JPH01291800A - 無機リン定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中の無機リンを定量する無機リン定量用
試薬に関するものである。

（従来の技術） 現在、無機リンの測定は、フイスケ　サバロー（Ｆｉｓ
ｋｅ−５ｕｂｂａｒｏｗ）法に代表されるように試料に
モリブデン酸塩を加えた後、塩化第−スズ、アミノナフ
トールスルホン酸、ヒドラジン、アスコルビン酸、硫酸
第一鉄、マラカイトグリーンなどの還元剤を加えること
によって生成するモリブデンブルーを比色する方法が一
般的である。しかし。

これらの方法においては１重金属であるモリブデンを含
む廃液を生じる他に、使用する機器の腐食や色素の吸着
が生じるという問題がある。また。

血清中の無機リンを測定するためには、除蛋白操作ある
いはトリクロロ酢酸を添加するなど前処理を必要とする
ことも迅速で多数の試料を測定することの障害となる。

そこで、モリブデン廃液を生じず、前処理の必要のない
無機リンの測定法として酵素法が数種提案されている。

この測定法に用いられる試薬としてホスホリラーゼａを
用いる試薬（パイオケミシエ　ツアイトシュリフト　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｚｅｉｔｓ　−ｃｈｒｉｆｔ
　　３４４巻　２１２頁　１９６６年、アナリテイカル
　バイオケミストリー　八ｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　　１９巻　３００頁　１９６７年）
。

グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素を用いる試薬（
アナリテイカル　バイオケミストリー　Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４５巻　２７７
頁　１９７２年及び４９巻　８８頁　１９７２年）、マ
ルトースホスホリラーゼを用いる試薬（特開昭５６−３
９７９９号公報）、ピルビン酸オキシダーゼを用いる試
薬（特公昭５９−１５６３７号公報）、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼを用いる試薬（アナリテイカル　バ
イオケミストリー　八ｒ＋ａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　５５巻３７９頁　１９７３年
、アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミ
ストリーΔｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　４５巻　１８０
１頁　１９８１年）がある。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、上記の酵素法に用いられる試薬は、以下
に述べるような種々の問題点を有している。

すなわち、ホスホリラーゼａを用いる試薬の測定原理は
グリコーゲンと無機リンとからホスホリラーゼａによっ
て生じさせたグルコース１リン酸をホスホグルコムター
ゼによってグルコース６リン酸に変換させた後、このグ
ルコース６リン酸とＮ７〜ＤＰ＋とからグルコース６リ
ン酸脱水素酵素によって生成したＮＡＤＰＨの吸光度で
測定するものであるが、この試薬はホスホリラーゼａの
無機リンに対するＫｍ値が数ｍＭと大きいため、血清な
どの１ｍＭ以下の無機リン含有試料を測定するには。

反応終結までの時間が長くなるという問題がある。

また、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素醇素を用いる
試薬の測定原理はグリセルアルデヒド３リン酸と無機リ
ン及びＮＡＤ”をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵
素によって１．３−ジホスホグリセルアルデヒド３リン
酸及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを生じさせて、このＮＡＤＨの吸
光度をもって無機リンを測定するものであるが、この試
薬はグリセルアルデヒド３リン酸が不安定な基質である
ため、さらにフルクトースニリン酸を基質としてアルド
ラーゼ、トリオースホスフェ−［−イソメラーゼを用い
てグリセルアルデヒド３リン酸を生じさせる系を付加す
る必要があり、しかも１反応系全体の平衡を無機リンの
消費方向に傾けるには生成したＡＴＰを消費させる系と
してＡＤＰ、３ホスホグリセロキナーゼ、グルコース、
ヘキソキナーゼなどを付加する必要がある。このため、
この試薬は無機リン定量のための本質的な反応系の他に
３種類の酵素とこれらの基質を必要とするため、複雑で
高価な試薬系となる。

次にマルトースホスホリラーゼを用いる試薬の測定原理
はマルトースと無機リンとからマルトースホスホリラー
ゼによって生じさせたβ−グルコースｌリン酸をβ−ホ
スホグルコムターゼによってグルコース６リン酸に変換
させた後、このグルコース６リン酸とＮＡＤＰ”とから
グルコース６リン酸脱水素酵素によって生成したＮ　Ａ
　Ｄ　Ｐ　Ｈの吸光度で測定するものであるが、この試
薬は前記したホスホリラーゼａを用いる試薬と同じく、
マルトースホスホリラーゼの無機リンに対するＫｍ値が
大きいため、血清などの１ｍＭ以下の無機リン含有試料
を測定するには１反応終結までの時間が長くなるという
問題がある。

さらにピルビン酸オキシダーゼを用いる試薬の測定原理
はピルビン酸と無機リンとからピルビン酸オキシダーゼ
によって生じさせた過酸化水素をペルオキシダーゼによ
って４−アミノアンチピリンとフェノール等を縮合１発
色させる系に導いて測定するものであるが、この試薬は
比色するため。

常に無機リン標準液を用いて無機リンの定量を行なわな
ければならず、また５分子状酸素を必要とすることから
、試料中の溶存酸素の不足の問題が生じる他、試料中の
アスコルビン酸などの共存物質の影響を受けるため、そ
れらを共存物質ごとに前処理を行なわなければならない
という問題がある。さらにはピルビン酸オキシダーゼ溶
液は極めて不安定であるという問題がある。

また、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いる試薬
の測定原理はイノシンと無機リンとからプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼによって生じさせたヒボキサンチン
をキサンチンオキシダーゼによって酸化させて過酸化水
素を発生させ１発生させた過酸化水素をペルオキシダー
ゼによって４＝アミノアンチピリンとフェノール等を縮
合３発色させる系に導いて測定するものであるが、この
試薬は前記したピルビン酸オキシダーゼを用いる試薬と
同様の問題がある。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、上記のごとき酵素法に用いられる試薬の問
題点を解決するために鋭意研究の結果。

無機リン定量用試薬にアセチルコエンザイムＡ及びホス
ホトランスアセチラーゼが利用できることを見出し２本
発明に到達したものである。

すなわち９本発明はアセチルコエンザイムＡ及びホスホ
トランスアセチラーゼを成分とする無機リン定量用試薬
を要旨とするものである。

本発明の試薬はアセチルコエンザイムＡ（以下Ａｃｅ　
ｔｙ　１ｃｏＡと略記する。）及びホスホトランスアセ
チラーゼ（以下ＰＴＡと略記する。）が成分であり、そ
の他の成分としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（リン酸）〔以下ＮＡＤ　（Ｐ）と略記する。〕
、アデノシン５”　−二リン酸（以下ＡＤＰと略記する
。）、グルコース、ヘギソキナーゼ（以下ＨＫと略記す
る。）又はグルコキナーゼ（以下ＧｌｃＫと略記する。

）、酢酸キナーゼ（以下ＡＫと略記する。）、グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ　６　Ｐ　Ｄ　Ｈと
略記する。）などがあげられる。

本発明の試薬は上記以外に通常の賦活剤、安定化剤、防
腐剤等の添加物を含んでいてもよい。

本発明の試薬の各成分の濃度としては２例えば。

八ｃｅｔｙｌｃｏＡ　　を０．０５〜１０ｍＭ、　　　
Ｐ　Ｔ　Ａを０．０５〜２０Ｕ／ｍ６．ＡＫを０．１〜
５０Ｕ／　ｍ　ＩＩ　、　　ＨＫ又はＣ１ｃＫを０．１
〜５０Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＩＩを０．１〜５０Ｕ　／　
ｍ　ｌ　、グルコースを１〜１００ｍＭ、　Ｎ　Ａ　Ｄ
　（Ｐ　）を０．０５〜０．４ｍＭ、　　Ａ　Ｄ　Ｐを
０．０５〜２０ｍＭ　、塩化マグネシウムを１〜１００
ｍＭ、又は塩化マンガンを１〜１０ｍＭとなるように使
用すればよく、特にＡｃｅ　ｔｙ　１ｃｏＡを０．１〜
５ｍＭ、ＰＴＡを０．１〜１０Ｕ／ｒｎｆ、ＡＫを０．
５〜１００／　ｍ　１．　、　　ＨＫ又はＧｌ　ｃＫを
０．５〜ＩＯＵ／ｍ＃、Ｇ６ＰＤｔＩを０．５〜］、Ｏ
Ｕ　／　ｍ　／！　。

グルコースを５〜３０ｍＭ、ＮＡＤ　（Ｐ）を０．１〜
０゜３ｍＭ、ＡＤＰを０．１〜２Ｏｎ＋Ｍ、塩化マグネ
シウムを１０〜２０１）ＩＭとなるように使用すること
が好ましい。

本発明に用いられるＰＴＡとしては、試薬全体の安定性
を高めるため、最適生育温度が５０°Ｃないし８５℃で
ある微生物由来のものが好ましい。そのような微生物と
しては２例えば、バチルス・ステアロザーモフイルス、
バチルス・サーモブロテオリカス、バチルス・アシドカ
ルダリウスなどのバチルス属、サーモアクチノマイセス
属、サーマス属、サーモミクＩコビウム属などの微生物
があげられる。これらの中でも特にバチルス・ステアロ
サーモフィルスが好ましく、その具体例としては。

ＡＴＣＣ７９３３，７９５４，１０１９４，１２９８０
、ＮＣＡ１５３０．ＵＫ５６３株（微工研菌第７２７５
号、ＦＥＲＭＰ−７２７５，昭和５８年９月２９日寄託
）等がある。

また、ＰＴＡ以外の酵素としては、微生物由来のもの、
動物由来のものなど各１重のものを使用することができ
るが、中でも上記の最適生育温度が５０℃ないし８５゛
Ｃである微生物由来のものが好ましい。

本発明の試薬を用いて無機リンを測定するには。

、例えば、試薬を測定温度（２５℃、３０℃、３７℃の
いずれでもよい、）に約３分間保温し、その後セル室を
保温した分光光度計に入れたのら、サンプルを混合し、
３４０ｎｍにおける吸光度の上昇又は減少を測定すれば
よい。サンプルを混合した後の反応時間としては、１〜
３０分間で任意に選択できるが、自動分析器の測定条件
に適応するためには２〜５分程度が好ましい。

（作用） 本発明の試薬の測定原理を以下に示す。

（実施例） 次に９本発明を実施例によって具体的に説明する。

実施例１ バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓ　ｔ　ｅ　ａ　ｒ　ｏ　ｔ　リエ町１）工１　ｕ　ｓ
　）由来のＰＴＡ、ＡＫ、ＧｌｃＫ（生化学工業株式会
社より購入）をそれぞれ０．３，５，３Ｕ／ｍｎ、ｏイ
コノストック・メセンテロイデス店鼎−９凱郊−坏Ｌ」
９ｓｅｎｔｅ靭力埴））由来のＧ６ＰＤＨ（オリエンタ
ル酵母株式会社より購入）３Ｕ／ｍｌ、ＡＤＰ２ｍＭ、
ＮＡＤＰｏ、２ｍＭ、グルコース２０ｍ　Ｍ、　Ａｃｅ
ｔｙｌＣｏＡ　　１　ｍ　Ｍ、塩化マグネシウム２０ｍ
Ｍ及びトリス緩衝液（ｐＨ７，５）１００ｍＭからなる
試薬を調製した。

次に、無機リン標準液としての濃度が５．１０゜１５、
２０ｍ　ｇ　／　ｄ　ｌであるリン酸二カリウム水溶液
を調製した。

測定は、光路長１　ｃｍのキュベツト中に３０℃で３分
間予備加温した３ｍ！！、の試薬に上記の各濃度の無機
リン標準液０．０１ｍ　（！を添加し、３４０ｎｍにお
ける１分間あたりの吸光度変化を測定した。

その結果を第１図に示す。

第１図は３４０ｎｍにおける吸光度変化量と無機リン濃
度との関係を示したもので、吸光度変化量と無機リン濃
度とが直線関係にあることがわかる。

このように本発明の試薬は、正確な定量性が示されてい
ることが明らかである。

また１本発明の試薬は　ｇＪｑ製した後冷蔵保存し２週
間後も支障なく使用することができ、良好な保存安定性
を有している。

（発明の効果） 本発明の試薬は、従来のモリブデンブルー法と良好な相
関を示すとともに、短時間で、かつ安価に、しかも血中
共存物質の影習を受けずに、前処理をも必要とせずに試
料中の無機リンを測定することができる。

その上２本発明の試薬は、溶液状態での保存安定性が極
めて良い。

【図面の簡単な説明】

第１図は７本発明の試薬による３４０ｎｍにおける１分
間あたりの吸光度変化量と無機９７２４度との関係を示
す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アセチルコエンザイムＡ及びホスホトランスアセ
   チラーゼを成分とする無機リン定量用試薬。