ｍＭ ピルビン酸ナトリウム　　　　５ｍＭ チアミンピロリン酸　　　　　０．５ｍＭ４−アミノア
ンチピリン　　　０．０１フエノール　　　　　　　　
　０．０２Ｆ　Ａ　Ｄ　　　　　　　　　　　　１０μ
ＭＡＴＰ　　　　　　　　　　　　０．２ｍＭペルオキ
シダーゼ　　　　　５ｕ／ｍｇベルベートオキシダーゼ
　　３ｕ／− 上記反応混液λ５−に尿素溶液０．２　ｗＩｔ（最終０
．１７ｍＭ）を加えた後、３７℃、５分間予備加温した
。なお、ブランクは尿素溶液の代シに蒸留水とした。尿
素アミドリアーゼ溶液（１５％エチルアルコール添加又
は無添加）０．３ｍ（最終０．１ｕ／、１　）を加え、
３７℃、３０分間反応させ、その間分光光度計の５００
ｎｍの波長で吸光度を経時的に記録した。その結果を第
３図に示す。呈色安定性はエチルアルコール無添加に比
べ添加した方が著しく優れていた。

実施例　４ 実施例１で示した反応混液λ５−に尿素溶液０．２−（
ｉ＆終０．１７ｍＭ）　　を加えた後、３７℃、５分間
予備加温した。なお、ブランクは尿素溶液の代りて蒸留
水とした。尿素アミドリアーゼ溶液（各アルコール：濃
度１５％）０．３ｄ（最終０．１ｕ／ｓｇ）を加え、３
７℃、３０分間反応させ、分光光度計の５００　ｎｍ　
　の波長で吸光度を読んだ。その結果を第１表に示す。

エチルアルコール、メチルアルコールで％に効果があっ
た。

第　　１　　表 実施例　５ 実施列１で示した反応混液２．５−に尿素溶液０、２　
ｍｌ　（ｄ終０．１７ｍＭ）を加えた後、３７℃、５分
間予備加温した。なお、プラ／りは尿素溶液の代りに蒸
留水とした。尿素アミドリアーゼ溶液（エチルアルコー
ル各濃度）０，３ゴ（最終０．１　ｕ／−）を加え、３
７℃、３０分間反応させたのち、分光光度計の５００ｎ
ｍの波長で吸光度を読んだ。

その結果を第４図に示す。１４〜１８％の濃度が最も有
効であった。

実施例　６ 実施例１で示した反応混液２．．６Ｗ＃ｔに人血清０．
１−を加えた後、３７℃、５分間予備加温した。なお、
ブランクは人血清の代りに蒸留水とした。尿素アミドリ
アーゼ溶液（１５％エタノール含有）０、３　ｔｎｔ　
（＊終ｏ、ｘｕ／ｄ）　を加え、３７℃、３０分間反応
させ、分光光度計の５００ｎｍの波長で吸光度を経時的
に記録した。その結果を第５図に示す。エタノール無添
加に比べ呈色安定性は添加した方が著しく優れていた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は尿素溶液を加えた反応混液に尿素アミ
ドリアーゼ溶液を加えた場合の呈色安定性を示す。 第５図は人血清を加えた反応混液に尿素アミドリアーゼ
溶液を加えた場合の呈色安定性を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体試料にアデノシン−３−リン酸、重炭酸塩、
   ２価陽イオン、１価陽イオンおよび低級アルコールの存
   在下、尿素アミドリアーゼを作用させ、生成するアデノ
   シン−２−リン酸、無機リンおよびアンモニアを測定す
   ることを特徴とする尿素の酵素的測定法。
2. （２）生成するアデノシン−２−リン酸をホスホエノー
   ルピルベート、チアミンピロリン酸および発色指示薬の
   存在下、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキシダ
   ーゼを作用させることにより、発色させ、光学的に測定
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の尿素
   の酵素的測定法。
3. （３）生成する無機リンをピルビン酸、チアミンピロリ
   ン酸および発色指示薬の存在下、ピルビン酸オキシダー
   ゼを作用することにより発色させ、光学的に測定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の尿素の酵素
   的測定法。