CN109988719B - 法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乌天麻栽培技术领域，具体涉及法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用。法国蜜环菌小草坝1号保藏编号为：CGMCC No.16781。实验证明，采用法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号栽培乌天麻，既可以提高乌天麻产量还可以提高品质。法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，生长速度较快，在用于菌种制作时缩短生产周期。另外该菌多糖含量较高，显示出较高的药用价值。

Description

法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用
技术领域
本发明涉及乌天麻栽培技术领域，具体涉及法国蜜环菌新菌株及其应用。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Blume)为兰科多年生共生草本植物，是传统的名贵中药。天麻具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗衰老、有助于记忆力、改善循环及免疫功能等药理作用。天麻的营养方式为异养型，早在1911年就发现天麻的营养来源是消化侵染的蜜环菌。根据花的颜色、花茎的颜色、块茎的形状、块茎的含水量等不同，天麻划分为4个类型，即原变型-红天麻(G.elata Bl.f.elata)、绿天麻(G.elata Bl.f.viridis Makino)、乌天麻(G.elataBl.f.glauca S.Chow)、黄天麻(G.elata Bl.f.f lavida S.Chow)。在生产中栽培最多的主要是红天麻和乌天麻。蜜环菌属(Armillaria)隶属于膨瑚菌科(Physalacriaceae)，是一个世界性分布的属，全球报道约有50余种，该属真菌既是重要的林木病原菌，也是重要的食用菌，其中一部分还是名贵中药天麻的共生菌。
云南省昭通市是我国公认的天麻地道药材产地，主要位于五莲峰山脉和乌蒙山脉的交汇地带，这一带由于受特殊的“昆明准静止峰”气候类型影响，创造了最适宜天麻生长的环境。昭通市彝良县小草坝镇被誉为世界天麻的原产地，所产的乌天麻是云南天麻的代表，更是昭通天麻的代表。不同种类的蜜环菌自然分布在不同的地理区域，而且并非同一个地域范围的蜜环菌种类都与天麻具有良好共生关系。蜜环菌不同菌株对天麻产量和质量会产生不同的影响，表现出显著性差异。目前天麻栽培生产中，蜜环菌菌种生产比较混乱，随意分离蜜环菌菌种，不经试验直接投入生产，导致烂麻、天麻产量和品质下降的事件屡屡发生。因此挑选合适的蜜环菌用于天麻栽培生产和产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明筛选得到一株法国蜜环菌新菌株，适用于乌天麻优质高产栽培，可以提高乌天麻产量和品质。
本发明提供的法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号，已于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.16781。
本发明提供的法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCCNo.16781)是从云南省彝良县小草坝镇野生天麻分离获得的。该菌株的形态特征如下：
菌丝体特征：菌丝乳白色，在黑暗处有萤光。菌丝容易在培养基内形成菌索，幼龄菌索未端呈棕红色，壮龄菌索表面光滑粗壮并呈暗红色，老龄菌索表面呈黑褐色。
子实体特征：菌盖锥形、凸形或平顶。菌盖棕黄色到棕色，中心颜色较深。菌盖表面覆盖有细纤毛，直立或倾斜向上。初期子实体菌盖下表面有一层絮状组织，从菌盖边缘伸展到菌柄上。菌褶最初为白色，逐渐变为奶油色或浅橙色，并覆盖锈色的斑点。菌褶联生或稍沿菌柄向下延伸。菌柄长4-10厘米。菌环以上，菌柄为浅橙色到棕色；菌环以下，菌柄呈白色或浅粉红色；基部为灰棕色。孢子印呈白色。孢子椭球形。菌盖角质层由不规则交织的菌丝组成，向上突出形成鳞状物。菌丝中存在锁状联合。
生物学特性：营养成分来源，小草坝1号可用改良PDA培养基(马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，pH自然)保存，适宜在4℃冰箱低温冷藏保存，每3个月转接1次。小草坝1号的菌种扩繁生产：母种生产适宜用改良PDA培养基培养；原种和栽培种生产适宜用以小树枝、水为主料，玉米粉为辅料组成的培养基。
培养及栽培条件：菌索生长温度9℃～38℃，最适20℃～23℃。
本发明还提供上述法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCCNo.16781)在乌天麻栽培中的应用。可采用本领域常规方法栽培乌天麻。
实验证明，采用法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCCNo.16781)栽培乌天麻，既可以提高乌天麻产量还可以提高品质。
具体地，本发明还提供一种乌天麻的栽培方法，其采用树棒、乌天麻种栽“三下窝”方式、仿野生栽培；天麻栽培穴长×宽×深为70cm×40cm×25cm；每穴摆放直径5～12cm、长度30cm的树棒5根，上述法国蜜环菌(Armillaria gallica)小草坝1号(CGMCC No.16781)菌种1瓶(净重约680g)，乌天麻种栽200g。其中，所述树棒可为本领域常规选择；可采用本领域常规方法制备所述法国蜜环菌菌种。
本发明还提供采用法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCCNo.16781)栽培所得的乌天麻。
本发明还提供乌天麻生药材，是采用上述法国蜜环菌(Armillaria gallica)小草坝1号(CGMCC No.16781)栽培所得的乌天麻加工而得。可采用本领域常规方法例如药典方法进行加工。具体例如将乌天麻采挖后，洗净，蒸透，敞开低温干燥。
本发明还提供上述法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCCNo.16781)在制备食品、保健食品或药物上的应用。
采用法国蜜环菌(Armillaria gallica)新菌株小草坝1号(CGMCC No.16781)进行培养，实验证明该菌的胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力显著高于其它菌株，生长速度较快，在用于菌种制作时缩短生产周期。另外该菌多糖含量较高，显示出较高的药用价值。
附图说明
图1为实施例1四株蜜环菌的系统发育N-J树。
图2、图3、图4分别为实施例2乌天麻栽培试验天麻产量、天麻有效成含量、天麻的天麻素和对羟基苯甲醇UPLC图。
图5、图6、图7、图8、图9、图10分别为实施例3中AM1、AM2不同时期胞外漆酶活力、胞外纤维素酶活力、胞外木聚糖活力、胞外果胶酶活力、胞外淀粉酶活力、多糖含量变化情况图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1菌株的获得、菌种鉴定
1.1菌株分离
从云南省彝良县小草坝镇野生天麻(带菌索的天麻块茎)分离获得两株蜜环菌，编号为AM1、AM4。具体分离方法如下：
利用清水洗净天麻上的泥土，自来水流淌15分钟后无菌水冲洗3次，用0.1％升汞溶液浸泡1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，去掉残留消毒液，然后用无菌刀切取所需要的部分组织置于无菌培养皿中，用无菌滤纸吸取表面水分，置于添加有氯霉素的PDA培养基的培养皿上，在25℃恒温条件下培养5天开始长出新菌索。
上述菌株AM1、AM4的形态特征如下：
菌丝体特征：菌丝乳白色，在黑暗处有萤光。幼龄菌丝未端呈棕红色，壮龄菌丝表面光滑粗壮并呈暗红色，老龄菌丝表面呈黑褐色。
子实体特征：菌盖锥形、凸形或平顶。菌盖棕黄色到棕色，中心颜色较深。菌盖表面覆盖有细纤毛，直立或倾斜向上。初期子实体菌盖下表面有一层絮状组织，从菌盖边缘伸展到菌柄上。菌褶最初为白色，逐渐变为奶油色或浅橙色，并覆盖锈色的斑点。菌褶联生或稍沿菌柄向下延伸。菌柄长4-10厘米。菌环以上，菌柄为浅橙色到棕色；菌环以下，菌柄呈白色或浅粉红色；基部为灰棕色。孢子印呈白色。孢子椭球形。菌盖角质层由不规则交织的菌丝组成，向上突出形成鳞状物。菌丝中存在锁状联合。
生物学特性：营养成分来源，可用改良PDA培养基(马铃薯200g，麦麸33g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，盐酸噻胺0.1g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL，pH自然)保存，适宜在4℃冰箱低温冷藏保存，每3个月转接1次。菌种扩繁生产：母种生产适宜用改良PDA培养基培养；原种和栽培种生产适宜用以小树枝、水为主料，玉米粉为辅料组成的培养基。
1.2菌种鉴定
另取两株生产上用于天麻栽培的蜜环菌菌株(Armillaria spp.)A9和京234，均来源于中国医学科学院药用植物研究所，编号为AM2(即A9)，AM3(即京234)。蜜环菌A9和京234为目前栽培天麻用的主流栽培品种。
将以上AM1、AM2、AM3、AM4四株蜜环菌菌株，分别接种于改良的PDA培养基中，25℃培养。将培养好的蜜环菌从培养基中剥离，放入研钵中，加入适量石英砂和液氮充分研磨，基因组DNA提取方法按照“植物基因组DNA提取试剂盒”的说明书步骤操作。扩增序列为rDNA-ITS(SEQ ID NO:1)、β-tubulin(SEQ ID NO:2)和tef1-α(SEQ ID NO:3)，采用引物见表1。PCR反应体系(25μL)：反应引物(10μM)1μL，DNA模板1μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件：预变性94℃，3min；循环条件：变性：94℃，30s；退火：rDNA-ITS和tef1-α为55℃，30s，β-tubulin为53℃，40s；72℃延伸：rDNA-ITS为120s，β-tubulin为90s，tef1-α为30s，以上循环30次；延伸72℃5min。
其中tef1-α序列采用两步PCR反应扩增，第一步反应使用引物EF526F、EF1567R，第一步的PCR产物作为第二步反应的模板。第二步反应使用引物EF595F、EF1160R，进行扩增。
表1引物序列及名称
Figure BDA0002062858260000051
PCR产物取5μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将条带明亮且唯一的PCR产物进行双向测序。其余产物则切下目的基因片段，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收，使用零背景pTOPO-TA克隆试剂盒及大肠杆菌DH5α感受态细胞对回收的DNA片段进行克隆。将37℃过夜培养的菌落挑出，在无菌环境下，转入液体LB培养基中(3mL)，并加入3μL氨苄(50mg·mL-1)，37℃180rpm恒温培养箱恒温培养4h以上，变浑浊的菌液进行双向测序。菌液测序采用通用引物M13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)、M13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)。使用Excel2016和SPSS 19.0对数据进行处理和分析，GraphPad 7.0进行绘图，DNAMAN对基因的同源性分析，MEGA 7.0画出系统发育N-J树。结果见图1(所有蜜环菌菌株序列为rDNA-ITS、β-tubulin和tef1-α的合并序列)。
分别将菌株AM1、AM2、AM3、AM4的rDNA-ITS、β-tubulin和tef1-α三个基因片段合并在一起后使用DNAMAN分析其同源性和遗传距离(表2)发现，AM1与AM3的同源性达到了99.2％，遗传距离较近为0.005；AM2与AM1和AM3分别为98.9％和98.7％，遗传距离稍远；AM4菌株与三者同源性仅约为75％，与AM1距离为0.246，M2AM2为0.242，AM3为0.251，遗传距离较远。
表2四株不同蜜环菌菌株的相似性和遗传距离表
Figure BDA0002062858260000061
注：表2的上半部分为遗传距离，下半部分为相似性，**为分隔线
将测得的序列片段在NCBI上比对AM1、AM2和AM3聚在了一支，支持率为99％。HKAS85563、HKAS85572、HKAS85567、HKAS86560、HKAS86559和HKAS86564为法国蜜环菌，AM1与其聚在了同一支上，支持率高达99％。即分子鉴定结果表明菌株AM1为法国蜜环菌。
将以上菌株AM1命名为法国蜜环菌(Armillaria gallica)小草坝1号，并于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.16781。
实施例2乌天麻栽培试验
本实施例检验法国蜜环菌(Armillaria gallica)小草坝1号(CGMCC No.16781)用于天麻伴栽对产量、质量的影响。为简便描述，仍将该菌株编号为AM1。
以实施例1中记载的蜜环菌AM2、AM3、AM4为对照，将以上四个菌株进行天麻伴栽实验。
乌天麻种栽来源：彝良县小草坝当地产的乌天麻一代种栽；栽培地点：小草坝天麻示范园，海拔2010m，104°12′2″E、27°45′21″N。采用“三下窝”的栽培方式，即采用树棒、不同蜜环菌菌株生产种、乌天麻种栽三者同时放置栽培穴的方法，于2017年3月20日进行栽培；天麻栽培穴长×宽×深60cm×45cm×20cm，每穴摆放直径5～15cm、长度25cm的树棒5根，栽培一层，蜜环菌菌种1瓶，乌天麻种栽200g。仿野生栽培，2017年11月20号对天麻进行采收。
天麻产量结果见图2，天麻有效成含量见图3，天麻的天麻素和对羟基苯甲醇UPLC见图4。图3中，A：天麻素含量；B：对羟基苯甲醇含量；C：天麻素和对羟基苯甲醇总含量；D：多糖含量；**表示各组分相比存在P<0.01显著差异。图4中，A：混合标准品；B：样品液a～d：AM1～AM4；1：天麻素；2：对羟基苯甲醇。
结果表明，用AM1菌株伴栽天麻，总产量为2.967kg/m2，比其他三个菌株都高，差异显著。AM3菌株总产量最低，为1.991kg/m2，和M2、AM4菌株相比存在显著差异。AM1菌株伴栽天麻的箭麻产量为1.912kg/m2，同AM4菌株(1.915kg/m2)非常接近，而与AM2、AM3菌株存在显著差异。总之，AM1菌株伴栽天麻具有明显优势，总产量高于其它三个菌株，箭麻产量高于其它两个菌株。
AM1菌株伴栽天麻的天麻素含量为5.822mg·g-1，高于AM2菌株的4.931mg·g-1和AM3菌株的3.882mg·g-1。AM4菌株伴栽的天麻，天麻素含量约为AM1菌株的1/2，含量最低。AM1菌株伴栽的天麻素含量与AM4菌株存在P<0.01的极显著性差异。对羟基苯甲醇的含量AM3菌株最高，为0.188mg·g-1，AM1菌株次之为0.151mg·g-1，AM2菌株和AM4菌株含量相近。
不同菌株伴栽天麻的麻素和对羟基苯甲醇总含量均高于2015年版中国药典规定的0.25％标准，AM1菌株伴栽的总含量为0.597％，是中国药典水平的2.388倍。AM2、AM3、AM4菌株伴栽的总含量分别为0.501％，0.407％和0.312％，与AM1菌株伴栽的存在显著性差异，AM1菌株伴栽的总含量是AM4菌株伴栽的2倍。
多糖含量测量结果显示，AM1和AM3菌株伴栽的多糖含量高于AM2菌株和AM4菌株，AM1菌株伴栽的多糖含量为21.39mg·g-1，与AM3菌株的21.42mg·g-1含量相近，AM4与AM2菌株伴栽的含量相近，AM4菌株伴栽的为19.39mg·g-1，AM2菌株伴栽的为17.62mg·g-1，含量均较低。
AM1在四个菌株中与乌天麻伴栽箭麻产量最高，天麻素含量高达5.822mg·g-1，天麻素和对羟基苯甲醇总含量为5.973mg·g-1，栽培的天麻品质最好。AM4菌株伴栽的天麻产量与AM1相近，但有效成分含量低，天麻素含量、总含量约为AM1的1/2左右。总之，用AM1菌株拌栽的天麻，其产量和质量最优。
实施例3生物学性质比较
本实施例检验法国蜜环菌(Armillaria gallica)小草坝1号(CGMCC No.16781)的生物学性质。为简便描述，仍将该菌株编号为AM1。
以实施例1中记载的蜜环菌AM2为对照。
改良固体PDA培养基分别定量接入菌株AM1、AM2的幼嫩菌索，置于25℃黑暗条件下培养，定期观测并记录实验数据。
生长量的测定
接种第四天起用十字交叉法测量菌株的生长量，每天测量至长满为止。
胞外酶活力测定
粗酶液的制备
用接种针随机取菌丝周边的培养基装满2.0mL离心管，12000r/min离心15min，吸出上清液1mL于10mL容量瓶中用蒸馏水定容，作为稀释后的酶液，用于下列实验。
酶活力测定
采用ABTS法测定漆酶活力：在2.0mL酶活反应体系中先加入0.5mL 0.5μmol/L的ABTS，以及1.0mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝4.0 0.2mol/L)混合均匀，再加入0.5mL稀释后的酶液启动反应，每隔30s记录420nm吸光度值的变化，在符合线性关系处求出斜率并换算出酶活力。一个酶活单位定义为反应体系中每分钟催化1μmol ABTS氧化所需要的酶量。
DNS法分别测定纤维素酶活力、木聚糖酶活力、果胶酶活力及淀粉酶活力。
纤维素酶活力测定：在刻度试管中分别加入用0.1mol/L的醋酸缓冲液(pH＝4.6)配制的1％CMC-Na溶液1.5mL，稀释后的酶液0.1mL，混匀后于40℃水浴保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5mL，置于沸水浴加热5min，待冷却后用蒸馏水稀释至10mL，于500nm测定吸光度值。其余酶活力测定方法与纤维素酶活测定方法相同，只是把1％CMC-Na溶液换成1％木聚糖溶液、1％果胶溶液、1％淀粉溶液，配置方法也相同。
以上方法均以加热灭活的粗酶液作对照，分别按葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸标准曲线，计算底物被酶分解的葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸的含量，1个酶活单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸所需要的酶量。
标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线：准确移取0.1mg/mL的葡萄糖标准液0.1～0.9mL于10mL容量瓶中，并用蒸馏水补充至2.0mL，以2.0mL蒸馏水作对照。加入5％苯酚溶液1mL，再加入浓硫酸5mL摇匀并用蒸馏水定容至10mL。放于沸水浴中15min后取出，冷却至室温在A490nm处测吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线：Y＝60.5X+0.0004(r＝0.9995)，该曲线在0.001～0.009mg/mL范围内线性关系良好。
木糖标准曲线：在10mL容量瓶中分别加入0.1～0.6mL 1.5mg/mL木糖标准液，并用醋酸缓冲液补充至1.0mL，以1.0mL醋酸缓冲液作为空白对照。再加入DNS试剂2.0mL摇匀后置于沸水浴显色5min，冷水浴迅速冷却，使用醋酸缓冲液定容至10mL，摇匀后测定A500的吸光度值，以木糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制木糖标准曲线为Y＝18.26X-0.0022(r＝0.9993)，该曲线在0.015～0.09mg/mL范围内线性关系良好。
半乳糖醛酸标准曲线：准确移取1mg/mL的半乳糖醛酸标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL分别于10mL容量瓶中，用醋酸缓冲液补足至2.0mL后加入DNS试剂2mL，摇匀置于沸水浴显色5min，冷水浴迅速冷却，用醋酸缓冲液定容至10mL，测定A500值，以半乳糖醛酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制半乳糖醛酸标准曲线Y＝12.763X-0.0091(r＝0.9992)，该曲线在0.020～0.120mg/mL范围内线性关系良好。
蜜环菌多糖测定
准确称取干燥至恒重的蜜环菌菌丝体粉末0.1g，加入10mL 75％的乙醇，于50℃水浴加热30min过滤。取滤渣加入60mL蒸馏水，微波加热5min，冷却后过滤，滤液用蒸馏水定容至100mL。准确移取200μL提取液于10mL容量瓶，加入5％苯酚1mL，浓硫酸5mL后加入蒸馏水定容至10mL，混匀后放入沸水浴15min，室温冷却后于A490nm处测吸光度值，按葡萄糖标准曲线计算多糖含量。
蜜环菌的生物量
如表3所示，蜜环菌生长第4天开始每天测量菌株的生长情况，分别以每4天为一个生长阶段进行统计分析发现，两种菌株在接种第8天时生长速度最大，分别达到了0.812cm/d和0.807cm/d，二者生长速度并无差异，而在接种第4天和第16天，二者生长量表现出了极显著差异(P<0.01)，结果表明AM1菌株在生长速度上优于AM2菌株。对比折干率，两种菌株差异不大。根据对两种菌株的长势观察，两种菌株接种20天后均长满培养皿，AM1菌株较AM2菌株菌索粗壮，分支多，长势好。
表3 AM1、AM2两菌株不同时期生物量
Figure BDA0002062858260000101
注：*表示两菌株在P<0.05水平上具有显著差异 **表示两菌株在P<0.01水平上具有显著差异
蜜环菌胞外酶活力变化
漆酶活力
不同时期胞外漆酶活力变化情况见图5。由图5可见，蜜环菌漆酶活力随着培养时间的增加呈现先升高后降低的趋势，在接种第16天时分别达到最高值。在第8,12,16,20天AM1菌株漆酶活力强于AM2菌株，并存在差异：其中第8天有差异(p<0.05)；16天有显著性差异(p<0.01)；第12、20天有极显著性差异(p<0.001)。
纤维素酶活力
不同时期胞外纤维素酶活力变化情况见图6。AM1、AM2两种菌株的纤维素酶活力在接种第4天、8天、12天、20天存在显著差异(P<0.05)。两个菌株纤维素酶活力表现为先增加后降低的趋势，并在接种第8天时达到最大值；AM2纤维素酶活力在接种第12天降至最低，而后有所回升。
木聚糖酶活力
不同时期胞外木聚糖酶活力变化情况见图7。可见，AM1、AM2两个菌株的木聚糖酶活力变化趋势一致，均是随接种时间的增加，酶活力也随之先升高后降低。在接种第12天时，木聚糖酶活力最高，其中在接种12,16天AM1木聚糖酶活力比AM2高，存在显著差异(P<0.05)。
果胶酶活力
不同时期胞外果胶酶活力变化情况见图8。可见，果胶酶活力变化趋势与其他酶活力变化趋势不同，AM1、AM2两个菌株蜜环菌果胶酶活力变化均呈现出先下降再升高的趋势，AM1的在第12天最低，而AM2的在第8天最低，都在第20天时最大。AM1和AM2两菌株果胶酶活力在第8、16、2天时有差异(P<0.05)。AM1菌株果胶酶活力在各个时期均高于AM1菌株。
淀粉酶活力
AM1、AM2不同时期胞外淀粉酶活力变化情况见图9。可知，淀粉酶活力也呈现出先增加后下降的变化趋势。但AM1菌株在接种第8天时，淀粉酶活力达到最大值，而AM2菌株则在接种第12天时达到最大值。在第8、12天时，AM1、AM2两菌株淀粉酶活力差异明显(P<0.05)。
蜜环菌多糖含量
不同时期多糖含量变化情况见图10。AM1、AM2两种菌株多糖含量随着培养时间的增加呈现先升高后降低的趋势。在培养第16天时，多糖含量达到最高值。两种菌株多糖含量在第12,16天有显著差异(P<0.05)。
酶活力与蜜环菌菌丝多糖的相关性
通过Pearson相关性分析，发现蜜环菌菌丝体多糖含量与木聚糖酶活力具有强相关性，相关系数为0.750，和漆酶酶活力则表现出极强的相关性相关系数为0.881，而其他酶活力与菌丝体多糖的累积并无相关性(P<0.05)。两种菌株漆酶活力和木聚糖酶活力的变化曲线与二者菌丝体多糖含量变化趋势基本一致，表明两种蜜环菌菌株的生长发育主要与其胞外漆酶和木聚糖酶分泌有关。结果见表4。
表4酶活力与菌丝体多糖的相关性
Figure BDA0002062858260000111
Figure BDA0002062858260000121
蜜环菌多糖和生物量反应了蜜环菌生长速度。在菌种制作中，较快的生长速度在生长上可以节约生产时间，降低成本，本实施例显示出了菌株AM1即小草坝1号该方面的优势。蜜环菌属主要依靠分解木材中的木质素、纤维素、半纤维素等获得营养，漆酶主要负责木质素降解、纤维素酶主要负责纤维素降解、木聚糖酶降解木聚糖(木聚糖是植物半纤维素(hemicellose)的主要成分)、果胶酶则是分解植物主要成分—果胶质的酶类，淀粉酶水解淀粉的酶类，因此这几种酶在高等真菌生长发育过程中发挥着重要的生理功能。本实施例也显示出了菌株AM1即小草坝1号在培养时显示出的酶活力优于菌株AM2。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 彝良县天麻产业开发中心
<120> 法国蜜环菌小草坝1号及其在乌天麻栽培中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 832
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaaggatca ttattgaaac ttgaatcgta gcatcgagaa ctgttgctga cctgttaaag 60
ggtatgtgca cgttcgacgt gttgcgttct attcatccac ctgtgcacct ttgtagactt 120
gattaacttt cgctttcgag cggttagaag ggttgctttc gagctccctt tgtctatcaa 180
gtctatgtct atataatctc ttgtatgtct agaatgtctt gtttatggga tgcaagtcct 240
ttaaatctta tacaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca 300
gcgaaatgcg ataactaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc 360
accttgcgcc ctttggtatt ccgaagggca tgcctgtttg agtgtcatta aattctcaac 420
ctccccttct ttcattagga gtgcggcgga ttggatatgg gggtttgctg gtttctaacg 480
agatcagctc ctctgaaatg cattagcaga aaccgtttga ctttggctgc taggctgtga 540
taatatctac gccttgtagt tgggtcggaa tacgagtcat acagtggtaa ctaatcaggc 600
tttcgggtct ggcttagaat cggtttggaa ggtgcttaac ggctccttct gctttctccc 660
tttgcggaga tacttgtcca attctaagag aggagttgct tagcgcgggc ttagctttcc 720
ttgatatttc cctttgactt tgtagaagga ttcagcttct aaccgtccat tgacttggac 780
aatttattga ctatttgacc tcaaatcagg taggactacc cgctgaactt ag 832
<210> 2
<211> 877
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataacaagtg tgcattttat gcgtttttgt accaactcgc actataggcc aagtcaatga 60
aaactcgccc tacagccacc aaaattgttg caaaccgatc ttgaccaatg gtttacttag 120
caaacctttc gtttcagaac cagttgccgt tcaaattttg aacgtagccc tcgaaagcta 180
agcaaacggt tgaaacggct aaaaaggtaa ccgtagctta acttacttag cttctaaggc 240
cttttcaatc atggcaacct tagggcaggc cctcaggctc actaacgatc cagaaaatca 300
gtcgtcgact cgccctttca aggatcttgg ctataccata tacgggatat cggccataag 360
gtcgatatca agtacaaggt aaagaccgtt ccaagtcagc gcacggttag agcttgctaa 420
ctaagtgcct tataagcctt caaggctcat aataactcgt gattcaaaag agaaaggtaa 480
caaaacacta aggcgttgtt gttagcctac cctttcgaat ctaagtaaca tgctgtcgcg 540
agtgcacaaa ggatactatc ccggccctca aggtctcagc atgtaaaaag aaaagagaaa 600
gtccaacaaa gttgaacaaa tctttagaac aagggcttaa cctcagtgga tcgtagcaac 660
aaggctactc taccacttac agtaccccgt tcccattcaa gtcgtctgca aaggattcac 720
cgccgcccat attatgatta caattcgtag acaagtcgcc caagcgtttc cgcaaagaca 780
acccagccca ccatatttgg ttcacgagca aagctctatt taaacacaag tctaatgtgc 840
gacaccaaca tcatcgtttc tagcacggat tctgact 877
<210> 3
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtgacttca tcaagaacat gatcaccggt acctcccagg ctgattgtgc catcctcatc 60
atcgctggtg gaactggtga gttcgaggcc ggtatctcca aggacggtca gacccgagag 120
cacgccctcc ttgccttcac cctcggtgtc aggcagctca ttgtcgccgt caacaagatg 180
gacaccacca aggtacgaga tctgctgctt tgtcttttgt ttagccaaat ctgactgtta 240
tctcagtgga gcgaggaccg gttcaacgaa atcgtcaagg aaacctctac cttcatcaag 300
aaggtcggct acaaccccaa ggccgttgct ttcgtcccca tctctggatg gcacggtgat 360
aacatgttgg aggagtccgc caagtaagtc tttacccaac tatgatcagt gctgtttctt 420
aacgttctct gtagcatgcc atggtacaag ggctggacca aggagaccaa ggccggtgtc 480
gtcaagggca agactctcct cgatgccatt gacgccattg agccccctgt ccgtccctcc 540
gacaagcctc tccgtctccc tctccaggac gtctacaaga t 581
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgtaggtg aacctgcgc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgcgggta actgggc 17
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgtygtya tygghcaygt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
achgtrccra taccaccrat ctt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtgacttca tcaagaacat g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgatcttgt agacgtcctg 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggaaacag ctatgacc 18

Claims (6)

1.法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号，其保藏编号为：CGMCC No.16781。
2.权利要求1所述法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号在乌天麻栽培中的应用。
3.乌天麻的栽培方法，其特征在于，采用树棒、乌天麻种栽“三下窝”方式、仿野生栽培；天麻栽培穴长×宽×深为60 cm×45 cm×20 cm；每穴摆放：直径5～15cm、长度25 cm的树棒5根，权利要求1所述法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号菌种1瓶，乌天麻种栽200 g。
4.乌天麻生药材，是采用权利要求1所述法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号栽培所得的乌天麻加工而得。
5.权利要求1所述法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号在制备食品或药物上的应用。
6.权利要求1所述法国蜜环菌（Armillaria gallica）小草坝1号在制备保健食品上的应用。
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