JPS63262555A - 新規な耐熱性ピルビン酸オキシダ−ゼを用いた酵素電極用酵素膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は酵素電極用酵素膜に関し、殊に血液や培養液或
は発酵液中に含まれるピルビン酸を酵素電極法によって
測定する際に、長期間安定して用いることができる様な
酵素電極用酵素膜に関するものである。

［従来の技術］ 生体内の代謝過程で生じるピルビン酸は、糖代謝過程上
の重要な位置付けを有している。しかるに血液中のピル
ビン酸存在量はグルコースや乳酸等と共に代謝系の様々
な因子の影響を受けて変動することが知られており、ピ
ルビン酸の測定値は循環障害や代謝異常によって大きく
変動すると言われている。また、血清トランスペプチダ
ーゼ（ＧＰＴ）は損傷部位および損傷の程度の指標であ
り、基質（α−ケトグルタル酸とＬ−アラニン）にＧＰ
Ｔを作用させ、生成するピルビン酸を測定することによ
りＧＰＴの量を知ることができる。従ってピルビン酸量
を測定することは、これらの疾患の病態を知る上での重
要な指標となる。

また工業的には各種の酵素や生理活性物質を生産する様
な各種細胞培養において、培養液中に分泌されるピルビ
ン酸は、グルコースや乳酸とともに、発酵状態或は菌や
細胞等の培養動態を知る上での重要な指標ともなる。特
にアルコール発酵においては、解糖によって生じたピル
ビン酸と経由してアルコールを生成する為、ピルビン酸
の測定は発酵初期の状態を反映するものとして極めて重
要である。

この様に各種の技術分野において、重要な情報を与える
ピルビン酸を測定する方法としては下記のものがある。

まず用手法としては、ラクテートデヒドロゲナーゼをピ
ルビン酸に作用させて生じるＮＡＤＨ（還元型ニコチン
酸アミドアデニンジヌクレオチド）の量を比色定量する
方法（ピルベートＵＶテスト：ベーリンガー・マンハイ
ム社）や、ピルビン酸オキシダーゼの作用によってピル
ビン酸から生じる過酸化水素を、４−アミノアンチピリ
ン及びフェノール（又はＮ、Ｎ−ジメチルアニリンやホ
モバニリン酸）等の色原体を加え、ペルオキシダーゼに
よって酸化発色させて比色定量する方法（例えば特公昭
５９−１５６３７号）等がある。

一方生化学的な特異性をもった酵素膜を用いる酵素電極
法も開発されており、例えば光硬化性樹脂によって包括
されたピルビン酸オキシダーゼ固定化酵素を用いる方法
（特開昭５５−１１１７８６号）や、多孔性高分子膜に
吸着されたピルビン酸オキシダーゼを用いる方法（特開
昭５６−１２２９４７号）等がある。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら上述した様な方法においては、下記の様な
問題点が指摘されている。

まず用手法においては、被検体中の血球や浮遊細胞或は
タンパクを除去する手間が必要であるのは勿論のこと、
多種類の試薬を混合する必要がある等、分析操作が煩雑
であり測定に多大の時間を要するという欠点があった。

この様な用手法に比べて酵素電極法においては、比較的
操作が簡単であり、分析操作上の煩雑さは回避できるの
であるが、従来使用されていたピルビン酸オキシダーゼ
は熱安定性が低い為に長期間に亘る高精度の安定した測
定が困難であった。この様な不都合を解消する手段とし
て、メルカプトエタノール、ジチオスクイトール。シス
ティン、グルタチオン等のチオール試薬が酵素安定化剤
として添加されているが、これらの安定化剤はその効果
が少ないばかりでなく、酵素電極法における電極反応を
逆に阻害し、測定結果に大きな誤差を生じさせるという
別の問題が生じた。更に従来使用されているピルビン酸
オキシダーゼを固定化する際に、グルタルアルデヒドの
様な架橋試薬に対して抵抗性が弱く、著しい変性を受け
て失活することがあった。従って強固な固定化手段を採
用することができず、吸着法や包括法等の様な比較的緩
やかな固定化手段しか採用することができず、実用的に
安定な固定化酵素を得ることは極めて困難であった。

本発明は従来の酵素電極法がもつ問題点を解決する為に
なされたものであって、その目的とするところは、ピル
ビン酸を迅速且つ正確にしかも長期に亘って安定して測
定できる酵素電極法を実現すべく、その様な酵素電極法
に最適な酵素電極用酵素膜を提供することにある。

［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とはピルビン酸にピルビン
酸オキシダーゼを作用させたときのピルビン酸の燐酸化
を伴う酸化還元酵素反応から生成する過酸化水素又は二
酸化炭素に対応する酸化還元電流又は電位変化、或は前
記酵素反応によって消費される酸素濃度に対応する酸化
還元電流又は電位変化をポーラログラフ電極で検出する
ことによって、ピルビン酸及び／又は燐酸を測定する様
な酵素電極法に用いる酵素電極用酵素膜において、下記
理化学的性質を有する新規な耐熱性ピルビン酸オキシダ
ーゼを用いた点に要旨を有するものである。

（ａ）作用：　ＦＡＤ及びチアミンピロ燐酸を補酵素と
し１．ピルビン酸、無機燐酸及び酸素からアセチル燐酸
、二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒する。

（ｂ）基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、
α−ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異
的である。

（Ｃ）耐熱性：ｐＨ７，０，１０分間処理で４５℃まで
熱に安定である。

（ｄ）至適ｐ　Ｈ：　５．７付近 （ｅ）Ｋｍ値：ピルビン酸に対して約４　Ｘ　１０−４
Ｍ（ｆ）分子量：約１６０，０００（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ　Ｓ−３００でのゲル濾過法） （ｇ）等電点：約４．４（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏ
ｌｙｔｅによる焦点電気泳動法） ［作用］ 本発明は上述の如く構成されるが、要は一連の酵素反応
の結果生じる過酸化水素、二酸化炭素或は酵素反応で消
費される酸素濃度等に対応する酸化還元電流又は電位変
化をポーラログラフ電極で検出することによって、ピル
ビン酸及び／又は燐酸を測定する様な酵素電極法を基本
的に採用するに当たり、この酵素電極法による測定が正
確且つ迅速しかも長期に亘って安定に実施できる様な酵
素電極用酵素膜を、耐熱性に優れた新規なピルビン酸オ
キシダーゼを用いることによりて実現し得たのである。

まず、本発明の酵素膜が適用される酵素電極法の原理に
ついて説明する。

血液、体液、生体組織、培養液、発酵液等の被検体にピ
ルビン酸オキシダーゼ（ＰＹＯ）を作用させると、該被
検体中に含まれるピルビン酸は、フラビンアデニンジヌ
クレオチド（ＦＡＤ）やチアミンピロ燐酸（ＴＰＰ）等
の補酵素及びｕ　ｇ＋　＋　、　ｃ　ａ　＋　＋　、　
Ｍｎ　＋＋等の２価金属の促進剤の存在下で、ピルビン
酸の燐酸化を伴なって過酸化水素及び二酸化炭素を生成
する。このときの反応機構は、下記（１）式によって示
される。

ＣＩ（＋ＣＯＣＯ２−”０２”ＨＰＯ４−−上記（１）
式によって生成する過酸化水素をポーラログラフ電極で
還元すると、過酸化水素濃度に比例した電極電流（酸化
還元電流）又は電位変化が発生する。このときの反応機
構を下記（２）〜（４）式に示すが、（２）式は白金ア
ノードでの反応、（３）式は銀カソードでの反応、（４
）式は全反応を夫々示す。

２Ｈ２０２−＋　　４）１”＋２０２＋４ｅ−−・・　
（２）４Ｈ”＋０２４−４ｅ−→２Ｈ２０・（３）２Ｈ
２０２→　２Ｈ，０４０□　　　　　　　　　・・・（
４）そして既知濃度のピルビン酸又は燐酸の標準液を用
い、予め電極電流を測定して検量線を作成しておき、被
検体によって得られた電極電流と検量線とを比較するこ
とによって、被検体中のピルビン酸又は燐酸の濃度を測
定することができる。尚本発明においては、電極電流（
又は電位変化）を求める対象としては、前述の過酸化水
素に限らず、上記（１）式によって生じる二酸化炭素或
は消費される酸素等であってもよい。

一方本発明で用いられるピルビン酸オキシダーゼは、下
記の理化学的性質を有する新規な酵素である。

（ａ）作用：　ＦＡＤ及びチアミンピロ燐酸を補酵素と
し、ピルビン酸、無機燐酸及び酸素からアセチル燐酸、
二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒する。

（ｂ）基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、
α−ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン酸に特異
的である。

（Ｃ）耐熱性：ｐＨ７，０，１０分間処理で４５℃まで
熱に安定である。

（ｄ）至適ＰＨ：５．７付近 （ｅ）Ｋｍ値：ピルビン酸に対して約４　Ｘ　１０−４
Ｍ（ｆ）分子量：約１６０，０００（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ　Ｓ−３００でのゲル濾過法） （ｇ）等電点：約４．４（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏ
ｌｙｔｅによる焦点電気泳動法） この耐熱性ピルビン酸オキシダーゼは、福井系敦賀市内
の土壌から分離されラクトバチルス属に属する微生物と
同定されたＴＥ−６１０３株によって産生される。この
ＴＥ−６１０３株は、従来のピルビン酸オキシダーゼよ
りも熱安定性に優れたピルビン酸オキシダーゼを産生す
るものとして既に特許出願されている（特願昭６１−１
９６２３０号）。

上記菌株ＴＥ−６１０３株の菌学的性質は下記の通りで
ある。

（ａ）形態 大きさ二０．５〜０．７Ｘ　５〜６μｍ（桿菌）ダラム
染色ニゲラム陽性 抗酸性二　− 運動性；　− 胞　子二　− 仙）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 ３０℃、４８時間で小さな円形のコロ ニーを形成する。表面は平滑で光沢はない。色は淡黄色
であり可溶性色素は形成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育弱い （３）肉汁液体培地 ３０℃、２４時間培養にて生育し、濁化する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 穿刺線に沿って生育する。ゼラチンは液化しない。

（５）リドマス・ミルク 変化なし くＣ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；陰性 （２）脱窒反応；陰性 （３）インドールの生成；陰性 （４）硫化水素の生成；陰性 （５）デンプンの加水分解；陰性 （６）色素の生成；なし く７）クエン酸の利用；陰性 （８）ウレアーゼ；陰性 （９）タカラーゼ：陰性 （１０）オキシダーゼ；陰性 （１１）生育の範囲；生育温度２０℃〜４５℃（１２）
酸素に対する態度；通性嫌気性（１３）　Ｏ−Ｆテスト
；発酵 （１４）ＭＪからの酸の生成 Ｌ−アラビノースニー Ｄ−キシロース；− Ｄ−グルコース：＋ Ｄ−マンノース：＋ Ｄ−フルクトース：＋ Ｄ−ガラクトースニー 麦芽ｗＩ：＋ ショ糖：＋ 乳　　　　糖ニー トレハロースニー Ｄ−ソルビットニー Ｄ−マンニット：一 イノシットニー ラムノースニー メリビオース：＋ （１５）その他 β−ガラクトシダーゼ：陰性 アルギニンジヒドラーゼ：陰性 リジンデカルボキシラーゼ：陰性 オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性 トリプトファンデアミナーゼ：陰性 上記菌学的性質の同定のための実験法は主として長谷用
武治編著「微生物の分類と同定」学会出版センター（１
９７５年）によって行なった。また分類同定の基準とし
てバージエイズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ
・バタテリオロジー第８版（１９７４年）を参考にした
。

以上の菌学的性状における木菌ＴＥ−６１０３株はグラ
ム陽性桿菌でカタラーゼ、オキシダーゼ陰性で、グルコ
ースから発酵的に酸を産生ずるが、グルコースからガス
を産生じないことなどから、パージエイズ・マニュアル
・オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版（
１９７４年）により検索するとラクトバチルス属に属す
るとみなされる。さらにラクトバチルス・デルブリッチ
４　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｉｉ）とよく一致するが、Ｄ−マンニットやメリビオ
ースからの酸の産生において相違が認められる。従って
本菌株はラクトバチルス・ニス・ビーＴＥ−６１０３株
と命名した。木菌は工業技術院微生物工業研究所に微生
物受託番号微工研菌寄第８８８６号として寄託されてい
る。

上述した様に本発明においては、ＴＥ−６１０３株によ
って産生されるピルビン酸オキシダーゼな用いることに
よって、本発明の目的を達成しようとするものであるが
、更にこの酵素を固定化することによって、本発明の効
果がより一層確実なものとなる。即ち上記の酵素を固定
化酵素とすることによって、その耐熱性を一層向上させ
ることができ、長期間に亘って安定して酵素活性を発揮
し、酵素電極法に最適な酵素電極用酵素膜が実現できる
。

本発明に係るピルビン酸オキシダーゼを固定化するに当
たっては、従来のピルビン酸を固定化する場合における
様な限定は一切なく、通常知られているすべての方法が
採用できる。例えば架橋法や共有結合法等の化学結合法
では、酵素や担体に含まれるアミノ基、水酸基、カルボ
キシル基等の官能基をグルタルアルデヒドやヘキサメチ
レンジイソシアネート等の架橋剤を介して酵素が固定化
できる。またジアゾカップリング法、臭化シアン活性化
法、トリアジニル誘導体法、ハロゲノアセチル誘導体法
、酸アジド誘導体法、若しくはカルボキシクロリド誘導
体法を利用しても、酵素な固重化することが可能である
。更に包括法では、包括マトリックスとしてポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチ
ルアクリレート又は各種の光硬化型感光性樹脂の様な合
成高分子やキトサン、ゼラチン、カラギーナン等の天然
高分子を用いて酵素等を固定化することが可能である。

尚必要によっては、ラクテートデヒドロゲナーゼ等の他
の酵素やアルブミンの様な蛋白質等を１種以上併用して
固定化することも可能である。

固定化酵素の形状としては、（ａ）酵素電極を構成する
ときに一体化できること、（ｂ）妨害物質を透過せずに
基質や電極検知物質のみを透過させることができる等を
考慮すると、膜状であるのが最適である。しかしながら
場合によっては繊維状、粒状担体な用い、バイオリアク
ター型カラムとして用いることも可能であり、適宜選定
すればよい。

尚本発明で用いられる電極としては、例えば白金（Ｐｔ
）アノード及び銀（Ａｇ）カソードからなるポーラログ
ラフ電極、及び炭酸ガス電極等を挙げることができる。

また実際の電流測定装置の構成は何ら限定されるもので
はなく、固定化酵素の反応をカラムを用いて行なった後
検知物質を電極によって電気的に測定するりアクタ一方
式、或は固定化酵素を膜状として電極と一体化した酵素
電極方式等を挙げることができる。

［実施例］ 以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。

厚さ４，５μｍのアセチルセルロース系非対称構造膜の
多孔質層を、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン０
．１ｍｌ、酢酸０．０３ｍ１及び蒸溜水１ｍｌからなる
溶液に浸漬し、室温で３０分風乾してから９５℃で６０
分間熱処理した。次に０．ＩＮ水酸化ナトリウム溶液に
１０分間浸漬し、蒸溜水で十分洗浄した。

得られたアミノ化アセチルセルロース膜を４％グルタル
アルデヒド水溶液に浸漬し、室温で１０分間ＩＡ理して
膜面にアルデヒド基を導入した。アルデヒド基を導入し
たアセチルセルロース非対称構造膜の多孔質面３６ｃｍ
２に、耐熱性とルピン酸オキシダーゼを含んだ燐酸緩衝
液（３６０１Ｕ／Ｉｔ　）　０．２　ｍｌ、牛血清アル
ブミン２０ｍｇ及び４％グルタルアルデヒド水溶液０．
０５　ｍｌからなる酵素溶液を均一に流延し、４℃で３
０分間反応させた。

更に３℃で３０分間風乾した後１Ｍグリシン溶液で反応
を停止させてから、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０
）で十分洗浄を繰返した。そして固定化酵素が汚染され
るのを防止する為に、孔径０．０５μｍの多花性ポリカ
ーボネート膜をラミネートした後、４℃で風乾し、固定
化酵素膜Ｉ（実施例）を得た。

得られた固定化酵素膜■におけるピルビン酸オキシダー
ゼの活性を調べたところ、ピルビン酸を基質としたとき
に、０．０２６　Ｉ　Ｕ　／　ｃｍ２であった。

比較例として、従来使用されていたピルビン酸オキシダ
ーゼを用い、４℃で３０分間、ウェット状態で反応させ
るという条件下で固定化酵素膜ＩＩを得た。この固定化
酵素膜１１におけるピルビン酸オキシダーゼ活性は、ピ
ルビン酸を基質としたときに０．０３０　Ｉ　Ｕ　／　
ｃｍ２であった。尚固定化酵素膜ＩＩを得るに当たって
は、これ以上苛酷な条件での固定化は急激な酵素失活の
原因となるので、上記実施例（固定化酵素膜１）を得る
際と同じ条件を設定することは不可能であった。

次にｐｔ−アノード及びＡｇ−カソードからなる過酸化
水素検知型ポーラログラフ電極に、固定化酵素膜Ｉ及び
Ｉ！の夫々を装着し、２種類の酵素電極を構成した。

更に上記各酵素電極をフローシステム分析計に装着し、
２ｍＭ燐酸カリウム、２ｍＭ塩酸マグネシウム、１ｍＭ
チアミンピロ燐酸及び０．０１ｍ　Ｍフラビンアデニン
ジヌクレオチド・２ナトリウムを含む０．１　Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，０）を用い、緩衝液流量３．
４ｍｌ／分、サンプル量１０μＬの条件で、ピルビン酸
カリウムに対する応答性及び電極出力の経時変化を調査
し、各酵素電極における長期安定性を評価した。

第１図は固定化酵素膜■（実施例）による酵素電極を用
いたときのピルビン酸カリウム標準液に対する初期応答
曲線（３７℃）であり、第２図は固定化酵素膜ＩＩ　（
比較例）による酵素電極を用いたときのピルビン酸カリ
ウム標準液に対する初期応答曲線（３０℃）である。尚
第１図及び第２図において、（１）〜　（６）で示した
部分は、ピルビン酸の濃度が夫々（１）　０．１．　（
２）　０．２．　（３）　０．３゜（４）　０．４．　
　（５）　０．５．　　（Ｂ）　１．０　（ミリｍｏｌ
／Ｉ１．）であることを示している。

一方第３図は各固定化酵素膜Ｉ、ＩＩを用いた酵素電極
によるピルビン酸カリウムに対する電極出力の経時変化
を相対出力で示したグラフである。

第１図〜第３図の結果から、下記の様に考察することが
できる。

固定化酵素膜Ｉ、ＩＩのいずれを用いた場合であっても
、基質濃度は０〜１．０ｍＭの範囲で電極出力との間に
良好な直線関係が認められ、この範囲内においてはいず
れの場合でも良好な測定精度が得られることが予想され
るが、両者間には電極出力の経時変化において大きな相
違が認められる。即ち第３図に示される様に、固定化酵
素膜Ｉ（実施例）を用いた酵素電極では３７℃で３０日
後においても初期出力の８０％を保持しているのに対し
、固定化酵素膜■（比較例）を用いた酵素電極では３０
℃の温和な条件下であるにも拘らず、１２日後において
初期出力の３４％に低下したのである。

［発明の効果］ 以上述べた如く本発明によれば、新規な耐熱性ピルビン
酸オキシダーゼを用いることによって、迅速且つ正確に
しかも長期に亘って安定して測定できる酵素電極法の実
現に最適な酵素電極用酵素膜が達成された。

【図面の簡単な説明】

第１図は固定化酵素膜Ｉ（実施例）による酵素電極を用
いたときのピルビン酸カリウム標準液に対する初期応答
曲線、第２図は固定化酵素膜ＩＩ（比較例）による酵素
電極を用いたときのピルビン酸カリウム標準液に対する
初期応答曲線、第３図は各固定化酵素膜１．ＩＩを用い
た酵素電極によるピルビン酸カリウムに対する電極出力
の経時変化を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼを作用させたとき
   のピルビン酸の燐酸化を伴う酸化還元酵素反応から生成
   する過酸化水素又は二酸化炭素に対応する酸化還元電流
   又は電位変化、或は前記酵素反応によって消費される酸
   素濃度に対応する酸化還元電流又は電位変化をポーラロ
   グラフ電極で検出することによって、ピルビン酸及び／
   又は燐酸を測定する様な酵素電極法に用いる酵素電極用
   酵素膜において、下記理化学的性質を有する新規な耐熱
   性ピルビン酸オキシダーゼを用いたことを特徴とする酵
   素電極用酵素膜。 （ａ）作用：ＦＡＤ及びチアミンピロ燐酸を補酵素とし
   、ピルビン酸、無機燐酸及び酸素か らアセチル燐酸、二酸化炭素及び過酸化水 素を生じる反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性：オキザロ酢酸、ＤＬ−乳酸、酢酸、
   α−ケトグルタール酸には反応せ ず、ピルビン酸に特異的である。 （ｃ）耐熱性：ｐＨ７．０、１０分間処理で４５℃まで
   熱に安定である。 （ｄ）至適ｐＨ：５．７付近 （ｅ）Ｋ＿ｍ値：ピルビン酸に対して約４×１０＾−＾
   ４Ｍ（ｆ）分子量：約１６０，０００（Ｓｅｐｈａｃｒ
   ｙｌ　Ｓ−３００でのゲル濾過法） （ｇ）等電点：約４．４（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏ
   ｌｙｔｅによる焦点電気泳動法）