JPH07121233B2 - 無機リン定量用試薬 - Google Patents
無機リン定量用試薬Info
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- JPH07121233B2 JPH07121233B2 JP22010086A JP22010086A JPH07121233B2 JP H07121233 B2 JPH07121233 B2 JP H07121233B2 JP 22010086 A JP22010086 A JP 22010086A JP 22010086 A JP22010086 A JP 22010086A JP H07121233 B2 JPH07121233 B2 JP H07121233B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，試料中の無機リンを定量する無機リン定量用
試薬に関するものである。
試薬に関するものである。
（従来の技術） 現在，無機リンの測定は，フイスケ サバロー（Fiske
−Subbarow）法に代表されるように試料にモリブデン酸
塩を加えた後，塩化第一スズ，アミノナフトールスルホ
ン酸，ヒドラジン，アスコルビン酸，硫酸第一鉄，マラ
カイトグリーンなどの還元剤を加えることによって生成
するモリブデン青を比色する方法が一般的である。しか
し，これらの方法においては，重金属であるモリブデン
を含む廃液を生じる他に，使用する機器の腐食や色素の
吸着が生じるという問題がある。また，血清中の無機リ
ンを測定するためには，除蛋白操作あるいはトリクロロ
酢酸を添加するなど前処理を必要とすることも迅速で多
数の試料を測定することの障害となる。
−Subbarow）法に代表されるように試料にモリブデン酸
塩を加えた後，塩化第一スズ，アミノナフトールスルホ
ン酸，ヒドラジン，アスコルビン酸，硫酸第一鉄，マラ
カイトグリーンなどの還元剤を加えることによって生成
するモリブデン青を比色する方法が一般的である。しか
し，これらの方法においては，重金属であるモリブデン
を含む廃液を生じる他に，使用する機器の腐食や色素の
吸着が生じるという問題がある。また，血清中の無機リ
ンを測定するためには，除蛋白操作あるいはトリクロロ
酢酸を添加するなど前処理を必要とすることも迅速で多
数の試料を測定することの障害となる。
そこで，モリブデン廃液を生じず，前処理の必要のない
無機リンの測定法として酸素法が数種提案されている。
この測定法に用いられる試薬としてホスホリラーゼａを
用いる試薬（バイオケミシエ ツアイトシユリフト Bi
ochemische Zeitschrift 344巻 212頁 1966年，アナ
リテイカル バイオケミストリー Analytical Biochem
istry 19巻 300頁 1967年），グリセルアルデヒド３
リン酸脱水素酸素を用いる試薬（アナリテイカル バイ
オケミストリー Analytical Biochemistry 45巻 27
7頁 1972年及び49巻 88頁 1972年），マルトースホ
スホリラーゼを用いる試薬（特開昭56−39799号公
報），ピルビン酸オキシダーゼを用いる試薬（特公昭59
−15637号公報），プリンヌクレオシドホスフオリラー
ゼを用いる試薬（アナリテイカル バイオケミストリー
Analytical Biochemistry 55巻 379頁 1973年，ア
グリカルチユラル アンド バイオロジカル ケミスト
リー Agricultural And Biological Chemistry 45巻
1801頁 1981年）がある。
無機リンの測定法として酸素法が数種提案されている。
この測定法に用いられる試薬としてホスホリラーゼａを
用いる試薬（バイオケミシエ ツアイトシユリフト Bi
ochemische Zeitschrift 344巻 212頁 1966年，アナ
リテイカル バイオケミストリー Analytical Biochem
istry 19巻 300頁 1967年），グリセルアルデヒド３
リン酸脱水素酸素を用いる試薬（アナリテイカル バイ
オケミストリー Analytical Biochemistry 45巻 27
7頁 1972年及び49巻 88頁 1972年），マルトースホ
スホリラーゼを用いる試薬（特開昭56−39799号公
報），ピルビン酸オキシダーゼを用いる試薬（特公昭59
−15637号公報），プリンヌクレオシドホスフオリラー
ゼを用いる試薬（アナリテイカル バイオケミストリー
Analytical Biochemistry 55巻 379頁 1973年，ア
グリカルチユラル アンド バイオロジカル ケミスト
リー Agricultural And Biological Chemistry 45巻
1801頁 1981年）がある。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら，上述の酸素法に用いられる試薬は，以下
に述べるような種々の問題点を有している。
に述べるような種々の問題点を有している。
すなわち，ホスホリラーゼａを用いる試薬の測定原理は
グリコーゲンと無機リンとからホスホリラーゼａによっ
て生じさせたグルコース１リン酸をホスホグルコムター
ゼによてグルコース６リン酸に変換させた後，このグリ
コース６リン酸とNADP+とからグリコース６リン酸脱水
素酵素によって生成したNADPHの吸光度で測定するもの
であるが，この試薬はホスホリラーゼａの無機リンに対
するKm値が数mMと大きいため，血清など1mM以下の無機
リン含有試料を測定するには，反応終結までの時間が長
くなるという問題がある。
グリコーゲンと無機リンとからホスホリラーゼａによっ
て生じさせたグルコース１リン酸をホスホグルコムター
ゼによてグルコース６リン酸に変換させた後，このグリ
コース６リン酸とNADP+とからグリコース６リン酸脱水
素酵素によって生成したNADPHの吸光度で測定するもの
であるが，この試薬はホスホリラーゼａの無機リンに対
するKm値が数mMと大きいため，血清など1mM以下の無機
リン含有試料を測定するには，反応終結までの時間が長
くなるという問題がある。
また，グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素を用いる
試薬の測定原理はグリセルアルデヒド３リン酸と無機リ
ン及びNAD+をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素に
よって1,3−ジホスホグリセルアルデヒド３リン酸及びN
ADHを生じさせて，このNADHの吸光度をもって無機リン
を測定するものであるが，この試薬はグリセルアルデヒ
ド３リン酸が不安定な基質であるため，さらにフルクト
ース二リン酸を基質としてアルドラーゼ，トリオースホ
スフエートイソメラーゼを用いてグリセルアルデヒド３
リン酸を生じさせる系を付加する必要があり，しかも，
反応系全体の平衡を無機リンの消費方向に傾けるには生
成したATPを消費させる系としてADP,3ホスホグリセロキ
ナーゼ，グルコース，ヘキソキナーゼなどを付加する必
要がある。このため，この試薬は無機リン定量のための
本質的な反応系の他に３種類の酵素とこれらの基質を必
要とするため，複雑で高価な試薬系となる。
試薬の測定原理はグリセルアルデヒド３リン酸と無機リ
ン及びNAD+をグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素に
よって1,3−ジホスホグリセルアルデヒド３リン酸及びN
ADHを生じさせて，このNADHの吸光度をもって無機リン
を測定するものであるが，この試薬はグリセルアルデヒ
ド３リン酸が不安定な基質であるため，さらにフルクト
ース二リン酸を基質としてアルドラーゼ，トリオースホ
スフエートイソメラーゼを用いてグリセルアルデヒド３
リン酸を生じさせる系を付加する必要があり，しかも，
反応系全体の平衡を無機リンの消費方向に傾けるには生
成したATPを消費させる系としてADP,3ホスホグリセロキ
ナーゼ，グルコース，ヘキソキナーゼなどを付加する必
要がある。このため，この試薬は無機リン定量のための
本質的な反応系の他に３種類の酵素とこれらの基質を必
要とするため，複雑で高価な試薬系となる。
次にマルトースホスホリラーゼを用いる試薬の測定原理
はマルトースと無機リンとからマルトースホスホリラー
ゼによって生じさせたβ−グルコース１リン酸をβ−ホ
スホグルコムターゼによってグルコース６リンに変換さ
せた後，このβ−グルコース６リン酸とNADP+とからグ
ルコース６リン酸脱水素酵素によって生成したNADPHの
吸光度で測定するものであるが，この試薬は前記したホ
スホリラーゼａを用いる試薬と同じく，マルトースホス
ホリラーゼの無機リンに対するKm値が大きいため，血清
などの1mM以下の無機リン含有試料を測定するには，反
応終結までの時間が長くなるという問題がある。
はマルトースと無機リンとからマルトースホスホリラー
ゼによって生じさせたβ−グルコース１リン酸をβ−ホ
スホグルコムターゼによってグルコース６リンに変換さ
せた後，このβ−グルコース６リン酸とNADP+とからグ
ルコース６リン酸脱水素酵素によって生成したNADPHの
吸光度で測定するものであるが，この試薬は前記したホ
スホリラーゼａを用いる試薬と同じく，マルトースホス
ホリラーゼの無機リンに対するKm値が大きいため，血清
などの1mM以下の無機リン含有試料を測定するには，反
応終結までの時間が長くなるという問題がある。
さらにピルビン酸オキシダーゼを用いる試薬の測定原理
はピルビン酸と無機リンとからピルビン酸オキシダーゼ
によって生じさせた過酸化水素をペルオキシダーゼによ
って４−アミノアンチピリンとフエノール等を縮合，発
色させる系に導いて測定するものであるが，この試薬は
比色するため，常に無機リン標準液を用いて無機リンの
定量を行わなければならず，また，分子状酸素を必要と
することから，試料中の溶存酸素の不足の問題が生じる
他，試料中のアスコルビン酸などの共存物質の影響を受
けるため，それらを共存物質ごとに前処理を行なわなれ
けばならないという問題がある。さらにはピルビン酸オ
キシダーゼ溶液は決めて不安定であるという問題があ
る。
はピルビン酸と無機リンとからピルビン酸オキシダーゼ
によって生じさせた過酸化水素をペルオキシダーゼによ
って４−アミノアンチピリンとフエノール等を縮合，発
色させる系に導いて測定するものであるが，この試薬は
比色するため，常に無機リン標準液を用いて無機リンの
定量を行わなければならず，また，分子状酸素を必要と
することから，試料中の溶存酸素の不足の問題が生じる
他，試料中のアスコルビン酸などの共存物質の影響を受
けるため，それらを共存物質ごとに前処理を行なわなれ
けばならないという問題がある。さらにはピルビン酸オ
キシダーゼ溶液は決めて不安定であるという問題があ
る。
また，プリンヌクレオシドホスフオリラーゼを用いる試
薬の測定原理はイノシンと無機リンとからプリンヌクレ
オシドホスフオリラーゼによって生じさせたヒポキサン
チンをキサンチンオキシダーゼによって酸化させて過酸
化水素を発生させ，発生させた過酸化水素をペルオキシ
ダーゼによって４−アミノアンチピリンとフエノール等
を縮合，発色させる系に導いて測定するものであるが，
この試薬は前記したピルビン酸オキシダーゼを用いる試
薬と同様の問題がある。
薬の測定原理はイノシンと無機リンとからプリンヌクレ
オシドホスフオリラーゼによって生じさせたヒポキサン
チンをキサンチンオキシダーゼによって酸化させて過酸
化水素を発生させ，発生させた過酸化水素をペルオキシ
ダーゼによって４−アミノアンチピリンとフエノール等
を縮合，発色させる系に導いて測定するものであるが，
この試薬は前記したピルビン酸オキシダーゼを用いる試
薬と同様の問題がある。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは，上記のごとき酵素法に用いられる試薬の
問題点を解決するために鋭意研究した結果，無機リン定
量用試薬にグルタミンシンセターゼが利用できることを
見出し，本発明に到達したものである。
問題点を解決するために鋭意研究した結果，無機リン定
量用試薬にグルタミンシンセターゼが利用できることを
見出し，本発明に到達したものである。
すなわち，本発明はグルタミンシンセターゼ，アデノシ
ン二リン酸，グルタミン，金属イオン及びこれらと無機
リンとの反応により生成するアデノシン三リン酸，グル
タミン酸又はアンモニアを検出する酵素系からなる無機
リン定量用試薬を要旨とするものである。
ン二リン酸，グルタミン，金属イオン及びこれらと無機
リンとの反応により生成するアデノシン三リン酸，グル
タミン酸又はアンモニアを検出する酵素系からなる無機
リン定量用試薬を要旨とするものである。
本発明の試薬はグスタミンシンセターゼ，アデノシン二
リン酸（ADP），グルタミン及びマグネシウムイオン又
はマンガンイオンなどの金属イオンが主成分であり，こ
の他に，反応により生成するグルタミン酸を検出する酵
素系，アデノシン三リン酸（ATP）を検出する酵素系又
はアンモニアを検出する酵素系を含んでいる。このATP
を検出する酵素系（）としては，例えば，ヘキソキナ
ーゼ又はグルコキナーゼ，グルコース６リン酸脱水素酵
素，グルコース,NADP+を主成分とする酵素系があげら
れ，また，グルタミン酸を検出する酵素系（）として
は，例えばグルタミン酸脱水素酵素,NADP+又はNAD+を主
成分とする酵素系があげられ，さらに，アンモニアを検
出する酵素系（）としては，例えば，グルタミン酸水
素酵素,2−オキソグルタル酸,NADPH又はNADHを主成分と
する酵素系があげられる。
リン酸（ADP），グルタミン及びマグネシウムイオン又
はマンガンイオンなどの金属イオンが主成分であり，こ
の他に，反応により生成するグルタミン酸を検出する酵
素系，アデノシン三リン酸（ATP）を検出する酵素系又
はアンモニアを検出する酵素系を含んでいる。このATP
を検出する酵素系（）としては，例えば，ヘキソキナ
ーゼ又はグルコキナーゼ，グルコース６リン酸脱水素酵
素，グルコース,NADP+を主成分とする酵素系があげら
れ，また，グルタミン酸を検出する酵素系（）として
は，例えばグルタミン酸脱水素酵素,NADP+又はNAD+を主
成分とする酵素系があげられ，さらに，アンモニアを検
出する酵素系（）としては，例えば，グルタミン酸水
素酵素,2−オキソグルタル酸,NADPH又はNADHを主成分と
する酵素系があげられる。
本発明の試薬は上記以外の通常の賦活剤を含んでいても
よい。
よい。
本発明の試薬の各成分の濃度としては，例えば,ADPを0.
05〜100mM,グルタミンを１〜200mM,塩化マグネシウムを
１〜100mM,又は塩化マンガンを１−10mM,グルタミンシ
ンセターゼを0.01〜100U/mlとなるように使用すればよ
く，特にADPを0.1〜20mM,グルタミンを20〜50mM,塩化マ
グネシウムを10〜20mM,グルタミンシンセターゼを20〜5
0U/mlとなるように使用することが好ましい。
05〜100mM,グルタミンを１〜200mM,塩化マグネシウムを
１〜100mM,又は塩化マンガンを１−10mM,グルタミンシ
ンセターゼを0.01〜100U/mlとなるように使用すればよ
く，特にADPを0.1〜20mM,グルタミンを20〜50mM,塩化マ
グネシウムを10〜20mM,グルタミンシンセターゼを20〜5
0U/mlとなるように使用することが好ましい。
また,ATPを検出する酵素系（）を各成分の濃度として
は，例えば，グルコースを0.1〜100mM,NADP+を0.1〜50m
M,ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを0.01〜100U/ml,
グルコース６リン酸脱水素酵素を0.01〜100U/mlとなる
ように使用することが好ましく，特に，グルコースを１
〜20mM,NADP+を0.5〜5mM,ヘキソキナーゼ又はグルコキ
ナーゼを１〜10U/ml,グルコース６リン酸脱水素酵素を
0.1〜10U/mlとなるように使用することが好ましい。
は，例えば，グルコースを0.1〜100mM,NADP+を0.1〜50m
M,ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを0.01〜100U/ml,
グルコース６リン酸脱水素酵素を0.01〜100U/mlとなる
ように使用することが好ましく，特に，グルコースを１
〜20mM,NADP+を0.5〜5mM,ヘキソキナーゼ又はグルコキ
ナーゼを１〜10U/ml,グルコース６リン酸脱水素酵素を
0.1〜10U/mlとなるように使用することが好ましい。
グルタミン酸を検出する酵素系（）の各成分の濃度と
しては，例えば,NAD+又はNADP+を0.1〜50mM,グルタミン
酸脱水素酵素を１〜100U/mlとなるように使用すること
が好ましく，特に,NAD+又はNADP+を0.5〜50mM,グルタミ
ン酸脱水素酵素を10〜100U/mlとなるように使用するこ
が好ましい。
しては，例えば,NAD+又はNADP+を0.1〜50mM,グルタミン
酸脱水素酵素を１〜100U/mlとなるように使用すること
が好ましく，特に,NAD+又はNADP+を0.5〜50mM,グルタミ
ン酸脱水素酵素を10〜100U/mlとなるように使用するこ
が好ましい。
アンモニアを検出する酵素系（）の各成分の濃度とし
ては，例えば,2−オキソグルタル酸を0.1〜10mM,NADH又
はNADPHを0.05〜0.5mM,グルタミン酸脱水素酵素を0.1〜
50U/mlとなるように使用することが好ましい。
ては，例えば,2−オキソグルタル酸を0.1〜10mM,NADH又
はNADPHを0.05〜0.5mM,グルタミン酸脱水素酵素を0.1〜
50U/mlとなるように使用することが好ましい。
本発明に用いられるグルタミンシンセターゼとしては，
試薬全体の安定生を高めるため，最適生育温度が50℃な
いし85℃である微生物由来のものが好ましい。そのよう
な微生物としては，例えばバシルス・ステアロサーモフ
イルス，バチルス・サーモプロテオリカス，バチルス・
アシドカルダリウスなどのバチルス属，サーモアクチノ
マイセス属，サーマス属，サーモミクロビウム属などの
微生物があげられる。これらの中でも特にバチルス・ス
テアロサーモフイルスが好ましく，その具体例として
は,ATCC7933,7954,10194,12980,NCA1530,UK563株（微工
研菌第7275号,FERMP−7275,昭和58年９月29日寄託）等
がある。
試薬全体の安定生を高めるため，最適生育温度が50℃な
いし85℃である微生物由来のものが好ましい。そのよう
な微生物としては，例えばバシルス・ステアロサーモフ
イルス，バチルス・サーモプロテオリカス，バチルス・
アシドカルダリウスなどのバチルス属，サーモアクチノ
マイセス属，サーマス属，サーモミクロビウム属などの
微生物があげられる。これらの中でも特にバチルス・ス
テアロサーモフイルスが好ましく，その具体例として
は,ATCC7933,7954,10194,12980,NCA1530,UK563株（微工
研菌第7275号,FERMP−7275,昭和58年９月29日寄託）等
がある。
また，グルタミンシンセターゼ以外の酵素としては，微
生物由来のもの，動物由来のものなど各種のものを使用
することができるが，中でも上記の最適生育温度が50℃
ないし85℃である微生物由来のものが好ましい。
生物由来のもの，動物由来のものなど各種のものを使用
することができるが，中でも上記の最適生育温度が50℃
ないし85℃である微生物由来のものが好ましい。
本発明の試薬を用いて無機リンを測定するには，例え
ば，試薬を測定温度（25℃,30℃,37℃のいずれでもよ
い。）に約３分間保温し，その後セル室を保温した分光
光度計に入れたのち，サンプルを混合し,340nmにおける
吸光度の上昇又は減少を測定すればよい。サンプルを混
合した後の反応時間としては,1〜30分間で任意に選択で
きるが，自動分析器の測定条件に適応するためには２〜
５分程度が好ましい。
ば，試薬を測定温度（25℃,30℃,37℃のいずれでもよ
い。）に約３分間保温し，その後セル室を保温した分光
光度計に入れたのち，サンプルを混合し,340nmにおける
吸光度の上昇又は減少を測定すればよい。サンプルを混
合した後の反応時間としては,1〜30分間で任意に選択で
きるが，自動分析器の測定条件に適応するためには２〜
５分程度が好ましい。
（作用） 本発明の試薬の測定原理を以下に示す。
ATPを検出する酵素系 グルタミン酸を検出する酵素系 アンモニアを検出する酵素系 （実施例） 次に，本発明の実施例によって具体的に説明する。
実施例１ ADP5mM,NADP+1.44mM,L−グルタミン50mM,グルコース20m
M,塩化マグネシウム20mM,バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）由来のグルコ
キナーゼ5U/ml（生化学工業社製），バチルス・ステア
サーモフイルス（Bacillus stearothermophilus）由来
のグルタミンシンセターゼ5U/ml,ロイコノストツク・メ
センテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来の
グルコース６リン酸脱水素酵素1U/ml（オリエンタル酵
母社製）及びイミダゾール−塩酸緩衝液（pH6.5）50mM
からなる試薬を調製した。
M,塩化マグネシウム20mM,バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）由来のグルコ
キナーゼ5U/ml（生化学工業社製），バチルス・ステア
サーモフイルス（Bacillus stearothermophilus）由来
のグルタミンシンセターゼ5U/ml,ロイコノストツク・メ
センテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来の
グルコース６リン酸脱水素酵素1U/ml（オリエンタル酵
母社製）及びイミダゾール−塩酸緩衝液（pH6.5）50mM
からなる試薬を調製した。
次に，この試薬0.5mlを37℃で３分間加温して340nmにお
ける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおげる吸光
度変化を測定した。
ける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおげる吸光
度変化を測定した。
その結果を第１図に示す。
第１図は340nmにおける吸光度変化量と無機リン濃度と
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直接関係にあることわか
る。
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直接関係にあることわか
る。
実施例２ 実施例１で調製した試薬0.5mlを37℃で３分間加温して3
40nmにおける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機
リン標準液0.02mlを添加し，吸光度が一定になるまでの
時間を測定した。
40nmにおける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機
リン標準液0.02mlを添加し，吸光度が一定になるまでの
時間を測定した。
その結果を表１に示す。
表１より,0.1〜30mg/dlの無機リン濃度に対して反応終
結時間がほぼ３分以内であり，広い無機リン濃度範囲に
対して極めて短時間に測定が終了することが明らかであ
る。
結時間がほぼ３分以内であり，広い無機リン濃度範囲に
対して極めて短時間に測定が終了することが明らかであ
る。
実施例３ 実施例１で調製した試薬0.5mlを37℃で３分間加温して3
40nmにおける初期吸光度を測定した後，各種血清0.02ml
を添加して340nmにおける吸光度変化を測定して無機リ
ン濃度を求めた。
40nmにおける初期吸光度を測定した後，各種血清0.02ml
を添加して340nmにおける吸光度変化を測定して無機リ
ン濃度を求めた。
また，市販のPhosphor B−Test（モリブデンブルー法，
和光純薬社製）を用いて上記血清の無機リン濃度を測定
して二者の相関性を調べた。
和光純薬社製）を用いて上記血清の無機リン濃度を測定
して二者の相関性を調べた。
その結果を第２図に示す。
第２図は本発明の試薬を用いて測定した無機リン濃度
と，市販のPhosphor B−Testを用いて測定した無機リン
濃度との相関を示すもので，両者は極めて良い相関性を
示している。
と，市販のPhosphor B−Testを用いて測定した無機リン
濃度との相関を示すもので，両者は極めて良い相関性を
示している。
実施例４ 実施例１で調製した試薬0.5mlに各種濃度のアスコルビ
ン酸ナトリウム溶液0.1mlを加え,37℃で３分間加温して
340nmにおける初期吸光度を測定した後,3mg/dlの無機リ
ン標準液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおけ
る吸光度変化を測定した。
ン酸ナトリウム溶液0.1mlを加え,37℃で３分間加温して
340nmにおける初期吸光度を測定した後,3mg/dlの無機リ
ン標準液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおけ
る吸光度変化を測定した。
その結果を第３図に示す。
第３図は340nmにおける吸光度変化量とアスコルビン酸
の濃度との関係を示すもので，アスコルビン酸の濃度に
関係なく無機リンが測定できることが明らかである。
の濃度との関係を示すもので，アスコルビン酸の濃度に
関係なく無機リンが測定できることが明らかである。
実施例５ ADP5mM,NADP+1.44mM,L−グルタミン50mM,グルコース20m
M,塩化マグネシウム20mM,グルタミン酸脱水素酵素20U/m
l（ベーリンガー・マンハイム社製），グルタミンシン
セターゼ5U/ml及びイミダゾール−塩酸緩衝液（pH7.5）
からなる試薬を調製した。
M,塩化マグネシウム20mM,グルタミン酸脱水素酵素20U/m
l（ベーリンガー・マンハイム社製），グルタミンシン
セターゼ5U/ml及びイミダゾール−塩酸緩衝液（pH7.5）
からなる試薬を調製した。
次に，この試薬0.5mlを37℃で３分間加温して340nmにお
げる初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおける吸光
度変化を測定した。
げる初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおける吸光
度変化を測定した。
その結果を第４図に示す。
第４図は340nmにおける吸光度変化量と無機リン濃度と
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直接関係にあることがわか
る。
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直接関係にあることがわか
る。
実施例６ ADP5mM,NADPH0.26mM,L−グルタミン50mM,塩化マグネシ
ウム50mM,グルタミン酸脱水素酵素10U/ml（ベーリンガ
ー・マンハイム社製），グルタミンシンセターゼ5U/ml,
2−オキソグルタル酸5mM及びイミダゾール−塩酸緩衝液
（pH7.0）からなる試薬を調製した。
ウム50mM,グルタミン酸脱水素酵素10U/ml（ベーリンガ
ー・マンハイム社製），グルタミンシンセターゼ5U/ml,
2−オキソグルタル酸5mM及びイミダゾール−塩酸緩衝液
（pH7.0）からなる試薬を調製した。
次に，この試薬0.5mlを37℃で３分間加温して340nmにお
ける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおける吸光
度変化を測定した。
ける初期吸光度を測定した後，各種濃度の無機リン標準
液（KH2PO4溶液）0.02mlを添加して340nmにおける吸光
度変化を測定した。
その結果を第５図に示す。
第５図は340nmにおける吸光度変化量と無機リン濃度と
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直線関係にあることがわか
る。
の関係を示したもので，無機リン濃度30mg/dlまで吸光
度変化量と無機リン濃度とが直線関係にあることがわか
る。
（発明の効果） 本発明の試薬は，従来のモリブデンブルー法と良好な相
関を示すとともに，短時間で，かつ安価に，しかもアス
コルビン酸の影響を受けずに，前処理をも必要とせずに
試料中の無機リンを測定することができる。
関を示すとともに，短時間で，かつ安価に，しかもアス
コルビン酸の影響を受けずに，前処理をも必要とせずに
試料中の無機リンを測定することができる。
その上，本発明の試薬は，溶液状態での保存安定性が極
めて良い。
めて良い。
第１図，第４図及び第５図は340nmにおける吸光度変化
量と無機リン濃度との関係を示すものであり，第２図は
本発明の試薬を用いて測定した無機リン濃度と，市販の
Phosphor B−Testを用いて測定した無機リン濃度との相
関を示すものであり，第３図は340nmにおける吸光度変
化量とアルコルビン酸の濃度との関係を示すものであ
る。
量と無機リン濃度との関係を示すものであり，第２図は
本発明の試薬を用いて測定した無機リン濃度と，市販の
Phosphor B−Testを用いて測定した無機リン濃度との相
関を示すものであり，第３図は340nmにおける吸光度変
化量とアルコルビン酸の濃度との関係を示すものであ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】グルタミンシンセターゼ，アデノシン二リ
ン酸，グルタミン，金属イオン及びこれらと無機リンと
の反応により生成するアデノシン三リン酸，グルタミン
酸又はアンモニアを検出する酸素系からなる無機リン定
量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22010086A JPH07121233B2 (ja) | 1986-09-18 | 1986-09-18 | 無機リン定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22010086A JPH07121233B2 (ja) | 1986-09-18 | 1986-09-18 | 無機リン定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6374499A JPS6374499A (ja) | 1988-04-04 |
| JPH07121233B2 true JPH07121233B2 (ja) | 1995-12-25 |
Family
ID=16745919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22010086A Expired - Lifetime JPH07121233B2 (ja) | 1986-09-18 | 1986-09-18 | 無機リン定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07121233B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3672036B2 (ja) | 2002-03-19 | 2005-07-13 | 松下電器産業株式会社 | 無機リン酸、ピロリン酸及び核酸の検出方法並びにｄｎａのｓｎｐ配列をタイピングする方法 |
-
1986
- 1986-09-18 JP JP22010086A patent/JPH07121233B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6374499A (ja) | 1988-04-04 |
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