DK158681B - Udstyr til pyrodruesyreanalyse. - Google Patents

Description

i

DK 158681 B

Opfindelsen angår et udstyr til pyrodruesyreanaly- se.

Udstyret er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

5 Pyruvatoxidase er et kendt enzym, som katalyserer en reaktion fra pyrodruesyre, phosphat og oxygen til dannelse af acetylphosphat, carbondioxid og hydrogenperoxid og afledt af en stamme af Lactobacillus delbruckii. Dette kendte pyruvatoxidaseenzym har et optimum-pH på omkring 5,5. 10 Det har vist sig, at enzymet pyruvatoxidase dannes i en bakteriestamme B-0667 tilhørende slægten Pediococcus og E-0668 tilhørende slægten Streptococcus isoleret fra en jordprøve taget i en radisemark i Ohito-cho, Tagata-gun,

Shizuoka-kcn, Japan. Pyruvatoxidasen fremstillet derfra har 15 i forhold til det ovennævnte tilsvarende Lactobacillus-en- zym et højere optimum-pH på 6,5-8, og det kan benyttes til pyrodruesyreanalyse i en prøve indeholdende pyrodruesyre eller forskellige systemer, som frigør pyrodruesyre. Det har også vist sig, at dette enzym kan benyttes til kvanti-20 tativ analyse af pyrodruesyre, måling af enzymaktiviteten af enzymreaktionssystemer, som danner pyruvat, kvantitativ bestemmelse af enzymet og substratet deraf. Pyrodruesyre kan analyseres ved omsætning af en prøve indeholdende pyrodruesyre med et reaktionssystem omfattende i det mindste 25 pyruvatoxidase, flavinadenindinucleotid (i det følgende kaldet pAD), thiaminpyrophosphat, oxygen og phosphat, og der er tilvejebragt et udmærket udstyr for pyruvatanalyse og·en analysemetode for pyrodruesyre.

Endvidere har det vist sig, at tilsætning af et salt, 30 som frigør calciumion, cobaltion, magnesiumion eller man ganion, til rcaktionssystemot, resulterer i en forbedring af analysen. Tilsætning af chromogen eller fluorescent indikator til reaktionssystemet giver et bekvemt og udmærket analyseudstyr og en tilsvarende fremgangsmåde.

35 Ifølge opfindelsen kan udstyret være ejendommeligt ved det i krav 2's kendetegnende del anførte.

DK 158681 B

2

Den kendte teknik ifølge "Metods in Enzymology, bind 1, side 482 (1955)", "Enzymes, 2. udgave, side 684 (1964)" og Chem. Abstracts, bind 43, 720i og bind 57/17176f nævner pyruvatoxidase fra Lactobacillus delbriickii, Pedio-5 coccus og Streptococcus faecalis . Pyruvatoxidasen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at have et pH-optimum på 6,5-8. Don or derfor i forhold til don kendto pyruvatoxi-daso bedre' egnet l il anvendelse i nnn 1 ysosysforner mod andre enzymer, der har optimum-pil i dette område, da enzymatiske ^0 reaktioner som bekendt foretrækkes at forløbe i det for en zymet optimale pH-område. Hvis man f.eks. med et udstyr ifølge opfindelsen vil analysere glutamat-oxalacetat-trans-ferase-(GOT) eller glutamat-pyruvat-transaminase-(GPT3-aktivitet i. sorumprøvor, er den optimale pif-værdi for disse ^5 to enzymer 7,4. Vod anvendelse af den kendte pyruvatoxidase med optimum-pH 5,5 vil reaktionen ikke forløbe så glat som ved anvendelse af pyruvatoxidasen ifølge opfindelsen med et højere pH-optimum.

Opfindelsen skal forklares nærmere i forbindelse med 2o tegningen, hvor fig. 1 viser den optimale pH-værdi for pyruvatoxidase, fig.lA den optimale pH-værdi for pyruvatoxidasen ifølge opfindelsen sammenlignet med pyruvatoxidasen fra Lactobacillus delbriickii, 25 fig. 2 varmestabiliteten af pyruvatoxidase, fig. 3 pH-stabiliteten af pyruvatoxidase, fig. 4 resultatet af analysen af pyrodruesyre med oxygenelektrode under anvendelse af pyruvatoxidase, 2o fig. 5 resultatet af analyse af serum med oxygenelek trode under anvendelse af pyruvatoxidase, fig. 6 resultatet af analyse af pyrodruesyre ved ko-lometrisk metode under anvendelse af pyruvatoxidase, 22 fig. 7 resultatet af kvantitativ analyse af serum- pyrodruesyre under anvendelse af pyruvatoxidase, 3

DK 158681 B

fig. 8 resultatet. nf analyse af ADP under anvendelse af pyruvatoxidase, fig. 9 resultatet af analyse af glycerol, triglyce-rid og serumtriglycerid under anvendelse af 5 pyruvatoxidase, fig.10 resultatet af analyse af GPT- og GOT-aktivitet under anvendelse af pyruvatoxidase, fig.11 ot korrelationsdiagram for analyse af GPT- aktivitet under anvendelse af pyruvatoxidase, 10 og fig.12 et korrelationsdiagram for analyse af GOT-aktivitet under anvendelse af pyruvatoxidase. Enzymet pyruvatoxidase katalyserer en oxidativ reaktion fra pyrodruesyre, uorganisk phosphat og oxygen til dan-15 nelse af acetylphosphat, carbondioxid og hydrogenperoxid og fremstilles ved dyrkning af pyruvatoxidaseproducerende mikrobestammer valgt blandt Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO 12219 eller IFO 12317.

Den isolerede stamme B-0667 og B-0668 ovenfor har følgen-20 de taksonomiske egenskaber.

A. Iagttagelser på forskellige medier, dyrket ved 30°C i 2 dage:

Stamme B-0667 Stamme B-0668

Tryptosojavæske svag vækst, homogent svag vægt, homogent uklar, senere uldagtig uklar, senere uldag- udfældning tig udfældning 30

Tryptosojaagar- svag vækst, bleggullig- svag vækst, bleggul- skråflade grå, ingen glans, ingen liggrå, ingen glans, produktion af opløseligt ingen produktion af pigment opløseligt pigment 35 Tryptosojaagar- koloni, lille og flad koloni, lille og flad plade 4

DK 158681 B

gelatineplade vækst langs stukket linie,vækst langs stukket ingen flydendegørelse af linie, ingen flydelig-gelatine gørelse af gelatine BCP mælk ingen ændring ingen ændring (14 dage) 5 B. Mikroskopisk iagttagelse:

Stamme B-0667 Stamme B-0668

Form sfærisk, ovoid, par sfærisk, ovoid, par tetraformet eller kort- tetraformet eller kortkædet kædet 10 størrelse: 0,5 - 1,0 x 0,5 - l,0jL>m 0.8 - 1,0 x 1,0 - 1,2 pm motilitet - - spore: gramfarvning + 4- syrefast - - 15 farve C.Fysiologiske egenskaber:

Stamme B-0667 Stamme B-0668 væksttemperatur

45°C

20 37 C + + 30 °C + + 26°C + + 10°C + + 5°C + eller (+) + eller (+) 25 _ - halogentolerance

NaCl 10% + 6,5% + ~ 5,0% + + 1,0% + + 30 0 % + OF-prøvo fi'rire ntat i v formcntativ opførsel i fakultativt anae- fakultativt anae- oxygen: robisk robisk ni t;rntrodukt; i on 25 indoldannelse 5

DK 158681 B

hydrogensulfat- dannelse: gelatinehydrolyse stivolseshydrolyse esculinhydrolyse: + + 5 acctoindannelse MK-prøve: katal ase: oxidase urease (SSR): 10 urcase (Christensen): udnyttelse af citronsyre (Christensen):

Syredannelse fra sukker: adonitol 25 l.(-l·)-arabinose cell obi ose + + dulcitol - - meso-erythritol fructose + + 20 fueose galactose + + glucose + + glycerol inositol 25 i nu 1 i η lactose + + maltose + + mannitol + mannose + + 20 melizitose melibiose + raffinose + L(+)-rhamnose salicin (+) 25 L-sorbose

DK 158681 B

Tabel fortsat 6

Syredannelse fra sukker: sorbitol - - stivelse - - saccharose + + trehalose + + 5 xylose - tolerance ved 60"C i + 30 minutter

Ved konsultation af Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave 1974, og S.T. Cowan og K.J. Steel, Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge Press, 1974, betegnes stammen B-0667 og B-0668 med de ovenfor angivne taksonomiske egenskaber, især grampositive cocci, catalase og oxidase negativ, fermentativ syredannelse fra glucose og ingen gasdannclse fra sukker (glucose), som til-1^ hørende slægten Pediococcus og slægten Streptococcus.

Sammenligning af disse stammer med ovennævnte identifikationsreferencer er som følger: I tabellen: + = positiv mere end 85% - = negativ mere end 85% 20 d = varierer blandt stammer eller arter.

stamme stamme slægt slægt B-0667 B-0668 Pediococcus Streptococcus vækst ved 45°C + d 25 tolerance ved 60°C i 30 min. + d glycerol (syredannelse) ·· - d arabinose (syredannelse) - - + d 30 halogentolerance (NaCl 10%) + - + Følgelig skal stammen B-0667 betegnes som slægten Pediococcus eller Streptococcus. Ved konsultation af ovennævnte Manual for the Identification of Medical Bacteria og J.Gen.

Microbiol., 26, 185-197 (1961). Er de taksonomiske egenskaber 35 af stammen B-0667 næsten identiske med egenskaberne af Pediococcus urina-equi, men egenskaberne beskrevet i Bergey's 7

DK 158681 B

Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, 1974 er en smule forskellige derfra. Derfor betegnes stammen B-0667 som slægten Pediococcus og betegnes som Pediococcus sp. B-0667.

Stammen B-0668 ligner slægten Streptococcus snarere 5 end slægten Pediococcus. Yderligere konsultation af Manual for the Identification of Medical Bacteria resulterer i, at stammen B-0668 ligner Streptococcus fnocium var. durans, mon ingen taksonomiske egenskaber er beskrevet i Bergey's Manual, hvorfor sammenligning i enkeltheder er umulig. Stammen B-0668 10 betegnes derfor som Streptococcus sp. B-0668.

Stammerne B-0667 og B-0668 er deponeret i Institute for Microbial Industry and Technology, agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, under de respektive numre FERM-P nr. 4438 og Ferm-P nr. 4439.

15 I en udførelsesform for den foreliggende opfindelse dyrkes ovennævnte Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO-12219 eller Aerococcus viri-dans IFO-12317 i et konventionelt medium til enzymproduktion.

Dyrkning kan foretages ved konventionel væskedyrkning, 20 og submors luftningskultur foretrækkes til industriel pro duktion. Der kan fortrinsvis benyttes et konventionelt medium til mikroorganismer. Som kulstofkilder kan benyttes assimilerbare carbonkilder såsom glucose, saccharose, lactose, maltose, fructose, melasse og pyrodruesyre. Assimiler-25 bare nitrogenkilder såsom pepton, kødekstrakt, gasrekstrakt og caseinhydrolysat kan benyttes. Forskellige uorganiske salte såsom phosphat, carbonat og sulfat af magnesium, calcium, kalium, jern, mangan eller zink kan benyttes.

Dyrkningstemperaturen kan vælges i området for dyrk-30 ning af mikrobeceller og produktion af pyruvatoxidase, for trinsvis 25-37°C. Dyrkningstiden kan ændres afhængende af betingelserne og afsluttes, når pyruvatoxidaseproduktionen er praktisk taget fuldstændig, normalt 18-48 timer.

Pyruvatoxidase eksisterer i cellerne af mikroorga-35 nismer.

8

DK 158681 B

Til adskillelse af pyruvatoxidase fra de dyrkede celler filtreres el.lor centrifugeres den dyrkede masse til samling af cel lorne, og den oplukkes ved behandling med mekaniske midler eller en enzymatisk proces såsom et lyso-5 zym. Om fornødent solubiliseres pyruvatoxidase ved tilsæt ning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og et overfladeaktivt middel såsom Triton X-100 (indregistreret varemærke) eller Adecatol SO-120 (indregistreret varemærke) til fraskillelse af enzymet. Den således opnåede opløsning 10 af pyruvatoxidase behandles med eller uden inddampning, og derefter fældes enzymet ved udsaltning ved tilsætning af et opløseligt salt såsom ammoniumsulfat eller natriumchlo-rid. Lavmolekylære urenheder fjernes ved dialyse. Endvidere fjernes urenheder i opløsningen af pyruvatoxidase fortrins-15 vis ved adsorptionschromatografi, ionbytningschromatografi eller gelfiltrering. Den således opnåede benzylopløsning behandles ved vakuuminddampning og lyofilisering til fremstilling af pulverformet pyruvatoxidase. Yderligere rensning kan opnås ved konventionelle rensningsmetoder for pro-20 teiner og enzymer såsom adsorptionschromatografi, ionbyt- ningschromatografi eller gelfiltrering.

Pyruvatoxidase fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har følgende fysisk-kemiske egenskaber, hvor der benyttes følgende forkortelse: 25 Pediococcus sp^. B-0667 forkortes B-0667

Streptococcus sp. B-0668 forkortes B-0668

Aerococcus viridans IFO- -12219 forkortes IFO-12219

Aerococcus viridans IFO-12317 forkortes IFO-12317 30 (1) Enzymvirkning:

Enzymet katalyserer oxidativ reaktion fra pyrodruesyre, uorganisk phosphat og oxygen til dannelse af acetylphosphat, carbondioxid og hydrogenperoxid: ch3cocooh + hopo“~ + o2 _^ ch3coopo” + co2 + h2o2 9

DK 15868 1 B

(2) Optimal pH-værdi:

Virkningen af pH-værdien på aktiviteten af pyruvatoxi-dase måles. Phosphatstødpudeopløsninger med pH-værdi 6-8 benyttes til undersøgelsen. Resultaterne fremgår af fig.l, 5 hvor den optimale pH-værdi er som følger: B-0667: pH-værdi 6,3-7,5 B-0668: pH-værdi 7,5-8,5 IFO-12219: pH-værdi 7,0-8,0 1FO-12317: pH-værdi 6,8-7,5 10 Små variationer iagttages ved phosphatkoncentration og art af metalion.

(3) Varmestabilitet:

Varmestabiliteten af enzymet bestemmes ved inkubering i 10 mM phosphatstødpude (pH-værdi 6,5) indeholdende 10 jJM 15 FAD ved 0, 40, 50, 60 og 70°C i 10 minutter efter metoden til enzymbestemmelse. Som det ses af fig. 2, bliver enzymerne opnået fra B-0667, IFO-12219 og IFO-12317 en smule aktiveret ved 40°C og denatureret over 60°C. Det enzym, som opnås fra B-0668, aktiveres ikke ved 40°C og denatureres næsten over 20 60 °C.

(4) pfl-stabilitet:

Til hver enzymopløsning {0,1 ml) sættes 0,2 M phosphatstødpude for pH 6-8 (0,9 ml) eller 0,2 M af Tris-HCl-stød-pude for pH 7-9 (0,9) og hver indeholdende 10 jjM FAD ef-25 terfulgt af henstand i 10 minutter ved 40°C. Der tages 20 filter enzymopløsning, og enzymaktiviteten bestemmes. Som det fremgår af tabel 3, er enzymet opnået fra B-0667, IFO-12219 og IFO-12317 mest stabilt ved ca. pH 7, og enzymet opnået fra B-0668 er stabilt ved en sur pH-værdi.

30 (5) Virkning af forskellige stoffer: 1) Virkningen af forskellige stoffer på enzymaktiviteten undersøges ved tilsætning af 5 mM af de nedenfor angivne stoffer i stedet for MgCl2 i analysesystemet.

35 10

DK 158681 B

_Relativ aktivitet (%)__

Tilsat stof _ B-0667 B-0668 IFO-12219 IFO-12317 ingen tilsætning 25,4 72,0 42,0 50,3 5 EDTA 0 0 0 0

MgCl2 100 100 100 100

CaCl2 " 69,4 75,0 83,4 78,7

MnCl2 129,1 102,7 116,2 111,0

CoCl2 81,3 81,1 85,0 84,0 10 BnCl2 20,6 58,8 23,9 28,8

ZnCl2 16,0 38,2 14,9 22,8

Som det ses ovenfor inhiberes enzymet af EDTA og akti- _ . ++ _ ++ . ++ ++ veres af Mg , Ca , Mn og c o 2) Virkningen af eliminering af følgende stoffer fra

15 nnalysesystemet på enzymaktiviteten er vist nedenfor. 0,1 M

dimethylglutarat-NaOH-stødpude benyttes i tilfælde af phosphat- eliminering.

Elimineret stof _Relativ aktivitet (%)_ _ B-0667 B-0668 IFO-12219 IFO-12317 20 Ingen eliminering 100 100 100 100

Thi nminpyrophosphat 0 0 0 0 FAD 33,9 100 32,7 41,7

Thiaminpyropliosphnt og KAI) 0 0 0 0 phosphat 0000 25 Det fremgår heraf, at enzymet kræver thiaminpyrophosphat og FAD som cofaktor og phosphat som substrat.

Oxygenforbruget ved enzymreaktionen måles med oxygenelektrode, og oxygenet forbruges i forhold til en enzymaktivitet (dannelse af hydrogenperoxid). Resultaterne 30 fremgår af følgende:

Oxygen- Reaktionsprodukt (pmol/min.

(pmol/min.) H2°2 acetylphosphat B-0667 0,042 0,042 0,038 B-0668 0,022 0,0213 0,020 IFO-12219 0,040 0,038 0,037 IFO-12317 0,035 0,036 0,034 35 11

DK 158681 B

Analyserne udføres som følger:

Oxygenforbrug: Måleapparat for opløst oxygen (Handelsnavn: YST-dissolvcd oxygen meter model 53).

Acethylphosphat: F. Lipmann m.fl., J. Biol. Chem., 5 134, 463-464 (1940).

Hydrogenperoxid: Metode under anvendelse af N,N-dime-thylanilin, 4-aminoantipyrin og peberrodsoxidase.

Som forklaret ovenfor betegnes det enzym, som fås fra de fire ovennævnte stammer, som pyruvatoxidase og flavinpro-10 tein. Analysemetoden for pyruvatoxidase ifølge opfindelsen er som følger: 0,5 M kaliumpyruvat 0,1 ml 0,5 M phosphatstødpude (pH 7,0) 0,2 ml 0,2% 4-aminoantipyrin 0,1 ml 15 0,2% N,N-dimethylanilin 0,2 ml 0,2 M MgCl2 50 pliter 10 mM thiaminpyrophosphat 20 yliter peroxidase (45 enheder/ml) 0,1 ml 1 mM FAD 10 jiliter 20 destilleret vand 0,22 ml

Ovenstående reaktionsblanding (1,0 ml) forinkuberes ved 37°C i 3 minutter. Til denne opløsning sættes enzymopløsningen (20 jaliter), og man inkuberer ved 37°C i 10 minutter. 0,1 M citratstødpude (pH 6,0, 2 ml) indeholdende 25 0,1 M EDTA tilsættes til standsning af reaktionen. Den dannede violette farve måles ved kolorimetrisk metode ved 665 nm.

En enhed for enzymaktivitet definres som den aktivitet, som frembringer 1 pmol hydrogenperoxid pr. minut.

30 Til aktivering af pyruvatoxidasereaktionssystemet tilsættes FAD, thiaminpyrophosphat og phosphat. Til aktivering af enzymet tilsættes der fortrinsvis yderligere ion-frigørende salt, som frigør calciumion, cobaltion, magnesiumion eller manganion i form af chlorid. Der vælges for-35 trinsvis en indikator såsom en farveindikator eller fluor- essensindikator for hydrogenperoxid.

DK 158681 B

12 Mængden og mængdeforholdet af komponenter i enzymre-akti.onssystemet kan vælges til hovedsagelig enzymreaktion og vil variere efter mængden af pyruvat, temperatur og tid af enzymreaktionen.

5 F.oks. kan der fortrinsvis benyttes 1-20 enheder py- ruvatoxidase,_0,1-20 nmol FAD og 0,05-0,5 ρηοΐ thiaminpy-rophosphat, 1-10 umol uorganisk phosphat og 0,05-10 ymol ionfrigørende salt pr. forsøg. Pyruvatoxidase kan være i mikroindkapslet form eller immobiliseret form af covalent 10 binding med organisk eller uorganisk bærer eller adsorption med bærer. Det molære forhold af indikator for hydrogenper-oxid er i det mindste et ækvimolært forhold eller et overskud af dannet hydrogenperoxid. I tilfælde af peroxidase benyttes der fortrinsvis 0,5-20 enheder pr. forsøg. Disse 15 komponenter af enzymatisk reaktionsblanding benyttes for trinsvis ved opløsning i don passende indstillede pil-værdi af stødpuden.

Det således fremstillede enzymatiske reaktionssystem kan benyttes til analyse af pyrodruesyre. Enhver prøve, som 20 indeholder pyruvat, kan analyseres. F.eks. pyrodruesyre selv, pyrodruesyre i serum eller urin og pyrodruesyredan-nende enzymreaktionssystemer såsom mælkesyre og lactasede-hydrogenase (LDH), ADP og pyruvatkinase og glycerol, gly-cerolkinase og pyruvatkinase. Yderligere eksempler i enkelt-25 heder på enzymatiske reaktioner, som danner pyrodruesyre og er genstande for analyse, er følgende: 30 35 13

DK 158681 B

(1) Analyse af mælkesyre- eller LDH-aktivitet: lactat LDH y pyruvat + NADl^

NAD

(2) Analyse af ADP eller pyruvatkinase (PK) aktivitet: 5 ADP + phosphoenolpyruvat _PK_^ATp + pyruvat (3) Analyse af glutamat-pyruvat-transaminase (GTP) aktivitet eller -kctoglutarat: alanin + Λ -kotoglutarat -GPT_^ pyruvat + 9lutamat (4) Analyse af glutamat-oxaloacetat-transaminase (GOT) aktivitet: asparaginat + A. -ketoglutarat -G°T_x,xaioaCetat + glutamat , , . oxaloacetatdecarboxylase , oxaloacetat -—-*-y pyruvat 15 + C02 (5) Analyse af glycerol eller glyerrophosphokinase (GK) aktivitet:

CK

glycerol. + ATP—~ ^glycerol-3-phosphat + ADP

PK

ADP + phosphenolpyruvat --—7pyruvat + ATP

2® (6) Analyse af triglycerid: . n lipase eller lipoproteinlipase , _ _η triglycerid —^^Ec—y· glycerol - -3-phosphat

+ ADP

PK

ADP + phosphoenolpyruvat pyruvat + ATP

25 (7) Analyse af creatinin eller creatininphosphikinase

(CPK)O

, . . creatinase , .

Creatinjn ---------- - -----> creatin

CPK

creatin + ATP---^creatinphosphat + ADP

ADP + phosphoenolpyruvat -¾ pyruvat + ATP

30 (8) Analyse af myokinase:

ATP + AMP 2 ADP

PK

ADP + phosphoenolpyruvat > pyruvat + ATP (9) Analyse af aktivitet af fede syrer eller thiokinase: fed syre + CoA + ATP t^lokin-^-s^ acyl-CoA + 35 AMP + PPi AMP + ATP niYokinas^ 2 ADp 14

DK 158681 B

PK

ADP + phosphoenolpyruvat —> pyruvat + ATP

Diaso enzymreakti onor or blot illustrerende, og disse pyruvatdannende reaktioner kan findes i kombination af enzym og dets substrat, f.eks. en biologisk prøve. Som 5 eksemplificeret ovenfor kan analysen ikke blot foretages til analyse af pyruvat, men også til analyse af enzym, enzymaktivitet eller substrat.

En analyse foretages ved inkubering med en prøve og reagensblanding. Heagensblandingen er fortrinsvis et udstyr 10 af do fornødne reagenser. Til analyse måles forbrugt kompo nent eller dannet komponent. Måling af mængden af oxygenfor-brug vod hjælp nf ot må 1eapparat for opløst oxygen er en forotrukken analysometode. 1 dette tilfælde kræves der ingen indikator for hydrogenperoxid. Hvad angår analyse for frem-15 bragt eller dannet komponent, foretrækkes måling af mængden af hydrogenperoxid, f.eks. ved hjælp af en hydrogenperoxid-elektrodemåler såsom YSI-oxidasemåler eller ved kolorimetrisk eller fluorometrisk analyse med indikator for hydrogenperoxid. Analysen kan fortrinsvis foretages i 10-60 minutter og ved 20 20-40°C, fortrinsvis 35-37°C.

En indikator for hydrogenperoxid er er en kombination af en eller flere chromogen- eller fluoressensindikatorer, som påvirkes ved kobling med hydrogenperoxid. Eksempler på sådanne indikatorer er kombinationer af tetravalent titanium-25 forbindelse og xylenolorange, som kobles med hydrogenperoxid til dannelse af en stabil rød farve, eller kombinationer af phenol eller N,N-dimethylanilin eller homovanilinsyre, 4-ami-noantipyrin og peroxidase til måling af farve eller fluoressens. 4-aminoantipyrin kan erstattes med 4-aminophenazon. En 30 kombination af 2,6-dichlorphenolindophenol og peroxidase og af guaiaeol og peroxidase kan også benyttes. Indikatoren kan fremstilles i forvejen som opløsning. Kolorimetriske eller f1uorometriske analyser udføres ved måling af absorptionen af passende bølgelængder såsom 563 nm.

35 Mængden af pyrodruesyre kan måles ved beregning ud fra en tilsvarende standardkurve af forbrugt oxygen eller dannet hydrogenperoxid.

15

DK 158681 B

Phosphat som on forbrugt komponent eller acetylphos-phat som en dannet komponent kan også analyseres ved konventionelle metoder.

Som forklaret ovenfor anvises der et udstyr til analyse, især 5 diagnostisk analyse, omfattende pyruvatoxidase med optimum-pH 6,5-8 og dets brug til forskellige analysemetoder. Diagnostisk analyse såsom analyse af pyruvat i pyruvatholdige reagenser eller i serum eller urin, analyse af enzymaktivitet af LDH, pyruvatkinase, GPT, GOT, glycerolkinase, lipase, lipoprote-10 inlipase, creatininphosphokinase, myokinase eller thiokinase og analyse af biologiske komponenter såsom lactat, ADP, glycerol, triglycerid, creatinin eller fede syrer kan med fordel udføres ved hjælp af udstyret ifølge opfindelsen.

Nedenstående eksempler illustrerer udførelsesformer for opfindelsen.

Eksempel_T_

Et medium (hver 100 ml pH-værdi 7) omfattende glucose (1%), pepton (1%), gærekstrakt (0,5%), NaCl (0,2%), KI^PO^ 20 (0,1%) K2HP04 (0,1%), MgS04) (0,05%) og CaCC>3 (0,3%) i en 500 ml erlenmeyerkolbe steriliseres ved 120°C i 20 minutter.

I hvert medium podes en stamme af Pediococcus sp. B-0667, FERM-P nr. 4438, Streptococcus sp. B-0668, FERM-P nr. 4439, Aerococcus viridans IFO-12218 eller Aerococcus viridans IFO-25 12317, og man dyrker under rystning ved 30°C i 24 timer ved 300 omdrejninger pr. minut. Derefter samles de dyrkede celler ved centrifugering og vaskes med 10 mM phosphatstød-pude (pH-værdi 6,5) og centrifugeres igen til samling af bakteriecellerne. De således opnåede celler suspenderes i 10 mM 30 phosphatstødpude (10 ml, pH-værdi 7,0) indeholdende 0,02% lysozym og 0,1% Triton X-100 og inkuberes ved 37° i 60 minutter. Den opnåede fracentrifugerede overliggende væske, som indeholder pyruvatoxidase, samles. Enzymaktiviteten af den overliggende væske fremgår af følgende tabel: 35 Stamme Enzymaktivitet enheder/ml_ B-0667 0,60 B-0668 0,38 IFO-12219 0,52 IFO-12317 0,46 16

DK 158681 B

Eksempel_2

Et medium (20 liter) bestående nf de samme komponenter som beskrevet i eksempel 1 i en 30 liter forgæringsbeholder dampsteriliseres. Dyrkningsvæske (200 ml) af Pediococcus sp.

5 B-0667 FERM-P nr. 4438 dyrket på samme måde som i eksempel 1 overføres dertil og dyrkes ved 30°C i 24 timer. De ved centrifugering samlede bakterieceller (ca. 100 g) suspenderes i lysozymopløsningen (0,2 mg/ml, 4 liter) og tilsættes yderligere Triton X-100 (4 g), EDTA (3 g) og 1 M phosphatstødpude 10 (pH-værdi 6,5, 40 ml), og man omrører ved 37°C i 60 minutter.

Til den ved centrifugering opnåede overliggende væske sættes ammoniumsulfat, og udfældningen ved 0,54 - 0,73 mætning samles ved centrifugering. Udfældningen opløses i 10 mM phosphatstødpude (pH-værdi 6,5, 1000 ml) (5160 enheder, udbytte 86%), og 15 der tilsættes derpå kold acetone (0,65 rumfang), og den urene udfældning skilles fra. Der tilsættes yderligere acetone (0,3 rumfang), og udfældningen, som samles ved centrifugering, opløses i 10 mM phosphatstødpude (pH-værdi 6,5, 70 ml) (4750 enheder, udbytte 79,2%).

20 Til opløsningen sættes ammoniumsulfat, og udfældningen ved 0,54 - 0,70 mætning samles ved centrifugering.

Efter opløsning af udfældningen i 10 mM phosphatstødpude (pil-værdi 6,5) hældes opløsningen på en søjle af Sepha-dex G-25 (indregistreret varemærke) (6,0 x 70 cm), og man 25 samler en fraktion, som viser absorbens ved 280 nm. De aktive fraktioner slås sammen og frysetørres til opnåelse af et pulver af pyruvatoxidase (3940 enheder, 758 mg, udbytte 65,7%). Eksempel 3

Udstyr til pyruvatanalyse (til oxygenelektrode): 3Q pyruvatoxidase opnået i eksempel 2 (samme som i de følgende eksempler) 300 enheder FAD 0,5 jamol thiaminpyrophosphat 10 pmol nm Cl^ 25 |imol 25 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 1,0 ml saccharose 0,5 g 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude (pH 7,5) 5 ml 17

DK 158681 B

Ovenstående blanding lyofiliseres til fremstilling af udstyret til analyse af pyrodruesyre (til oxygenelektrode-måling, 50 forsøg).

Eksempel 4 5 Udstyr til pyruvatanalyse (til kolorimetrisk analyse):

Reagens (I) pyruvatoxidase 200 enheder FAD 0,5 pmol thiaminpyrophosphat 10 pmol 10 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 1,0 ml saccharose 0,5 g 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude (7,5)5 ml peroxidase (100 enheder/mg, peberrod) 2,5 mg 0,3% 4-aminoantipyrin 5 ml 15 Ovenstående blanding lyofiliseres til dannelse af rea gens (I) i udstyret til pyruvatanalyse (til kolorimetrif50 forsøg).

Yderligere reagens (II) bestående af: 0,2% vandig Ν,Ν-dimethylanilin indeholdende 25 umol 20 nm CI2 (50 ml) samt stopreagens (III) bestående af: 0,1 M citratstødpude (pH 6,0, 100 ml) indeholdende 0,1 M EDTA tilføjes.

Eksempel 5 25 Et udstyr illustreret i eksempel 3 opløses i destille ret vand (50 ml), og en portion opløsning (1,0 ml) deraf anbringes i en reaktionsbeholder. Der tilsættes 5,0 mM py-ruvatopløsning (hver 0-100 uliter) eller humant serum 50 pliter og 5,0 mM pyruvatopløsning (hver yderligere 0-100 30 piliter), og man inkuberer ved 37°C og måler derpå oxygenfor bruget med galvanisk oxygenelektrode. Resultaterne fremgår af fig. 4.

Yderligere opløses et udstyr ifølge eksempel 3 i destilleret vand (25 ml), og en portion opløsning (0,5 ml) 35 deraf anbringes i reaktionsbeholdere og inkuberes under tilsætning af vandig opløsning (0,5 ml) indeholdende humant serum (0-0,5 ml) ved 37°C. I fig. 5 ses resultatet af en analyse af oxygenforbrug målt med galvanisk oxygenelektrode.

18

DK 158681 B

Som det fremgår af fig. 4 og 5, iagttages der gode lineære relationer.

Eksempel 6

Det i eksempel 4 fremstillede lyofiliserede reagens 5 (I) opløses ved tilsætning af reagens (II) (50 ml), og hver portion opløsning (1 ml) i de små reagensglas inkuberes ved 37°C. Der tilsættes 5 mM kalium pyruvatopløsning (hver 0-50 ^liter) eller humant serum (50 illiter) tilsat 5 mM kaliumpy-ruvatopløsning (hver 0-50 jiliter), og man inkuberer ved 37°C 10 i 10 minutter. Stopopløsning (2 ml) tilsættes, og man måler absorptionen ved 565 nm. Som vist i fig. 6 fås der gode lineære relationer og kvantitative resultater i ovenstående analyser, og også i dette tilfælde falder dette resultat sammen med kalibreringskurven ved ^2°2 ^,5 mM I^C^, 0-50 jiliter).

15 En yderligere prøveportion af humant serum (0-0,5 ml) anbringes i små reagensglas og indstilles til 0,5 ml ved tilsætning af destilleret vand. Hver opløsning (1,0 ml) af reagens (I) fremstillet ved tilsætning af reagens (II) i eksempel 4 tilsættes og inkuberes ved 37°C i 10 minutter.

20 Reaktionen standses ved tilsætning af stopreagens (III) (1,5 ml), og man analyserer kolorimetrisk ved 565 nm. Som det ses i fig. 7, fås der et godt kvantitativt resultat. Eksempel 7

Reaktionsblanding: 25 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude 0,2 ml 10 mM MnCl2 50 uliter 0,2% N,N-dimethylanilin 0,2 ml 0,3% 4-aminoantipyrin 0,1 ml peroxidase (45 enheder/ml) 0,1 ml 30 10 mM thiaminpyrophosphat 20 jiliter 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 25 jiliter 20 mM phosphoenolpyruvat 0,1 ml pyruvatkinase (4000 enheder/ml) 5 uliter

5 mM ADP 0-50 jU

33 Ovenstående reaktionsblanding indstilles til 1,0 ml ved tilsætning af destilleret vand og forinkuberes ved 37°C, og derpå tilsættes der en opløsning af pyruvatoxidase (200 enheder/ml, 20 jiliter), og man inkuberer ved 37°C i 10 mi- 19

DK 158681 B

nutter. Efter standsning af reaktionen ved tilsætning af 0,1 M EDTA i 0,1 M citratstødpude (pH 6,0, 2,0 ml) måles absorptionen ved 565 nm. Som det ses i fig. 8, opnås der gode kvantitative resultater for ADP-analyse, idet man 5 analyserer det hydrogenperoxid, som dannes af reaktions blandingen af ADP, pyruvatkinase og phosphoenolpyruvat.

Ligeledes ses det i fig. 8, at der iagttages en god linearitet, når der benyttes 2,5 mM hydrogenperoxid i stedet for 5 mM ADP.

10 Eksempel 8

Triglyceridanalyseudstyr:

Reagens (I): 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude 10 ml (pH 7,5) 15 0,3% 4-aminoantipyrin 5 ml peroxidase (100 enheder/mg) 2,5 mg thiaminpyrophosphat 10 umol 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 1,25 ml phosphoenolpyruvat 100 ^imol 20 pyruvatkinase (4000 enheder/ml) 0,1 ml pyruvatoxidase (200 enheder/ml) 2 ml lipoproteinlipase (3000 enheder/ml) 0,5 ml glycerolphosphokinase (300 enheder/ml) 1,0 ml ATP 100 ymol 25 Ovenstående reagens lyofiliseres.

Reagens (II): 25 umol MnC^ i 0,2% dimethylanilin 50 ml

Reagens (III): (stopopløsning) 0,1 M EDTA i 0,1 M citratstødpude 100 ml 30 (pH 6,0)

Eksempel 9

Reagens (I) i eksempel 8 opløses i reagens (II), og hver portion opløsning (1,0 ml) deraf anbringes i reagensglas.

35 Hver portion prøve (0-50 pliter) af humant serum in deholdende 1,02 pnol/ml triglycerid, 5 mM glycerolopløsning, 4,2 mM triolein i 0,1% Triton X-100-opløsning eller 2,5 mM hydrogenperoxid tilsættes og inkuberes ved 37°C i 10 minutter.

20

DK 158681 B

Som dot sos i fig. 9, opnås der god linearitet.

Eksempel 10

Et udstyr til analyse af serumtransaminase (til 100 forsøg): 5 (1) en udrustning til GPT-analyse (til 100 prøver):

Reagens (I): Lyofiliseret reagens bestående af: pyruvatoxidase 400 enheder FAD 500 nmol thiaminpyrophosphat 150 umol L-alanin 20 mmol ^'-ketoglutarat 1 mmol saccharose 1- g 4-aminoantipyrin 150 ytmol peroxidase 450 enheder 15 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 2,5 ml 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude 30 ml (pH 7,5)

Reagens (II) (100 ml benyttes til reagens (D): 20 42 jamol MnC^ i 0,2% dimethylanilinopløs- 210 ml ning

Reagens (III) (stopopløsning)(200 ml til reagens (I), 0,2 ml for hvert forsøg): 0,1 M EDTA i 0,2 M citratstødpude (pH 5,0) 420 ml 25 (2) et udstyr til GOT-analyse (til 100 forsøg):

Reagens (I): Lyofiliseret reagens bestående af: pyruvatoxidase 400 enheder FAD 500 nmol thiaminpyrophosphat 150 jimol 3ø L-asparaginsyre 20 mmol ft-ketoglutarat 1 mmol oxaloacetatdecarboxylase 200 enheder saccharose 1 g 4-aminoantipyrin 150 jamol 35 peroxidase 450 enheder 0,2 M phosphatstødpude (pH 7,5) 2,5 ml 0,2 M dimethylglutarat-NaOH-stødpude (pH 7,5) 30 ml 21

DK 158681 B

Reagens (II) og reagens (III):

Samme som ovennævnte (1).

Eksempel 11

Reagenser (I) fremstillet i eksempel 1, (1) (for ana-5 lyse af GPT-aktivitet) og (2) (til analyse af GOT-aktivitet) opløses ved tilsætning af reagens (II) (100 ml). Hver portion (1,0 ml) af opløsningen anbringes separat i små reagensglas og forinkuberes ved 37°C i 5 minutter (forinkuberet opløsning af reagens (I)). Standardserumopløsningen (20 pliter)

10 (Calbiochem Co., handelsnavn: Maxitol, indeholdende GPT 700 K

enheder/ml og GOT 1000 K/ml) fortyndet med konstant forhold tilsættes og inkuberes ved 37°C i 10 minutter. Reaktionen standses ved tilsætning af stopreagens (III) (2,0 ml), og man måler absorptionen ved 565 nm.

15 Som vist i fig. 10 har begge enzymaktiviteter lineari tet; op til den optiske tæthed på ca. 1,0 (enzymakti.vi.tet: ca. 750 K enheder/ml).

Eksempel_1_2

Til hver forinkuberet opløsning af reagens (I) frem-20 stillet i. eksempel. 1.1 sættes 20 pliter humant serum (45 prøver), og man inkuberer ved 37°C i 20 minutter. Der tilsættes stopreagens (III) (2,0 ml), og man måler adsorptionen ved 565 nm.

Samme prøver af humant serum analyseres ligeledes 25 ved LKB-metoden (ultraviolet absorptionsmetode, GOT-ana- lyseudstyr og GPT-analyseudstyr, fremstillet af LKB Corp.), og korrelationen afbindes grafisk med aktiviteten af GPT og GOT.

Som det ses i fig. 11, iagttages korrelationskoeffi-30 cienten r = 0,998 og regressionsligningen y = 0,00295 x + 0,0032 for GPT-analysen.

Ved GOT-analysen fremgår korrelationsmønsteret af fig.

12, hvor man får korrelationskoefficienten r = 0,966 og regressionsligningen y = 0,00287 x + 0,0180.

35

Claims (2)

1. Udstyr til pyrodruesyreanalyse omfattende et reaktionssystem indeholdende pyruvatoxidase, som katalyserer en reaktion fra pyrodruesyre, phosphat og oxygen til dannelse af acetylphosphat, carbondioxid og hydrogen- 5 peroxid, hvilket reaktionssystem består af i det mindste pyruvatoxidase, thiaminpyrophosphat, phosphat og salte, som frigør calciumion, cobaltion, magnesiumion eller manganion, evt. også FAD og en indikator for hydrogenperoxid, f.eks. bestående af peroxidase, 4-aminoantipyrin og phe-2 q nol eller Ν,Ν-dimethylanilin eller homovanillinsyre, ken detegnet ved, at pyruvatoxidasen har et optimum-pH på 6,5-8.

2. Udstyr ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pyruvatoxidasen med optimum-pH 6,5-8 er et enzym, som 25 fås fra en dyrkning af en pyruvatoxidaseproducerende mikro organisme udvalgt blandt Pediococcus sp. B-0667 FERM-P nr. 4438, Streptococcus sp. B-0668 FERM-P nr. 4439, Aerococcus vi ridans IFO-12219 eller Aerococcus viridans IFO-12317. 20 25 30 35