JPS59213400A - キナ−ゼを用いる高感度定量法 - Google Patents
キナ−ゼを用いる高感度定量法Info
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- JPS59213400A JPS59213400A JP8881983A JP8881983A JPS59213400A JP S59213400 A JPS59213400 A JP S59213400A JP 8881983 A JP8881983 A JP 8881983A JP 8881983 A JP8881983 A JP 8881983A JP S59213400 A JPS59213400 A JP S59213400A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ａ’Ｊ’ｌ）（アデノソントリボスソエー１
−） おＬ（ＪＮＡＤ にコチンアテニン／ヌクレオチ
ド）のｂずれか１成分全含有する被・１９薔夜、また＆
Ｊ Ａ ’Ｌ” ＰおよびＮＡＬ）のいずれか１成分金
遊離、Ｌｌ−成する酵素反応系のＡ ′ｆ’ Ｐおよび
Ｎ Ａ Ｉ）のいずカーか１成分を遊離、生成する被＋
’ｌＥ ？ｆヶの成分の示針、さらにこの定＋辻に〃、
くそのｒ・Ｊ’ｆｉ素反１，６、系中の成分のイｌｉｌ
定ｆ／Ｃ関する。さらに詳しくは、Ａ Ｔ ］〕および
ＮＡ ｆ）のいずれかＩ成分を合力“１−るか、ま／ζ
！ｆｉ遊Ｎ１ｆ、生成する被検゛奴申の１成分の疋−４
−７Ｈｆ／（ｍおいて、その被検液に、被検液中の１成
分でないＮ Ａ ＩＪる・よびＡ ’ｌ” Ｐのいずれ
か１イ巾、゛マグイ・ンウムイオ゛／−よたシー１、マ
ンガフイオンを力父出でさる水７（ｉ ’ｌ’：Ｉ：
”１ｉｉ’ｔ、およびＮＡＤキナーゼを作用せしめてＡ
ＤＰ （アテノンンジホスフェート）およびＮＡＩ）Ｐ
’にコチンアテニンジヌクレオチドホスフエート）を生
成せしめ、次いで２ ＋ｊｊｉ類のＮ Ａ Ｄ ｌ）依
存性テヒドｒ」ゲナーゼおよび谷々の酵素（ｔ？：、
Ｘ’、Ｊ応したｉ、’ｉ＆化型、還７ｃ型基′６を共役
させてサイクリング反応を行ない、その後戻！ＩＩｓに
おける検出できる変化の創を定量してなるγ力規な高感
度定叶法Ｖ（関する３、ｆｌγ来」こりＡ ′〕’ Ｐ
の定１，１．法としては、例え（ｒｉ級子東液中のＡ
Ｔ Ｐにグルコースの存在下へキンキナルセラ１生月Ｊ
ぜしめてグルコース−６−ホスフニートトナシ、この生
成し／こグルコース−６−ホスフェートＫ Ｎ Ａ Ｄ
Ｐ （Ｄ 存在下グルコース−６−ホスフニートデヒ
トロゲナーゼを作用せしめて還元型ＮＡ Ｉ） Ｐ ｆ
：＜４−成せしめ、この還フこ型Ｎ Ａ ｌ） Ｐの生
成１ｄを波長３４ＱｎｍＹこて吸光ｅ測定してなる方法
がヂ１］らｆ’してｂる。しかしこの方法は、１モル比
のＡ Ｔ Ｐから１モル比の還プし４１７’、ｊ Ｎ
Ａ Ｄ Ｌ） Ｌか生成せず、被検液中のＡ Ｔ Ｐ＠
刊゛計が微量のときには充分な測定感、度を示さないも
のであった。またＮＡＤの定紋において、ＮＡＤをＮ
Ａ １）依存性デヒドロゲナーゼ訃よびＮＡＤ依存性デ
ヒドａゲナーゼ用基質にて還元型Ｎ Ａ Ｄとな１１、
さらにこの還元型Ｎ Ａ Ｄに、還元型ＮＡＤ依存性デ
ヒドロゲナーセおよび還元型ＮＡＬ）依任性デヒドロゲ
ナーゼ用基冴を作用せしめてｉ’Ｊ Ａ ＤとｋすＮＡ
Ｄ−還元型Ｎ Ａ Ｉ）のサイクリング反応金用いた方
法がツ泪しれており、丑たＮ Ａ Ｄ Ｐ−還元ノ＜ｌ
Ｊ、Ｎ Ａ ｖ Ｊ）のサイクリング反応も知られてｌ
、−１／と〔１生化学丈盛ｄＬ′ｌ座・酊素研死法（上
）」第５巻第１２１頁〜第１３１頁、１９７６年、特開
昭５６−１４４０９６号公報、特ｌ！ａ昭５７−１０２
２３号１４［ａｌ、）。し７かし、例えばこのＮＡＤ−
還元型、Ｎ Ａ−１）のサイクリング反応においては、
未反応のｒＪ Ａ Ｉ） Ｖたは還元型ＮＡＤのいずれ
か一方をアルカリ性または酸性、熱処（１ｊ１４にて分
解せしめた鏝、残存する他方をサイクリングさせ測定し
ねばならないもので、−・段反ｊ心Ｖこでなレイ仝Ｉる
ものでなく、またそのため自動化し債ないものであった
。
−） おＬ（ＪＮＡＤ にコチンアテニン／ヌクレオチ
ド）のｂずれか１成分全含有する被・１９薔夜、また＆
Ｊ Ａ ’Ｌ” ＰおよびＮＡＬ）のいずれか１成分金
遊離、Ｌｌ−成する酵素反応系のＡ ′ｆ’ Ｐおよび
Ｎ Ａ Ｉ）のいずカーか１成分を遊離、生成する被＋
’ｌＥ ？ｆヶの成分の示針、さらにこの定＋辻に〃、
くそのｒ・Ｊ’ｆｉ素反１，６、系中の成分のイｌｉｌ
定ｆ／Ｃ関する。さらに詳しくは、Ａ Ｔ ］〕および
ＮＡ ｆ）のいずれかＩ成分を合力“１−るか、ま／ζ
！ｆｉ遊Ｎ１ｆ、生成する被検゛奴申の１成分の疋−４
−７Ｈｆ／（ｍおいて、その被検液に、被検液中の１成
分でないＮ Ａ ＩＪる・よびＡ ’ｌ” Ｐのいずれ
か１イ巾、゛マグイ・ンウムイオ゛／−よたシー１、マ
ンガフイオンを力父出でさる水７（ｉ ’ｌ’：Ｉ：
”１ｉｉ’ｔ、およびＮＡＤキナーゼを作用せしめてＡ
ＤＰ （アテノンンジホスフェート）およびＮＡＩ）Ｐ
’にコチンアテニンジヌクレオチドホスフエート）を生
成せしめ、次いで２ ＋ｊｊｉ類のＮ Ａ Ｄ ｌ）依
存性テヒドｒ」ゲナーゼおよび谷々の酵素（ｔ？：、
Ｘ’、Ｊ応したｉ、’ｉ＆化型、還７ｃ型基′６を共役
させてサイクリング反応を行ない、その後戻！ＩＩｓに
おける検出できる変化の創を定量してなるγ力規な高感
度定叶法Ｖ（関する３、ｆｌγ来」こりＡ ′〕’ Ｐ
の定１，１．法としては、例え（ｒｉ級子東液中のＡ
Ｔ Ｐにグルコースの存在下へキンキナルセラ１生月Ｊ
ぜしめてグルコース−６−ホスフニートトナシ、この生
成し／こグルコース−６−ホスフェートＫ Ｎ Ａ Ｄ
Ｐ （Ｄ 存在下グルコース−６−ホスフニートデヒ
トロゲナーゼを作用せしめて還元型ＮＡ Ｉ） Ｐ ｆ
：＜４−成せしめ、この還フこ型Ｎ Ａ ｌ） Ｐの生
成１ｄを波長３４ＱｎｍＹこて吸光ｅ測定してなる方法
がヂ１］らｆ’してｂる。しかしこの方法は、１モル比
のＡ Ｔ Ｐから１モル比の還プし４１７’、ｊ Ｎ
Ａ Ｄ Ｌ） Ｌか生成せず、被検液中のＡ Ｔ Ｐ＠
刊゛計が微量のときには充分な測定感、度を示さないも
のであった。またＮＡＤの定紋において、ＮＡＤをＮ
Ａ １）依存性デヒドロゲナーゼ訃よびＮＡＤ依存性デ
ヒドａゲナーゼ用基質にて還元型Ｎ Ａ Ｄとな１１、
さらにこの還元型Ｎ Ａ Ｄに、還元型ＮＡＤ依存性デ
ヒドロゲナーセおよび還元型ＮＡＬ）依任性デヒドロゲ
ナーゼ用基冴を作用せしめてｉ’Ｊ Ａ ＤとｋすＮＡ
Ｄ−還元型Ｎ Ａ Ｉ）のサイクリング反応金用いた方
法がツ泪しれており、丑たＮ Ａ Ｄ Ｐ−還元ノ＜ｌ
Ｊ、Ｎ Ａ ｖ Ｊ）のサイクリング反応も知られてｌ
、−１／と〔１生化学丈盛ｄＬ′ｌ座・酊素研死法（上
）」第５巻第１２１頁〜第１３１頁、１９７６年、特開
昭５６−１４４０９６号公報、特ｌ！ａ昭５７−１０２
２３号１４［ａｌ、）。し７かし、例えばこのＮＡＤ−
還元型、Ｎ Ａ−１）のサイクリング反応においては、
未反応のｒＪ Ａ Ｉ） Ｖたは還元型ＮＡＤのいずれ
か一方をアルカリ性または酸性、熱処（１ｊ１４にて分
解せしめた鏝、残存する他方をサイクリングさせ測定し
ねばならないもので、−・段反ｊ心Ｖこでなレイ仝Ｉる
ものでなく、またそのため自動化し債ないものであった
。
さらにＮＡＤキナーゼば、ＪεＣ・２・７・１・２３と
し７て知られており、またその活性測定法におりでハク
ルコース−６−ホスフエートテヒドロゲナーゼお」：び
フエナジンメトサルフエ−１・を用する化学的サイクリ
ング反応が知られて因る〔［Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ
Ｊ Ｖｏｌ ＩＸ 、 ３ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ７６
〜８２白（１９７３年）〕１、しかしながら、フエツー
ジンメトサルフエートなどの化学的試薬を７−ＩＪｔ４
る方法は必ずしも良好でなく、従ってまた上古ピの活性
測定法を設計変更して各成分の定量法としても良好に電
層（２難す不満足なものであった。
し７て知られており、またその活性測定法におりでハク
ルコース−６−ホスフエートテヒドロゲナーゼお」：び
フエナジンメトサルフエ−１・を用する化学的サイクリ
ング反応が知られて因る〔［Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ
Ｊ Ｖｏｌ ＩＸ 、 ３ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ７６
〜８２白（１９７３年）〕１、しかしながら、フエツー
ジンメトサルフエートなどの化学的試薬を７−ＩＪｔ４
る方法は必ずしも良好でなく、従ってまた上古ピの活性
測定法を設計変更して各成分の定量法としても良好に電
層（２難す不満足なものであった。
本発明者け、ＡＴＰまたばＮＡＤの高感度測定に関して
神々研究した結果、ＡＴＰを含有するか、゛または遊離
、生成する被検液に、Ｎ Ａ Ｉ）、マグネ／ラムイオ
ンまたはマンガンイオンを放出できる水溶性塩、および
ＮＡＤキナーセを作用せしめてＡ Ｉ） ＰおよびＮＡ
Ｌ）Ｐを生成せしめるか、または−Ｊ’Ｓ Ｎ己のＡＴ
Ｐの代りにｒＪ Ａ Ｉ）を含有するか、また＋＝：１
送離、生成する被検液を対象として、Ａ ’ｆ” Ｐ、
マグネ／ラムイオンまたはマンガンイオンｋ 放出でき
る水溶１生塩、およびＩＱ Ａ Ｄキナーゼを作用せし
めてＡＤＰおよびＮＡＤＰを生成せしめて、被検液中の
Ａ ’ｒ ＰまたＩｒ１ＮＡＤを、被検液中の成分でな
いＮＡＬ）またけＡ Ｔ Ｐの存在下酵素的にＮＡＤＰ
となし、次めでこのＮ Ａ Ｄ Ｉ−’に、ＮＡＤＰ依
存性デヒドロゲナーゼおよびその還元型基質を有する還
元！−’ｊ’４ Ｎ Ａ Ｄ Ｐ生成試薬を作用せしめ
て還元型ＮＡＤＰとなし、ざらにこの生成した還元型Ｎ
ＡＤＰに、別のＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼおよび
そのＮへ〇Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用版化型基を有す
るＮＡＤＰ生成試薬を作用仕しめてＮ Ａ Ｌ） １）
とな−してＮＡＤＰ−還元型Ｎ’ＡＩ）Ｐの酵素的サイ
クリング反応を行なわせしめ、次−でこのサイクリング
反応Ｖこおける・演出できる変化の車を定置することに
ょジ、例えばＮＡ、Ｄの被検液中に混存する還元型ＮＡ
Ｉ）を酸性熱分解せしめることなく、定量し得たもので
、簡便かつ自動化のための測定法として極めて良好でる
る。さらにＡＴＰやＮＡＤを、Ｎ’ＡＩ）Ｐの酵素的サ
イクリング反応Ｖζよる高感度測定として定量し得たも
ので、全く新規な知見である。
神々研究した結果、ＡＴＰを含有するか、゛または遊離
、生成する被検液に、Ｎ Ａ Ｉ）、マグネ／ラムイオ
ンまたはマンガンイオンを放出できる水溶性塩、および
ＮＡＤキナーセを作用せしめてＡ Ｉ） ＰおよびＮＡ
Ｌ）Ｐを生成せしめるか、または−Ｊ’Ｓ Ｎ己のＡＴ
Ｐの代りにｒＪ Ａ Ｉ）を含有するか、また＋＝：１
送離、生成する被検液を対象として、Ａ ’ｆ” Ｐ、
マグネ／ラムイオンまたはマンガンイオンｋ 放出でき
る水溶１生塩、およびＩＱ Ａ Ｄキナーゼを作用せし
めてＡＤＰおよびＮＡＤＰを生成せしめて、被検液中の
Ａ ’ｒ ＰまたＩｒ１ＮＡＤを、被検液中の成分でな
いＮＡＬ）またけＡ Ｔ Ｐの存在下酵素的にＮＡＤＰ
となし、次めでこのＮ Ａ Ｄ Ｉ−’に、ＮＡＤＰ依
存性デヒドロゲナーゼおよびその還元型基質を有する還
元！−’ｊ’４ Ｎ Ａ Ｄ Ｐ生成試薬を作用せしめ
て還元型ＮＡＤＰとなし、ざらにこの生成した還元型Ｎ
ＡＤＰに、別のＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼおよび
そのＮへ〇Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用版化型基を有す
るＮＡＤＰ生成試薬を作用仕しめてＮ Ａ Ｌ） １）
とな−してＮＡＤＰ−還元型Ｎ’ＡＩ）Ｐの酵素的サイ
クリング反応を行なわせしめ、次−でこのサイクリング
反応Ｖこおける・演出できる変化の車を定置することに
ょジ、例えばＮＡ、Ｄの被検液中に混存する還元型ＮＡ
Ｉ）を酸性熱分解せしめることなく、定量し得たもので
、簡便かつ自動化のための測定法として極めて良好でる
る。さらにＡＴＰやＮＡＤを、Ｎ’ＡＩ）Ｐの酵素的サ
イクリング反応Ｖζよる高感度測定として定量し得たも
ので、全く新規な知見である。
本発明は、上記の凡児に＄：いて完成したもので、ＡＴ
ＰおよびＮＡＤのいずれか１成分を含有するか、または
遊離、生成する被検液中の１成分の定ｈＩ・において、
その被検液に、被検液中の１成分でないＮ Ａ Ｄおよ
びＡＴＰのいずれか１棟、マグネ／ラムイオン″または
マンガンイオンを放出できる水溶性Ｉ晶、およびＮＡ、
Ｄキナーゼを作用せしめてＡＤＰおよびＮ Ａ Ｄ １
）を生成せしめ、次すでＮＡ１） Ｐ依存性デヒドロゲ
ナーゼおよびＮ Ａ Ｄ Ｐ ｉ＆ 存件デヒドロゲナ
ーゼ用還元型基質を有する還元型Ｎ Ａ、 Ｉ） Ｉ）
生成試薬、および別のＮへ〇Ｐ依存性デヒトロゲナーセ
およびそのＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼ用酸化型基
質を１′：ｉするＮＡＤＰ生成試薬を作用せしめてサイ
クリフグ反ノ、６を行ない、その後反応に督ける伏出で
きる変化の量を定量することを特徴とする高感度測定法
である。
ＰおよびＮＡＤのいずれか１成分を含有するか、または
遊離、生成する被検液中の１成分の定ｈＩ・において、
その被検液に、被検液中の１成分でないＮ Ａ Ｄおよ
びＡＴＰのいずれか１棟、マグネ／ラムイオン″または
マンガンイオンを放出できる水溶性Ｉ晶、およびＮＡ、
Ｄキナーゼを作用せしめてＡＤＰおよびＮ Ａ Ｄ １
）を生成せしめ、次すでＮＡ１） Ｐ依存性デヒドロゲ
ナーゼおよびＮ Ａ Ｄ Ｐ ｉ＆ 存件デヒドロゲナ
ーゼ用還元型基質を有する還元型Ｎ Ａ、 Ｉ） Ｉ）
生成試薬、および別のＮへ〇Ｐ依存性デヒトロゲナーセ
およびそのＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼ用酸化型基
質を１′：ｉするＮＡＤＰ生成試薬を作用せしめてサイ
クリフグ反ノ、６を行ない、その後反応に督ける伏出で
きる変化の量を定量することを特徴とする高感度測定法
である。
′Ｊず本発明の高感度測定のための反応を略示すただし
、各記号は以下の意味を示す。
、各記号は以下の意味を示す。
Ｅｌ：１’ＪＡｌ）’ＰおよびＳよを基質として、還元
型ＮＡＤＰおよびＰｌを生成する反応を触媒するＮＡｔ
）Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ、 Ｅ２＝還元型ＮＡＩ）Ｐおよびｓ２を基質として、Ｎｋ
ＤＰおよびＰ２を生成する反応を触媒するＮＡＤＰ依存
性デヒドロゲナーゼ、 Ｓ、 ： Ｎ Ａ Ｄ Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ餡）
の還元型基質、 Ｓ２：ＮＡＤＰ依存性デヒドロケナーセ■２）の酸化型
基質、 Ｐ、：’Ｅ１によるＳ□からの酸化型生成物、Ｐ２ ｍ
Ｅ／２によるＳ２からの還元型生成物、本発明で対象
とする被検液としては、Ａ Ｔ Ｉ）およびＮＡＪ）の
いずれか１成分を含有するが、または遊離、生成するも
のであればよく、あらかじめＡＴＰｋ含有する被検液、
あらかじめＮ Ａ ］）を含有する被検液、種々の＃菓
反応系にて遊離、生成するＡＴＰの被検液や１’ＪＡＤ
の被検液などが挙られる。ざらに詳しくげ、あらかじめ
ＡＴＰを言Ｍする被検液としては、例えばＡＴＰの試薬
浴液やＡ Ｔ Ｉ）を試薬として消費、してなる下記例
示の種々の酵素反応の未反応Ａ Ｔ ｆ）含有溶液、１
マＡ、 ｌ）の試薬やＮＡ」〕を試薬として消費してな
る下呂己例示の種々の酵素反応の未反応のＮ Ａ Ｏ含
有浴液が￥げらノ′１．るが、これらは例示反応系であ
り、何んら本発明の勾象を限定するものではない。
型ＮＡＤＰおよびＰｌを生成する反応を触媒するＮＡｔ
）Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ、 Ｅ２＝還元型ＮＡＩ）Ｐおよびｓ２を基質として、Ｎｋ
ＤＰおよびＰ２を生成する反応を触媒するＮＡＤＰ依存
性デヒドロゲナーゼ、 Ｓ、 ： Ｎ Ａ Ｄ Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ餡）
の還元型基質、 Ｓ２：ＮＡＤＰ依存性デヒドロケナーセ■２）の酸化型
基質、 Ｐ、：’Ｅ１によるＳ□からの酸化型生成物、Ｐ２ ｍ
Ｅ／２によるＳ２からの還元型生成物、本発明で対象
とする被検液としては、Ａ Ｔ Ｉ）およびＮＡＪ）の
いずれか１成分を含有するが、または遊離、生成するも
のであればよく、あらかじめＡＴＰｋ含有する被検液、
あらかじめＮ Ａ ］）を含有する被検液、種々の＃菓
反応系にて遊離、生成するＡＴＰの被検液や１’ＪＡＤ
の被検液などが挙られる。ざらに詳しくげ、あらかじめ
ＡＴＰを言Ｍする被検液としては、例えばＡＴＰの試薬
浴液やＡ Ｔ Ｉ）を試薬として消費、してなる下記例
示の種々の酵素反応の未反応Ａ Ｔ ｆ）含有溶液、１
マＡ、 ｌ）の試薬やＮＡ」〕を試薬として消費してな
る下呂己例示の種々の酵素反応の未反応のＮ Ａ Ｏ含
有浴液が￥げらノ′１．るが、これらは例示反応系であ
り、何んら本発明の勾象を限定するものではない。
（１）ＡＴ１〕＋Ｌ−メチオニン＋Ｆ■２０（”−）Ｓ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン＋ＰＰｉ＋Ｐｉ（：ンＩ
Ａ’ｌ”Ｐ十〇−ヘキソース Ａｌ）Ｐ＋ｆ）−ベキノース−６−ホスフェートｆ３）
Ａ ’ｒ Ｐ＋グリセロ〜ル Ａ Ｉ） Ｐ＋グリセロール−３−ホスフェート（４）
、、Ａ ’ｌ’ 、Ｐ＋ホスファチジルイノント〜ル
（ＥＣ，２，７，１，６７） ＡＤＰ＋ホスファチジルイノントール−４−ボスフェー
ト（５ｊ Ａ Ｔ Ｐ＋イノンン ＡＤＰ＋イノシン−５７−ホスフェ−１・（６） Ａ
’Ｉ’ Ｐ−１Ｒ２０ ＡＤＰ＋Ｐｊ Ｉ７１ Ａ Ｔ ｌ）＋ ｌＩ２０ （ＥＣ，３，６，１，８） Ａ ＩＶＩ Ｐ ＋ Ｐ Ｐ １ Ｉ８） Ａ Ｔ Ｐ ４− ｉＱ級脂肪酸＋ ＣｏＡＳ
ＨＡＭＰ＋ＰＰｉ＋アンルー５ＣＯＡ ＋９１ＡＴＰ＋−ｒレイト＋ＣｏＡＳＨＡＭＰ＋コロイ
／Ｉｚ −５ＣｏＡ ＋ ＰＰ１Ｈ１ｌｌ Ａ Ｔ Ｐ
＋テアミドＮＡＤ＋Ｎ１−（ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ＮＡＤ ｔｌ Ｉ＋ Ａ Ｔ Ｐ ＋Ｈ２Ｃｏ３＋ピルベートＡ
Ｉ）ＰｆＰｉ＋オギザロ酢酸 （１２）エタノール＋ＮＡＤ アセトアルデヒド十遺元型ＮＡＤ （Ｉ３）グリセワール＋ＮＡＤ ジヒドロキシアセトン＋還元型ＮＡＤ （１イ）グリセロ−３−ホスフェ−１−＋ＮＡＤジヒド
ロキシアセトンホスフェート＋ｆｋ元型Ｎ Ａ Ｄｆ１
５）Ｌ−ラクテー１−＋ＮＡＤ ピルベート＋還元型ＮＡＤ （ｌｉｉ） Ｌ−マレイド＋ＮＡＤ オギサロ酢酸十遭元型ＮＡＤ １７）Ｌ〜カルニチン＋ＮＡＤ ３−テヒトロ力ルニチン＋遣元型ＮＡＤ（１８）ホルメ
イト＋ＮＡＤ ＣＯ□十茄元型ＮＡＤ １ ！ｌ） Ｎ Ａ Ｉ）モ１−Ｉ２０ニコチナミＦ＋
Ａ Ｄ Ｉ）−リボースこ一１ｔらの破倹ｆイダにおり
ては、酵素反応後に残在するＡＴＰｉたはＮ’Ａ Ｄの
量を定量することを１的として供するもので、さらにこ
のＡＴＰまたばＮ’ＡＤの定量値から、その酵素反応系
の酵素濱、１生や用いたＡ′ＰＰまたはＮＡＩ）の消費
−酸に対応して消費された他方の成分の定量をなしても
よい。
−アデノシル−Ｌ−メチオニン＋ＰＰｉ＋Ｐｉ（：ンＩ
Ａ’ｌ”Ｐ十〇−ヘキソース Ａｌ）Ｐ＋ｆ）−ベキノース−６−ホスフェートｆ３）
Ａ ’ｒ Ｐ＋グリセロ〜ル Ａ Ｉ） Ｐ＋グリセロール−３−ホスフェート（４）
、、Ａ ’ｌ’ 、Ｐ＋ホスファチジルイノント〜ル
（ＥＣ，２，７，１，６７） ＡＤＰ＋ホスファチジルイノントール−４−ボスフェー
ト（５ｊ Ａ Ｔ Ｐ＋イノンン ＡＤＰ＋イノシン−５７−ホスフェ−１・（６） Ａ
’Ｉ’ Ｐ−１Ｒ２０ ＡＤＰ＋Ｐｊ Ｉ７１ Ａ Ｔ ｌ）＋ ｌＩ２０ （ＥＣ，３，６，１，８） Ａ ＩＶＩ Ｐ ＋ Ｐ Ｐ １ Ｉ８） Ａ Ｔ Ｐ ４− ｉＱ級脂肪酸＋ ＣｏＡＳ
ＨＡＭＰ＋ＰＰｉ＋アンルー５ＣＯＡ ＋９１ＡＴＰ＋−ｒレイト＋ＣｏＡＳＨＡＭＰ＋コロイ
／Ｉｚ −５ＣｏＡ ＋ ＰＰ１Ｈ１ｌｌ Ａ Ｔ Ｐ
＋テアミドＮＡＤ＋Ｎ１−（ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ＮＡＤ ｔｌ Ｉ＋ Ａ Ｔ Ｐ ＋Ｈ２Ｃｏ３＋ピルベートＡ
Ｉ）ＰｆＰｉ＋オギザロ酢酸 （１２）エタノール＋ＮＡＤ アセトアルデヒド十遺元型ＮＡＤ （Ｉ３）グリセワール＋ＮＡＤ ジヒドロキシアセトン＋還元型ＮＡＤ （１イ）グリセロ−３−ホスフェ−１−＋ＮＡＤジヒド
ロキシアセトンホスフェート＋ｆｋ元型Ｎ Ａ Ｄｆ１
５）Ｌ−ラクテー１−＋ＮＡＤ ピルベート＋還元型ＮＡＤ （ｌｉｉ） Ｌ−マレイド＋ＮＡＤ オギサロ酢酸十遭元型ＮＡＤ １７）Ｌ〜カルニチン＋ＮＡＤ ３−テヒトロ力ルニチン＋遣元型ＮＡＤ（１８）ホルメ
イト＋ＮＡＤ ＣＯ□十茄元型ＮＡＤ １ ！ｌ） Ｎ Ａ Ｉ）モ１−Ｉ２０ニコチナミＦ＋
Ａ Ｄ Ｉ）−リボースこ一１ｔらの破倹ｆイダにおり
ては、酵素反応後に残在するＡＴＰｉたはＮ’Ａ Ｄの
量を定量することを１的として供するもので、さらにこ
のＡＴＰまたばＮ’ＡＤの定量値から、その酵素反応系
の酵素濱、１生や用いたＡ′ＰＰまたはＮＡＩ）の消費
−酸に対応して消費された他方の成分の定量をなしても
よい。
さらにＡＴＰおよびＮＡＤのいずｆ１７かＩ成分を遊離
し７、生成する被検液と・しては、以下に例示きれる種
々の酵素反応液が挙げられる。例えばＡＴＰを遊離、生
成する被検液としては、Ａ ＯＰおよびキナーゼ基質用
ポスフェート化合物に作用してＡｒＰを遊離、生成する
反応ｆ：酊媒するキナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質
用ホスフェ−１・化合物の酵累反１芯系による反応にお
りで遊ｓｔ、生成するＡｆｐの被検液が挙げられる。さ
らに詳しくは、このキナーゼ、ＡＩ）Ｐおよびキナーゼ
基質用ポスフェート化合物の酵素反応系としては、例え
ばクレアチンキナーゼ、Ａ Ｄ Ｐおよびタレアチンホ
スフエートの酵素反応系やピルベートキナーゼ、ＡＯＰ
およびホスホエノールピルビン酸の面系反応糸が午げら
れる。またＮＡ、１）を遊ＭＵ、生成する被検液として
は、ＮＡＩ）依存性デヒドロゲナーセ１、畢几型ＮＡ
Ｉ）およびこグ）ＮＡＤ依存性デヒドロゲナ−セ月ｊ酸
化型基り４化合物の酵素反応系による反応において遊離
、生成するＮＡｊ）の被検液が挙げら力１、例えばラク
テートテヒドロヶナーゼ、還元ｔＩ！！＋”Ｊ Ａ Ｄ
およびピルベー）・の酵素反応糸による生成ＮＡＩ）の
被検液が￥げられる。これらの種々の被検液中（７）
Ａ Ｔ Ｌ）やＮＡＤを定量することＶこより、その酵
素反応系の酵素活性の測定や反応に関与した１反分の定
ｈ４のいずれか１ノ戎分の０１１］定をなし得るもので
ある。奨下に種々の酵素反応系の概略を示すが、これら
の対象反ノ、６ボｖｉ例示であって１ＤＩんら限定きれ
るものでけな力。
し７、生成する被検液と・しては、以下に例示きれる種
々の酵素反応液が挙げられる。例えばＡＴＰを遊離、生
成する被検液としては、Ａ ＯＰおよびキナーゼ基質用
ポスフェート化合物に作用してＡｒＰを遊離、生成する
反応ｆ：酊媒するキナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質
用ホスフェ−１・化合物の酵累反１芯系による反応にお
りで遊ｓｔ、生成するＡｆｐの被検液が挙げられる。さ
らに詳しくは、このキナーゼ、ＡＩ）Ｐおよびキナーゼ
基質用ポスフェート化合物の酵素反応系としては、例え
ばクレアチンキナーゼ、Ａ Ｄ Ｐおよびタレアチンホ
スフエートの酵素反応系やピルベートキナーゼ、ＡＯＰ
およびホスホエノールピルビン酸の面系反応糸が午げら
れる。またＮＡ、１）を遊ＭＵ、生成する被検液として
は、ＮＡＩ）依存性デヒドロゲナーセ１、畢几型ＮＡ
Ｉ）およびこグ）ＮＡＤ依存性デヒドロゲナ−セ月ｊ酸
化型基り４化合物の酵素反応系による反応において遊離
、生成するＮＡｊ）の被検液が挙げら力１、例えばラク
テートテヒドロヶナーゼ、還元ｔＩ！！＋”Ｊ Ａ Ｄ
およびピルベー）・の酵素反応糸による生成ＮＡＩ）の
被検液が￥げられる。これらの種々の被検液中（７）
Ａ Ｔ Ｌ）やＮＡＤを定量することＶこより、その酵
素反応系の酵素活性の測定や反応に関与した１反分の定
ｈ４のいずれか１ノ戎分の０１１］定をなし得るもので
ある。奨下に種々の酵素反応系の概略を示すが、これら
の対象反ノ、６ボｖｉ例示であって１ＤＩんら限定きれ
るものでけな力。
（２０）タレアチノホスフェ−１−十Ａ Ｄ １）（Ｏ
Ｃ，２，７，３，２） クレアチン＋ＡＴＰ （２１）ホスホエノールピルビンＩ投＋Ａｌ）Ｐピルビ
ア厳十ＡＴＰ （２２）アセチルホスフェ−１−＋ＡＤＰ酢酸＋ＡＴＰ ＋２３１カルバモイルホスフェ−Ｘ−ＡＤＰＮＨ十Ｃｏ
２＋ ＡＴＰ ｔ７！４１４−ホスホ−し−アスパルテイト＋Ａ Ｉ）
Ｌ）Ｌ−アスパルテイｌ−＋ Ａ Ｔ Ｉ）（２５１
１，３−７ホスホーＤ−グリセレイト→−Ａ １） Ｐ
３−ホスホ−ローグリセレイト＋Ａ’ｒＰ（２６）アル
ギニンホスフェート＋ＡＬ）ＰＬ−アルギニン＋ＡＴＰ （２７）ジヒドロキシアセトンホスフェ−）＋還元型Ｎ
ＡＤグリセロールー３−ホスフェート＋ＮＡＤ（２８）
ピルベート＋遁元型ＮＡＤ Ｌ−ライテート＋ＮＡ Ｄ い））３−デヒドロカルニチン＋還元型ＮＡＤＬ−カル
ニチン＋ＮＡＤ ＋１（ｌｌ＋ ２−オギンクルタレイト十ＮＬ（４＋還
元型ＮＡＤＬ−グルタノイｌ−＋ １４゜０ ＋ＮＡＤ
＋：ｎ７還元型ＮＡＤ＋）＋２０゜ ｒｌｌｌＡＤ ＋２１（２Ｏ なお前記の種々の酵素反応系において、反応を行なわし
めるためのｐＨ条件、金属イオンや安定化のための添加
剤の必要性の条件などは、適宜公知の技術に基いて判断
すればよく（例えば［酵素ハンドブックＪ １９’８２
年１２月発行、同刊行物１９６６年４月発行参照）、例
えば＠記のキナーゼを用いる酵素反応系においては、金
属イオンとしてマグネシウムイオンやその他マンガンイ
オンなどの存在下反応せしめるものである。さらにｐＨ
条件としては、対象とする酵素反応系毎に異なるもので
、適宜ｐＨ６〜９．５程度の範囲の緩衝液を選択して用
いればよい。またこの緩衝液としては、例えばリン酸緩
衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、グリセリルグリノン緩衝
液、イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液、ジメチルゲルタール
酸−ＮａＯＨ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ピペ
ス（ＰＩＰＥＳ ） −ＮａＯＨ緩衝液、トリエタノー
ルアミン緩衝液などが用因られる。またその反応温度と
しては通常３７℃程度でよく、また反応時間も１分以上
反応せしめればよく、何んら反応時間は限定されるもの
ではない。
Ｃ，２，７，３，２） クレアチン＋ＡＴＰ （２１）ホスホエノールピルビンＩ投＋Ａｌ）Ｐピルビ
ア厳十ＡＴＰ （２２）アセチルホスフェ−１−＋ＡＤＰ酢酸＋ＡＴＰ ＋２３１カルバモイルホスフェ−Ｘ−ＡＤＰＮＨ十Ｃｏ
２＋ ＡＴＰ ｔ７！４１４−ホスホ−し−アスパルテイト＋Ａ Ｉ）
Ｌ）Ｌ−アスパルテイｌ−＋ Ａ Ｔ Ｉ）（２５１
１，３−７ホスホーＤ−グリセレイト→−Ａ １） Ｐ
３−ホスホ−ローグリセレイト＋Ａ’ｒＰ（２６）アル
ギニンホスフェート＋ＡＬ）ＰＬ−アルギニン＋ＡＴＰ （２７）ジヒドロキシアセトンホスフェ−）＋還元型Ｎ
ＡＤグリセロールー３−ホスフェート＋ＮＡＤ（２８）
ピルベート＋遁元型ＮＡＤ Ｌ−ライテート＋ＮＡ Ｄ い））３−デヒドロカルニチン＋還元型ＮＡＤＬ−カル
ニチン＋ＮＡＤ ＋１（ｌｌ＋ ２−オギンクルタレイト十ＮＬ（４＋還
元型ＮＡＤＬ−グルタノイｌ−＋ １４゜０ ＋ＮＡＤ
＋：ｎ７還元型ＮＡＤ＋）＋２０゜ ｒｌｌｌＡＤ ＋２１（２Ｏ なお前記の種々の酵素反応系において、反応を行なわし
めるためのｐＨ条件、金属イオンや安定化のための添加
剤の必要性の条件などは、適宜公知の技術に基いて判断
すればよく（例えば［酵素ハンドブックＪ １９’８２
年１２月発行、同刊行物１９６６年４月発行参照）、例
えば＠記のキナーゼを用いる酵素反応系においては、金
属イオンとしてマグネシウムイオンやその他マンガンイ
オンなどの存在下反応せしめるものである。さらにｐＨ
条件としては、対象とする酵素反応系毎に異なるもので
、適宜ｐＨ６〜９．５程度の範囲の緩衝液を選択して用
いればよい。またこの緩衝液としては、例えばリン酸緩
衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、グリセリルグリノン緩衝
液、イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液、ジメチルゲルタール
酸−ＮａＯＨ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ピペ
ス（ＰＩＰＥＳ ） −ＮａＯＨ緩衝液、トリエタノー
ルアミン緩衝液などが用因られる。またその反応温度と
しては通常３７℃程度でよく、また反応時間も１分以上
反応せしめればよく、何んら反応時間は限定されるもの
ではない。
さらに本発明に用いられるＮＡＤキナーゼは、１モルの
ＡＴＰと１モルのＮＡＤを基質として作用１して、Ｊモ
ルのＡＤＰと１モルのＮＡＤ、Ｐを生成する反応を触媒
する酵素でＥＣ，２，７，１，２３と１２で分類されて
因る公知の酵素であり、酵母や・・ト、ラットやウサギ
の肝臓から精製、採取できる〔Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、１８２．８０５ （１９５０）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、、２０６ 、３１１’ （１’Ｊ ５４）、Ｅ
ｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５５ 、４７５ （
１９７５）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４３ 、４
８８５ （１９６８）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
４３Ｂ 、 ｌ ４９ （１９７１） 〕。
ＡＴＰと１モルのＮＡＤを基質として作用１して、Ｊモ
ルのＡＤＰと１モルのＮＡＤ、Ｐを生成する反応を触媒
する酵素でＥＣ，２，７，１，２３と１２で分類されて
因る公知の酵素であり、酵母や・・ト、ラットやウサギ
の肝臓から精製、採取できる〔Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、１８２．８０５ （１９５０）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、、２０６ 、３１１’ （１’Ｊ ５４）、Ｅ
ｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５５ 、４７５ （
１９７５）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４３ 、４
８８５ （１９６８）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
４３Ｂ 、 ｌ ４９ （１９７１） 〕。
またＮＡＤキナーゼの使用量としては、例えば１テスト
当り０．１単位（Ｕ、）以上あればよぐ、通常１〜５０
Ｕ、程度用いればよい。
当り０．１単位（Ｕ、）以上あればよぐ、通常１〜５０
Ｕ、程度用いればよい。
また用いるＡＴＰまたはＮＡＤＯ量としては、被検液中
のＮＡＤまたはＡ Ｔ Ｐの量に比べて多く用いればよ
く、特に１沢にされるものではない１、また一般に用い
るＡＴＰやｌ”Ｊ Ａ Ｄは、用いる緩衝液に潜１１１
イして用いればよく、さらにｌテスト当り好−１Ｌ ＜
ｌ’ｊ ５ ｒｔｔ Ｍ〜１００フルＭの磯度にて使
用すハばよい。
のＮＡＤまたはＡ Ｔ Ｐの量に比べて多く用いればよ
く、特に１沢にされるものではない１、また一般に用い
るＡＴＰやｌ”Ｊ Ａ Ｄは、用いる緩衝液に潜１１１
イして用いればよく、さらにｌテスト当り好−１Ｌ ＜
ｌ’ｊ ５ ｒｔｔ Ｍ〜１００フルＭの磯度にて使
用すハばよい。
さらに用いられるマグネシウムイオンまたはマンガンイ
オンを放出できる水溶性塩としては、通常塩化マグネシ
ウム（ＭｇＣ］ ２）または塩化マンガン（ＭｎＣ１２
）を用いることが好ましく、通常１テスト当り好ましく
は５ｍＭ〜５０’ｔｎＭの戻度にて使用すればよい。さ
らに適宜被検液中に混入してｂるマグネシウムイオンや
マンガンイオンの量全考慮して、使用する上記水溶性塩
の量を減じてもよｌ／’１０さらに本発明のサイクリン
グ反応形成のためのＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼお
よびＮ Ａ １） Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用還元型
基質を有する還元型ＮＡＤＰ生成試薬におけるＮ Ａ
ｆ） Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）は、ＡＴＰと
ＮＡＤの存在下ＮＡＤキナーゼの酵素作用によって生じ
たＮＡＤＰＩ’こ作用して還元型ＮＡＩ）Ｐを形成せし
める反応を解媒する酵素であればよく、通常このＮＡＤ
ＰとＮＡｆ）Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用還元型基質（
Ｓ工）との存在下ＮＡｆ）Ｐ依ｑ性デヒドロゲナーゼは
、その基質の酸化型生成物（Ｐ工）および還元型ＮＡＤ
Ｐを生成せしめてなるものである。以−ドにこのＮ Ａ
Ｄ Ｉ）依存性デヒドロゲナーゼおよびＮ Ａ ｌ）
Ｉ）依存性デヒドロゲナーゼ用還元型基質、さらＶ（
これらによる酵素反応の概略を挙げるが、こｈ−らは例
示であって何んら限定するものではない３、 （個キンリト−ル＋ＮＡＤＰ Ｌ−キ／ルロース→−趙元型ＮＡＩ）Ｐ（：３：つＬ−
グロネイｌ−＋ＮＡＤＰＤ−グルクロネイト＋還元型Ｎ
ＡＤＰ −ｔ３４１ Ｌ−マレイド十Ｎ Ａ ｌ）
Ｉ）±＝ニーピルベイト＋ＣＯ２＋還プ気すＮＡ１）Ｐ
（、（９グルコース−６−ホスフェ−＋−＋ＮＡＤＰＤ
−グルコノーδ−ラクＩ・ン＋還元型ＮＡＤＰ（至）Ｌ
−−マレイド十Ｎｋ］）Ｐ オギザロアセテート」−還元型ＮＡＤＰ（３７）グリセ
ロール＋Ｎ”ＡＤＰ ジヒドロキンアセトン＋還元型ＮＡＤＰμｓ）グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェート十Ｎへ〇Ｐ３−ホスホ−
グリセレイ）＋還元ＷＮＡＤＰまたサイクリング反応形
成のための前記とは異なる別のＮＡＤＰ依存性デヒドロ
ゲナーゼおよび（−のＮＡｆ）Ｐ依存性デヒドロゲナー
ゼ用酸化型基質を有するＮＡＤＰ生成試薬におけるこの
Ｎ Ａ ｐＰ依存性デヒドロゲナーゼ（Ｅ２）！ｒｉ、
前記の還元型ＮＡＩ）Ｐ生成試薬によって生じた還フ〔
型ＮＡＤＰに作用してＮＡＤＰを形成せしめる反応を触
媒する酵素であればよく、通常この還元型へＡＤＰとＮ
Ａ Ｄ Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用酸化型基質Ｇ５
２）との存在下ＮＡ Ｄ Ｐデヒドロゲナーゼ■２）は
、・その基質の還元型生成物（Ｐ２）およびＮＡＤＰを
生成せしめてなるものである。以下にこの還元型Ｎ Ａ
１） ｉ＋依存性デヒドロゲナーゼおよび還元型ＮＡ
ＤＰ依存性テヒドロゲナーゼ用基、さらにこれらによる
酵素反応の概略を挙げるが、その反応系としては、前記
の逆反応の系や、以下の正又応が挙げられるものである
が、こり、らは例示であって何んら限定するものではな
い。
オンを放出できる水溶性塩としては、通常塩化マグネシ
ウム（ＭｇＣ］ ２）または塩化マンガン（ＭｎＣ１２
）を用いることが好ましく、通常１テスト当り好ましく
は５ｍＭ〜５０’ｔｎＭの戻度にて使用すればよい。さ
らに適宜被検液中に混入してｂるマグネシウムイオンや
マンガンイオンの量全考慮して、使用する上記水溶性塩
の量を減じてもよｌ／’１０さらに本発明のサイクリン
グ反応形成のためのＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼお
よびＮ Ａ １） Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用還元型
基質を有する還元型ＮＡＤＰ生成試薬におけるＮ Ａ
ｆ） Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）は、ＡＴＰと
ＮＡＤの存在下ＮＡＤキナーゼの酵素作用によって生じ
たＮＡＤＰＩ’こ作用して還元型ＮＡＩ）Ｐを形成せし
める反応を解媒する酵素であればよく、通常このＮＡＤ
ＰとＮＡｆ）Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用還元型基質（
Ｓ工）との存在下ＮＡｆ）Ｐ依ｑ性デヒドロゲナーゼは
、その基質の酸化型生成物（Ｐ工）および還元型ＮＡＤ
Ｐを生成せしめてなるものである。以−ドにこのＮ Ａ
Ｄ Ｉ）依存性デヒドロゲナーゼおよびＮ Ａ ｌ）
Ｉ）依存性デヒドロゲナーゼ用還元型基質、さらＶ（
これらによる酵素反応の概略を挙げるが、こｈ−らは例
示であって何んら限定するものではない３、 （個キンリト−ル＋ＮＡＤＰ Ｌ−キ／ルロース→−趙元型ＮＡＩ）Ｐ（：３：つＬ−
グロネイｌ−＋ＮＡＤＰＤ−グルクロネイト＋還元型Ｎ
ＡＤＰ −ｔ３４１ Ｌ−マレイド十Ｎ Ａ ｌ）
Ｉ）±＝ニーピルベイト＋ＣＯ２＋還プ気すＮＡ１）Ｐ
（、（９グルコース−６−ホスフェ−＋−＋ＮＡＤＰＤ
−グルコノーδ−ラクＩ・ン＋還元型ＮＡＤＰ（至）Ｌ
−−マレイド十Ｎｋ］）Ｐ オギザロアセテート」−還元型ＮＡＤＰ（３７）グリセ
ロール＋Ｎ”ＡＤＰ ジヒドロキンアセトン＋還元型ＮＡＤＰμｓ）グリセロ
アルデヒド−３−ホスフェート十Ｎへ〇Ｐ３−ホスホ−
グリセレイ）＋還元ＷＮＡＤＰまたサイクリング反応形
成のための前記とは異なる別のＮＡＤＰ依存性デヒドロ
ゲナーゼおよび（−のＮＡｆ）Ｐ依存性デヒドロゲナー
ゼ用酸化型基質を有するＮＡＤＰ生成試薬におけるこの
Ｎ Ａ ｐＰ依存性デヒドロゲナーゼ（Ｅ２）！ｒｉ、
前記の還元型ＮＡＩ）Ｐ生成試薬によって生じた還フ〔
型ＮＡＤＰに作用してＮＡＤＰを形成せしめる反応を触
媒する酵素であればよく、通常この還元型へＡＤＰとＮ
Ａ Ｄ Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用酸化型基質Ｇ５
２）との存在下ＮＡ Ｄ Ｐデヒドロゲナーゼ■２）は
、・その基質の還元型生成物（Ｐ２）およびＮＡＤＰを
生成せしめてなるものである。以下にこの還元型Ｎ Ａ
１） ｉ＋依存性デヒドロゲナーゼおよび還元型ＮＡ
ＤＰ依存性テヒドロゲナーゼ用基、さらにこれらによる
酵素反応の概略を挙げるが、その反応系としては、前記
の逆反応の系や、以下の正又応が挙げられるものである
が、こり、らは例示であって何んら限定するものではな
い。
１３！１１ ＲＣＩ（Ｏ＋還）し型ＮＡｒ５Ｐ ±＝
＝＝＝＝＝苓Ｌ（ＣＨ２０Ｈ＋ＮＡＤＰ（ただ１〜１（
は低級アルキル基、例えばメチル基を示す）（１（υＤ
−グリセロアルデヒドｌ−１−還元型ＮＡＤ Ｐクリセ
ロール＋ＮＡＤＰ （４１］２−アセトアセテート＋還元型ＮＡＤＰ２．３
−ジヒドロキシインバレレイト＋Ｎ’ＡＩ）Ｐ（４２ア
ニスアルテヒド＋還元型ＮＡＩ）Ｐアニスアルコール＋
ＮＡＤＰ ｔ４３）Ｄ−フラクトース＋還元型ＮＡＤＰＤ−マンニ
トール＋ＮＡＤＰ ｔｌ ４１ジヒドロキノアセトン＋還元型Ｎ Ａ Ｄ
））グリセロール＋ＮＡＤ Ｐ （４５） ２−オキノグルタレイト十ＮＬヰ還元型Ｎ
Ａ Ｄ ｆ）Ｌ−グルメメイト＋１（２０＋ ＮＡＤＰ
（４６）フェノール＋０２＋還元型Ｎ Ａ Ｄ ’Ｐ（
ＦＪｏ、１’、、１４．１３．７） カテコール、（Ｐ２）＋Ｈ２０＋ＮＡＤＰ（４７）ベン
ゾエイト（Ｓ２）＋０２＋還元型ＮＡＤＰ４〜ヒドロキ
／ベンゾエイト（Ｐ２）＋Ｈ２０＋ＮＡＬ）Ｐｔ＝１８
）コレステロール（Ｓ２）＋０２＋還元型ＮＡＤ Ｐ７
α−ヒドロキシコレステロール（Ｐ２）＋Ｈ２０−１−
ＮＡＬ）Ｐ（・Ｉ！ＩＩ Ａ、 （Ｓ２）十還元型Ｎ
Ａ Ｄ ＰＡｌ（、、’ＣＰ、、）＋ ＮＡＩ）Ｐ（た
だしＡはテトラゾリウム塩を示し、ＡＨ２はホルマザン
を示す） 前記の種々の反応系において、反応方向→は正反応とし
ての使用目的の反応系を意味し、丑だ反応方向（−は逆
反応としての別の使用目的にて利用される反応系を示す
ものである。例えば前記の（１２）Ｑ３ｊ等の正反応は
残存１マＡＤ定量のための目的として供し得、またその
逆反応は生成１’Ｊ Ａ Ｄを定量するための目的とし
て供し得るものである。−！だ前記の（３つ、（３３）
等の正反応ばＥｌによる反応としての目的で使用され、
捷た逆反応は」Ｃ２による反応として使用できるもので
ある。
＝＝＝＝＝苓Ｌ（ＣＨ２０Ｈ＋ＮＡＤＰ（ただ１〜１（
は低級アルキル基、例えばメチル基を示す）（１（υＤ
−グリセロアルデヒドｌ−１−還元型ＮＡＤ Ｐクリセ
ロール＋ＮＡＤＰ （４１］２−アセトアセテート＋還元型ＮＡＤＰ２．３
−ジヒドロキシインバレレイト＋Ｎ’ＡＩ）Ｐ（４２ア
ニスアルテヒド＋還元型ＮＡＩ）Ｐアニスアルコール＋
ＮＡＤＰ ｔ４３）Ｄ−フラクトース＋還元型ＮＡＤＰＤ−マンニ
トール＋ＮＡＤＰ ｔｌ ４１ジヒドロキノアセトン＋還元型Ｎ Ａ Ｄ
））グリセロール＋ＮＡＤ Ｐ （４５） ２−オキノグルタレイト十ＮＬヰ還元型Ｎ
Ａ Ｄ ｆ）Ｌ−グルメメイト＋１（２０＋ ＮＡＤＰ
（４６）フェノール＋０２＋還元型Ｎ Ａ Ｄ ’Ｐ（
ＦＪｏ、１’、、１４．１３．７） カテコール、（Ｐ２）＋Ｈ２０＋ＮＡＤＰ（４７）ベン
ゾエイト（Ｓ２）＋０２＋還元型ＮＡＤＰ４〜ヒドロキ
／ベンゾエイト（Ｐ２）＋Ｈ２０＋ＮＡＬ）Ｐｔ＝１８
）コレステロール（Ｓ２）＋０２＋還元型ＮＡＤ Ｐ７
α−ヒドロキシコレステロール（Ｐ２）＋Ｈ２０−１−
ＮＡＬ）Ｐ（・Ｉ！ＩＩ Ａ、 （Ｓ２）十還元型Ｎ
Ａ Ｄ ＰＡｌ（、、’ＣＰ、、）＋ ＮＡＩ）Ｐ（た
だしＡはテトラゾリウム塩を示し、ＡＨ２はホルマザン
を示す） 前記の種々の反応系において、反応方向→は正反応とし
ての使用目的の反応系を意味し、丑だ反応方向（−は逆
反応としての別の使用目的にて利用される反応系を示す
ものである。例えば前記の（１２）Ｑ３ｊ等の正反応は
残存１マＡＤ定量のための目的として供し得、またその
逆反応は生成１’Ｊ Ａ Ｄを定量するための目的とし
て供し得るものである。−！だ前記の（３つ、（３３）
等の正反応ばＥｌによる反応としての目的で使用され、
捷た逆反応は」Ｃ２による反応として使用できるもので
ある。
上記のＮ、Ａ Ｄ Ｐ生成試薬においては、特にジアホ
ラーゼ（ＮＡ、ＤＰＩ（）およびテトラゾリウム塩を有
する試薬を用いることが好ましく、寸たテトう゛ゾリウ
ム塩としては、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル’）−
２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ・テ
トラゾリウムＱクロライド（Ｉ ＮＴ） 、３− （４
，５−ジメチル−２−チアゾリル）−，２，５−ジフェ
ニル−２Ｈ・テトラゾリウム・ブロマイド、３．３’
−（４，４’−ビフエニリレ：／）−ビス（２，５−ジ
フェニル−２Ｈ・テトラゾリウム・クロライド）、３．
３’ −（３，３’−ジメトキ７−４．４７−ビフエリ
レン）−ビス［２−（ｐ−二ｌ・ロフェニル）−５−フ
ェニル−２Ｈ・テトラツリウム・クロライド（ニトロテ
トラゾリウム：ｒＱＴ、Ｂ）など力・挙げられる。
ラーゼ（ＮＡ、ＤＰＩ（）およびテトラゾリウム塩を有
する試薬を用いることが好ましく、寸たテトう゛ゾリウ
ム塩としては、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル’）−
２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ・テ
トラゾリウムＱクロライド（Ｉ ＮＴ） 、３− （４
，５−ジメチル−２−チアゾリル）−，２，５−ジフェ
ニル−２Ｈ・テトラゾリウム・ブロマイド、３．３’
−（４，４’−ビフエニリレ：／）−ビス（２，５−ジ
フェニル−２Ｈ・テトラゾリウム・クロライド）、３．
３’ −（３，３’−ジメトキ７−４．４７−ビフエリ
レン）−ビス［２−（ｐ−二ｌ・ロフェニル）−５−フ
ェニル−２Ｈ・テトラツリウム・クロライド（ニトロテ
トラゾリウム：ｒＱＴ、Ｂ）など力・挙げられる。
上記の還元ノｌｌ！！ Ｎ Ａ ｌ） ｌ）生成試薬お
よびＮ Ａ Ｄ ））／−１成試薬によるサイクリング
反応においては、■ザイクルノ又尾、１σＶこ、１’Ｊ
Ａ １つＰ１モル比当−リ、１モル比のＮ Ａ Ｄ
Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用基質を消′＃１．てその基
質酸化物を生成し、かつ生成した還元型Ｎ Ａ、 ｌ）
Ｐ Ｉモル比当り１モル比の還元型依存性テヒトログ
ナーゼ用基質を消費してその基質壷几物を牛、１戎にて
なるもので、被検液中の成分の一定「、４・に対して１
分当りＪＯザイクル以上の戊比、をヰすることから、少
なくとも定量目的とする成分のＭ Ｌ７こ比べてそのサ
イクル数以上のモル比に相１、ｌ’、、 ｔ、た試薬の
量を用いノ１．ばより。通常人過継］媚゛の各−Ｊ４１
ｉ、が用いらり、、例えば被恢欣中のＡ Ｔ ｌ）ま／
こはｒ’Ｊ Ａ １）の量に比べて５０借量以上、好ま
しくは１００〜１００００倍量のＮ Ａ Ｄ Ｐ依存性
デヒト１’：Ｉゲナ−セ月ｊ僅元型基４１や別のＮ Ａ
Ｄ Ｐ依イｊ性テヒトロケナーセに対応する酸化型基
質を用いればよい。址だ用いらｔしるＮ、Ａ Ｌ） Ｐ
依存性テヒドロゲーノー−−セや別ノ） Ｎ Ａ ｆ）
ｌ）依存性デヒドロゲナーセ（は、ザイクリ７り反り
巳、をイーｊなわせしめるに充分な任意の１１゛（酵素
活性単位）の使用でよく、また適宜選択し、たデヒドロ
ゲナ−ゼの比活性やｋｍ 値に応じて使用量４：増減
すれはよい。通常ｌゲスト当り０．０５ 単位以上あ
ればよく、１分間当り１０サイクル以上、好ましくは１
分間当り５０サイクル以上、より好ましくは１分間当り
１００サイクル以上の反ｊ芯を行なわせしめるような酵
素層を用いればよく、好ましくは１牟位〜１００単位用
いればよい１、さらにこめサイクリング反応ｖｃ ：ｈ
ける反応媒体としては、用いる谷酵素の活性の安定なｐ
Ｈ域のものであればよく、通讃弱敵１生ないし弱アルカ
リ性、例えばｐｆ（６〜９．５程度の緩衝液を選択して
用い八（ばよい。また緩動７没としては、例えばリン酸
緩葡ｆＬ仮、トリス−ＨＣ１緩イ匍ず夜、クリセリルグ
リンン緩剖？ｆダ、イミダゾール〜ｆ−ＩＣＩ緩価１１
り、ジメチルゲルタール＋６−１’Ｊａ’Ｏｌ（緩衝液
、グリノン−Ｎａｔ）Ｈ緩衝液、ピペスーＮａ１ｌ（緩
衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが用いられる。
よびＮ Ａ Ｄ ））／−１成試薬によるサイクリング
反応においては、■ザイクルノ又尾、１σＶこ、１’Ｊ
Ａ １つＰ１モル比当−リ、１モル比のＮ Ａ Ｄ
Ｐ依存性デヒドロゲナーゼ用基質を消′＃１．てその基
質酸化物を生成し、かつ生成した還元型Ｎ Ａ、 ｌ）
Ｐ Ｉモル比当り１モル比の還元型依存性テヒトログ
ナーゼ用基質を消費してその基質壷几物を牛、１戎にて
なるもので、被検液中の成分の一定「、４・に対して１
分当りＪＯザイクル以上の戊比、をヰすることから、少
なくとも定量目的とする成分のＭ Ｌ７こ比べてそのサ
イクル数以上のモル比に相１、ｌ’、、 ｔ、た試薬の
量を用いノ１．ばより。通常人過継］媚゛の各−Ｊ４１
ｉ、が用いらり、、例えば被恢欣中のＡ Ｔ ｌ）ま／
こはｒ’Ｊ Ａ １）の量に比べて５０借量以上、好ま
しくは１００〜１００００倍量のＮ Ａ Ｄ Ｐ依存性
デヒト１’：Ｉゲナ−セ月ｊ僅元型基４１や別のＮ Ａ
Ｄ Ｐ依イｊ性テヒトロケナーセに対応する酸化型基
質を用いればよい。址だ用いらｔしるＮ、Ａ Ｌ） Ｐ
依存性テヒドロゲーノー−−セや別ノ） Ｎ Ａ ｆ）
ｌ）依存性デヒドロゲナーセ（は、ザイクリ７り反り
巳、をイーｊなわせしめるに充分な任意の１１゛（酵素
活性単位）の使用でよく、また適宜選択し、たデヒドロ
ゲナ−ゼの比活性やｋｍ 値に応じて使用量４：増減
すれはよい。通常ｌゲスト当り０．０５ 単位以上あ
ればよく、１分間当り１０サイクル以上、好ましくは１
分間当り５０サイクル以上、より好ましくは１分間当り
１００サイクル以上の反ｊ芯を行なわせしめるような酵
素層を用いればよく、好ましくは１牟位〜１００単位用
いればよい１、さらにこめサイクリング反応ｖｃ ：ｈ
ける反応媒体としては、用いる谷酵素の活性の安定なｐ
Ｈ域のものであればよく、通讃弱敵１生ないし弱アルカ
リ性、例えばｐｆ（６〜９．５程度の緩衝液を選択して
用い八（ばよい。また緩動７没としては、例えばリン酸
緩葡ｆＬ仮、トリス−ＨＣ１緩イ匍ず夜、クリセリルグ
リンン緩剖？ｆダ、イミダゾール〜ｆ−ＩＣＩ緩価１１
り、ジメチルゲルタール＋６−１’Ｊａ’Ｏｌ（緩衝液
、グリノン−Ｎａｔ）Ｈ緩衝液、ピペスーＮａ１ｌ（緩
衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが用いられる。
さらに反Ｊ、Ｌｌに当っては、通常３０〜３７℃１寸近
にて１分以上行なえばよく、−！、た６０分以上Ｖこわ
たって反応ぜ１、め−Ｃもよ−。
にて１分以上行なえばよく、−！、た６０分以上Ｖこわ
たって反応ぜ１、め−Ｃもよ−。
このようにしてサイクリング反応せしめた後、次いでノ
又ｈｊ’、’：によって生ずる伏出できる変化のｉ汁を
定量するのであるが、この検出できる変化として嬉ザイ
クリング反応における消費されるＮＡ’ＤＰ依存性デヒ
ドロゲナーゼ用遣元型基質（Ｓ□）またけＮ’ Ａ Ｄ
ｌ）依存性テヒドロゲナーゼ用酸化循基質（Ｓ２）や
、Ｓｌの酸化型生成物であるＰｌまたす′ｉｓ２の還元
型生成物であるＰ２の成分の変化をもって行な／ｌばよ
い。こり、らの成分を測定するに肖っては、その成分を
基質として、少なくとも酸素を消費すルオキ／ダーゼを
作用せしめ、この反応によって消費される成分丑たは生
成される成分を定゛最すルに１、よい３、例えばｐ１ｔ
／こはＰ２がピルビン酸の〕場合にはピルビンｊ夕を、
！１（質とし、酸素および無機リンを消費して、アセチ
ルリン酸−ＣＯ７および過酸化水ｇ、全生成するピルベ
ートオキシダーゼ（ａｃ、ｉ。
又ｈｊ’、’：によって生ずる伏出できる変化のｉ汁を
定量するのであるが、この検出できる変化として嬉ザイ
クリング反応における消費されるＮＡ’ＤＰ依存性デヒ
ドロゲナーゼ用遣元型基質（Ｓ□）またけＮ’ Ａ Ｄ
ｌ）依存性テヒドロゲナーゼ用酸化循基質（Ｓ２）や
、Ｓｌの酸化型生成物であるＰｌまたす′ｉｓ２の還元
型生成物であるＰ２の成分の変化をもって行な／ｌばよ
い。こり、らの成分を測定するに肖っては、その成分を
基質として、少なくとも酸素を消費すルオキ／ダーゼを
作用せしめ、この反応によって消費される成分丑たは生
成される成分を定゛最すルに１、よい３、例えばｐ１ｔ
／こはＰ２がピルビン酸の〕場合にはピルビンｊ夕を、
！１（質とし、酸素および無機リンを消費して、アセチ
ルリン酸−ＣＯ７および過酸化水ｇ、全生成するピルベ
ートオキシダーゼ（ａｃ、ｉ。
２．３．３）および無機リンを用いてさらにフラビンア
デニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフェートの存
在下反ＬＣ，せしめて溶存酸素を消費せしめ、アセチル
リン１笈、ＣＯ□および過酸化水素全生成せしめ、次い
でこの酸素の消音量またはＣＯ２、過酸化水素の佑成量
を定量することにより、存在するピルビン酸の量を測定
してなるものである。寸たＰｌまたけＰ２がエタノール
の場合に（は、エタノールを基質とし、酸素を消費して
、アセトアルテヒドおよび過酸化水素を生成してなるア
ルコールオキンダーゼ［Ａｎａｌｙ−ｔｉｃａｌ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、２ （１）、４１−４８ （１９６９））
を用−て、前記と同様に消費さ′ｈた成分または生成さ
れた成分を定量して、エタノールをｏ１１］定すればよ
い。さらＩ／ＣＰ１−ＪたばＰ２がグリセロールの場合
には、グリセロールを基質トして酸素を〆消費し、グリ
セロアルテヒドおよび過酸化水素を生成するグリセロー
ルオギシダーゼを用いて行なえばよい。さらにこれらの
オキシダーゼによる消費成分である酸素の量はｒ夕素′
眠極にて電気化学的変化量として定量すればよく、址た
その生成成分が過酸化水素のノ易合には過酸化水素電極
にて電気化学的変化量として定量すればよく、通常これ
らの各成分は簡便な電気化学的変化量とし、て定量すれ
ばよい。寸だ特に簡便には、Ｓ２と（７てテトラゾリウ
ム塩、例えばＮ ’Ｉ” Ｂを用することに」こり形成
されるホルマザン色素（Ｐ２）の量を比色定量するもの
で、比色定量に当ってはそのホルマザン色素の１吸収波
長、例えば波長４５０〜５５０’ ？１９７ｒによる吸
光度測定を行なえばよい。このようにしてサイクリング
反応にお・ける消費される成分の川または生成ざ；とシ
る成分の量を定量すること１【よつ、その倹量曲線から
被検液中のＡ゛ｒＩ）首たｕ Ｎ Ａ ｌ）の決定がな
しイｑるものである。さらＶこそのＡ Ｔ Ｐま／こは
ＮＡＤの値から、用いた被↑英液中の酵素反則系のｒ腎
素ｆ占件または用−た成分の定率の゛いずれか一成分の
測定をなし得るものである４゜ さらに本発明の定量１去命実施するためのＩＶヂ素およ
び必要な試薬は、同−系丑たは２以上からなる禾として
、水浴散状Ｖこて保存してもよく、また乾燥した粉末状
１でて保存してもよく、特に凍結乾・探にて乾燥保存す
ることが簡便である。さらにテトシゾリウムＪｊ＋Ａｆ
：用いる場合には形成されるホルマザン色素の沈澱を生
ずることもあり、かつ凍結乾燥後の可溶化、の際に良好
に溶解できない傾向があるために、界面活性剤、゛特に
非イオン系界面活性剤を用いて、その点を改善すること
が好ましめ。
デニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフェートの存
在下反ＬＣ，せしめて溶存酸素を消費せしめ、アセチル
リン１笈、ＣＯ□および過酸化水素全生成せしめ、次い
でこの酸素の消音量またはＣＯ２、過酸化水素の佑成量
を定量することにより、存在するピルビン酸の量を測定
してなるものである。寸たＰｌまたけＰ２がエタノール
の場合に（は、エタノールを基質とし、酸素を消費して
、アセトアルテヒドおよび過酸化水素を生成してなるア
ルコールオキンダーゼ［Ａｎａｌｙ−ｔｉｃａｌ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、２ （１）、４１−４８ （１９６９））
を用−て、前記と同様に消費さ′ｈた成分または生成さ
れた成分を定量して、エタノールをｏ１１］定すればよ
い。さらＩ／ＣＰ１−ＪたばＰ２がグリセロールの場合
には、グリセロールを基質トして酸素を〆消費し、グリ
セロアルテヒドおよび過酸化水素を生成するグリセロー
ルオギシダーゼを用いて行なえばよい。さらにこれらの
オキシダーゼによる消費成分である酸素の量はｒ夕素′
眠極にて電気化学的変化量として定量すればよく、址た
その生成成分が過酸化水素のノ易合には過酸化水素電極
にて電気化学的変化量として定量すればよく、通常これ
らの各成分は簡便な電気化学的変化量とし、て定量すれ
ばよい。寸だ特に簡便には、Ｓ２と（７てテトラゾリウ
ム塩、例えばＮ ’Ｉ” Ｂを用することに」こり形成
されるホルマザン色素（Ｐ２）の量を比色定量するもの
で、比色定量に当ってはそのホルマザン色素の１吸収波
長、例えば波長４５０〜５５０’ ？１９７ｒによる吸
光度測定を行なえばよい。このようにしてサイクリング
反応にお・ける消費される成分の川または生成ざ；とシ
る成分の量を定量すること１【よつ、その倹量曲線から
被検液中のＡ゛ｒＩ）首たｕ Ｎ Ａ ｌ）の決定がな
しイｑるものである。さらＶこそのＡ Ｔ Ｐま／こは
ＮＡＤの値から、用いた被↑英液中の酵素反則系のｒ腎
素ｆ占件または用−た成分の定率の゛いずれか一成分の
測定をなし得るものである４゜ さらに本発明の定量１去命実施するためのＩＶヂ素およ
び必要な試薬は、同−系丑たは２以上からなる禾として
、水浴散状Ｖこて保存してもよく、また乾燥した粉末状
１でて保存してもよく、特に凍結乾・探にて乾燥保存す
ることが簡便である。さらにテトシゾリウムＪｊ＋Ａｆ
：用いる場合には形成されるホルマザン色素の沈澱を生
ずることもあり、かつ凍結乾燥後の可溶化、の際に良好
に溶解できない傾向があるために、界面活性剤、゛特に
非イオン系界面活性剤を用いて、その点を改善すること
が好ましめ。
また非イオン系界面活性剤として（ｄｌ例えばセチルア
ルコール、５つ’）ルアルコール、ステアリルアルコー
ル、オレイルアルコールなどの高級脂肪族アルコールの
ポリオキシエチレンエーテル誘導体、インオクチルフェ
ノールやノニルフェノールのポリオキシエチレンエーテ
ル誘導体、ステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸のノ
ルビタンエステルのポリオキシエチレンエステル誘導体
、ショ糖脂肪酸エステル誘導体、ボリホキンエチレンの
第２級アルコールのエトキ／レート訪導体、などが挙げ
られ、）ｆＬＢ１１〜２０の範囲のものを用いることが
良好であり、好ましくは、例えばトリトンＸ−１００（
商品名）やアデカトールＳＯ−１４５（商品名）などが
拳げられる。丑だ界面活性剤の使用濃度としては帆００
１〜５優の範囲が好ましい。ざらに心安に応じてグリセ
リン、ポリエチレンクリコール、ソルビト−ル、シヨｖ
島りル：：Ｉ−−ス、マルトースなどを添加してもよ（
八。
ルコール、５つ’）ルアルコール、ステアリルアルコー
ル、オレイルアルコールなどの高級脂肪族アルコールの
ポリオキシエチレンエーテル誘導体、インオクチルフェ
ノールやノニルフェノールのポリオキシエチレンエーテ
ル誘導体、ステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸のノ
ルビタンエステルのポリオキシエチレンエステル誘導体
、ショ糖脂肪酸エステル誘導体、ボリホキンエチレンの
第２級アルコールのエトキ／レート訪導体、などが挙げ
られ、）ｆＬＢ１１〜２０の範囲のものを用いることが
良好であり、好ましくは、例えばトリトンＸ−１００（
商品名）やアデカトールＳＯ−１４５（商品名）などが
拳げられる。丑だ界面活性剤の使用濃度としては帆００
１〜５優の範囲が好ましい。ざらに心安に応じてグリセ
リン、ポリエチレンクリコール、ソルビト−ル、シヨｖ
島りル：：Ｉ−−ス、マルトースなどを添加してもよ（
八。
このような各酵素および必要な試薬の量を決足（７、こ
れを水溶液状として定量に供するものであるが、用いる
液−嘴は特に限定されるものでなく、］１６常１テスト
’Ａ 、ｔ） ０．０５ ｍｌ 〜５ｔｎｌを用イｈ、
ばよく、また対象点しての被検液量も、特に限定される
ものではなく、通常１テスト当り０．００５ｍ１〜５
ｍｌ用いればよく、特にｏ、ｏｉ〜Ｑ、ｌＩｎ、ｄ程要
が適当であるまた反ｊ心に当っては、ｌマＡ、ｆ）キナ
ーゼにょる液比、と、Ｎ Ａ １） Ｐ依存性デヒドロ
ゲナーゼと別の１’Ｊ ＡＬ）Ｐ依存性テヒドロゲナー
ゼとを用いる共役反応によるサイクリング反応とを、遂
次別々に行なってもよく、また同一系で行なってもよｊ
ものである。次いでそのサイクリング反応後、反応にお
いて消費される成分または生成される成分を検出できる
変化の積゛として定二赦すればよい。
れを水溶液状として定量に供するものであるが、用いる
液−嘴は特に限定されるものでなく、］１６常１テスト
’Ａ 、ｔ） ０．０５ ｍｌ 〜５ｔｎｌを用イｈ、
ばよく、また対象点しての被検液量も、特に限定される
ものではなく、通常１テスト当り０．００５ｍ１〜５
ｍｌ用いればよく、特にｏ、ｏｉ〜Ｑ、ｌＩｎ、ｄ程要
が適当であるまた反ｊ心に当っては、ｌマＡ、ｆ）キナ
ーゼにょる液比、と、Ｎ Ａ １） Ｐ依存性デヒドロ
ゲナーゼと別の１’Ｊ ＡＬ）Ｐ依存性テヒドロゲナー
ゼとを用いる共役反応によるサイクリング反応とを、遂
次別々に行なってもよく、また同一系で行なってもよｊ
ものである。次いでそのサイクリング反応後、反応にお
いて消費される成分または生成される成分を検出できる
変化の積゛として定二赦すればよい。
このようにしてなる本発明の定＠法は、ＡＴＰまたは１
ぐＡｎ）の定電法として新規な方法によるもノテ、カッ
′ｅ、量のＡ ’Ｊ” ＰやＮ Ａ Ｉ）を高感度にて
良好（で定量し得るもので、さらに自動化のだめのもの
として有用であシ、さらＫＡ、ＴＰやＮ Ａ Ｄを用す
る種々の酵素液玉）系やＡＴＰ’ｅＦＮＡＤを生成する
酵素反応系に関与する酵素活性捷たけその他の成分のい
ずれか一成分゛の測定を良好になし倚るものである。
ぐＡｎ）の定電法として新規な方法によるもノテ、カッ
′ｅ、量のＡ ’Ｊ” ＰやＮ Ａ Ｉ）を高感度にて
良好（で定量し得るもので、さらに自動化のだめのもの
として有用であシ、さらＫＡ、ＴＰやＮ Ａ Ｄを用す
る種々の酵素液玉）系やＡＴＰ’ｅＦＮＡＤを生成する
酵素反応系に関与する酵素活性捷たけその他の成分のい
ずれか一成分゛の測定を良好になし倚るものである。
次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限られるもの・ ではない
。
明はこれらによって何んら限られるもの・ ではない
。
実施例１ ：ＮＡＤの定量
反応液■組成
反ｂｓ液１１組成
上記反応液Ｉ組成を有する反応液Ｑ 、 １ｍｌに、各
磯Ｉｔ １〜５ ｔｔ＋〜／Ｉ）のＮＡＩＤを含有する
試料液４０μｌを添加し、３７℃で２０分間反応せしめ
た。反応後こり、に、上記反応液ＩＴ組成を有する反応
ン仮０．１ｔｒｔ ｌを添加し、添加後３７℃で正確に
１０分間反応せしめ、その＆ Ｏ，ＬＮＨＣ１２、８ｍ
ｌを添加して反応を停止した。次すで反応終了液を、吸
光波長５５０７ｊ７？ルにおける吸光Ｋを比色定量した
。その結果、第１］女］に示す通りで、ＮＡｏｘと吸光
／ｆの間に良好なＨ（ｉ線件が１ｉＬ’Ｗ度よく得られ
た。この結果サイクリング率は約４５回／分であった。
磯Ｉｔ １〜５ ｔｔ＋〜／Ｉ）のＮＡＩＤを含有する
試料液４０μｌを添加し、３７℃で２０分間反応せしめ
た。反応後こり、に、上記反応液ＩＴ組成を有する反応
ン仮０．１ｔｒｔ ｌを添加し、添加後３７℃で正確に
１０分間反応せしめ、その＆ Ｏ，ＬＮＨＣ１２、８ｍ
ｌを添加して反応を停止した。次すで反応終了液を、吸
光波長５５０７ｊ７？ルにおける吸光Ｋを比色定量した
。その結果、第１］女］に示す通りで、ＮＡｏｘと吸光
／ｆの間に良好なＨ（ｉ線件が１ｉＬ’Ｗ度よく得られ
た。この結果サイクリング率は約４５回／分であった。
実施例２：ＮＡＯの定量
実施−＆ＩＪ １の戊応欧１１組成のＮＴＢの代りに（
〕、０１備１１’Ｊ Ｔ音用１い、トリトンｘ−ｉｏｏ
Ｏ代シに０．１係アテカト−ルＳ＋、）−１４５（商品
名：旭電化工業社製）を用すて反応液ＩＩＩ ｉ組成を
調製し、各濃度（１〜５μＭ）のＮＡＤを含有する試料
液４ｏｕを対象として、反応液Ｉ組成および液比：液１
■刊或の各反応液を用いて、以下実施例１を同様に操作
し、その反応終了液を吸光波長５００ ｎｍにおける吸
光度を比色定量した。その結果、第２図に示す通りで、
良好な直線性が高感度にて得られたものであった。
〕、０１備１１’Ｊ Ｔ音用１い、トリトンｘ−ｉｏｏ
Ｏ代シに０．１係アテカト−ルＳ＋、）−１４５（商品
名：旭電化工業社製）を用すて反応液ＩＩＩ ｉ組成を
調製し、各濃度（１〜５μＭ）のＮＡＤを含有する試料
液４ｏｕを対象として、反応液Ｉ組成および液比：液１
■刊或の各反応液を用いて、以下実施例１を同様に操作
し、その反応終了液を吸光波長５００ ｎｍにおける吸
光度を比色定量した。その結果、第２図に示す通りで、
良好な直線性が高感度にて得られたものであった。
実施例３ ：ＡＴＰの定量
実施例Ｉの１反応液Ｉ組成のＡＴＰの代シに１゜ηＬ
Ｍ ｆ’Ｊ Ａ Ｄを用いてなる反応液帆１ ｍｌを小
試験管ｆ／Ｃとり、各’ＰＭ’１１度（１〜５μＭ）の
Ａ ’ｆ’ Ｐを含有する試料液４０ ｌＪを添加し、
３７℃で２０分間反応せしめ、次いでこれに、実施例１
の反応液■組成の反応数０．１ｒｎｅを添加し、３７℃
で正確に１０分間反応せしめた。反応後、Ｌ、１３ｍ１
のＯ’、ｌＮ１（Ｃ）を添〃ｕした後、吸光波長５５０
ｒｖｍにおける吸光興を比色定量した。その結果、第
３図に示す通りで、ＡＴＰ電と吸光度の間にＢＬ好な直
勝性が高感度でイ４Ｉられた。
Ｍ ｆ’Ｊ Ａ Ｄを用いてなる反応液帆１ ｍｌを小
試験管ｆ／Ｃとり、各’ＰＭ’１１度（１〜５μＭ）の
Ａ ’ｆ’ Ｐを含有する試料液４０ ｌＪを添加し、
３７℃で２０分間反応せしめ、次いでこれに、実施例１
の反応液■組成の反応数０．１ｒｎｅを添加し、３７℃
で正確に１０分間反応せしめた。反応後、Ｌ、１３ｍ１
のＯ’、ｌＮ１（Ｃ）を添〃ｕした後、吸光波長５５０
ｒｖｍにおける吸光興を比色定量した。その結果、第
３図に示す通りで、ＡＴＰ電と吸光度の間にＢＬ好な直
勝性が高感度でイ４Ｉられた。
”、Ｋ 流側４ ：クレアチンポスフエートの定量反応
液Ｉ Ａ＝成 反応Ｉｆり１１絹成 」−記反応准Ｉ組成を有する反１．６液帆１ ｍｅに、
谷ｒｔ＋ｉ ６ａ Ｉ＆ （１〜５μＭ）のタレアチン
ホスフエートヲ含自する試料液４０μｌを添加し、３７
℃で２０分間反Ｌしｅ：、 した。反応後こノ１書ご、
上記の反応液１１１絹成を有する反応液Ｑ、ｌ＋ｎＪを
添加し、３７℃で１ｔｔ ｒｉｔ＋に１０分間反応せし
め、０．１ Ｎ ｆ（ＣＩ ２．８ ｍｅを添加して反
応を停止した。反応終了後、吸光波長５５０７１．７７
＋、における吸光度を比色定量した。その結果、第４図
に示す通りで、微量のクレアチノホスフＪ−トの定量が
簡便になし得た。なお盲検ば、タレアチンホスフエ−１
・の代りに蒸台水４． Ｏｔｉｌｌ ’ｔｒ 用いて行
なった。
液Ｉ Ａ＝成 反応Ｉｆり１１絹成 」−記反応准Ｉ組成を有する反１．６液帆１ ｍｅに、
谷ｒｔ＋ｉ ６ａ Ｉ＆ （１〜５μＭ）のタレアチン
ホスフエートヲ含自する試料液４０μｌを添加し、３７
℃で２０分間反Ｌしｅ：、 した。反応後こノ１書ご、
上記の反応液１１１絹成を有する反応液Ｑ、ｌ＋ｎＪを
添加し、３７℃で１ｔｔ ｒｉｔ＋に１０分間反応せし
め、０．１ Ｎ ｆ（ＣＩ ２．８ ｍｅを添加して反
応を停止した。反応終了後、吸光波長５５０７１．７７
＋、における吸光度を比色定量した。その結果、第４図
に示す通りで、微量のクレアチノホスフＪ−トの定量が
簡便になし得た。なお盲検ば、タレアチンホスフエ−１
・の代りに蒸台水４． Ｏｔｉｌｌ ’ｔｒ 用いて行
なった。
また上記の反応液Ｉ組成のタレアチンキナーゼの代りに
ｌ ＯｍＭのり１／アチンホヌフエ＝−）・を用′ハる
ことにより、クレアチンキナーゼ活性測定用の系となし
得るものである。
ｌ ＯｍＭのり１／アチンホヌフエ＝−）・を用′ハる
ことにより、クレアチンキナーゼ活性測定用の系となし
得るものである。
さらに、上記の反応液組成のタレアチンキナーゼの代り
に１０ ？７ｉ、ｉＶＩホスホエノールピルビン［ｆ
ｋ用いることにより、ピルヘートキナーセ活併測定用の
系となし得るものである３、 実施例５：ＮＡＤの酸素電極による定量反応液■組成；
前記実流例１と同一の組ｂｙ、を有する。
に１０ ？７ｉ、ｉＶＩホスホエノールピルビン［ｆ
ｋ用いることにより、ピルヘートキナーセ活併測定用の
系となし得るものである３、 実施例５：ＮＡＤの酸素電極による定量反応液■組成；
前記実流例１と同一の組ｂｙ、を有する。
反応液１１絹成
）又応液Ｉ絹１＆、をイ１する２反応液０．２ｍｌを酸
メ・、′直極ＪＬＩセル（／ことり、これに、谷祐′延
度（０，１０，２０、：３０．４０．５０ ｔｔＭ）の
ＮＡＤを含有する試料液１．０ ｔｈｅを添加し、；３
７℃で１０分１１４１反ｒｃＬ、ぜしめた３、こｆｔに
、あらかじめ３７℃に刀目温しでおい／、−、ノ又応液
１１ポ［１成をイ１する反応液］、Ｑｔｎｅを加えて：
（７℃で反１心せしめ／こ。次いでこの反応開始１表、
２′１）−７Ｊ・ら４分の２分間ＶＣ：Ｉ’、−ける酸
素の減少ＴＪｊ−を溶存酸素計にて測定した。その結果
（は、第５図ζ・こ小す通りであって、ｊ波累消費量と
Ｎ Ａ Ｉ）−＋けとの間ｆ良好なｌＩ′−！、線関係
が仙られ／こ。丑たこのときのサイクリング率は約３０
回／分であっ／し なおこの反応原理の概略を示ぜ（ば、以ドの則りである
。
メ・、′直極ＪＬＩセル（／ことり、これに、谷祐′延
度（０，１０，２０、：３０．４０．５０ ｔｔＭ）の
ＮＡＤを含有する試料液１．０ ｔｈｅを添加し、；３
７℃で１０分１１４１反ｒｃＬ、ぜしめた３、こｆｔに
、あらかじめ３７℃に刀目温しでおい／、−、ノ又応液
１１ポ［１成をイ１する反応液］、Ｑｔｎｅを加えて：
（７℃で反１心せしめ／こ。次いでこの反応開始１表、
２′１）−７Ｊ・ら４分の２分間ＶＣ：Ｉ’、−ける酸
素の減少ＴＪｊ−を溶存酸素計にて測定した。その結果
（は、第５図ζ・こ小す通りであって、ｊ波累消費量と
Ｎ Ａ Ｉ）−＋けとの間ｆ良好なｌＩ′−！、線関係
が仙られ／こ。丑たこのときのサイクリング率は約３０
回／分であっ／し なおこの反応原理の概略を示ぜ（ば、以ドの則りである
。
ｄｆｒ １図および第２図（はＮＡＤの定量曲線を示し
、第３図はＡＴＰの定量曲想を示し、ｊｉ否４図はタレ
アチンホスフェ−１・の定犠曲臓を示し、第５図ｆｒｉ
ｆｌ？、索？１ｉ小返にょるＮＡＤの定１ｔ１川、；幌
を同くず。 特肝出願人 東洋Δに造株式会社 代表者 高１ゴー１伯男 ′°／ 図 ０１２３４ｆｆ 神の卿・射−％Ｍ） 第２」 ＯＩ ２ ３ 牛 Ｖ 右【斧市ムＨＡＤへ製麦（ｐＨン 第 ３ 図 Ｑ １ ２ ３ ４ ５’本シ牛十の４丁
Ｐのｆ ｒｔυ 第４図 Ｄ Ｉ ２３４ ５ シら ヅＨ →Ｘ 慢 轟← ７本 よ 第 ５１−１ ０ １０ ：Ｌｏ １０ ４０ Ｎ
。 捜／ｌ！Ｆｃ１ｙＩｊ伍斜（ピ）
、第３図はＡＴＰの定量曲想を示し、ｊｉ否４図はタレ
アチンホスフェ−１・の定犠曲臓を示し、第５図ｆｒｉ
ｆｌ？、索？１ｉ小返にょるＮＡＤの定１ｔ１川、；幌
を同くず。 特肝出願人 東洋Δに造株式会社 代表者 高１ゴー１伯男 ′°／ 図 ０１２３４ｆｆ 神の卿・射−％Ｍ） 第２」 ＯＩ ２ ３ 牛 Ｖ 右【斧市ムＨＡＤへ製麦（ｐＨン 第 ３ 図 Ｑ １ ２ ３ ４ ５’本シ牛十の４丁
Ｐのｆ ｒｔυ 第４図 Ｄ Ｉ ２３４ ５ シら ヅＨ →Ｘ 慢 轟← ７本 よ 第 ５１−１ ０ １０ ：Ｌｏ １０ ４０ Ｎ
。 捜／ｌ！Ｆｃ１ｙＩｊ伍斜（ピ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１Ａ’ｌｌ’Ｊ’ （アテノシントリホスフエート
）およびＮＡＤ にコチンアテニンジヌクレオチド）の
いずれか１成分を含有するか、または遊離、生成する被
検液中の１成分の定量において、その被検液に、敲険液
中の１成分でなｌ／ＩＮＡＤおＬびＡＴＰの旨すり、か
１種、マダイ・ゾウムイオノ１だＩＣｒマンガンイオン
を放出できる水溶性地、およびＮ Ａ Ｉ）キナーゼを
作用せしめてＡＤＰ （アテノシンジホスフエート）お
よびＮＡＤＰ にコチンフ′テニ／ジヌクレオチドホス
フェート）を生成−１ノーシめ、次いでＮ Ａ １）
Ｐ １ぺ存性デヒドロケプーゼおよびＮ Ａ ｌ） Ｅ
Ｊ依存性テヒドロゲナーゼ月］還元４ｉ１基質ｆ：Ｍす
る還元型ＮＡＤＰ生成試桑、および別のＮＡＤＰ依存性
デヒドロゲナーゼお」：びそのＮＡＤＰ依任性デヒドロ
ケナ゛−ゼ用阪化４１；！！基質を有するＮ Ａ Ｉ）
ｌ）生成試薬を作用せしめてザイクリング反応を行な
い、その後反応における検出できる変化の量を定量する
ことを特徴とする高感度定量法１、 （２１ＡＴＰを遊Ｗｌ、生成する被検ｉイｋ 中ｏ Ａ
′ｒ ｐ カ、Ａ Ｄ Ｐおよびキナーゼ基質用ホス
フェ−１・化合物に作用してＡ Ｔ Ｐを遊離、生成す
る反応を触ｉｉＫするキナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ
基質用ホスフェート化合物の酵素反応系によるＡ Ｔ
Ｉ）である特許請求の範囲第１項記載の高感髪軍厳法。 （３） キナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質用ホス
フェート化合物の酵素反ＬＬ、系が、りＩ／アチンギナ
ーゼ、ＡＤＰおよびクレアチンホスフェートの酵素反応
系である特許請求の範囲第２項６ｆ」載の高感度定量法
。 （４） キナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質用ホスフ
ェート化合物の酵素反応系が、ピルベートキナーゼ、Ａ
ＤＰおよびホスホエノールピルビン酸の酵素反応系であ
る特許請求の範囲第２項記載の高感度定量法。 （５） Ｎ Ａ ｌ）をＭ届、生１戊する敲倹液中のＮ
Ａ ＋）が、ＮＡＪ）依存性テヒドログナーゼおよび
Ｎ Ａ Ｄ依存：４１） １ヒトロゲツー−ゼ用・ν［
ヒ型基質化合勿５っ１１４７：・反応糸（ｌ（よるＮＡ
Ｉ）である特許請求の範囲第Ｊ 、ｌ１ｔｊ 、；己載
の高感１８１定４１：、去１、（６） Ｎ Ａ、 、ｉ
Ｊ依存１生デヒドロゲナーゼ、還ノじノーＩ１１！ Ｎ
ＡＤおよｏ：Ｎｈｖ依存性テヒト゛ロゲナーセ；１１
１ソ化型基質化合−吻の酵素反応糸が、ラクテートテヒ
ドロゲナーゼ゛ム・よびビルへ−１・のＨａｄ素反・６
糸である・イ、１イ［請求の範囲第５）貝記載の高１１
・に匹＞Ｊ−、；、＃、 、人１、ｆ７） Ｎ Ａ
Ｄ １）的存性テヒドロゲッーーセが、グルコース−６
−ホスフエードテヒドロゲナーセ、７１／イトデヒドロ
ゲツ一一一セ（１寸Ａ Ｉ） Ｐ、テヵルボキンｉ／イ
ディノグ）ペンズアルテヒドデヒトｒＪゲナーセである
’ｌ’：？ ｌ；′ｌ請求の範囲、第１項記・１あの１
□１−１″」４度定量法１、 （８） Ｎ Ａ、、 Ｄ Ｐ １衣存性テヒドロゲナ
ーゼおよびＮＡ１〕１）渣存性テヒトロゲナーゼ用、液
化型基ＪＭを刑するＮ Ａ、 １） Ｐ牛ノ攻試桑が、
ジアホラーゼ（ＮＡ１） ｌ） １１ ） ％１．ｌ、
びテ］・ジゾリウム塩を４］’する」マＡ」）Ｐ生成試
薬であるｔ１寺６ト１−請求の１屯囲第１項記載の高感
昨定届゛法。 （９）ノ又応における検出できる変化の甲が、サイクリ
ング反応における消費きれる成分の最丑たば１１敗さｒ
＋−る成分の融である゛・（す許１．Ｉ″！求のイ、鹸
れｌ第１１１］記・１・しの高ｊ函度定吊″法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8881983A JPS59213400A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | キナ−ゼを用いる高感度定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8881983A JPS59213400A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | キナ−ゼを用いる高感度定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59213400A true JPS59213400A (ja) | 1984-12-03 |
| JPH0412120B2 JPH0412120B2 (ja) | 1992-03-03 |
Family
ID=13953524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8881983A Granted JPS59213400A (ja) | 1983-05-19 | 1983-05-19 | キナ−ゼを用いる高感度定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59213400A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0496412A2 (en) * | 1991-01-25 | 1992-07-29 | Noda Institute For Scientific Research | Method for highly sensitive determination of NADH using NADH kinase |
| US5227299A (en) * | 1991-01-25 | 1993-07-13 | Noda Institute For Scientific Research | Nadh kinase and a process for producing the same |
-
1983
- 1983-05-19 JP JP8881983A patent/JPS59213400A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0496412A2 (en) * | 1991-01-25 | 1992-07-29 | Noda Institute For Scientific Research | Method for highly sensitive determination of NADH using NADH kinase |
| US5227299A (en) * | 1991-01-25 | 1993-07-13 | Noda Institute For Scientific Research | Nadh kinase and a process for producing the same |
| US5250416A (en) * | 1991-01-25 | 1993-10-05 | Noda Institute For Scientific Rsearch | Method for highly sensitive determination of NADH using kinase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0412120B2 (ja) | 1992-03-03 |
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