JPH0677520B2

JPH0677520B2 - ピルビル酸の測定法およびその試薬

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Publication number: JPH0677520B2
Application number: JP62194076A
Authority: JP
Inventors: 和己山本; 俊郎菊地; 重典愛水
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1987-08-03
Filing date: 1987-08-03
Publication date: 1994-10-05
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: JPS6437300A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ピルビン酸またはピルビン酸を遊離する系を
有してなる試料中のピルビン酸の測定法およびその試薬
に関するものである。

本発明によれば、ピルビン酸の直接測定ばかりではな
く、ピルビン酸を遊離する系における基質及びピルビン
酸形成反応を接触する酵素の測定にも利用することがで
きる。測定の代表例は例えば以下の通りである。

グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ又はα
−ケトグルタール酸グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ乳酸デヒドロゲナーゼ又は乳酸ピルビン酸キナーゼ又はADP （従来の技術）従来、血清や尿中のピルビン酸の比色定量はピルビン酸
オキシダーゼ（EC1.2.3.3）を用いて行なわれてきた
が、従来のピルビン酸オキシダーゼは耐熱性が充分では
なく、また溶存酸素等の問題から、酵素、補酵素、発色
剤等を重層塗布、乾燥し、この乾燥物上に血液または血
清を滴下して発色させるドライケミストリーには不適で
あった。

何故ならドライケミストリーでは、酵素の塗布、乾燥工
程は水を効率よく蒸発させるため、通常、45〜50℃で処
理するが、これまで知られていたピルビン酸オキシダー
ゼの熱安定性は約45℃以下であり、45〜50℃の処理では
多量の該酵素が失活してしまう。またピルビン酸オキシ
ダーゼの反応には酸素が必要であるが、ドライケミスト
リーでは酵素を重層塗布、乾燥するため、酵素反応中に
酸素を供給することができず、酵素周辺に存在する酸素
を消費してしまい、基質であるピルビン酸が存在しても
酵素反応は停止してしまうから。

また従来より溶存酸素の影響を受けないピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼとしては、いわゆるPyruvate Dehydrogena
se complexを形成しているPyruvate:Lipoamide oxidore
ductase（EC1.2.4.1）,Pyruvate:Ferricytochrom bloxi
doreductase（EC1.2.2.2）及びPyruvate:Ferredoxin ox
idoreductase（EC1.2.7.1）が知られているが（酵素ハ
ンドブック、丸尾文治、田宮信雄監修、発行所：朝倉書
店）、これらの酵素のうち、酵素（EC1.2.4.1）はコン
プレックスを形成しているため、反応に３種の酵素が必
要であり、生成物は紫外部に吸収をもつNADHであり、比
色定量に適さない。また酵素（EC1.2.2.2）および酵素
（EC1.2.71）は、ピルビン酸に作用する酵素であるが、
反応生成物はいずれも容易に比色定量できる物質ではな
く、またこれらの酵素反応にはチトクロームｂやコエン
ザイムＡにような高価な物質が必要であり、やはり比色
定量に適していない。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは上記の背景を踏まえて、熱安定性に優れ、
溶存酸素の影響を受けない、より実用的なピルビン酸測
定試薬を見い出そうとした。

（問題点を解決するための手段）本発明者らはラクトバチルス属に属する微生物から、ピ
ルビン酸の酸化的リン酸化反応を触媒し、熱安定性に優
れたピルビン酸デヒドロゲナーゼを見い出し、既に特許
出願した。さらにこのピルビン酸デヒドロゲナーゼが、
有効にピルビン酸を測定し得ることを見い出し、加えて
ピルビン酸を生成する酵素反応系の酵素活性の測定、ピ
ルビン酸を生成する酵素反応系の基質の定量をなし得る
ことを見い出し本発明に到達した。さらに上記ラクトバ
チルス属由来の酵素の１種、FAD（フラビンアデニンジ
ヌクレオチド）、TPP（チアミンピロホスフェート）、
リン酸塩電子受容体、及びマグネシウムイオン、コバル
トイオン、カルシウムイオン、ニッケルイオン、亜鉛イ
オンのうち少なくとも１種の金属イオンからなる反応系
をピルビン酸含有試料系と反応させることにより、良好
に試料系中のピルビン酸を測定することができ、またこ
の反応系中の電子受容体にニトロテトラゾリウムブルー
（NTB）等のホルマザン系色素を共役させることによ
り、簡便かつ良好にピルビン酸を測定できることを見い
出し、本発明に到達した。すなわち本発明は、試料に、
電子受容体およリン酸の存在下、下記理化学的性質
（１）〜（４）を有する新規なピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼを作用させ、生成する還元型電子受容体、二酸化炭
素又はアセチルリン酸の生成量を測定するか、あるいは
電子受容体またはリン酸の消費量を測定することを特徴
とするピルビン酸の測定法である。

（１）作用：ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体→ アセチルリン酸＋CO₂＋還元型電子受容体（２）至適pH:6.2〜6.3付近（３）安定pH:5〜８付近（４）熱安定性（pH6.3、15分間処理）:50℃まで安定
である。

また本発明は、下記理化学的性質（１）〜（４）を有す
る新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼを含有することを
特徴とするピルビン酸デヒドロゲナーゼ測定用試薬であ
る。

本発明は試料中の成分、特にピルビン酸を測定するもの
であるが、試料としては人血清、食品などに限られな
い。また本発明ではピルビン酸を直接に測定することに
より、試料中のピルビン酸を形成する物質、例えばα−
ケトグルタル酸、乳酸など、またはピルビン酸形成反応
を触媒する酵素、例えばGPT、GOT、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼなどの測定も可能とする。

本発明に使用されるピルビン酸デヒドロゲナーゼとして
は、前記理化学的性質（１）〜（４）を有するものであ
ればよく、好ましくは、ラクトバチルス・デルブリッチ
ィ・サブスピーシズ・ラクティスJCM 1063、JCM1248、
ラクトバチルス・デルフリッチィIFO3202、IFO3534、ラ
クトバチルス・サリバリウム・サブスピーシズ・サリバ
リウムJCM 1231の生産するピルビン酸デヒドロゲナーゼ
が挙げられる。しかしこれらの菌に限らず、前記理化学
的性質（１）〜（４）を有する熱安定性に優れたピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼを生産する菌由来の酵素は、すべ
て本発明において使用することができる。

熱安定性に優れたピルビン酸デヒドロゼナーゼ生産菌は
酵素を生産する通常の方法で培養する。使用する培地組
成としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無
機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれ
ば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。例えば炭
素源としてはグルコース、シュクロース、デキストリ
ン、ピルビン酸、糖蜜などが使用される。窒素源として
は、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物などの窒素含有天然物や、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、グルタ
ミン酸などのアミノ酸など、無機あるいは有機の窒素化
合物が使用される。

培養は、通常振盪培養あるいは通気攪拌培養で行なう。
培養温度は20℃〜50℃の範囲、好ましくは37℃付近、培
養pHは５〜８の範囲、好ましくはpH6〜７に制御するの
が良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育す
れば実施できる。培養期間は通常１〜４日間で生育し、
菌体内にピルビン酸デヒドロゲナーゼが生成蓄積され
る。

本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用い
る機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤など、い
ずれを用いてもよい。さらに抽出液については公知の硫
安や芒硝などの塩折法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミ
ンなどの凝集法さらにはDEAE（ジエチルアミノエチル）
セファロース、CM（カルボキシメチル）セファロースな
どのイオン交換体クロマト法などにより精製することが
できる。

次にこのようにして得られた熱安定性に優れたピルビン
酸デヒドロゲナーゼの一例の理化学学性質について述べ
る。

（１）作用ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体→ アセチルリン酸＋CO₂＋還元型受容体（２）基質特異性（ａ）オキザロ酢酸、DL−乳酸、酢酸またはα−ケト
グルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異的であ
る。

（ｂ）電子伝達系に酸素のみを用いた場合、及び、次
に示す電子受容体を加えた場合のオキシザーゼとしての
酵素活性を示した。表示は酸素のみの活性を100として
相対活性で示した。

また同様の反応式を示す公知のピルビン酸オキシダーゼ
〔Fed.Proc.13巻 734〜738頁（1954）〕と比較した。

その結果、本酵素は、電子伝達系として酸素よりも他の
電子受容体に作用しやすい。

（３）至適pH ピルビン酸デヒドロゲナーゼの反応pHの影響を求めた。
緩衝液は50mM K−リン酸緩衝液を用いて行なった。各pH
でのピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定結果は第１
図に示す通りで、至適pHは6.2〜6.3付近であった。

（４）安定pH 緩衝液には50mM酢酸緩衝液（pH3〜６）、50mMBK−リン
酸緩衝液（pH5.5〜８）、50mM Tris-HCl緩衝液を用い、
25℃、20時間保温して、その残存活性を測定した。その
結果第２図に示す通り、安定pHは５〜８付近であった。

（５）至適温度各温度における酵素活性を測定した。その結果第３図に
示す通り、至適温度は55℃付近であった。

（６）熱安定性ピルビン酸デヒドロゲナーゼを50mM K−リン酸緩衝液、
pH6.3で40〜60℃で15分間加熱した後、残存活性を測定
した。その結果第４図に示す通り、50℃まで安定であっ
た。

（７）物質的影響（ａ）酵素活性測定法にて示す反応系より、下記の物
質を除去した場合の酵素活性を次表に相対活性として示
した。なお、リン酸除去の場合は緩衝液として50mM酢酸
緩衝液pH6.3を用いた。

以上のことより、本酵素はコファクターとしてTPP,FAD,
Mg²⁺が必要であり、基質としてリン酸が必要なことが判
明した。

（ｂ）酵素活性測定法にて示す反応系のMgSO₄の代り
に、次に示す種々の金属を用いて酵素活性を測定した。
各種金属の反応液中での濃度は10mMであり、さらに表示
はMgSO₄のときの活性を100として相対活性で示した。

その結果、Mg²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、およびNi²⁺により
酵素活性が発現した。以上の結果より、本酵素は明らか
に熱安定性に優れた新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ
である。

次に本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性測定法
を示す。

0.15M K−リン酸緩衝液pH6.3 10ml 3mM TPP 2ml 0.15mM FAD・Na₂ 2ml 15mM EDTA・Na₂ 2ml 0.15M MgSO₄ 2ml 1mM １−メトキシPMS−10mM NTB 3ml 10％ Triton X−100 1.5ml 蒸留水 2.5ml 上記反応液を調製した後、2.5mlを試験管に分取し、0.3
Mピルビン酸カリウム水溶液を0.5ml加えて37℃で５分間
予備加温する。酵素溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混
和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で570nm
における１分間当りの吸光度変化を求める（ΔOD tes
t）。

盲検は、酵素溶液の代りに酵素希釈液50mM K−リン酸緩
衝液、pH6.3を0.1ml加え、上記同様に操作を行なって１
分間当りの吸光度変化を求める（ΔOD blank）。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の表示は、上記条件で
１分間あたり1/2マイクロモルのdiformazanを生成する
酵素単位を１単位（Ｕ）とした。

本発明で使用した熱安定性に優れたピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼは次の方法で単離した。

1.培養肉エキス0.5％、ポリペプトン２％、酵母エキス１％、K
₂HPO₄・3H₂O1％、MgSO₄、7H₂O 0.02％を含む培地（pH6.
8）90mlを500ml容坂口フラスコに移し、121℃、15分間
オートクレーブを行なった。冷却した後、別殺菌した20
％ピルビン酸ナトリウム水溶液（pH5.0）を無菌的に10m
l添加した。種菌としてラクトバチルス・デルブリッチ
ィ・IFO3202を同培地に一白金耳接種し、37℃で24時間
振盪培養し種培養液とした。次に同培地5.4を10・
ジャーファメンターに移し、121℃で15分間オートクレ
ーブを行ない、放冷後、別殺菌した20％ピルビン酸水溶
液を無菌的に600ml添加した。これに種培養液100mlを移
し、300rpm、通気量２／分、37℃で24時間培養した。
培養終了時のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、0.35
U/mlであった。

2.精製培養液６を遠心分離にて集菌し、50mM K−リン酸緩衝
液pH7.0 100mlにて懸濁した。超音波破砕機（海上電気
製 19KHz）にて15分間処理し、遠心分離してその上清
液を得た。上清液を、50mMK−リン酸緩衝液、pH7.0にて
平衡化したDEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア
製）カラムクロマトグラフィーに供し、０〜0.5M NaCl
溶出画分にピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を得た。溶
出液を限外濾過機にて濃縮した後、50mM K−リン酸緩衝
液、pH7.0にて平衡化したセファデックスＧ−200（ファ
ルマシア製）にてゲル濾過を行なった。その結果840Uの
ピルビン酸デヒドロゲナーゼが得られた。

本発明では酵素の使用例としては酵素反応が充分に進行
する量であればよく、また試料中のピルビン酸の含量、
酵素反応の温度、時間などにより適宜変更されるもので
あるが、例えば本発明試薬は熱安定性に優れたピルビン
酸デヒドロゲナーゼ0.1〜20U/ml程度、リン酸塩１〜100
mM程度、FAD 1〜20μＭ程度、TPP 0.1〜0.5mM程度、金
属イオン１〜50mM程度、電子受容体0.01〜1mM程度、緩
衝液pH5〜7.5並びに還元型電子受容体としてホルマザン
系色素0.1〜10mM程度を含有する。ピルビン酸を形成す
る物質又はピルビン酸形成反応を触媒する酵素を測定す
るには、本発明の試薬と従来公知のピルビン酸へ誘導す
る試薬を組合せて使用する。

本発明では試料に、上記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
無機リン酸及び電子受容体を含有する試薬を添加して、
生成する還元型電子受容体、二酸化炭素又はアセチルリ
ン酸の生成量を測定するか、あるいは酸化型電子受容体
または無機リン酸の消費量を測定することにより、試料
中のピルビン酸の量を知ることができる。特に本発明の
熱安定性に優れたピルビン酸デヒドロゲナーゼを含有す
る反応系においては、ピルビン酸との酵素反応性を良好
に行なわせため、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと共に、
FAD,TPP,リン酸塩、電子受容体及びマグネシウムイオ
ン、コバルトイオン、カルシウムイオン、ニッケルイオ
ン、亜鉛イオンのうち少なくとも１種の金属イオンを用
いればよく、さらにまたこの反応による生成物である還
元型電子受容体の比色検出系を用いる場合は、必要によ
りホルマザン系色素を適宜選択して共役させればよい。
還元型電子受容体の検出系としては、例えば次のような
共役系が考えられる。

電子受容体フェナジンメトサルフェート（PMS）１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフ
ェート（１−mPMS）９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾクソニウム
（メルドラブルー）ホルマザン系色素３−（4,5−ジメチル−２−チアゾリル）−2,5−ジフェ
ニル−2Hテトラゾリウム（MTT）ネオテトラゾリウムブルーニトロテトラゾリウムブルー（NTB）テトラゾリウムブルー（TB）テトラニトロテトラゾリウムブルー（TNTB）（実施例）以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何ら
これらによって限定されるものではない。

実施例１Ｋ−リン酸緩衝液 pH6.3 50mM FAD・Na₂ 10μＭ TPP 0.2mM MgSO₄ 10mM １−mPMS 0.1mM NTB 1.0mM Triton X−100 0.5％ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 3U/ml 上記の組成よりなる反応液3.0mlを分取し、37℃で約５
分間予備加温し、これにピルビン酸カリウム水溶液（0.
2〜1mM）0.2mlを添加した後37℃、10分間反応させ、反
応後570nmにおける吸光度を測定した。その結果は第５
図に示す通り極めて良好な定量曲線が得られた。

実施例２Ｋ−リン酸緩衝液 pH6.3 50mM FAD・Na₂ 10μＭ TPP 0.2mM MgSO₄ 10mM １−mPMS 0.1mM NTB 1.0mM Triton X−100 0.5％ホスホエノールピルビン酸 0.5mM ピルビン酸キナーゼ 10U/ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 3U/ml 上記の組成よりなる反応液3mlを分取し、37℃で約５分
間予備加温し、これにADP水溶液（0.2〜1mM）0.2mlを添
加した後37℃、10分間反応させ、反応後570nmにおける
吸光度を測定した。その結果は、第６図に示す通り極め
て良好な定量曲線が得られた。

実施例３Ｋ−リン酸緩衝液 pH6.3 50mM FAD・Na₂ 10μＭ TPP 0.2mM MgSO₄ 10mM １−mPMS 0.1mM NTB 1.0mM Triton X−100 0.5％ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 3U/ml 上記の組成よりなる反応液3.0mlを分取し、37℃で５分
間予備加温する。これに管理血清（Ｑ−pak I）0.2ml〜
1mlを1mlにfill upしたサンプルを0.2ml添加した後、37
℃で10分間反応させ、反応後570nmにおける吸光度を測
定した。その結果は第７図に示す通り良好な直線性を示
し、実施例１のピルビン酸の検量線より血清中のピルビ
ン酸濃度は113μＭと計算された。

実施例４Ｋ−リン酸緩衝液 pH6.3 50mM FAD・Na₂ 10μＭ TPP 0.2mM MgSO₄ 10mM １−mPMS 0.1mM NTB 1.0mM Triton X−100 0.5％ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 3U/ml 上記の組成よりなる反応液3.0mlを分取し、37℃で約５
分間予備加温する。これにピルビン酸水溶液（０〜1m
M）0.2mlを添加した後、37℃で10分間反応させ、反応後
ピルビン酸量を570nmで比色定量した。また同一のサン
プルを市販品（協和メディクス製、デタミナーPA）を用
いて測定し、その相関を求めた。その結果第８図に示す
相関図が得られ、その相関はｒ＝0.982（ｎ＝11）Ｙ＝1.02X＋0.05 であり、極めて良好なものであった。

（発明の効果）本発明では、熱安定性に優れたピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼを使用することにより、優れた溶液安定性を有する
分析用試薬、例えばピルビン酸測定用試薬を製造するこ
とができる。また溶存酸素の影響を受けないので、ドラ
イ・ケミストリー、固定化酵素など、広範囲の測定系が
可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼの至適
pHを示す。第２図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼの安定
pHを示す。図中○−○は50mM酢酸緩衝液、●−●は50mMK−リン酸
緩衝液、△−△は50mM Tris−HCl緩衝液を示す。第３図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼの至適
温度を示す。第４図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼの熱安
定性を示す。第５図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼを用い
たピルビン酸の検量線を示す。第６図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼを用い
たADPの検量線を示す。第７図は、本発明のピルビン酸デヒドロゲナーゼを用い
た血清中のピルビン酸の定量結果を示す。第８図は、実施例４における市販品との相関図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料に、電子受容体およリン酸の存在下、
下記理化学的性質（１）〜（４）を有する新規なピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子
受容体、二酸化炭素又はアセチルリン酸の生成量を測定
するか、あるいは電子受容体またはリン酸の消費量を測
定することを特徴とするピルビン酸の測定法。（１）作用：ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体→ アセチルリン酸＋CO₂＋還元型電子受容体（２）至適pH:6.2〜6.3付近（３）安定pH:5〜８付近（４）熱安定性（pH6.3、15分間処理）:50℃まで安定
である。
【請求項２】下記理化学的性質（１）〜（４）を有する
新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼを含有することを特
徴とするピルビン酸デヒドロゲナーゼ測定用試薬。（１）作用：ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体→ アセチルリン酸＋CO₂＋還元型電子受容体（２）至適pH:6.2〜6.3付近（３）安定pH:5〜８付近（４）熱安定性（pH6.3、15分間処理）:50℃まで安定
である。